CN117143823A - 一种基于tcr单链可变区的靶向ras(g12v)的嵌合抗原受体记忆nk细胞的研制及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于TCR单链可变区的靶向肿瘤新抗原RAS(G12V)的嵌合抗原受体记忆NK细胞的研制及其应用。所述的嵌合抗原受体包括单链TCR的可变区、铰链区、跨膜区、共刺激结构域、信号传导结构域，必要时，可串联分选标签。所述NK细胞为记忆NK细胞。所述TCR的可变区包括具有α链可变区的Vα片段和具有β链可变区的Vβ片段，所述Vα片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述Vβ片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明构建的嵌合抗原受体具有TCR的靶点优势，能够识别肿瘤新抗原。而NK细胞缺乏完整的CD3信号通路，通过CAR的信号通路，再与记忆NK细胞结合，可以有效性解决TCR‑T、CAR‑T、CAR‑NK、TCR‑NK的局限性。同时嵌合抗原受体记忆NK细胞能在体内持续存活，在抗原再次刺激时，能够产生更强大的杀伤作用，在防止肿瘤复发方面起到一定的作用。是一种靶点范围广、通用性强、安全、有效且低成本的细胞治疗产品。

Description

一种基于TCR单链可变区的靶向RAS(G12V)的嵌合抗原受体记 忆NK细胞的研制及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于TCR单链可变区的靶向肿瘤新抗原的嵌合抗原受体记忆NK细胞的研制及其应用

背景技术

实体肿瘤发病率更高、异质性强、致病机制和肿瘤微环境极其复杂。虽然CAR-T在实体肿瘤的临床研究风生水起，但是目前尚未取得突破性进展，在其众多技术瓶颈中，靶点的突破无疑是至关重要的。当前实体肿瘤的靶点主要基于肿瘤相关抗原的(TAA)的开发，这类靶点存在脱靶现象、肿瘤清除不彻底、因正常组织受损引起副作用和不良反应等问题。因此针对实体肿瘤的CAR-T需要通过肿瘤特异性靶点(TSA)的优化选择实现治疗上的突破。

传统CAR技术只能识别细胞膜蛋白，但实体肿瘤缺乏有效的膜蛋白。仅仅靠一个或几个膜蛋白靶点无法彻底解决实体肿瘤异质性难题，即靶点的缺失导致肿瘤的复发。T细胞抗原受体(TCR)的作用是识别抗原。理论上可以识别肿瘤细胞内所有多肽(蛋白)，其抗原识别范围远远广于CAR。肿瘤新抗原是一种来源于非同义突变的肿瘤特异性抗原，具有广泛性和特异性。随着个体化、多靶点的肿瘤新抗原(肿瘤特异性抗原，TSA)的发现，使得T细胞抗原受体(TCR)技术重新纳入研究人员视野。

相较于T细胞，NK细胞作为靶向杀伤载体在肿瘤治疗中更具有优势。除了获得与传统自体CAR-T治疗肿瘤相当的疗效外，还具有无免疫排斥、无严重CRS反应等特征，实现了临床治疗有效性、安全性、通用性，并且可以大大降低生产成本及制备风险。基于上述众多优势，目前嵌合抗原受体NK细胞技术正在逐步替代嵌合抗原受体T细胞技术。

由于NK细胞缺乏完整的CD3信号通路，因此TCR不能够直接“安装”于NK细胞载体中，为了解决上述难题，有文献报道将NK细胞进行CD3分子改造，即在“安装”TCR分子同时，“安装”CD3的四个亚基CD3ζ、CD3γ、CD3ε、CD3δ，但这种改造后的结构分子量大，不利于转导，且缺乏第二信号通路。也有文献报道通过对TCR进行改造，构建出sc-TCRVaVbCb突变体，将sc-TCRVaVbCb基因被连接到CD3-z上，诱导嵌合TCRab基因的异二聚和T细胞激活。虽然对TCR的a链进行了优化，但依然存在分子量大及第二信号通路问题。Chandran SS等人报道，将TCR的a链在其TM区域上被截断，在其恒定域上添加了半胱氨酸，并且两个链通过2A肽序列连接。CD28作为跨膜区(TM)，并连接了CD3和CD28作为第二刺激信号。虽然解决了第二信号通路问题，但分子量依然很大，不利于转导的问题没有解决。

