CN117567651B - 协同表达血管内皮黏附分子vcam1的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

协同表达血管内皮黏附分子vcam1的嵌合抗原受体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫疗法和基因工程技术领域，具体涉及一种协同表达血管内皮黏附分子VCAM1的嵌合抗原受体及其应用。本发明将血管内皮黏附分子VCAM1与抗CDH17的CAR分子构建到同一个慢病毒载体上，并使用可剪接的2A linker使两者相连，使得T细胞既表达抗CDH17的CAR，也表达血管内皮黏附分子VCAM1。通过抗CDH17的CAR‑T细胞共表达血管内皮黏附分子VCAM1，显著增强了CAR‑T的迁移能力，并帮助CAR‑T细胞向实体瘤迁移。因此，本发明的CAR‑T细胞对实体瘤展现出更强的杀伤功能。

Description

协同表达血管内皮黏附分子VCAM1的嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明涉及免疫疗法和基因工程技术领域，更具体地说，它涉及一种协同表达血管内皮黏附分子VCAM1的嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
CAR-T细胞疗法，即嵌合抗原受体T细胞疗法，是一种新型的细胞疗法，为许多传统疗法无法治疗的疾病带来了希望。然而，CAR-T在治疗实体肿瘤时仍面临一些挑战。首先，实体肿瘤具有复杂的微环境，包括免疫抑制因子、肿瘤细胞的抗原逃逸等，这使得CAR-T细胞难以有效地在肿瘤部位发挥作用。其次，CAR-T细胞的持久性和扩增能力也是关键因素，因为它们直接影响到CAR-T细胞对肿瘤的杀伤效果。此外，如何将CAR-T细胞高效地输送到肿瘤部位也是一个难点，因为现有的输送方法往往不能完全保证CAR-T细胞在肿瘤部位富集。
CDH17是一种在结肠癌中高表达的钙黏蛋白，研究表明其在肿瘤的发生和发展中起到了关键作用。因此，CDH17成为了一个理想的CAR-T靶点。通过靶向CDH17，CAR-T细胞可以更有效地识别和杀伤表达CDH17的结肠癌细胞，从而达到治疗的目的。近年来，针对CDH17的CAR-T细胞疗法已经在临床试验中取得了显著的成果。在一项早期临床试验中，研究人员对一部分结肠癌患者进行了CDH17 CAR-T细胞疗法，结果显示，部分患者的肿瘤明显缩小，生活质量得到显著改善。这一结果证明了CDH17 CAR-T细胞疗法的有效性和安全性。
血管内皮黏附分子VCAM1是一种在血管内皮细胞上表达的糖蛋白，它在免疫应答和炎症反应中起着关键作用。VCAM1可以与淋巴细胞表面的VLA-4受体相互作用，引导淋巴细胞穿越血管内皮层，从而到达炎症部位。这一特性使得VCAM1成为了一个有潜力的CAR-T细胞共表达分子，帮助CAR-T细胞在实体肿瘤中迁移和发挥杀伤作用。
综上所述，为了增强CAR-T细胞（即嵌合抗原受体T细胞）在实体肿瘤中的迁移能力和杀伤效果，本发明将VCAM1与CAR-T细胞共表达。通过基因工程技术，制备出同时表达CDH17受体和VCAM1的CAR-T细胞。通过靶向CDH17并共表达VCAM1，CAR-T细胞在治疗实体肿瘤方面展示了显著的优势。这种策略不仅能增强CAR-T细胞的迁移能力，还能帮助它们更有效地在实体肿瘤中发挥杀伤作用。未来的研究将进一步优化这种治疗方法，以期能在临床试验中取得更好的效果，为结肠癌患者提供一种更有效的治疗选择。
发明内容
本发明的目的是提供一种协同表达血管内皮黏附分子VCAM1的嵌合抗原受体及其应用。本发明通过将血管内皮黏附分子VCAM1与抗CDH17的CAR分子构建到同一个慢病毒载体上，中间用可剪接的2A linker相连，使得T细胞既表达抗CDH17的CAR（即嵌合抗原受体），也表达血管内皮黏附分子VCAM1。
抗CDH17的CAR-T细胞共表达血管内皮黏附分子VCAM1后，显著增强了CAR-T的迁移能力，并帮助CAR-T细胞向实体瘤迁移，从而可以对实体瘤展现出更强的杀伤功能。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种协同表达血管内皮黏附分子VCAM1的嵌合抗原受体，所述的嵌合抗原受体包括有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列和SEQ ID No:2所示的氨基酸序列。
优选地，SEQ ID No:1所示的氨基酸序列与SEQ ID No:2所示的氨基酸序列之间使用可剪接的2A linker相连。
优选地，所述的嵌合抗原受体具有下式I结构：
L-CDH17 scFv-H-TM-C-CD3ζ-2A-VCAM1(I)
式中，
各“-”为连接肽或肽键；L为信号肽序列；CDH17 scFv为针对CDH17肿瘤抗原的抗体，所述CDH17 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；H为铰链区序列；TM为跨膜区序列；C为共刺激域序列；CD3ζ为信号传导域序列。
一种核酸分子，其编码上述的嵌合抗原受体。
优选地，所述的核酸分子包括有SEQ ID No:5所示的核苷酸序列和SEQ ID No:6所示的核苷酸序列。
一种载体，其包括有上述的核酸分子。
优选地，所述的载体选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子中的一种或多种组合。
一种细胞，其包括有上述的载体、或染色体中整合有外源的上述的核酸分子、或表达上述的嵌合抗原受体。
优选地，所述细胞为T细胞。
