TWI454279B - 抗單純皰疹病毒抗體及其使用方法 - Google Patents

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Description

抗單純皰疹病毒抗體及其使用方法
本申請案主張2009年1月5日提出申請之美國專利申請案第12/348,550號之優先權，該案之全文以引用方式併入本文中。
單純皰疹病毒(HSV)係皰疹病毒家族中的一個成員，其引起人類感染。HSV感染視感染位點而定導致多種不同的醫學病症。口、臉、手及生殖器之感染通常不會引起嚴重的併發症。然而，眼、中樞神經系統及腦之感染可能危及生命。免疫系統發育不全或受抑制之患者(例如新生兒、移植接受者及HIV攜帶者)易於因HSV感染出現嚴重的併發症。
目前，多種方法皆可用來治療HSV感染，其包含抗病毒藥劑及疫苗。然而，業內仍需要研究預防或治療HSV感染之藥物。
本發明係基於在抑制HSV複製中呈現高效能之人類抗HSV抗體的確定。本發明抗體結合至HSV-1及HSV-2之糖蛋白D(gD)上的構形表位(conformational epitope)。
在一個態樣中，本發明提供與單純皰疹病毒-1(HSV-1)及單純皰疹病毒-2(HSV-2)之gD特異性結合之分離抗體(例如人類抗體)或多肽，其中抗體或多肽結合至糖蛋白D上之構形表位，且表位包括SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45中所示之胺基酸Y38、D215、P221及R222或gD上對應於SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45中所示之胺基酸Y38、D215、P221及R222之胺基酸。在某些實施例中，抗體與SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45中所示之胺基酸35-40及215-222或gD上對應於SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45中所示之胺基酸35-40及215-222之胺基酸結合或相互作用。
在另一態樣中，本發明特徵係與HSV之gD特異性結合之抗體(例如，與HSV-1及HSV-2之gD特異性結合之抗體)。該抗體含有(1)重鏈可變區(VH )及輕鏈可變區(VL )，其分別包含至少80%(例如，至少85%、90%、95%、99%、或100%中任一者)與單鏈抗體scFv E317之VH (SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1之胺基酸3-124)及VL (SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2之胺基酸1-108)一致的胺基酸序列，(2) VH 及VL ，其包含至少80%(例如，至少85%、90%、95%、99%、或100%中任一者)與單鏈抗體scFv E425之VH (SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3之胺基酸3-124)及VL (SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:4之胺基酸1-108)一致的胺基酸序列，或(3) VH 及VL ，其分別包含至少80%(例如，至少85%、90%、95%、99%、或100%中任一者)與單鏈抗體scFv Y571之VH (SEQ ID NO:41)及VL (SEQ ID NO:42)一致的胺基酸序列。在一個實例中，本發明抗HSV抗體含有scFv E317、scFv E425或scFv Y571之全部互補決定區(CDR)。
本發明之另一態樣係關於醫藥組合物，其包括本文所述抗體(包含其抗原結合片段)或多肽及醫藥上可接受之載劑。
本發明之另一態樣係關於分離核酸，其包括編碼本文所述抗體、抗體片段或區域之核苷酸序列。在某些實施例中，本發明提供編碼上述VH 及VL 區中任一者之核酸。在一個實例中，該核酸包含編碼SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:1之胺基酸3-124、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:2之胺基酸1-108、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:3之胺基酸3-124、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:4之胺基酸1-108、SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42之核苷酸序列。較佳地，核酸包含編碼SEQ ID NO:1及2二者、編碼SEQ ID NO:1之胺基酸3-124及SEQ ID NO:2之胺基酸1-108二者、編碼SEQ ID NOs:3及4二者、編碼SEQ ID NO:3之胺基酸3-124及SEQ ID NO:4之胺基酸1-108二者、或編碼SEQ ID NO:41及42二者之核苷酸序列。本發明亦提供包括一或多種本文所述核酸之載體(例如表現載體)或宿主細胞。
本發明亦提供產生抗體或其抗原結合片段之方法，其包括培養產生抗體或片段之本文所述宿主細胞及自細胞培養物回收抗體或片段。哺乳動物細胞(例如COS、HeLa及CHO細胞)及非哺乳動物細胞(包含原核生物(例如大腸桿菌(E. coli))及酵母)可作為宿主細胞用來產生抗體。
在又一態樣中，本發明特徵係治療或預防HSV感染之方法，其係藉由向有其需要之個體投與有效量的本發明抗體或其編碼核酸達成。抗體或核酸亦可用來製造用於治療HSV感染之藥劑。本文所用術語「治療」係指向感染HSV或有感染HSV之風險之個體施用或投與包含一或多種活性藥劑之組合物，其中目的係治癒、癒合、減輕、緩解、改變、補救、改善、改良或影響感染、感染之症狀或易於感染之素質。本文所用「有效量」係指將治療效果賦予個體所需之每一活性藥劑單獨或與一或多種其他活性藥劑組合之量。如彼等熟習此項技術者所瞭解，有效量視投與路徑、賦形劑選擇及與其他活性藥劑之共用而變化。抗體可在暴露於HSV(例如HSV-1或HSV-2)之前或之後投與。
在本發明範圍內亦係用上述抗HSV抗體診斷個體HSV感染之方法。該方法包含(a)使抗體與得自個體且懷疑含有HSV病毒粒子或蛋白之生物試樣接觸，及(b)測定抗原-抗體反應。若檢測到此反應則表明試樣中存在HSV。
本發明之一或多個實施例的細節闡述於下文說明中。根據以下若干個實施例之詳細說明且亦根據隨附申請專利範圍將明瞭本發明之其他特徵或優點。