肿瘤复发仍然是细胞治疗面临的一个难点。NK细胞在细胞因子或在病毒感染的情况下能产生记忆样特性，在抗原再次刺激时能产生更强烈的抗肿瘤效应，在肿瘤复发方面具有一定的优势。

发明内容

发明目的：针对上述技术问题，本专利技术通过对TCR的两条肽链进行改造，只保留α、β两条肽链的可变区(V区)，然后借鉴CAR的结构构建了嵌合抗原受体记忆NK细胞，解决了CAR-T细胞的靶点识别问题及TCR的信号传导通路问题，具有多靶点识别和信号传导的双重特性，抗原识别区只保留了α、β两条肽链的可变区，分子量大大缩小，不仅能够识别HLA递呈的抗原多肽，还有利于转导。将本专利中构建的嵌合抗原制备成脐血来源的嵌合抗原受体记忆NK细胞，能在体内持续存活，在抗原再次刺激时，能够产生更强大的杀伤作用，在防止肿瘤复发方面起到一定的作用，是一种靶点范围广、通用性强、安全、有效且低成本的细胞治疗产品。

技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种基于TCR单链可变区的靶向RAS(G12V)的嵌合抗原受体记忆NK细胞的研制及其应用。其特征在于所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域，铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域、信号传导结构域和/或分选标签。所述NK细胞为记忆NK细胞。

所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域为TCR单链抗体的可变区。所述TCR单链抗体的可变区包括具有α链可变区的Vα片段和β链可变区的Vβ片段，所述Vα片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1

(GEQVEQRPPHLSVREGDSAVITCTYTDPNSYYFFWYKQEPGASLQLLMKVFSSTEINEGQGFTVLLNKKDKRLSLNLTAAHPGDSAAYFCAVSGGTNSAGNKLTFGIGTRVLVRP)所示，所述Vβ片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

(ETAVFQTPNYHVTQVGNEVSFNCKQTLGHDTMYWYKQDSKKLLKIMFSYNNKQLIVNETVPRRFSPQSSDKAHLNLRIKSVEPEDSAVYLCASSRDWGPAEQFFGPGTRLTVLE)

所述α链可变区的Vα片段和β链可变区的Vβ片段是通过linker连接。其连接顺序为Vα-linker-Vβ或者Vβ-linker-Vα。所述linker的序列如SEQ ID NO：3(SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ)、SEQ ID NO：4(GGGGS)、SEQ ID NO：5(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)、SEQ ID NO：6(EAAAK)、SEQ ID NO：7(EAAAKEAAAKEAAAK)、SEQ IDNO：8(GSADDAKKDAAKKDGKS)、SEQ ID NO：9(SSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDA)；

优选的，所述linker为:SEQ ID NO：4(GGGGS)

所述的铰链区选自CD8α、CD28、CD4、CD5、CD134、CD137、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。

跨膜结构域选自CD3ζ、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD19、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、ICOS、CD134、CD137、CD154、NKG2D、2B4和DNAM1中的一种或多种的跨膜结构域。

所述共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自：CD27、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD30、CD40、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB、OX40、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、DAP10、DAP12、NKp44、NKG2D、NKp46，NKp30、TNFR家族(4-1BB、OX40和CD27)或SLAM相关受体家族(2B4)中的一种或多种。

优选地，所述铰链区为CD8α(CD8αSEQ ID NO：10)

ACCACCACCCCCGCCCCCCGCCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGCGCCCCGAGGCCTGCCGCCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCCGCGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGCGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACC。

所述跨膜结构域为NKG2D(SEQ ID NO：11)

CCATTTTTTTTCTGCTGCTTCATCGCTGTAGCCATGGGAATCCGTTTCATTATTATGGTAGCA。

所述胞内信号传导结构域选用CD3ζ结构域(SEQ ID NO：12)

CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACCAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGGTGA

优选的，所述胞内共刺激结构域选用4-1BB，(SEQ ID NO：13)

AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG

所述的NK细胞可以来自于健康成人脐带血提取的NK细胞、外周血提取的NK细胞、胚胎干细胞(ESC)及诱导多能干细胞(iPSC)产生的NK细胞。优选地，所述的NK细胞为脐带血提取的NK细胞。

