CN107250160A - 人源化cc趋化因子受体4 (ccr4)抗体及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供与趋化因子受体CCR4结合的人源化单克隆抗体、双特异性抗体、抗体缀合物和融合蛋白。该抗体来源于CCR4‑IgG1并识别相同的表位。该抗体含有IgG4或固定化IgG4以提高结合效率，并降低体内Fab臂交换。本文公开的抗体与CCR4的结合抑制其配体介导的活性，并且用于治疗癌症的症状。

Description

人源化CC趋化因子受体4 (CCR4)抗体及其使用方法

相关申请

本申请要求2014年10月6日提交的美国临时申请号62/060,381的优先权和权益，其内容通过引用以其整体结合到本文中。

发明领域

本申请总的来说涉及具有IgG4 Fc结构域的抗CCR4单克隆抗体及其使用方法。

政府权益

本发明在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的P50 CA93683的政府支持下完成。政府在本发明中享有一定权利。

通过序列表的引入结合

名为“DFCI-094_001WO_ST25.txt”的文本文件的内容通过引用以其整体结合到本文中，该文件于2015年10月5日创建，大小为32千字节。

发明背景

皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)是成人中第二最常见的结外非霍奇金T细胞淋巴瘤。最近的WHO-EORTC一致分类(Willemze R.等, Blood 2005, 105:3768-3785)表明有13种临床上和组织学上不同类型的CTCL；然而，90%的CTCL落入3个类别；霉菌肉芽肿病(MF)、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)和塞扎里综合征(Sezary syndrome)。最常见的CTCL类型，霉菌肉芽肿病的特征在于最常含有显示表皮亲和力或亲表皮现象的CD4⁺ T细胞的红斑和斑块(Willemze R.等, Blood 2005, 105:3768-3785)。分期基于TNM分类；患有1A期疾病的患者具有正常的预期寿命，而患有1B期或更高期的患者的预期寿命缩短(Kim, Y.H.等, ArchDermatol 2003,139:857-866)。患有II-IV期疾病的患者有少于5年的中位生存期，其大细胞转化常常导致恶化加剧(Kim, Y.H.等, Arch Dermatol 2003, 139:857-866)。塞扎里综合征是CTCL的白血病变体，其中克隆CD4⁺ T细胞在血液和淋巴结以及皮肤内蓄积；5年生存期小于25%。原发性皮肤ALCL具有很少的侵略性进程，其5年生存期为95%；然而，具有并存的结受累的皮肤ALCL是更侵略性的(Willemze R.等, Blood 2005, 105:3768-3785；KadinME, Carpenter C. Semin Hematol 2003, 40:244-256)。

在具有未知病因学的T细胞库的整体调节异常的CTCL患者中有明显的免疫功能障碍(Yamanaka K.等, Clin Cancer Res 2005, 11:5748-5755；Yawalkar N.等, Blood2003, 102:4059-4066)。大多数患者中的终末事件是细菌脓毒症。晚期MF和塞扎里综合征的现有疗法是治标的，可持久的长期缓解极少(Querfeld C.等, Curr Opin Hematol2005, 12:273-278)。因此，迫切需要更有效的疗法。

现有假设表明异常T细胞活性是CTCL的病理生理学的可能的驱动力。最重要的是恶性T细胞可在CTCL中起类似于调节T细胞的作用并因此抑制抗肿瘤活性的观察。CC趋化因子受体4 (CCR4)在存在于CTCL中的恶性皮肤归巢T细胞以及在调节T细胞(Treg)上以高水平表达。肿瘤细胞分泌作为CCR4的配体的趋化因子CCL17和CCL22。接着，这些配体的分泌将调节T细胞和恶性T细胞吸引至肿瘤的部位，这导致癌细胞环境中的效应T细胞的抑制。效应T细胞的这种抑制为持续的癌细胞生长产生有利的环境。

之前的研究表明，使用人源化抗CCR4单克隆抗体mAb2-3 IgG1减少调节T细胞朝向CCR4配体的迁移，并最终导致体内肿瘤模型中肿瘤大小的缩小。调节性和恶性T细胞朝向肿瘤细胞的迁移能力以及恶性细胞的直接细胞毒性两者的调节在癌症的进程中起关键作用。

发明概述

本发明提供与人CC趋化因子受体4 (CCR4)结合并具有IgG4重链恒定区的分离的人源化单克隆抗体。

本发明进一步提供含有以下的抗体：具有SEQ ID NO: 2的V_H氨基酸序列和具有SEQ ID NO: 4的V_L氨基酸序列；具有SEQ ID NO: 16的V_H氨基酸序列和具有SEQ ID NO: 18的V_L氨基酸序列；具有SEQ ID NO: 20的V_H氨基酸序列和具有SEQ ID NO: 22的V_L氨基酸序列；具有SEQ ID NO: 24的V_H氨基酸序列和具有SEQ ID NO: 26的V_L氨基酸序列；具有SEQ IDNO: 28的V_H氨基酸序列和具有SEQ ID NO: 30的V_L氨基酸序列或具有SEQ ID NO: 44的V_H氨基酸序列和具有SEQ ID NO: 46的V_L氨基酸序列和具有SEQ ID NO: 6或SEQ ID: 8的重链恒定区。

本发明的抗体具有约1.5nM^-1或更小的结合亲和力。

本发明还提供是双特异性抗体的抗体，其含有本发明的抗体和识别第二抗原的抗体的重链-轻链。例如，第二抗原是肿瘤相关抗原或T细胞功能调节分子。肿瘤相关抗原是例如CA-IX、ErbB2或HVEM。T细胞功能调节分子是PD-L1、GITR、IL21、IL21R、CD160、TIM3、LAG3或GAL9。

另一方面，本发明提供产生本发明抗体的细胞。

再一方面，抗体与治疗剂连接。治疗剂是例如毒素、放射性标记、siRNA、小分子或细胞因子。细胞因子是例如IL-2或TGF-β。

本发明进一步提供含有本发明抗体的融合蛋白。融合蛋白是例如与细胞因子或生长因子(例如IL-2或TGF-β多肽)有效连接的抗CCR4抗体或其功能片段。

本发明进一步提供通过使T细胞与含有与细胞因子有效连接的抗CCR4抗体的融合蛋白接触来增加T细胞增殖的方法。

在某些方面，本发明提供通过给予受试者本发明的抗体抑制受试者的调节T细胞(Treg)迁移的方法。淋巴细胞、效应T细胞或Treg不被耗减。

本发明还包括通过使抗原与本发明的抗体接触提高对抗原的免疫应答的方法。再一方面，在暴露于抗原之前或之后给予抗体。给予本发明的抗体使抗原特异性T细胞活性提高。另一方面，给予本发明的抗体使T细胞增殖增加。例如，T细胞是效应T细胞。例如，抗原是病毒抗原、细菌抗原或肿瘤相关抗原。一方面，病毒抗原是例如HIV。

本发明还提供逆转效应T细胞增殖的调节T细胞介导的抑制的方法，所述方法包括使T细胞与本发明的抗体接触。

另一方面，本发明提供通过给予有需要的受试者包括本发明的抗体的组合物以治疗或减轻癌症的症状的方法。癌症为例如实体癌或血癌。示例性血癌包括但不限于：皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、霉菌肉芽肿病(MF)、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤(皮肤ALCL)、塞扎里综合征(Sezary syndrome)或成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)。示例性实体癌包括但不限于：肾细胞癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、宫颈癌、脑癌、肝癌、胰腺癌、肾癌或胃癌。癌症是过量表达CA IX、PD-L1或HVEM的实体癌或癌症。

本公开内容的任何方法中的给药途径包括但不限于胃肠外(例如静脉内)、皮内、静脉内、口服(例如口用)、经皮(即局部)、跨黏膜和直肠给药。

本公开内容的任何方法中的受试者是例如哺乳动物。哺乳动物是例如人。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似或等同于本文描述的方法与材料可用于实施本发明，但以下描述了合适的方法与材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考资料均通过引用以其整体明确予以结合。如有抵触，则应以本说明书(包括定义)为准。另外，本文所述材料、方法和实例只是说明性的，无意是限制性的。

本发明的其它特征和优势从随附发明详述和权利要求来看将是显而易见的并由其所包括。

附图简述

图1. mAb2-3介导Treg迁移的抑制。(A)显示了卵巢癌细胞系的CCL22表达。将癌细胞用或不用布雷菲德菌素-A处理。在4小时处理后，收获细胞，用抗CCR4抗体染色，然后通过流式细胞术分析。(B)由表达CCL22的卵巢癌细胞上清液诱导的CD4+CD25+ T细胞的体外趋化性被mAb2-3抑制，但不被对照抗体抑制。(C)人淋巴细胞受100 nM CCL22的化学吸引被mAb2-3以剂量依赖性方式抑制。结果表示为均值± SD和斯氏t检验。这些数据表明卵巢癌细胞系IGROV-1和OVCAR-5能够CCL22分泌，并可显著促进Treg上CCL22化学吸引的增加。另外，mAb2-3 IgG1和IgG4两者还能够抑制Treg上的CCL22化学吸引。

图2. 由分泌CCL22的IGROV-1异种移植物引起的人淋巴细胞的体内化学吸引被mAb2-3抑制。(A)给荷有卵巢肿瘤细胞的小鼠注射萤光素化CD4+CD25+CD127dim/- Treg细胞，并用3 mg/kg mAb2-3 IgG1或IgG4或等量的PBS治疗。萤光素化CD4+CD25+CD127dim/- T细胞注射后18小时卵巢癌异种移植物小鼠模型的体内生物发光图像(成像)。(B)肿瘤区域的生物发光强度通过IVIS成像系统和软件测量。(C)收获肿瘤，用胶原酶处理，用抗CD4和抗CD25抗体染色，然后通过流式细胞术分析。显示了CD4+CD25+ Treg的百分比。统计值以斯氏t检验计算。*和**分别表示p值< 0.5和0.01。