本發明提供與HSV-1及HSV-2之糖蛋白D結合且中和HSV-1及HSV-2之抗體及多肽。該等抗體及多肽結合至gD上之非線性構形表位，其中表位包括SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45中所示之胺基酸D215、P221及R222，或gD上對應於SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45中所示之胺基酸D215、P221及R222之胺基酸。在某些實施例中，表位進一步包括胺基酸Y38或gD上對應於SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45中所示之Y38之胺基酸。在某些實施例中，抗體與SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45中所示之胺基酸35-40及215-222或gD上對應於SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45中所示之胺基酸35-40及215-222之胺基酸結合或相互作用。
據信，一般而言HSV進入細胞中需要gD與若干個潛在進入受體中之一者相互作用：(a)皰疹病毒進入介體(HVEM)，即TNF受體家族中的一個成員；(b)結合素-1，即免疫球蛋白超家族中的一個成員；及(c) 3-O-硫酸化的硫酸類肝素。參見Reske等人之Rev. Med. Virol. 17:205-215,2007。HSV-1 gD係由369個胺基酸組成之I型膜糖蛋白，其中N-末端胞外結構域內具有316個胺基酸。該蛋白之胞外結構域核心係具有免疫球蛋白摺疊之V樣結構域(殘基56-184)。在核心之N-末端延長部分內，37個殘基髮夾結構(在殘基21處彎曲)形成整個接觸受體HVEM之位點。HVEM不存在時，N-末端採用伸展及撓性構象。不希望受限於理論，本文所述抗體可結合至gD中在形成gD之髮夾結構時與N-末端序列相互作用之胺基酸，且抗體與gD之結合可阻止形成髮夾結構。已證實，特異性結合此gD部分之抗體在活體外及活體內抑制HSV複製時呈現高效能。
本文所述抗體或多肽可具有下列特徵中之一或多者：(a)與HSV-1及HSV-2之gD特異性結合；(b)結合至gD之非線性構形表位；(c)結合至包含下列之表位:至少SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45中所示之胺基酸D215、P221及R222或gD上對應於SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45中所示之胺基酸殘基D215、P221及R222之胺基酸；(d)結合至包含下列之表位：SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45中所示之胺基酸Y38、D215、P221及R222或gD上對應於SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45中所示之胺基酸殘基Y38、D215、P221及R222之胺基酸；(e)與SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45中所示之胺基酸35-40及215-222或gD上對應於SEQ ID NO:44或SEQ ID NO:45中所示之胺基酸35-40及215-222之胺基酸結合或相互作用；(f)抗體或多肽與gD之結合依賴於二硫鍵；(g)若SEQ ID NO:44或45中所示之胺基酸224-240或gD上對應於SEQ ID NO:44或45中所示之胺基酸之胺基酸缺失，則不結合gD；(h)若SEQ ID NO:44或45中所示之胺基酸27-43或gD上對應於SEQ ID NO:44或45中所示之胺基酸27-43之胺基酸缺失，則不與gD結合；(i)在蝕斑減少分析中抑制HSV-1及/或HSV-2複製時IC50 介於約1 nM至約10 nM之間；及(j)預防或治療個體HSV感染。
來自KOS(HSV-1菌株)(SEQ ID NO:44)之gD及來自HG52(HSV-2菌株)(SEQ ID NO:45)之gD之胺基酸序列的比對示於下文：
術語「抗體」意指包含完整天然存在之抗體及其片段(例如，Fab及F(ab')2 )及遺傳上經修飾之抗體(例如，scFv抗體、嵌合抗體、雙特異抗體及雙重可變結構域免疫球蛋白)。在某些實施例中，抗體係人類抗體。在某些實施例中，抗體係人類化抗體。
「分離」分子或材料(例如，抗體及核酸)係已經鑒定且自天然環境之組份中分離及/或回收者。在某些實施例中，該分子或材料經純化。舉例而言，該材料可係至少90%純(即，不含污染物)、至少95%純或至少99%純。
除非上下文另外明確指出，否則本文及隨附申請專利範圍中所用單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包含複數個指示物。應瞭解，本文所述之本發明態樣及變化形式包含由態樣及變化形式「組成」及/或「基本上由其組成」。
本文亦揭示人類抗體(例如E317、E425及Y571)，其與單純皰疹病毒1(HSV-1)及單純皰疹病毒2(HSV-2)二者結合，具體而言與其糖蛋白D特異性結合。
E317抗體含有VH 片段，該片段或該片段之一部分具有SEQ ID NO:1之殘基3-124中所示之胺基酸序列；及VL 片段，該片段或該片段之一部分具有SEQ ID NO:2之殘基1-108中所示之胺基酸序列。該兩個胺基酸序列示於下文：
E317 V H 片段(SEQ ID NO:1)之胺基酸序列
[*上文序列中之下劃線區係指互補決定區(CDR)]。
E317 V L 片段(SEQ ID NO:2)之胺基酸序列
[*上文序列中之下劃線區係指CDR。]
E425抗體含有VH 片段，該片段或該片段之一部分具有SEQ ID NO:3之殘基3-124中所示之胺基酸序列；及VL 片段，該片段或該片段之一部分具有SEQ ID NO:4之殘基1-108中所示之胺基酸序列。兩序列示於下文：
E425 V H 片段(SEQ ID NO:3)之胺基酸序列
[*上文序列中之下劃線區係指CDR。]
E425 V L 片段(SEQ ID NO:4)之胺基酸序列
[*上文序列中之下劃線區係指CDR。]
Y571抗體含有VH 片段，該片段或該片段之一部分具有SEQ ID NO:41之胺基酸序列；及VL 片段，該片段或該片段之一部分具有SEQ ID NO:42之胺基酸序列。兩序列示於下文：
Y571 V H 片段(SEQ ID NO:41)之胺基酸序列
[*上文序列中之下劃線區係指CDR。]
Y571 V L 片段(SEQ ID NO:42)之胺基酸序列
[*上文序列中之下劃線區係指CDR。]
本發明亦提供與抗體scFv E317、scFv E425及/或scFv Y571競爭結合HSV-1及/或HSV-2之gD之抗體及多肽。若升高濃度之一種抗體或多肽之存在顯著抑制第二種抗體或多肽與gD之結合，則認為一種抗體或多肽與另一種抗體或多肽競爭。舉例而言，抑制可為至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。在某些實施例中，抗體及多肽能以實質上相等之效力中和HSV-1及HSV-2。可在活體外或活體內測量效力。舉例而言，在實例3所述之蝕斑分析中抗體或多肽可具有約1 nM至約10 nM(例如約1 nM至約6 nM、或約1 nM至約5 nM)之IC5 0。
本文亦揭示E317、E425及Y571抗體之功能等效物。此一功能等效物係如下之抗體：與HSV糖蛋白D特異性結合；且具有VH 片段，該片段或該片段之一部分係至少70%(例如，75%)與SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:41一致；及VL 片段，該片段或該片段之一部分係至少70%(例如，75%)與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:42一致。