所述嵌合抗原受体记忆NK细胞可由如下方法制备：

S1、取健康供者的脐带血分离出NK细胞，并在细胞因子刺激下被激活。

S2、激活后的NK细胞通过一定的方式除去激活物，并更换成新鲜的培养基。

S3、用带有嵌合抗原受体基因的慢病毒感染激活后的NK细胞。

S4、感染后的NK细胞在24小时后更换成新鲜的培养基。

S5、加入辐照的滋养层细胞继续培养。

S6、收获细胞。

所述的刺激NK细胞的激活物为IL2、IL12、IL15、IL18的混合物。优选地，所述激活物浓度为500U/ml的IL2、10ng/ml的IL12、15ng/ml的IL15、50ng/ml的IL18的混合物。

上述S2中所述的NK细胞被刺激16-36小时后，除去激活物，并更换成新鲜的培养基。优选的，NK细胞激活24小时后，300g、5min离心后，用PBS或者生理盐水洗2遍，更换成含IL15(200U)的新鲜KBM581或者X-VIVO15培养基，并加入5％-10％人AB血清。

上述S3中带有嵌合抗原受体CSR基因的慢病毒是通过四质粒悬浮细胞包装，且所用的包膜蛋白为BaEV、BaEVRT、BaEVRless、RD114、RDpro、VSVG、RabV、Cacal-G、MOKV、PRYV-G等，优选地，所选的包膜蛋白为BaEVRless(SEQ ID NO：14)

MGFTTKIIFLYNLVLVYAGFDDPRKAIELVQKRYGRPCDCSGGQVSEPPSDRVSQVTCSGKTAYLMPDQRWKCKSIPKDTSPSGPLQECPCNSYQSSVHSSCYTSYQQCRSGNKTYYTATLLKTQTGGTSDVQVLGSTNKLIQSPCNGIKGQSICWSTTAPIHVSDGGGPLDTTRIKSVQRKLEEIHKALYPELQYHPLAIPKVRDNLMVDAQTLNILNATYNLLLMSNTSLVDDCWLCLKLGPPTPLAIPNFLLSYVTRSSDNISCLIIPPLLVQPMQFSNSSCLFSPSYNSTEEIDLGHVAFSNCTSITNVTGPICAVNGSVFLCGNNMAYTYLPTNWTGLCVLATLLPDIDIIPGDEPVPIPAIDHFIYRPKRAIQFIPLLAGLGITAAFTTGATGLGVSVTQYTKLSNQLISDVQILSSTIQDLQDQVDSLAEVVLQNRRGLDLLTAEQGGICLALQEKCCFYVNKSGIVRDKIKTLQEELERRRKDLASNPLWTGLQGLLPYLLPFLGPLLTLLLLLTIGPCIFNRLTAFINDKLNIIHAM

上述S3中所述的转导是在NK细胞被激活后5-10天，优选地，NK细胞被激活后D5天转导。转导时需去除人AB血清并加入助染剂Vectofusin-1或者Ploybrene。优选地，所用助染剂为Vectofusin-1。

上述S5中所述的滋养层细胞为转导了IL21、41BB、CD64和CD86的经辐照的K562细胞。其中IL21的序列为SEQ ID NO:15所示；

MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS；

CD137的序列为SEQ ID NO:16所示：

ATGGGAAACAGCTGTTACAACATAGTAGCCACTCTGTTGCTGGTCCTCAACTTTGAGAGGACAAGATCATTGCAGGATCCTTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAATCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAGGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCACTCCAGGGTTTCACTGCCTGGGGGCAGGATGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAACTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAACGATCAGAAACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGTGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGATCATCTCCTTCTTTCTTGCGCTGACGTCGACTGCGTTGCTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCACGCTCCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGTGA

CD64的序列为SEQ ID NO:17所示

MWFLTTLLLWVPVDGQVDTTKAVITLQPPWVSVFQEETVTLHCEVLHLPGSSSTQWFLNGTATQTSTPSYRITSASVNDSGEYRCQRGLSGRSDPIQLEIHRGWLLLQVSSRVFTEGEPLALRCHAWKDKLVYNVLYY；

CD86的序列为SEQ ID NO:18所示；

MDPQCTMGLSNILFVMAFLLSGAAPLKIQAYFNETADLPCQFANSQNQSLSELVVFWQDQENLVLNEVYLGKEKFDSVHSKYMGRTSFDSDSWTLRLHNLQIKDKGLYQCIIHHKKPTGMIRIHQMNSELSVLANFSQPEIVPISNITENVYINLTCSSIHGYPEPKKMSVLLRTKNSTIEYDGVMQKSQDNVTELYDVSISLSVSFPDVTSNMTIFCILETDKTRLLSSPFSIELEDPQPPPDHIPWITAVLPTVIICVMVFCLILWKWKKKKRPRNSYKCGTNTWEREESEQTKKREKIHIPERSDEAQRVFKSSKTSSCDKSDTCF；同时还要添加IL12(500U)及5％人AB血清。