一种制备协同表达血管内皮黏附分子VCAM1的CAR-T细胞的方法，其包括如下步骤：将血管内皮黏附分子VCAM1与抗CDH17的CAR分子构建到同一个慢病毒载体上，并使用可剪接的2A linker使两者相连，然后将该慢病毒载体转染到T细胞中；所述血管内皮黏附分子VCAM1包括有如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列；所述抗CDH17的CAR分子包括有如SEQ IDNo:1所示的氨基酸序列。
综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明制备的协同表达血管内皮黏附分子VCAM1的CAR-T细胞不仅可以提高对实体瘤的治疗效果，还可以增强CAR-T细胞的迁移能力，有助于减少肿瘤转移和复发的风险。此外，本发明还提供了该协同表达血管内皮黏附分子VCAM1的CAR-T细胞在治疗其他免疫相关疾病中的应用，拓展了CAR-T细胞疗法的应用范围。
附图说明
图1是本发明中CDH17的结构示意图；
图2是本发明中CAR的结构示意图；
图3是本发明中CAR-T的扩增倍数图；
图4是本发明中流式检测CAR-T细胞的表达情况图I；
图5是本发明中流式检测CAR-T细胞的表达情况图II；
图6 是本发明中Transwell评估CAR-T的迁移情况图（***P≤0.001）；
图7是本发明中CAR-T的杀伤率检测图（*P≤0.05）。
具体实施方式
为使本发明的目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。附图中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。
实施例1：嵌合抗原受体的设计
本实施例构建了抗CDH17的嵌合抗原受体（CDH17 CAR）、共表达血管内皮黏附分子VCAM1的抗CDH17的（CDH17-VCAM1 CAR），其结构见图1-图2。嵌合抗原受体包括一段CD8α的信号肽序列（Leader），抗CDH17的单链抗体序列（anti-CDH17scFv），CD8α的铰链区（Hinge）和跨膜区序列（Transmembrane），4-1BB共刺激域序列和CD3ζ信号传导域序列，其结构见图2。
其中抗人CDH17抗体序列（Anti-CDH17 scFv）的氨基酸序列来源于专利WO2023107558A1中07-0663-h7scfv序列（SEQ ID No:1），具体如下所示：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSSIISSSKLHWYQQKPGKAPKPLIYGTSTLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQWSNYPFTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKISCKVSGYTFTDHTIHWMRQAPGQGLEWIGYIFPRDDIVVYAQKFQGRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPPYYYSRNFYFDYWGQGTTLTVSS
VCAM1氨基酸序列（SEQ ID NO:2），具体如下所示：
MPGKMVVILGASNILWIMFAASQAFKIETTPESRYLAQIGDSVSLTCSTTGCESPFFSWRTQIDSPLNGKVTNEGTTSTLTMNPVSFGNEHSYLCTATCESRKLEKGIQVEIYSFPKDPEIHLSGPLEAGKPITVKCSVADVYPFDRLEIDLLKGDHLMKSQEFLEDADRKSLETKSLEVTFTPVIEDIGKVLVCRAKLHIDEMDSVPTVRQAVKELQVYISPKNTVISVNPSTKLQEGGSVTMTCSSEGLPAPEIFWSKKLDNGNLQHLSGNATLTLIAMRMEDSGIYVCEGVNLIGKNRKEVELIVQEKPFTVEISPGPRIAAQIGDSVMLTCSVMGCESPSFSWRTQIDSPLSGKVRSEGTNSTLTLSPVSFENEHSYLCTVTCGHKKLEKGIQVELYSFPRDPEIEMSGGLVNGSSVTVSCKVPSVYPLDRLEIELLKGETILENIEFLEDTDMKSLENKSLEMTFIPTIEDTGKALVCQAKLHIDDMEFEPKQRQSTQTLYVNVAPRDTTVLVSPSSILEEGSSVNMTCLSQGFPAPKILWSRQLPNGELQPLSENATLTLISTKMEDSGVYLCEGINQAGRSRKEVELIIQVTPKDIKLTAFPSESVKEGDTVIISCTCGNVPETWIILKKKAETGDTVLKSIDGAYTIRKAQLKDAGVYECESKNKVGSQLRSLTLDVQGRENNKDYFSPELLVLYFASSLIIPAIGMIIYFARKANMKGSYSLVEAQKSKV
Anti-CDH17 CAR氨基酸序列（SEQ ID NO:3），具体如下所示：
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSSIISSSKLHWYQQKPGKAPKPLIYGTSTLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQWSNYPFTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKISCKVSGYTFTDHTIHWMRQAPGQGLEWIGYIFPRDDIVVYAQKFQGRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPPYYYSRNFYFDYWGQGTTLTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