本文所用兩胺基酸序列之「同源性百分比」係使用Karlin及Altschul,Proc,Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268,1990中所述算法來測定，該算法如Karlin及Altschul,Proc,Natl. Acad. Sci. USA 5873-5877,1993中所述經修正。此一算法納入Altschul等人之J. Mol. Biol . 215:403-410,1990之NBLAST及XBLAST程式中。用XBLAST程式(評分=50、字長=3)實施BLAST蛋白搜索以得到與參照多肽同源的胺基酸序列。出於比較目的，使用如Altschul等人之Nucleic Acids Res . 25:3389-3402,1997中所述之Gapped BLAST得到缺口比對。當使用BLAST及Gapped BLAST程式時，使用各個程式(例如，XBLAST及NBLAST)之缺省參數。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。
本發明抗體可僅含有上述E317、E425或Y571之VH 及VL 片段。其可係單鏈抗體(scFv)，其中VH 與VL 片段係直接連接或經由連接體(例如，肽連接體)連接。在一個實例中，抗體係scFv E317，其胺基酸序列示於下文：
ScFv E317(SEQ ID NO:5)之胺基酸序列
(*下劃線區係指連接VH 與VL 片段之肽連接體)
在另一實例中，抗體係scFv E425，其具有下文所示SEQ ID NO:6之胺基酸：
ScFv E425(SEQ ID NO:6)之胺基酸序列
(*下劃線區係指連接VH 與VI 片段之肽連接體)
在另一實例中，抗體係scFv Y571，其具有下文所示SEQ ID NO:43之胺基酸：
ScFv Y571(SEQ ID NO:43)之胺基酸序列
(*下劃線區係指連接VH 與VI 片段之肽連接體)
本發明亦提供包括下列之抗體或多肽：重鏈可變區，其包括三個來自SEQ ID NO:1之CDR；及/或輕鏈可變區，其包括三個來自SEQ ID NO:2之CDR。本發明亦提供包括下列之抗體或多肽：重鏈可變區，其包括SEQ ID NO:1中所示之胺基酸殘基3-124；及/或輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:2中所示之胺基酸殘基1-108。本發明亦提供包括下列之抗體或多肽：重鏈可變區，其包括三個來自SEQ ID NO:3之CDR；及/或輕鏈可變區，其包括三個來自SEQ ID NO:4之CDR。本發明亦提供包括下列之抗體或多肽：重鏈可變區，其包括SEQ ID NO:3中所示之胺基酸殘基3-124；及/或輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:4中所示之胺基酸殘基1-108。本發明亦提供包括下列之抗體或多肽：重鏈可變區，其包括三個來自SEQ ID NO:41之CDR；及/或輕鏈可變區，其包括三個來自SEQ ID NO:42之CDR。本發明亦提供包括下列之抗體或多肽：重鏈可變區，其包括SEQ ID NO:41中所示之胺基酸序列；及/或輕鏈可變區，其包括SEQ ID NO:42中所示之胺基酸序列。本發明亦提供包括SEQ ID NO:5、6或43中所示之胺基酸序列之抗體或多肽。
本文所用「互補決定區」或「CDR」包含任一定義之CDR，例如Kabat CDR(Kabat等人之Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))、Chothia CDR(Chothia及Lesk之J. Mol. Biol. 196:901-917(1987))及組合CDR。在某些實施例中，CDR係縮短的CDR，其包含若干段CDR殘基，該等殘基包含全部特異性決定殘基(SDR)(Kashmiri等人之Methods 36:25-34,2005)。在某些實施例中，本發明提供包括全部來自抗體ScFv E317、ScFv E425或ScFv Y571之SDR之抗體。
本發明抗體亦可係整個免疫球蛋白分子，其中VH 及VL 片段各自連接至免疫球蛋白(例如人類IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgD、IgA1及IgA2)之重鏈恆定區及輕鏈恆定區。
本文所述抗體可藉由篩選抗體文庫(例如噬菌體展示文庫)產生並使用業內所習知及本文所述之方法確定具有期望結合特性之抗體。參見(例如)實例1-5。
上述抗體中之任一者皆可使用習用重組技術製備。舉例而言，抗體可在宿主細胞中藉由表現編碼抗體之核酸及自細胞培養物回收抗體而產生。舉例而言，E317、E425或Y571抗體可藉由在宿主細胞中自一或兩個含有編碼以下多肽之核苷酸序列之表現盒表現該等多肽來製備：藉由表現含有SEQ ID NO:1之殘基3-124、SEQ ID NO:3之殘基3-124、或SEQ ID NO:41之多肽來製備VH ，及/或藉由表現含有SEQ ID NO:2之殘基1-108、SEQ ID NO:4之殘基1-108、或SEQ ID NO:42之多肽來製備VL 。VH 及VL 片段可作為兩個單獨的多肽來製備且隨後再摺疊在一起以形成抗體。或者，兩片段係作為單一多肽之一部分產生。
E317、E425或Y571之功能等效物可藉由在其VH 及VL 片段中、較佳地在框架區(FR)中引入突變來產生。已熟知，抗體之CDR決定其抗原特異性。因而，在E317、E425或Y571之FR中，突變、尤其保守突變通常不會影響其與HSV之結合活性。如此製備之功能等效物的抗原特異性可使用業內所習知之方法(例如ELISA、免疫沉澱或西方墨點分析(Western-blot analysis))來證實。
本文所述抗體及其編碼核酸二者皆可用來治療需要此治療之人類個體之HSV感染或減少其HSV複製，該人類個體係(例如)感染HSV之患者或免疫系統變弱之患者(例如，具有感染先天性HSV之風險之嬰兒、孕婦、器官移植接受者、癌症患者、白血病患者及HIV攜帶者)。
為實施上述治療，可使本發明抗體或編碼核酸中之任一者懸浮於醫藥上可接受之載劑(例如，生理鹽水)中以形成醫藥組合物且經由習用路徑投與。醫藥組合物中所含之載劑必須係「可接受的」，此意指與組合物中之活性成份相容且較佳地能穩定活性成份且對欲治療之個體無害。醫藥組合物可經口或藉由靜脈輸注、或經皮下、肌內、鞘內、腹膜內、直腸內、陰道內、鼻內、胃內、氣管內或肺內注入或植入來投與。當使用編碼核酸時，其可經由活載體(例如沙門氏菌(Salmonella)、BCG、腺病毒、痘病毒或牛痘)遞送。
上述醫藥組合物可根據所欲投與路徑使用習用方法調配成各劑型。舉例而言，其可調配成膠囊、凝膠封或錠劑供口服。膠囊可含有任何標準醫藥上可接受之材料，例如明膠或纖維素。錠劑可根據習用程序藉由壓製組合物與固體載劑及潤滑劑之混合物調配。固體載劑之實例包括澱粉及糖膨潤土。膠囊或錠劑可進一步含有黏結劑(例如乳糖或甘露醇)、習用填充劑及製錠劑以形成硬殼膠囊或錠劑。