具体的，可按如下方法制备：

(1)加入浓度为500U/ml的IL2、10ng/ml的IL12、15ng/ml的IL15、50ng/ml的IL18的混合物刺激NK细胞；

(2)15-20小时后，用PBS将上述激活物去除，更换成含IL15(200U)的新鲜KBM581或者X-VIVO15培养基，并加入5％-10％人AB血清；

(3)被激活后4-6天，用HLA-A*1101和RAS(G12V)质粒包装的慢病毒转导NK细胞；转导时需去除人AB血清并加入助染剂Vectofusin-1；转导后24小时换成新鲜的含IL12(500U)、5％人AB血清的X-VIVO15培养基继续培养；每隔1-2天进行补液，培养14天，获得嵌合抗原受体记忆NK细胞。

本发明所提供的一种基于TCR单链可变区的靶向肿瘤新抗原RAS(G12V)的嵌合抗原受体NK细胞的研制，其中基于TCR单链可变区的单链抗体适用于所有肿瘤新抗原。在细胞方面，还使用于除NK细胞外的其他免疫细胞，如T细胞、γδT细胞、NKT细胞等

本发明提供一种嵌合抗原受体记忆NK的制备方法及在防止肿瘤复发中的应用。

鉴于现有技术存在的问题，本发明参考TCR在结构上与抗体分子高度相似(TCR有两条链构成)的特点，借鉴单链抗体的结构，构建单链可变区TCR。此改造后单链可变区TCR仅含有α的可变区片段(Vα)和β的可变区片段(Vβ)，大大缩短了质粒的长度，有利于质粒的转导。同时借鉴CAR的分子结构，建立一种基于单链可变区TCR的新型嵌合抗原受体。此嵌合抗原受体既保留了TCR识别靶点的优势，能识别肿瘤特异性的抗原，同时拥有CAR的信号通路。本发明中的嵌合抗原受体细胞，可以为NK细胞、T细胞、γδT细胞、NKT细胞等免疫细胞，尤其适用于NK细胞。因为NK细胞的寿命短，毒性风险相对较低，且NK细胞来源广泛，如NK92细胞系、外周血单个核细胞(PBMCs)、脐带血(UCB)和诱导多能干细胞(iPSCs)等，可以提供一种“现成的”产品，消除了对困扰当前CAR-T细胞治疗的个性化和患者特异性产品的需求，且成本大大降低。为解决实体肿瘤的异质性和复杂性提供治疗策略。此专利方法中的嵌合抗原受体NK细胞是一款目前最理想的实体肿瘤细胞治疗产品，实现对肿瘤细胞的无死角杀伤，使广大肿瘤患者受益。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：

(1)借鉴单链抗体结构，构建仅含有TCR可变区的单链TCR，大大减小了单链的分子量，且保留了TCR识别靶点的优势，能识别肿瘤特异性的抗原。同时借鉴CAR分子结构，拥有CAR的信号通路，确保嵌合抗原受体的靶向性。

(2)NK细胞不受MHC识别的限制，异体来源NK细胞移植几乎不会诱发移植物抗宿主病(GVHD)，不会引起CRS，且分泌的PD-1水平较低，免疫抑制作用较小。同时，记忆NK细胞在抗原再次刺激时能产生更强烈的抗肿瘤效应，将TCR的优势应用于NK细胞。在肿瘤复发方面具有一定的优势。

(3)脐血NK来源广，成本低，具备通用型的特点，可作为“现货型”产品使用。

(4)嵌合抗原受体记忆NK不仅能够治疗肿瘤，在防止肿瘤复发方面在存在一定的作用。

附图说明

图1：嵌合抗原受体的结构示意图。

图2：嵌合抗原受体-NK细胞的感染效率及扩增倍数。

图3：嵌合抗原受体NK对肿瘤细胞的杀伤作用。

图4：IFNγ的表达量。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实例，进一步阐述本发明。

鉴于肿瘤新抗原RAS(G12V)在包括肺癌，结直肠癌和胰腺癌中高频突变及HLA-A*11:01在亚洲人群中的高频占比，我们选择HLA-A*11:01/RAS(G12V)作为靶点，并成功筛选出具有高亲和力的抗体，开发设计出嵌合抗原受体NK细胞。前期已经初步完成其功能和安全性验证，显示出较好的对表达HLA-A*01:01/RAS(G12V)靶点的肿瘤细胞的杀伤性以及安全性。本实施例选用HLA-A*01:01/RAS(G12V)的肿瘤细胞。但此实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。