共表达血管内皮黏附分子VCAM1的抗CDH17的（CDH17-VCAM1 CAR）氨基酸序列（SEQID NO:4），具体如下所示：MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRVSSIISSSKLHWYQQKPGKAPKPLIYGTSTLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQWSNYPFTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKISCKVSGYTFTDHTIHWMRQAPGQGLEWIGYIFPRDDIVVYAQKFQGRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPPYYYSRNFYFDYWGQGTTLTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMPGKMVVILGASNILWIMFAASQAFKIETTPESRYLAQIGDSVSLTCSTTGCESPFFSWRTQIDSPLNGKVTNEGTTSTLTMNPVSFGNEHSYLCTATCESRKLEKGIQVEIYSFPKDPEIHLSGPLEAGKPITVKCSVADVYPFDRLEIDLLKGDHLMKSQEFLEDADRKSLETKSLEVTFTPVIEDIGKVLVCRAKLHIDEMDSVPTVRQAVKELQVYISPKNTVISVNPSTKLQEGGSVTMTCSSEGLPAPEIFWSKKLDNGNLQHLSGNATLTLIAMRMEDSGIYVCEGVNLIGKNRKEVELIVQEKPFTVEISPGPRIAAQIGDSVMLTCSVMGCESPSFSWRTQIDSPLSGKVRSEGTNSTLTLSPVSFENEHSYLCTVTCGHKKLEKGIQVELYSFPRDPEIEMSGGLVNGSSVTVSCKVPSVYPLDRLEIELLKGETILENIEFLEDTDMKSLENKSLEMTFIPTIEDTGKALVCQAKLHIDDMEFEPKQRQSTQTLYVNVAPRDTTVLVSPSSILEEGSSVNMTCLSQGFPAPKILWSRQLPNGELQPLSENATLTLISTKMEDSGVYLCEGINQAGRSRKEVELIIQVTPKDIKLTAFPSESVKEGDTVIISCTCGNVPETWIILKKKAETGDTVLKSIDGAYTIRKAQLKDAGVYECESKNKVGSQLRSLTLDVQGRENNKDYFSPELLVLYFASSLIIPAIGMIIYFARKANMKGSYSLVEAQKSKV
Anti-CDH17 scFv核苷酸序列（SEQ ID NO:5），具体如下所示：
GATATACAAATGACACAAAGCCCATCTTCACTTAGCGCTTCAGTCGGGGATAGGGTGACTATCACTTGCCGGGTAAGCTCCATTATAAGCAGCTCCAAGTTGCACTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCGCCAAAACCGCTTATTTACGGGACTTCCACACTGGCAAGTGGAGTGCCCTCCCGGTTTAGTGGCTCTGGCTCTGGCACTGACTACACTCTGACCATCTCTTCACTCCAGCCTGAGGATTTCGCTACTTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAACTACCCATTCACCTTTGGTCAGGGGACAAAGCTCGAAATCAAAGGAGGCGGCGGGTCAGGGGGCGGAGGATCTGGAGGGGGTGGTTCTCAGGTCCAACTCGTGCAAAGCGGAGCCGAGGTAAAGAAGCCAGGATCTAGTGTCAAGATCTCATGCAAGGTATCTGGCTACACGTTTACAGACCACACTATACACTGGATGAGGCAGGCTCCTGGGCAGGGACTCGAATGGATTGGCTATATATTTCCACGGGACGACATCGTGGTCTACGCCCAGAAGTTTCAGGGAAGGGCTACACTTACTGCCGATAAGTCAACGTCCACCGCCTATATGGAGCTGTCCTCCCTCAGGAGCGAGGACACAGCAGTCTACTATTGCGCCCGACCCCCATACTACTACTCTCGGAATTTCTACTTTGATTATTGGGGACAGGGGACAACTCTTACCGTGAGTAGT
VCAM1核苷酸序列（SEQ ID NO:6），具体如下所示：