醫藥組合物亦可調配成非經腸劑型，其包括活性劑之水溶液，等滲鹽水或5%葡萄糖，或其他熟知之醫藥上可接受之賦形劑。可使用環糊精或熟習此項技術者所熟知之其他增溶劑作為遞送治療劑之醫藥賦形劑。
含有抗體或其編碼核酸之可注射組合物可含有多種載劑，例如植物油、二甲基乙醯胺、二甲基甲醯胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、乙醇及多元醇(甘油、丙二醇、液體聚乙二醇及諸如此類)。對於靜脈內注射而言，水溶性抗體可由滴注方法投與，藉此輸注含有抗體及生理上可接受之賦形劑之醫藥調配物。生理上可接受之賦形劑可包括例如5%右旋糖、0.9%鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)或其他適宜賦形劑。肌內製劑(例如抗體之適宜可溶鹽形式的滅菌調配物)可溶於醫藥賦形劑(例如注射用水、0.9%鹽水或5%葡萄糖溶液)中投與。
為有助於遞送，本發明抗體或其編碼核酸可與伴隨劑(chaperon agent)接合(conjugated)。本文所用「接合」意指兩實體相聯結，較佳以充分親和性，實現兩實體間相聯結之治療益處。接合包括共價或非共價結合以及其他聯結形式，例如一種實體陷入另一實體之上或之中，或任一種或兩種實體均陷入第三種實體(例如膠粒)之上或之中。
伴隨劑可為天然存在之物質，例如蛋白質(例如人類血清白蛋白、低密度脂蛋白、或球蛋白)、碳水化合物(例如葡聚糖、普魯蘭糖(pullulan)、甲殼質、殼聚糖、菊糖、環糊精或透明質酸)或脂質。其亦可係重組或合成分子，例如合成聚合物，例如合成聚胺基酸。聚胺基酸之實例包含聚離胺酸(PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物及聚膦嗪(polyphosphazine)。
在一個實例中，伴隨劑係膠粒、脂質體、奈米粒子或微球，其中寡核苷酸經囊封。用來製備此膠粒、脂質體、奈米粒子或微球之方法在業內已熟知。參見(例如)美國專利第5,108,921號、第5,354,844號、第5,416,016號及第5,527,5285號。
在另一實例中，伴隨劑作為一或多種融合劑或縮合劑之連接基質。
融合劑對局部pH有反應。舉例而言，在遇到核內體內的pH後，融合劑可引起核內體直接環境之物理變化，例如滲透特性之變化，其破壞核內體膜或增大核內體膜之通透性，從而有助於將抗體或核酸釋放至宿主細胞的細胞質中。較佳之融合劑改變電荷，例如在低於生理範圍之pH下(例如，在pH 4.5-6.5下)發生質子化。融合劑可係含有在暴露於特定pH範圍時能進行電荷變化(例如，質子化)之胺基之分子。此等融合劑包含具有聚胺基鏈之聚合物(例如，聚乙烯亞胺)及膜破壞劑(例如，蜂毒肽(mellittin))。其他實例包含聚組胺酸、聚咪唑、聚吡啶、聚丙烯亞胺及聚縮醛物質(例如，陽離子聚縮醛)。
縮合劑與抗體/核酸相互作用，此促使其縮合(例如，減小寡核苷酸之尺寸)，從而對其進行保護以免降解。較佳地，縮合劑包含經由(例如)離子相互作用與寡核苷酸相互作用之部分(例如，帶電荷之部分)。縮合劑之實例包含聚離胺酸、精胺、精脒、聚胺或其四級鹽、假肽-聚胺、擬肽聚胺、樹枝狀聚胺、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉及α螺旋肽。
本發明方法中所需之抗體或編碼核酸之劑量取決於投與路徑之選擇；調配物性質；個體之疾病性質；個體之大小、體重、表面積、年齡及性別；所投與之其他藥物；及主治醫師之判斷。適宜劑量係在0.01-100.0毫克/公斤之範圍內。預期所需劑量可隨所用組合物之不同及各種投與路徑之不同效能而發生較大變化。舉例而言，預期口服投與所需劑量高於靜脈內注射投與。該等劑量量之變化可使用標準經驗慣例來調節以便優化，此在業內已熟知。組合物於適宜遞送媒劑(例如，聚合微粒或可植入裝置)中之囊封可增大遞送效率、尤其經口遞送效率。
本發明抗體用來治療HSV感染之效能可在活體外及活體內評價。簡言之，可在活體外測試抗體抑制病毒蛋白產生或病毒複製之能力。對於活體內研究而言，可將抗體注射至動物(例如，小鼠模型)內且隨後獲得其治療效果。基於該等結果，可確定適當的劑量範圍及投與路徑。
在本發明範圍內，亦係用本發明抗體診斷人類個體HSV感染之方法。在該方法中，測試試樣(例如，血樣或口或生殖組織試樣)係得自懷疑患有HSV感染之人類個體且隨後使用本發明抗體經由適合檢測抗體-抗原反應之免疫分析來檢驗HSV病毒蛋白之存在。舉例而言，可使測試試樣與如本文所述之抗HSV抗體在適合形成抗體-抗原複合物之條件下一起培育且複合物(若形成)係藉由習用免疫分析(例如，ELISA、免疫沉澱及免疫組織化學)檢測。
本發明亦提供包括本文所述之抗體或抗原-結合片段之套組。在某些實施例中，該等套組包括一或多個包括本文所述抗體或片段之容器及根據本文所述之本發明之任一方法使用的說明。在某些實施例中，該等說明包括投與抗體或片段以預防或治療個體HSV感染之闡述。在某些實施例中，該等說明包括使用抗體或片段用來檢測試樣中存在HSV之闡述。
無需進一步闡釋，據信熟習此項技術者可基於上文闡述最大程度地應用本發明。因此，以下具體實施例僅應理解為闡釋之目的，且無論如何不應理解為以任何方式限制其餘揭示內容。本文所引用之所有公開案之全文皆以引用方式併入本文中。
實例1：人類抗HSV之scFv抗體自混合噬菌體scFv文庫之分離
scFv噬菌體展示文庫係使用自50個健康亞洲成年人分離之RNA按照Clackson等人之Nature ,352:624-628(1991)中所述之程序產生。簡言之，mRNA係自50個健康亞洲成年人分離之B淋巴細胞純化。對應於免疫球蛋白之VH 結構域的cDNA係自該等mRNA經由RT-PCR使用以下引物來擴增：
V H 反向：
HuVH1abacksfi:5'-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGSARTCTGG-3'(SEQ ID NO:7)
HuVH2abacksfi:5'-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG-3'(SEQ ID NO:8)
HuVH3abacksfi:5'-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGKTGGAGWCY-3'(SEQ ID NO:9)HuVH4abacksfi:5'-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCSG-3'(SEQ ID NO:10)
HuVH5abacksfi:5'-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC-3'(SEQ ID NO:11)
HuVH6abacksfi:5'-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCA-3'(SEQ ID NO:12)HuVH14abacksfi:5'-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTCACCTTGAAGGAGTCTG-3'(SEQ ID NO:13)