实施例1嵌合抗原的序列选择

鉴于肿瘤新抗原RAS(G12V)在包括肺癌，结直肠癌和胰腺癌中高频突变及HLA-A*11:01在亚洲人群中的高频占比，我们选择HLA-A*11:01和RAS(G12V)作为靶点，筛选出具有高亲和力的抗体，经过不断的实验摸索，筛选出由Vα和Vβ片段组成的单链TCR。构建的嵌合抗原受体包括抗原识别结构域、铰链区、跨膜区、共刺激结构域、信号传导结构域、分选标签(图1)。其中抗原识别结构域识别由HLA-A*1101递呈RAS(G12V)突变多肽的TCR的α和β可变区的单链。Vα片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，Vβ片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。Vα片段与Vβ片段通过接头Linker连接；铰链区为CD8α，如SEQ ID NO：10所示；跨膜区为NKG2D，如SEQ ID NO：11所示，共刺激结构域选用4-1BB，如SEQ ID NO：12所示；胞内信号传导结构域选用CD3ζ结构域，如SEQ ID NO：13所示。

实施例2序列载体的构建

利用PCR技术将嵌合抗原受体的核苷酸序列扩增出来，然后将嵌合抗原受体序列克隆至载体中，挑选阳性克隆并测序，鉴定正确的质粒。扩大培养后，提取质粒，获得所需的质粒载体。

实施例3慢病毒的制备

(1)采用四质粒悬浮细胞体系包装慢病毒。

(2)在转染前24小时，将传3代以上的悬浮细胞调整密度达到3.5–5.5×10⁶viablecells/ml。24小时后将上述细胞直接用培养基稀释至3.5×10⁶viable cells/ml，过夜生长，活率应≥95％。

(3)将扩增后的细胞用新鲜培养基将细胞稀释至4.7×10⁶viable cells/ml的密度，然后加入Supplement，轻轻旋转摇瓶混匀。

(4)制备DNA/转染试剂复合物。

(5)将DNA/转染试剂复合物缓慢转移至摇瓶中，在此过程中轻轻旋转摇瓶。

(6)培养箱摇床培养。

(7)转染后5-6h，加入4％的转染增强剂

(8)转染后48-55h收病毒后，将收集到的上清培养基5000rpm、4℃离心10min，弃沉淀留上清，并将上清用0.45um的滤膜过滤。

(9)将上述病毒上清液加入到含有蔗糖溶液的离心管中，4℃，25，000rpm.(82，700g)离心2小时，使用超高速离心机进行病毒浓缩。

(10)弃上清，用不含钙和镁的PBS重悬沉淀，即得病毒悬液。分装后冻存于-80℃待用；

(11)利用QPCR检测病毒滴度，病毒滴度可达10的8次方。

实施例4嵌合抗原受体记忆NK细胞的制备

(1)脐带血来自健康供者，采用淋巴细胞分离术分离出PBMC。

(2)用NK细胞分离试剂盒分选出NK细胞。

(3)加入浓度为500U/ml的IL2、10ng/ml的IL12、15ng/ml的IL15、50ng/ml的IL18的混合物刺激NK细胞。

(4)18小时后，用PBS将上述激活物去除，更换成含IL15(200U)的新鲜KBM581或者X-VIVO15培养基，并加入5％-10％人AB血清。

(5)被激活后D5天，用HLA-A*1101和RAS(G12V)质粒包装的慢病毒转导NK细胞。转导时需去除人AB血清并加入助染剂Vectofusin-1。转导后24小时换成新鲜的含IL12(500U)、5％人AB血清的X-VIVO15培养基继续培养。