ATGCCTGGGAAAATGGTTGTCATTTTGGGAGCAAGTAATATCCTGTGGATCATGTTTGCCGCCTCACAGGCTTTTAAGATCGAGACCACACCAGAATCCAGGTACTTGGCCCAGATTGGTGATAGCGTCAGCCTTACATGCTCCACAACCGGGTGTGAGAGCCCTTTCTTTTCTTGGCGGACCCAAATCGATTCTCCTCTGAATGGGAAGGTCACTAATGAGGGAACGACCAGCACCCTGACTATGAACCCCGTGAGCTTCGGCAATGAACATAGCTATCTTTGTACTGCAACATGTGAGTCACGAAAGTTGGAGAAGGGCATCCAAGTCGAGATCTATTCCTTCCCCAAGGACCCTGAGATCCATTTGAGCGGTCCTTTGGAGGCCGGAAAGCCCATAACCGTAAAGTGCAGCGTGGCTGATGTGTATCCATTTGACCGGCTGGAAATCGACCTTCTCAAGGGAGACCACTTGATGAAGTCTCAAGAATTTCTTGAAGACGCCGACAGAAAGAGCCTGGAGACTAAAAGTCTTGAGGTGACCTTTACTCCCGTCATCGAAGATATTGGCAAAGTGCTGGTCTGTCGGGCCAAACTGCACATCGACGAAATGGACTCAGTGCCAACCGTTCGGCAAGCAGTAAAAGAGCTCCAGGTGTACATCAGTCCGAAGAACACCGTGATCTCAGTTAACCCTTCCACAAAGCTGCAAGAGGGAGGCTCAGTGACTATGACTTGTTCCAGCGAAGGCCTGCCTGCACCCGAGATCTTCTGGTCCAAAAAGCTGGACAACGGTAATTTGCAACATCTGTCAGGTAACGCTACGCTGACCCTTATCGCAATGAGGATGGAGGATAGTGGGATCTACGTGTGCGAGGGAGTGAATCTGATAGGAAAAAATAGAAAGGAGGTGGAGCTGATAGTGCAGGAGAAGCCCTTTACAGTCGAGATTTCACCAGGCCCCAGGATTGCTGCTCAGATCGGGGATTCTGTGATGTTGACTTGCAGTGTTATGGGGTGTGAGTCCCCTAGCTTCTCATGGCGAACCCAGATTGACAGTCCACTGAGTGGGAAAGTGCGGAGCGAAGGTACGAACTCAACACTGACTCTTTCTCCCGTGTCCTTCGAGAATGAACACTCATATCTGTGTACTGTTACCTGCGGCCATAAGAAGCTCGAGAAGGGCATACAGGTGGAGCTGTATTCCTTCCCTCGCGACCCCGAAATTGAGATGTCTGGCGGACTTGTGAATGGAAGTAGTGTGACAGTTAGTTGTAAGGTGCCTAGCGTGTACCCACTCGATAGACTCGAGATAGAGCTTCTGAAGGGAGAGACTATTCTGGAGAACATCGAGTTCCTGGAGGACACCGACATGAAAAGCCTCGAGAACAAGTCCCTCGAGATGACATTCATCCCAACCATAGAGGATACCGGGAAGGCACTCGTGTGTCAGGCTAAACTTCACATTGACGATATGGAGTTCGAGCCCAAACAGAGACAGAGTACTCAGACATTGTATGTAAATGTGGCCCCTCGAGATACTACAGTACTGGTTAGCCCTTCATCTATCTTGGAGGAGGGTAGCAGCGTGAATATGACCTGTCTCAGCCAAGGATTCCCTGCCCCTAAAATCCTGTGGTCACGACAGCTCCCCAACGGTGAGCTCCAACCTCTTTCTGAGAATGCAACGTTGACTCTCATCAGCACTAAGATGGAAGACAGCGGGGTTTACCTGTGTGAAGGCATCAATCAGGCGGGAAGATCCCGCAAAGAAGTGGAACTCATTATCCAGGTCACTCCTAAGGACATAAAGCTCACCGCCTTTCCAAGTGAGTCAGTGAAGGAAGGAGATACAGTGATTATTTCTTGCACATGCGGCAACGTCCCCGAGACATGGATCATCCTCAAAAAGAAAGCCGAGACAGGTGATACTGTGCTGAAATCCATTGACGGCGCCTACACTATAAGGAAGGCCCAGCTGAAAGATGCAGGCGTATACGAGTGTGAGTCTAAGAACAAAGTCGGGTCACAGTTGAGGTCTTTGACACTGGATGTGCAGGGCAGGGAAAATAACAAGGATTACTTCAGCCCTGAGTTGCTGGTTCTCTACTTTGCTAGTTCCCTGATTATACCAGCCATAGGTATGATCATCTATTTTGCCAGGAAAGCTAATATGAAGGGGTCTTACAGCTTGGTGGAGGCACAGAAATCTAAAGTG
Anti-CDH17 CAR核苷酸序列（SEQ ID NO:7），具体如下所示：
ATGGCCCTGCCCGTTACAGCTCTGTTGTTGCCCCTGGCACTCCTGTTGCATGCCGCCAGACCTGATATTCAGATGACACAGTCACCCAGTAGCCTGTCTGCCAGTGTGGGTGACAGGGTGACCATCACCTGTAGAGTGAGCAGTATCATATCATCATCTAAGCTGCATTGGTACCAGCAAAAACCAGGAAAGGCCCCCAAGCCACTGATTTACGGAACATCAACCCTCGCCTCCGGCGTGCCCTCTAGGTTTTCAGGATCTGGTAGCGGCACTGACTACACTCTGACTATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGATTTTGCAACATATTACTGTCAGCAATGGAGCAACTATCCCTTTACTTTCGGGCAGGGCACTAAGCTCGAGATAAAAGGTGGAGGTGGTTCAGGTGGGGGAGGTTCAGGAGGGGGAGGTTCACAGGTGCAGCTCGTTCAGTCAGGAGCCGAGGTGAAAAAGCCCGGCTCCAGCGTGAAAATTTCATGCAAAGTCAGTGGCTACACTTTCACCGATCATACCATACACTGGATGAGACAGGCTCCCGGACAGGGACTGGAGTGGATCGGTTATATATTTCCTCGCGACGACATCGTGGTTTATGCACAGAAGTTCCAAGGCAGGGCTACCCTGACCGCAGACAAGTCCACCTCTACCGCCTACATGGAACTCAGCTCTCTCAGGAGTGAGGACACGGCTGTATACTATTGCGCCCGCCCTCCCTATTACTATAGCAGGAACTTTTACTTTGATTATTGGGGCCAGGGGACAACATTGACCGTGAGTAGCACCACAACCCCAGCTCCTAGACCTCCAACCCCAGCTCCAACAATAGCTAGTCAGCCACTGAGTCTCAGACCTGAGGCTTGTAGGCCAGCGGCAGGAGGGGCAGTGCATACCAGAGGCCTGGATTTCGCCTGCGACATTTACATCTGGGCGCCTTTGGCGGGAACCTGCGGAGTGCTCTTGCTGAGCCTCGTGATTACTTTGTACTGCAAGCGCGGAAGGAAGAAGCTGCTGTATATCTTCAAGCAGCCATTCATGAGACCGGTTCAGACGACCCAGGAGGAAGATGGTTGCTCCTGTCGCTTCCCCGAGGAAGAAGAAGGAGGCTGCGAGTTGCGCGTGAAATTCAGTAGGTCTGCAGACGCTCCAGCCTACCAACAGGGGCAAAACCAGTTGTATAATGAGCTCAACCTCGGGAGGAGAGAAGAATACGATGTGCTGGATAAACGGAGAGGGCGCGATCCTGAAATGGGAGGAAAACCTAGGCGCAAGAATCCCCAGGAAGGCCTCTACAACGAACTGCAGAAGGATAAGATGGCCGAGGCATACTCAGAAATAGGCATGAAGGGAGAACGAAGACGGGGCAAGGGGCATGATGGCCTGTATCAAGGCCTGTCTACCGCAACTAAGGATACCTACGATGCGCTCCATATGCAGGCCCTTCCCCCTCGG
共表达血管内皮黏附分子VCAM1的抗CDH17的（CDH17-VCAM1 CAR）核苷酸序列（SEQID NO:8），具体如下所示：ATGGCCTTGCCCGTGACCGCTCTCTTGCTCCCCCTTGCATTGCTCCTCCACGCCGCCAGGCCAGACATTCAGATGACCCAATCACCCTCTAGCCTGAGCGCTAGTGTTGGCGATAGGGTCACCATCACGTGTCGGGTGAGCTCTATCATCTCTTCATCCAAGCTGCACTGGTACCAACAGAAGCCGGGCAAGGCCCCTAAGCCTCTGATATATGGTACATCCACTCTGGCTAGCGGGGTGCCATCTAGGTTTTCCGGCTCCGGGAGTGGGACAGATTACACCCTGACCATATCAAGCCTCCAGCCAGAGGACTTTGCTACATACTACTGCCAGCAGTGGAGCAACTACCCGTTTACATTCGGACAGGGGACGAAACTCGAAATCAAGGGAGGCGGCGGATCTGGAGGAGGGGGAAGTGGTGGGGGCGGTTCTCAGGTCCAATTGGTACAATCTGGCGCTGAAGTGAAGAAACCCGGAAGCAGTGTCAAGATTAGCTGCAAAGTCTCAGGCTACACCTTTACTGACCACACTATCCACTGGATGAGGCAGGCCCCCGGACAGGGATTGGAGTGGATCGGGTACATATTTCCTCGAGATGACATCGTGGTGTATGCTCAGAAATTTCAGGGCAGGGCTACCCTGACGGCTGATAAAAGCACAAGCACAGCCTATATGGAACTTAGTTCACTTAGGAGTGAGGACACCGCCGTGTATTATTGCGCGCGCCCCCCTTACTACTACAGCCGGAACTTTTACTTCGACTATTGGGGGCAGGGCACAACACTGACCGTCTCTTCCACCACAACACCCGCTCCTCGGCCTCCTACACCTGCTCCAACCATAGCGAGTCAACCGCTGTCTCTCAGGCCAGAGGCCTGTAGACCCGCTGCAGGAGGGGCTGTGCATACTCGGGGCCTGGATTTTGCATGCGATATATACATCTGGGCCCCTTTGGCTGGTACATGTGGGGTGCTCTTGCTGAGTCTGGTGATTACCCTGTACTGCAAACGGGGACGAAAAAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAACCGTTTATGCGCCCCGTGCAGACAACCCAGGAGGAGGATGGTTGTAGCTGTCGCTTCCCCGAGGAAGAGGAGGGTGGTTGTGAATTGAGGGTGAAATTTAGCAGGTCCGCCGATGCACCTGCGTACCAACAGGGGCAAAACCAGCTGTACAACGAATTGAATCTGGGACGCCGCGAAGAGTATGACGTGCTTGACAAACGAAGGGGACGAGACCCAGAAATGGGCGGCAAACCCAGAAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGTTGCAGAAGGACAAAATGGCCGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGCGAAAGACGACGCGGCAAAGGTCACGACGGACTTTACCAAGGGCTCAGCACCGCCACAAAGGATACTTATGACGCCCTCCACATGCAGGCCCTTCCTCCCAGAGGAAGCGGGGCAACTAATTTCTCTCTTCTCAAGCAGGCCGGTGACGTTGAGGAGAACCCTGGCCCTATGCCCGGTAAAATGGTTGTCATACTGGGCGCTTCTAATATCCTGTGGATCATGTTTGCAGCAAGCCAAGCCTTCAAGATTGAAACGACCCCCGAATCTCGGTACCTGGCGCAGATCGGAGATTCTGTGTCTCTGACTTGTAGTACAACCGGGTGTGAGAGCCCCTTTTTTAGCTGGCGCACTCAGATCGACAGCCCCTTGAATGGGAAGGTAACCAACGAAGGGACTACGTCAACACTGACAATGAACCCAGTGTCTTTCGGCAATGAGCATTCTTACCTCTGCACAGCAACTTGTGAGAGCAGGAAATTGGAAAAGGGTATTCAGGTGGAGATATATAGCTTCCCGAAAGACCCAGAAATCCACCTGTCCGGGCCTCTCGAGGCTGGAAAGCCCATCACGGTCAAGTGTTCAGTTGCTGACGTCTATCCCTTCGACAGACTGGAAATCGATTTGCTTAAGGGAGATCACCTGATGAAAAGCCAGGAGTTTCTTGAGGATGCGGACCGAAAGAGCCTGGAAACAAAAAGCCTGGAGGTCACTTTTACTCCAGTCATTGAGGACATCGGAAAAGTTCTGGTGTGTAGAGCGAAACTGCACATAGACGAAATGGACTCCGTGCCAACTGTGAGGCAAGCTGTCAAAGAGCTCCAAGTGTACATATCTCCAAAAAACACCGTTATTTCCGTGAACCCCAGTACCAAACTGCAAGAAGGTGGTAGCGTTACCATGACTTGTTCCTCTGAAGGCCTGCCAGCCCCCGAGATATTTTGGAGTAAGAAACTGGATAATGGCAATCTGCAGCACCTTAGCGGCAATGCGACACTCACACTTATTGCGATGAGAATGGAGGACTCAGGCATCTATGTCTGCGAAGGCGTGAATCTCATTGGGAAGAACAGGAAAGAGGTTGAGCTGATCGTGCAAGAAAAGCCCTTTACCGTTGAAATCTCCCCCGGCCCTAGAATCGCGGCTCAAATCGGCGACTCAGTCATGCTGACATGCAGCGTGATGGGCTGTGAGTCTCCTTCTTTCTCTTGGCGAACCCAAATTGACTCTCCCCTCAGCGGTAAGGTGAGGTCTGAGGGTACCAATTCCACACTCACACTGAGTCCAGTCTCATTTGAGAACGAACATTCCTATCTGTGCACTGTCACTTGTGGGCATAAAAAATTGGAGAAGGGTATTCAGGTTGAACTCTACAGCTTTCCACGCGACCCTGAGATCGAGATGTCAGGAGGTCTCGTTAACGGTTCCTCTGTCACTGTGTCATGCAAGGTGCCATCCGTGTATCCTCTTGACCGCCTGGAAATCGAACTTTTGAAGGGCGAAACGATTCTTGAGAACATTGAGTTCCTGGAAGATACCGACATGAAGTCATTGGAGAACAAATCCCTGGAAATGACTTTTATTCCCACCATTGAGGATACAGGAAAGGCCCTGGTCTGTCAGGCCAAACTTCATATCGATGACATGGAGTTCGAACCCAAGCAGAGGCAGTCCACCCAAACTTTGTATGTCAACGTGGCTCCAAGAGACACCACGGTACTGGTGAGCCCAAGTTCTATCCTCGAAGAGGGGAGCTCCGTCAACATGACTTGCCTCAGCCAGGGGTTCCCCGCTCCTAAGATCTTGTGGAGCAGGCAGCTGCCCAATGGAGAGCTCCAGCCTCTGTCCGAGAACGCCACTCTGACACTGATCTCCACCAAAATGGAGGACTCAGGTGTGTACCTTTGCGAGGGCATTAATCAGGCCGGACGATCTCGGAAAGAGGTAGAACTCATCATACAAGTCACACCTAAAGACATAAAATTGACCGCCTTTCCTTCCGAGTCCGTTAAAGAGGGGGACACTGTGATCATCTCTTGCACATGTGGCAACGTTCCAGAAACCTGGATCATCCTGAAGAAGAAGGCCGAGACTGGTGACACAGTGCTGAAGAGTATTGATGGGGCTTACACCATCAGGAAAGCTCAGCTGAAAGACGCCGGAGTCTATGAGTGCGAGAGTAAGAATAAGGTTGGGTCACAACTGAGGTCACTCACGCTGGACGTCCAGGGGCGCGAAAACAACAAAGATTATTTCTCACCCGAGTTGCTGGTGCTGTACTTCGCTAGCAGTTTGATCATACCTGCCATTGGCATGATCATCTATTTCGCCAGGAAAGCCAACATGAAGGGCTCATATTCCCTTGTGGAGGCTCAGAAATCCAAAGTC
具体各部分序列如下：
L(leader)为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合；优选为CD8α信号肽，其氨基酸序列（SEQ ID NO:40）为：MALPVTALLLPLALLLHAARP。