HuVH16abacksfi:5'-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGG-3'(SEQ ID NO:14)
J H 正向:
HuJH1-2正向：5'-TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3'(SEQ ID NO:15)
HuJH3正向:5'-TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC-3'(SEQ ID NO:16)
HuJH4-5正向:5'-TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC-3'(SEQ ID NO:17)
HuJH6正向：5'-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC-3'(SEQ ID NO:18)
對應於免疫球蛋白之VL 結構域的cDNA係使用下文所示引物來擴增。
V K 反向：
HuVK1a反向：5'-GACATCCAGATGACCCAGTCTCC-3'(SEQ ID NO:19)
HuVK2a反向：5'-GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC-3'(SEQ ID NO:20)
HuVK3a反向：5'-GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC-3'(SEQ ID NO:21)
HuVK4a反向：5'-GACATCGTGATGACCCAGTCTCC-3'(SEQ ID NO:22)
HuVK5a反向：5'-GAAACGACACTCACGCAGTCTCC-3'(SEQ ID NO:23)
HuVK6a反向：5'-GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC-3'(SEQ ID NO:24)
J K for Not：
HuJK1forNot：5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC-3'(SEQ ID NO:25)
HuJK2forNot：5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3'(SEQ ID NO:26)
HuJK3forNot：5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC-3'(SEQ ID NO:27)
HuJK4forNot：5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC-3'(SEQ ID NO:28)
HuJK5forNot：5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC-3'(SEQ ID NO:29)
V λ 反向：
HuVL1反向：5'-CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC-3'(SEQ ID NO:30)
HuVL2反向：5'-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC-3'(SEQ ID NO:31)
HuVL3a反向：5'-TCCTATGTGCTGACTCAGCCACC-3'(SEQ ID NO:32)
HuVL3b反向：5'-TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC-3'(SEQ ID NO:33)
HuVL4反向：5'-CACGTTATACTGACTCAACCGCC-3'(SEQ ID NO:34)
HuVL5反向：5'-CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC-3'(SEQ ID NO:35)
HuVL6反向：5'-AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA-3'(SEQ ID NO:36)
J λ f or Not：
HuJL1forNot：5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC-3'(SEQ ID NO:37)
HuJL2-3forNot：5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3'(SEQ ID NO:38)
HuJL4-5forNot：5'-GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAAAACGGTGAGCTGGGTCCC-3'(SEQ ID NO:39)
藉由PCR反應經由具有核苷酸序列5'-GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG-3'(SEQ ID NO:40)之連接體隨機連接VH cDNA與VL cDNA以形成編碼scFv抗體之片段。將該等片段選殖至pCANTAB 5E噬菌粒載體中以產生scFv噬菌體展示文庫。
使用自印度患者之B淋巴細胞、患有嚴重急性呼吸症候群之患者的B淋巴細胞及臺灣患者之脾細胞分離之mRNA按照上述程序來構建3個額外scFv噬菌體展示文庫。組合該3個文庫與上述文庫以形成混合scFv噬菌體展示文庫，其係用來篩選抗HCMV之scFv抗體。如下所述篩選噬菌體滴度為1×1013 pfu/ml之此混合文庫中表現HSV特異性scFv抗體之純系。
首先，藉由五輪生物淘選來富集展示抗HSV抗體之噬菌體，如下文所述。用稀釋於塗佈緩衝液(50 mM碳酸氫鈉，pH 9.6，5×105 /毫升)中之HSV-1病毒粒子塗佈免疫管且在4℃下過夜，用含有0.1% Tween之PBS洗滌3次，用含有2%脫脂乳之PBS封閉，且再次用含有0.1% Tween之PBS洗滌3次。將一等份混合噬菌體文庫稀釋於含2%脫脂乳之PBS中，並添加至經HSV-1塗佈之免疫管中。培育2小時後，免疫管用含0.1% Tween之PBS洗滌10次且隨後用PBS洗滌10次以去除未結合的噬菌體。使用100 mM三乙胺洗提結合噬菌體，用1 M Tris,pH7.4中和，且在37℃下使用其將TG1細菌感染30分鐘。隨後將經噬菌體感染之TG1細胞置於含有補充有安普西林(amplicillin)及葡萄糖之2x YT培養基(2YT/安普西林/葡萄糖培養基)之板上並在30℃下生長過夜。在板上添加補充有甘油之2YT/安普西林/葡萄糖培養基並使用玻璃塗佈器將TG1細胞分散至培養基中。將如此收集之TG1細胞接種至2YT/安普西林/葡萄糖培養基中並在37℃、250 rpm下培養直至TG1培養物之OD600 值達到0.5。與5×1010 pfu M13KO7輔助性噬菌體混合後，將TG1培養物在37℃下培育30分鐘並隨後在室溫及2,000×g下離心10分鐘。將如此形成之細胞沉澱物再懸浮於補充有安普西林及卡那黴素(kanamycin)之10毫升2x YT培養基中並在30℃、250 rpm下培育過夜。將培養物在10,000 g下於4℃下離心20分鐘以收集所得上清液。隨後將PEG/NaCl添加至上清液中。1小時後，對上清液實施離心以收集含有噬菌體粒子之沉澱物。使沉澱物再懸浮於PBS中並實施離心以去除殘餘細菌碎屑。將如此所收集之噬菌體粒子再次懸浮於PBS中以形成富集表現抗HSV抗體之純系之第1輪scFv噬菌體文庫。