(6)每隔1-2天进行补液，培养14天，获得嵌合抗原受体记忆NK细胞。利用流式细胞术检测感染效率和嵌合抗原受体记忆NK细胞的扩增能力。

(7)同步用正常因子培养法制备CAR-NK细胞、嵌合抗原受体NK细胞。

结果显示，经体外扩增14天，嵌合抗原受体记忆NK扩增近400倍(图2A)。对照组CAR-NK细胞、嵌合抗原受体NK、嵌合抗原受体记忆NK的转导效率分别为18.54％、40.54％和52.18％(图2B)，嵌合抗原受体记忆NK的转导效率明显高于CAR-NK细胞组。

实施例5嵌合抗原受体记忆NK对体外肿瘤杀伤效果的评估

为了验证嵌合抗原受体记忆NK对表达HLA-A*1101和RAS(G12V)的靶细胞的杀伤能力。将嵌合抗原受体记忆NK细胞与表达HLA-A*1101和RAS(G12V)的靶细胞按照2:1、5:1、10:1效靶比共培养，24小时后，检测靶下拨的裂解情况及细胞因子的分泌情况。结果如图3A-C及图4所示，嵌合抗原受体记忆NK对过表达HLA-A*1101和RAS(G12V)的靶细胞具有较强的杀伤作用，且能分泌更多的IFNγ。。

以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (10)

1.一种基于TCR单链可变区的靶向RAS(G12V)的嵌合抗原受体记忆NK细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体记忆NK细胞可由如下方法制备：

S1、分离出NK细胞，并在细胞因子刺激下被激活；

S2、激活后的NK细胞通过一定的方式除去激活物，并更换成新鲜的培养基；

S3、用带有嵌合抗原受体基因的慢病毒感染激活后的NK细胞；

S4、感染后的NK细胞在24小时后更换成新鲜的培养基；

S5、加入辐照的滋养层细胞继续培养；

S6、收获细胞；

其中，所述嵌合抗原记忆NK细胞包含基于TCR单链可变区的靶向RAS-G12V的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜区、共刺激结构域、信号传导结构域，其中抗原结合结构域为TCR单链抗体的可变区，具有α链可变区的Vα片段和β链可变区的Vβ片段，所述Vα片段的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述Vβ片段的氨基酸序列如SEQID NO：2所示；所述NK细胞来自于健康成人脐带血提取的NK细胞、外周血提取的NK细胞、市售的胚胎干细胞或诱导多能干细胞产生的NK细胞。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体记忆NK细胞，其特征在于，所述α链可变区的Vα片段和β链可变区的Vβ片段是通过linker连接，其连接顺序为Vα-linker-Vβ或者Vβ-linker-Vα；所述嵌合抗原受体可选的包括分选标签。

3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体记忆NK细胞，其特征在于，所述铰链区选自CD8α、CD28、CD4、CD5、CD134、CD137、ICOS铰链区中的一种或多种的组合；跨膜区选自CD3ζ、CD4、CD5、CD8、CD8α、CD9、CD16、CD19、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、ICOS、CD134、CD137、CD154、NKG2D、2B4和DNAM1中的一种或多种的跨膜结构；所述共刺激信号传导区分子选自：CD27、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD30、CD40、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB、OX40、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、DAP10、DAP12、NKp44、NKG2D、NKp46，NKp30、TNFR家族或SLAM相关受体家族中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体记忆NK细胞，其特征在于，所述铰链区为CD8α，如SEQ ID NO：10所示；所述跨膜区为NKG2D，如SEQ ID NO：11所示；所述胞内信号传导结构域为CD3ζ结构域，如SEQ ID NO：12所示；所述胞内共刺激结构域为4-1BB，如SEQ ID NO：13所示。

5.根据权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体记忆NK细胞，其特征在于，S1中刺激NK细胞的细胞因子为IL2、IL12、IL15、IL18的混合物。

6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体记忆NK细胞，其特征在于，所述细胞因子浓度为500U/ml的IL2、10ng/ml的IL12、15ng/ml的IL15、50ng/ml的IL18的混合物。

7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体记忆NK细胞，其特征在于，S2中所述的NK细胞被刺激16-36小时后，除去激活物，并更换成新鲜的培养基。

8.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体记忆NK细胞，其特征在于，NK细胞激活24小时后，300g、5min离心后，用PBS或者生理盐水洗2遍，更换成含200U的IL15新鲜KBM581或者X-VIVO15培养基，并加入5％-10％人AB血清。

9.权利要求1-9任一项所述的嵌合抗原记忆NK细胞在制备防止实体癌复发的药物中的应用。

10.权利要求9所述的应用，所述实体癌为胰腺癌。