H(Hinge)为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合；优选为CD8α铰链区，其氨基酸序列（SEQ ID NO:42）为：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD。
TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154；优选为CD8α跨膜区，其氨基酸序列（SEQ ID NO:44）为：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC。
C为选自下组的共刺激域：CCD28、4-1BB、GITR、ICOS-1、CD27、OX-40、DAP10；优选为4-1BB，其氨基酸序列（SEQ ID NO:46）为：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL。
CD3ζ信号传导域的氨基酸序列（SEQ ID NO:48）为：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
2A linker为2A肽，其氨基酸序列包括但不限于以下几种：
P2A (e.g., sequence: ATNFSLLKQAGDVEENPGP)、
E2A (e.g., sequence: QCTNYALLKLAGDVESNPGP)、
F2A (e g., sequence: VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP)、
T2A (e g., sequence :EGRGSLLTCGDVEENPGP)。
实施例2：构建的嵌合抗原受体表达载体
（1）根据CAR基因的蛋白理论序列，优化CAR基因，使其能够在人细胞中高效表达，通过密码子优化及全基因合成方法制备CAR基因，进行全基因合成；
（2）用EcoRI和BamHI双酶切全基因合成的CAR基因和空载体pCDH-EF1-MCS,于37℃水浴中酶切30min后，使用1.5%的琼脂糖凝胶进行DNA电泳，然后使用天根的琼脂糖凝胶试剂盒纯化回收处理；
（3）pCDH-EF1-MCS载体与CAR基因片段的连接，连接体系如表1所示：
表1 pCDH-EF1-MCS载体与CAR基因片段的连接体系表
组件 添加量（μl）
pCDH-EF1-MCS载体 2（50ng）
CAR基因 10（150ng）
T4 DNA 连接缓冲液 2
T4 DNA 连接酶（NEB） 1
dd H2O 5
总共 20
于22℃连接1h，连接产物直接转化Stbl3大肠杆菌感受态细胞，取200μl转化产物涂布氨苄抗性的LB平板，LB平板于37℃的培养箱中倒置培养过夜。次日早晨随机挑选3个单克隆进行菌落PCR鉴定，将阳性克隆送样测序。
实施例3：慢病毒包装
分别对实施例中的慢病毒表达载体进行慢病毒包装，采用四质粒系统，具体步骤如下：
（1）四质粒系统分别表达慢病毒载体包装所需的gag/pol、Rev、VSV-G及本发明构建的CAR表达载体：将四质粒进行瞬时转染293T细胞，DNA含量为2μg/mL；
（2）将上述质粒与PEI转染试剂混合，加入至一定体积的无血清的DMEM中，混匀后放置15分钟，将上述混合液加入至铺有293T细胞的T75培养瓶中，轻轻混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱培养6h；
（3）6h后更换新鲜培养基，继续进行培养，并且加入10mM的丁酸钠溶液，72小时后收集慢病毒的培养上清进行纯化检测。
实施例4：慢病毒感染T细胞
分离PBMC后，用含50ng/mL的OKT3，300IU/ml的IL-2的X-VIVO进行激活，2日后将培养基更换成含300IU/mL的X-VIVO进行扩大培养；利用RetroNectin提高慢病毒对T细胞的感染效率，将30μg的RetroNectin，包被于6孔板内，放于37℃细胞培养箱2h；吸取RetroNectin，利用含2.5％BSA的Hank’s溶液封闭包被后的6孔板，放于37℃细胞培养箱0.5h；吸取封闭液，利用含2％Hepes的Hank’s溶液洗涤6孔板，加入X-VIVO培养基，加入适量的慢病毒溶液，2000×g，离心2h；弃上清，加入1×106的激活后的PBMC细胞，1000×g，离心10min，于37℃、5％CO2和一定湿度的细胞培养箱内培养。每两天进行一次计数并更换含300IU/mL的X-VIVO，并且将细胞浓度维持0.5×106-1×106/mL，连续培养8天。用CountstarIC1000 自动细胞计数仪计数，评估CAR-T细胞的扩增情况。结果发现，各CAR-T组扩增良好，未转导T细胞、VCAM1-T细胞、CDH17 CAR-T和CDH17-VCAM1 CAR-T细胞在培养10天后分别扩增41.00、56.65、68.50和70.50倍，见图3所示。
实施例5：CAR的表达及其功能评估
采用流式细胞仪检测CAR-T细胞表面CAR分子的表达及其与对应抗原蛋白的结合能力，利用APC-anti-CD3抗体标记T细胞群，然后用CDH17蛋白（ACRO Biosystems公司；货号CA7-H5258）检测CAR表达阳性率。结果显示：未转导T细胞、VCAM1-T细胞、CDH17 CAR-T和CDH17-VCAM1 CAR-T细胞的CAR表达率分别为3.3%、5.0%、84.36%和81.27%（相比未转导T细胞，***P≤0.001，见图4所示），表明CAR-T能有效识别CDH17抗原。