根據上述程序使一等份此第1輪經富集文庫經受額外4輪生物淘選，以產生進一步富集表現抗HSV抗體之噬菌體純系的噬菌體文庫。根據下文所述之方法對此噬菌體文庫實施ELISA篩選，以確定表現抗HSV單鏈抗體之個別噬菌體純系。
將一等份噬菌體文庫稀釋且置於補充有安普西林及葡萄糖之2×YT培養基上並在37℃下培育過夜。挑選376個單一菌落並在補充有安普西林及葡萄糖之2×YT培養基中於37℃、250 rpm下單獨培育過夜。將如此所得之一等份各培養物接種至補充有安普西林及葡萄糖之新鮮2×YT培養基中且隨後與109 pfu M13KO7輔助性噬菌體混合。將混合物在37℃、250 rpm下培養1-2小時，且隨後在14,000 rpm下於室溫下離心5分鐘。將懸浮於補充有安普西林及卡那黴素之2×YT培養基中之細胞沉澱物在30℃、250 rpm下培育過夜，且隨後在2000 g下於室溫下離心30分鐘。如下使上清液經受ELISA篩選。
用感染HSV-1之TG1細胞的裂解物塗佈測試多孔微量板並用經載體pET-22b轉染之大腸桿菌細胞的裂解物塗佈對照微量板。將各自含有上述376個噬菌體純系中之一者之粒子的上清液添加至測試及對照微量板中。將兩微量板在室溫下培育2小時並用含有0.05% Tween之PBS洗滌3次。隨後將稀釋於含有0.05% Tween及2%脫脂乳之PBS中之接合HRP之抗M13抗體添加至兩微量板中。將該等板在室溫下培育1小時，用含有0.05% Tween之PBS洗滌3次並將HRP受質添加至微量板中。隨後在室溫下培育該等板直至顯現藍色為止。使用ELISA讀數器測定各孔之OD450 及OD650 值。
在上述ELISA篩選分析中，發現71個噬菌體純系呈陽性(HSV/對照>8)。擴增編碼在該等純系中表現之scFv之cDNA並測定其核苷酸序列。陽性噬菌體純系中之一者表現scFv E317(SEQ ID NO:5)且另一者表現scFv E425(SEQ ID NO:6)。亦分離表現scFv Y571之噬菌體純系。
實例2：scFv E317、E425及Y571之製備
將編碼scFv E317、E425及Y571之cDNA選殖至pET27b(+)表現載體中並引入大腸桿菌中用於表現。將攜帶編碼scFv E317、scFv E425或scFv Y571之cDNA之大腸桿菌純系在37℃下於補充有卡那黴素之Luria-Bertani(LB)培養基中培育過夜。將70毫升過夜培養物接種至新鮮LB/卡那黴素培養基中並在37℃下培養2小時。隨後將異丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)添加至培養物中至最終濃度為1 mM並使培養物在30℃下再培育5小時。經由離心收穫大腸桿菌細胞，再懸浮於緩衝液A(50 mM磷酸鈉，1M氯化鈉，pH 8.0)中，藉由微射流均質器(microfludizer)裂解並在14,000 rpm下於4℃下再離心20分鐘以得到含有scFv E317、scFv E425、或scFv Y571之上清液，使其與His-標記融合。根據習用程序經由親和管柱層析純化His-scFv融合蛋白。藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳檢驗純化蛋白之純度及量。
scFv E317及scFv E425之抗原-特異性係藉由下文所述之免疫沉澱分析檢驗。用4微克pLPCX-KOS-gD轉染293T細胞(2×105 )用來表現HSV糖蛋白D。在適宜條件下培養48小時後，收穫經轉染細胞並使用含有PBS、1% NP40、1 mM PMSF及蛋白酶抑制劑之溶胞緩衝液溶解。使2微克His-scFv E317或His-scFv E425與His-標記珠一起培育1小時。用磷酸鹽緩衝液洗滌後，收集His-標記珠並使其與10微升細胞裂解物一起培育1小時。隨後，用含有5 mM EDTA及1%脫氧膽酸鈉之RIPA緩衝液將該等珠洗滌數次；洗提黏附至His-標記珠之蛋白並使用市售抗HSV糖蛋白D抗體(1:20000)進行西方墨點分析。如此所得之結果表明，scFv-317與scFv-425二者皆與HSV糖蛋白D結合。藉助類似實驗，顯示scFv Y571與HSV糖蛋白D結合。
實例3：用scFv E317及scFv E425抑制HSV複製
採用蝕斑減少分析來檢驗scFv E317及scFv E425抑制HSV-1及HSV-2複製之能力。簡言之，將1×105 個Vero細胞接種於12-孔板之各孔中並在MEM培養基中於37℃下培養過夜。隨後用含有1X PBS、MEM(無FBS)、HSV-1 KOS、HSV-1 00410(臨床菌株)、HSV-2 186或HSV-2 00040(臨床菌株)(各病毒菌株皆為5×102 pfu/ml)及抗體scFv E317及scFv E425中之一者之混合物(1毫升/孔)替代培養基。在置於板中之前，使混合物在37℃下預培養1小時。使用scFv E102作為陰性對照。使Vero細胞與該混合物在37℃下一起培育2小時且隨後去除混合物。用1X PBS洗滌1次後，向含有Vero細胞之板上添加含有0.4%瓊脂糖及10% FBS之MEM。瓊脂糖固化後，將板置於37℃培育箱中7天。在此期間，將含有10% FBS之500微升MEM添加至板中各孔中。第8天時，自板中各孔去除培養基，且隨後添加500微升1X PBS/甲醇(1:1，以體積計)。5分鐘後，用500微升100%甲醇替代1X PBS/甲醇以固定孔中所包含之細胞。再5分鐘後，去除甲醇並用250微升結晶紫將細胞染色10分鐘。隨後用水自板洗滌結晶紫並對板實施空氣乾燥。隨後在顯微鏡下對板中各孔中所包含之蝕斑的數量進行計數。
得自上述研究之結果表明，scFv E317、E425及Y571顯著抑制感染HSV-1或HSV-2之Vero細胞中的蝕斑形成。scFv E317、scFv E425及scFv Y571之抑制效果匯總於下表1-3中。
在表1-3中，IC50 係指對感染HSV之Vero細胞中蝕斑形成之抑制達到50%時所需scFv E317、scFv E425或scFv Y571之濃度。抑制百分比係根據下式計算：
抑制%=100-(抗體存在時感染HSV之細胞中之蝕斑數量)/(抗體不存在時感染HSV之細胞中之蝕斑數量)
對照抗體scFv E102不能抑制感染HSV-1或HSV-2之Vero細胞中的蝕斑形成。
實例4：在活體內防止HSV致死
mAb E317針對HSV-1之活體內保護研究係藉由以下方式來實施：經由腹膜內注射用抗體mAb E317-103治療接種有HSV-1之小鼠、隨後檢驗感染小鼠之存活率。具體而言，實施該等研究以分析mAb E317劑量及不同mAb E317劑量方案(多個劑量與單一劑量)對針對HSV-1之保護的影響。用於該等研究之小鼠菌株係C.B-17 SCID小鼠。該等研究中所使用之mAb E317-103係包括兩個重鏈及兩個輕鏈之全長抗體。mAb E317-103之重及輕可變區係來自抗體scFv E317，重鏈恆定區係來自人類IgG1重鏈，且輕鏈恆定區係來自人類κ輕鏈。