另外，未转导T细胞不表达嵌合受体，VCAM1-T细胞只表达VCAM1。未转导T细胞、VCAM1-T细胞、CDH17 CAR-T和CDH17-VCAM1 CAR-T细胞的VCAM1表达率分别为15.34%、72.69%、16.89%和78.36%，见图5所示。
实施例6：Transwell评估CAR-T的迁移能力
使用Transwell评估CAR-T细胞的迁移能力的具体步骤如下：
（1）在24孔板中每孔接种8×10E4个细胞，常规条件培养24小时；
（2）弃培养基，用PBS洗涤细胞2次，用消化液消化细胞，继而用无血清培养液重悬细胞，计数，将细胞密度调为30万/ml；
（3）将transwell培养小室放入24孔板中，共分2组，每组3个复孔，一组在小室下层分别加600μl无血清培养基、另一组加600μl含10%胎牛血清的培养液，小室内则加入100μl含3× 10E4个细胞的单细胞悬液，常规培养12小时；
（4）取出transwell小室，用甲醇固定15分钟，0.1%结晶紫染色20分钟，用棉签小心擦去微孔膜上层细胞，PBS清洗两次；
（5）细胞计数：在荧光显微镜下给微孔膜下层细胞拍照，每孔拍9个视野，计数。
培养一段时间以后，一部分细胞穿过transwel小室，迁移到孔膜下层，在荧光显微镜下可看到蓝紫色的细胞。通过以上步骤，可以评估CAR-T细胞的迁移能力。
结果显示：相比未转导T细胞和CDH17 CAR-T细胞，共表达VCAM1分子的VCAM1-T细胞和CDH17-VCAM1 CAR-T细胞的迁移能力明显提升，见图6所示。
实施例7：CAR-T功能评估
肿瘤细胞杀伤效率由基于荧光素酶的细胞杀伤检测方法(Luciferase-basedcytotoxicity assay)进行评估。用过表达CDH17和荧光素酶基因的人结肠癌细胞SW480（SW480-CDH17-Luc）作为靶细胞，进行杀伤试验。
首先，将1×104个SW480-CDH17-Luc接种于96孔平底黑板上，每孔100μL培养基，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养18～20小时。第二天，以效应细胞：靶细胞＝1:1的比例加入嵌合受体修饰T细胞至含有靶细胞的孔中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中继续培养6小时，共培养结束后使用微孔板发光检测仪检测靶细胞的荧光素酶活力值。细胞杀伤率的计算公式如下所示，细胞杀伤率(％)＝(未转导T细胞组荧光素酶活力值-实验组荧光素酶活力值)/未转导T细胞组荧光素酶活力值×100。
结果显示，CDH17 CAR-T细胞和CDH17-VCAM1 CAR-T细胞都能杀伤SW480-CDH17-Luc，杀伤率分别为29.00%和52.00%。共表达血管内皮黏附分子VCAM1的CAR-T细胞（CDH17-VCAM1 CAR-T）比经典CAR-T（CDH17 CAR-T）的杀伤能力显著提高（*P≤0.05），见图7所示。
综上所述，共表达血管内皮黏附分子VCAM1的CAR-T细胞（CDH17-VCAM1 CAR-T）能特异性识别CDH17抗原；相比经典的CAR-T（anti-CDH17 CAR-T），CDH17-VCAM1 CAR-T的迁移能力更强，杀伤力显著提升。本发明提供的共表达血管内皮黏附分子VCAM1的CAR-T细胞在实体瘤的治疗中具有极大的临床转化价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种协同表达血管内皮黏附分子VCAM1的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体中包含的SEQ ID No:1所示的氨基酸序列与SEQ ID No:2所示的氨基酸序列之间使用可剪接的2Alinker相连。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体的结构如下I式所示：
L-CDH17 scFv-H-TM-C-CD3ζ-2A-VCAM1(I)
式中，
各“-”为连接肽或肽键；L为信号肽序列；CDH17 scFv为针对CDH17肿瘤抗原的抗体，所述CDH17 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；H为铰链区序列；TM为跨膜区序列；C为共刺激域序列；CD3ζ为信号传导域序列。
4.一种核酸分子，其特在在于，其编码权利要求1所述的嵌合抗原受体。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子包括有SEQ ID No:5所示的核苷酸序列和SEQ ID No:6所示的核苷酸序列。
6.一种载体，其特征在于，所述的载体包括有权利要求5所述的核酸分子。
7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于，所述的载体选自DNA、RNA中的一种或两种组合。
8.一种细胞，其特征在于，所述的细胞包括有权利要求6所述的载体、或染色体中整合有外源的权利要求4所述的核酸分子、或表达权利要求1所述的嵌合抗原受体。
9.根据权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述细胞为T细胞。
10.一种制备协同表达血管内皮黏附分子VCAM1的CAR-T细胞的方法，其特征在于，将血管内皮黏附分子VCAM1与抗CDH17的CAR分子构建到同一个慢病毒载体上，并使用可剪接的2A linker使两者相连，然后将该慢病毒载体转染到T细胞中；所述的CAR-T细胞中包含的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。
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