mAb E317-103之多劑投與對防護HSV-1之影響： 在此實驗中使用7週齡雄性小鼠。使用HSV-1(KOS)接種小鼠，經腹膜內投與5×103 PFU之滴度。在第0天(D0)小鼠接種HSV-1病毒。每隔5天經由腹膜內注射投與小鼠mAb E317-103，即在病毒接種前24小時(第(-1)天或D(-1))、接種後4天(D4)、接種後9天(D9)、接種後14天(D14)及接種後19天(D19)投與。使用不同的mAb E317-103劑量實施此研究：1.5毫克抗體/公斤小鼠體重(mpk)、5 mpk或15 mpk。使用兩對照組，一組僅接受磷酸鹽緩衝液(PBS)(「假/媒劑」)，另一組僅接受HSV-1病毒(「疾病/媒劑」)。在假/媒劑對照組中有4隻動物。在疾病/媒劑組中及在投與抗體之各組中有5隻動物。在小鼠接種HSV-1後每天監測存活率，持續7週。
結果顯示，mAb E317-103之投與顯著改良感染小鼠之存活(圖1)。疾病/媒劑組中之小鼠在感染後11天內全部死亡。存活率與所投與之mAb E317-103劑量正相關，其中根據感染後7週所測量，接受15 mpk抗體之小鼠的存活率為100%，接受5 mpk抗體之小鼠的存活率為80%，接受1.5 mpk抗體之小鼠的存活率為20%。
mAb E317-103之單劑投與對防護HSV-1之影響： 在此研究中使用6週齡雄性小鼠。使用HSV-1(KOS)接種小鼠，經由腹膜內投與5×103 PFU之滴度。在第0天(D0)小鼠接種HSV-1病毒。在病毒接種前24小時(D(-1))向小鼠投與單劑mAb E317-103。使用不同的mAb E317-103劑量：1.5 mpk、5 mpk或15 mpk。使用兩對照組，一組僅接受PBS(「假/媒劑」)，另一組僅接受HSV-1病毒(「疾病/媒劑」)。在假/媒劑對照組中有5隻動物。在疾病/媒劑對照組中及在投與抗體之各組中有10隻動物。在小鼠接種HSV-1後，每天監測存活率，持續7週。
結果顯示，單劑mAb E317足以提供針對HSV-1之保護(圖2)。疾病/媒劑組中之小鼠在感染後的10天內全部死亡。存活率與mAb E317之劑量正相關，其中感染約7週後，接受15 mpk抗體之小鼠的存活率為100%，接受5 mpk抗體之小鼠的存活率為60%，且接受1.5 mpk抗體之小鼠的存活率為50%。因此，mAb E317之單次 劑量投與可有效提供針對HSV-1之保護。
mAb E317-103投與時間選擇對針對HSV之保護的影響： 實施研究來分析在病毒攻擊前是否需要抗體以實施保護，或是否可在感染的同一天或甚至確定感染後投與抗體。在此研究中使用6週齡雄性小鼠。經由腹膜內投與以5×103 PFU之滴度使用HSV-1(KOS)給小鼠接種。給小鼠接種HSV-1病毒之時間視為第0天(D0)。在病毒接種前24小時(D(-1))、病毒接種之同一天(D0)或病毒接種後24小時(D1)以15 mpk之單一劑量向小鼠投與mAb E317-103。對於D0，首先注射病毒且隨後注射抗體；且病毒注射與抗體注射之間的間隔約為1分鐘。使用兩對照組，一個僅接受PBS(「假/媒劑」)且另一個僅接受HSV-1病毒(「疾病/媒劑」)。在假/媒劑對照組中有5個動物。在疾病/媒劑對照組中及投與抗體之每一組中有10個動物。給小鼠接種HSV-1後每天監測存活率，持續至少9週。
結果顯示，在病毒接種前24小時(D(-1))及接種之同一天(D0)投與mAb E317-103提供完全保護(感染約9週後存活率為100%)，而病毒接種後24小時(D1)投與mAb E317-103提供強保護(感染約9週後存活率為70%)(圖3)。因此，當在感染前或感染後投與mAb 317-103時，其具保護性。
實例5：由mAb E317及mAb E425所識別之糖蛋白D表位的表徵
mAb E317及E425與gD之結合具構象依賴性： 實施免疫沉澱分析以確定由mAb E317或E425所識別之糖蛋白(「gD」)表位是否具構象依賴性。使用為熟習此項技術者所習知之現有方法實施分析。簡言之，用HSV-1 gD重組DNA(來自KOS菌株)表現構建體來轉染293T細胞並在48小時後收穫細胞。表現構建體係藉由將編碼gD之cDNA亞選殖至由結構內XhoI及NotI位點消化之pLPCX(Clontech)中來產生。在含有PBS、1% NP40、蛋白酶抑制劑及1 mM PMSF之緩衝液中於冰上將細胞裂解10分鐘。離心後收集細胞裂解物並與經HIS標記的scFv E317或E425及HIS-選擇鎳親和凝膠珠(Sigma)在PBS中於4℃下培育。收集珠並用RIPA緩衝液(50 mM Tris HCl pH 7.4、150 mM NaCl、2 mM EDTA、1% NP-40、0.1% SDS)洗滌6次。藉由12%SDS-PAGE凝膠或西方墨點法使用mAb E317或mAb E425對經洗滌珠實施分析。對於藉由mAb E317免疫沉澱之細胞裂解物而言，當在SDS-PAGE凝膠上而非在西方墨點法上使用用於免疫墨點法之mAb E317或E425對蛋白質染色時，凝膠上顯示gD。此表明，mAb E317或E425不能結合西方墨點法上之變性gD，且由mAb E317或E425所識別之gD表位不是線性表位，而是具構象依賴性。
繪製由mAb E317或E425所識別之gD表位： 由mAb E317所識別之gD表位係經由免疫沉澱分析藉由檢驗突變gD與mAb E317或E425間之結合來繪製。免疫沉澱分析係使用為熟習此項技術者所習知之現有方法實施。簡言之，用HSV-1 gD重組DNA(來自KOS菌株)表現構建體來轉染293T細胞並在48小時後收穫細胞。在含有PBS、1% NP40、蛋白酶抑制劑及1 mM PMSF之緩衝液中於冰上將細胞裂解10分鐘。離心後收集細胞裂解物並與經HIS標記之scFv E317及HIS-選擇鎳親和凝膠珠在PBS中於4℃下培育。收集珠並用RIPA緩衝液洗滌6次。藉由實施西方墨點法使用市售抗HSV gD單株抗體H170(ViruSys，目錄號P1103)作為墨點抗體來分析經洗滌珠。
HSV-1 gD突變體係藉由為熟習此項技術者所習知之方法產生。使用截短gD突變體之研究顯示，gD中的多個區域對抗體識別係重要的(圖4)。胺基酸218-235看來對抗體識別係重要的，此乃因顯示其與gD 1-235而非缺失胺基酸224-240之gD 1-218或gD結合。胺基酸32-43看來對抗體識別係重要的，此乃因顯示其與缺失胺基酸24-32之gD而非缺失胺基酸27-43之gD結合。胺基酸125-161之缺失會破壞抗體識別。不希望受限於理論，胺基酸125-161之缺失可能會破壞蛋白質構象，此乃因缺失會破壞二硫鍵。表位之進一步繪製係藉由使用經由胺基酸取代(例如，不含丙胺酸之胺基酸與丙胺酸之胺基酸取代)所產生之gD突變體實施。發現包含Y38、D215、P221及R222在內之若干種胺基酸對抗體識別係必需的，此乃因該等胺基酸之取代會破壞mAb E317或E425之識別(圖5)。
因此，藉由mAb E317或E425所識別之表位並非線性表位且具構象依賴性，且胺基酸Y38、D215、P221及R222對mAb E317及E425至gD之結合係重要的。
其他實施例
本說明書中所揭示之全部特徵可以任一組合方式組合。本說明書中所揭示之每一特徵皆可由適合於相同、相等或類似目的之替代特徵所代替。因而，除非另有明確說明，否則每一所揭示特徵僅係一類相當或類似特徵之實例。
自以上闡述，熟習此項技術者可易於確定本發明之本質特徵，且可對本發明作出各種改變及修改以使其適於各種用途及條件而不背離本發明之精神及範疇。因而，其他實施例亦在申請專利範圍內。
圖1展示藉由多次以1.5 mpk、5 mpk或15 mpk之劑量投與mAb E317劑量對感染HSV1之SCID小鼠進行保護防止HSV致死之結果。mAb E317係自病毒接種前24小時開始以5天之間隔投與5次；
圖2展示藉由以1.5 mpk、5 mpk、或15 mpk之劑量單次注射mAb E317對感染HSV1之SCID小鼠進行保護防止HSV致死之結果。mAb E317係在病毒接種前24小時投與；
圖3展示藉由在病毒接種前24小時、病毒接種之同一天或病毒接種後24小時以15 mpk單次注射mAb E317對感染HSV1之SCID小鼠進行保護防止HSV致死之結果；
圖4展示經由免疫沉澱分析確定糖蛋白D(「gD」)中對mAb E317之表位識別重要之各區域的結果。「+」表示檢測到抗體至突變體gD之結合；「-」表示未檢測到抗體至突變體gD之結合；及
圖5展示經由免疫沉澱分析確定糖蛋白D(「gD」)中對mAb E317之表位識別重要之胺基酸的結果。「+」表示檢測到抗體至突變體gD之結合；「-」表示未檢測到抗體至突變體gD之結合。
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(無元件符號說明)

Claims (24)

  1. 一種分離之人類抗體，其與單純皰疹病毒-1(HSV-1)及單純皰疹病毒-2(HSV-2)之糖蛋白D(gD)特異性結合，其中該抗體結合至該糖蛋白D上之構形表位(conformational epitope)，該表位包含SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示之胺基酸Y38、D215、P221及R222，或gD上對應於SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示之Y38、D215、P221及R222之胺基酸。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體與SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示之胺基酸35-40及215-222或該gD上對應於SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45中所示之胺基酸35-40及215-222相互作用。
  3. 如請求項1之抗體，其中該抗體抑制HSV-1及/或HSV-2之複製。
  4. 如請求項1之抗體，其中該抗體與具SEQ ID NO：5所示序列之抗體scFv E317、具SEQ ID NO：6所示序列之scFv E425、或具SEQ ID NO：43所示序列之scFv Y571競爭結合該HSV-1及HSV-2之gD，且能以實質上相等效力中和HSV-1及HSV-2。
  5. 一種分離之人類抗體，其與單純皰疹病毒(HSV)糖蛋白D特異性結合，其中該抗體含有(1)如SEQ ID NO：1所示之重鏈可變區(VH )胺基酸序列；及如SEQ ID NO：2所示之輕鏈可變區(VL )胺基酸序列，或 (2)VH ，其包含如SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列；及VL ，其包含如SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列。
  6. 一種分離之人類抗體，其與HSV糖蛋白D特異性結合，其中該抗體包含VH ，其包含scFv E317之VH 之三個互補決定區(CDRs)，該VH 具SEQ ID NO：1所示序列；及VL ，其包含scFv E317之VL 之三個CDRs，該VL 具SEQ ID NO：2所示序列。
  7. 如請求項6之抗體，其中該抗體包含VH ，其包含SEQ ID NO：1之胺基酸3-124；及VL ，其包含SEQ ID NO：2之胺基酸1-108。
  8. 如請求項6之抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列。
  9. 一種分離之人類抗體，其與HSV糖蛋白D特異性結合，其中該抗體包含VH ，其包含scFv E425之VH 之三個CDRs，該VH 具SEQ ID NO：3所示序列；及VL ，其包含scFv E425之VL 之三個CDRs，該VL 具SEQ ID NO：4所示序列。
  10. 如請求項9之抗體，其中該抗體包含VH ，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸3-124；及VL ，其包含SEQ ID NO：4之胺基酸1-108。
  11. 如請求項9之抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
  12. 一種分離之人類抗體，其與HSV糖蛋白D特異性結合，其中該抗體包含SEQ ID NO：41中所示之重鏈胺基酸序列 之三個CDRs及SEQ ID NO：42中所示之輕鏈胺基酸序列之三個CDRs。
  13. 如請求項12之抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO：41中所示之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：42中所示之輕鏈胺基酸序列。
  14. 如請求項12之抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列。
  15. 一種分離之核酸，其包含編碼如請求項1至14中任一項之抗體之核苷酸序列。
  16. 一種載體，其包含如請求項15之核酸。
  17. 一種分離之宿主細胞，其包含如請求項15之核酸。
  18. 一種產生如請求項1至14中任一項之抗體之方法，其包含培養產生該抗體之宿主細胞，及自該細胞培養物回收該抗體。
  19. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至14中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
  20. 一種如請求項1至14中任一項之抗體之用途，其係用以製備用於治療或預防有需要之個體之單純皰疹病毒(HSV)感染之藥物，其中該藥物包含有效量之該抗體。
  21. 如請求項20之用途，其中該個體有感染HSV之風險。
  22. 如請求項20之用途，其中該HSV感染係HSV-1或HSV-2感染。
  23. 如請求項20之用途，其中該抗體係與另一抗HSV藥物使用。
  24. 一種診斷個體HSV感染之方法，其包含：(a)使如請求項1至14中任一項之抗體與得自該個體且懷疑含有HSV病毒之生物試樣接觸；及(b)測定抗原-抗體反應；其中檢測到該抗原-抗體反應則表明試樣中存在HSV。
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