图3. 体内人PBMC分布的验证。(A)和(B)中的FACS图和图表表示在体内用抗CCR4抗体治疗后CD4+ T细胞群的测量。首先，小鼠通过尾静脉接受1x10⁷个人PBMC，然后给小鼠静脉内注射3 mg/kg抗体。在体内24小时循环期后，收集小鼠血液，人PBMC用Pacific blue缀合的抗CD3、Brilliant Violet缀合的抗CD4、APC缀合的抗CD25、PE-Cy7缀合的抗CD127、PE-Cy5缀合的抗CD45RA和PerCp-Cy5缀合的抗CCR7抗体染色，进行选通以区分Treg、Tcm、Tem、Teff和Tnaive。显示了来自3个独立实验平均值的CD3+CD4+ T细胞中(C)CD25+CD127-Treg，(D) CD45RA+CCR7- Teff，(E) CD45RA+CCR7+ Tnaive，(F) CD45RA-CCR7- Tem和(G)CD45RA-CCR7+ Tcm群的百分比。*，p值< 0.05。(H)在抗体治疗后体内T细胞群的定量测定。*，p值< 0.05。在这个实验中，mAb2-3 IgG1介导Treg耗减，并减少幼稚T细胞群。相比之下，mAb2-3的IgG4形式对T细胞失去耗减活性，并保持体内正常的T细胞亚群。

图4. IGROV-1卵巢癌细胞的肿瘤致敏T细胞的产生和证实。(A)单核细胞来源的树突细胞(DC)的证实。(B)使人肿瘤致敏T细胞与肿瘤脉冲的DC或未脉冲的DC一起孵育。在48小时孵育后，收获上清液，并通过MSD测量IFN-γ。(C)使人肿瘤致敏T细胞与IGROV-1或Treg一起孵育。收获上清液，通过MSD测量IFN-γ，(D)通过ELISA测量LDH以检测细胞死亡百分比。结果表示为均值± S.D.和斯氏t检验。

图5. 荷有IGROV-1致敏T细胞的IGROV-1异种移植物小鼠中mAb2-3的免疫调节疗法。(A)用5x10⁶个IGROV-1肿瘤细胞给小鼠接种。当肿瘤达到50 mm³的大小时，通过尾静脉注射1x10⁷个IGROV-1致敏T细胞、1x10⁶个Treg和1 mg/kg抗体。每周两次对小鼠进行治疗。肿瘤大小通过测径器计算，并测量为长x (宽) 2x 0.52。灰色*，p < 0.05，与mAb2-3 IgG1相比；黑色*和**，p< 0.05和p < 0.01，与mAb2-3 IgG4相比。(B)收获肿瘤，称重。比例尺，1cm。(C)在整个实验中监测小鼠体重。(D)在抗体治疗后，通过流式细胞术测量人T细胞中的T细胞亚群。在荷有肿瘤致敏T细胞的这些NSG小鼠中显示了在用mAb2-3 IgG1或IgG4治疗后杀灭活性提高。这些结果显示Treg耗减和由mAb2-3引起的Treg募集的抑制两者对肿瘤治疗是有益的。

图6. 被人源化抗CCR4抗体抑制的信号传导。(A)将人PBMC在对照抗体、mAb2-3IgG1或mAb2-3 IgG4存在和不存在时与或不与Treg一起孵育。通过[3H]胸苷掺入检测PBMC增殖(CPM)。(B) CD4+ T细胞自人PBMC中分离，并在对照抗体、mAb2-3 IgG1或mAb2-3 IgG4存在和不存在时与Treg一起孵育。定量测定老化相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)阳性细胞。(C)用抗p-ERK1/2、ERK1/2、p-P38和P38抗体进行的蛋白质印迹法和蛋白质印迹分析；测定了p-ERK1/2和p-P38表达与对照IgG处理的CD4+ T细胞相比的倍数。(D)在用对照IgG、mAb2-3 IgG1或mAb2-3 IgG4处理后，通过流式细胞术检测CD4+ T细胞上CD27和CD28的表达。所有值为均值± S.D.。这些数据表明，通过降低SA-β-gal和p-P38的表达并恢复CD27和CD28的表达，mAb2-3抑制Treg活性的其它功能，这提供共刺激信号并且是淋巴细胞活化所必需的。

发明详述

趋化因子是主要因其在白细胞活化和趋化性中的作用而著名的分泌蛋白质的家族。它们与靶细胞上的趋化因子受体的特异性相互作用引发导致炎性介质释放、细胞形状改变和细胞迁移的信号传导级联。CC趋化因子受体4 (CCR4)是CC趋化因子CCL17和CCL22的关联受体（cognate receptor），并在功能上不同的T细胞亚型上表达，所述T细胞亚型包括T辅助2型细胞(Th2)和大多数的调节T细胞(Treg) (Iellem等，2001；和Imai等，1999)。越来越多的证据表明CCL17/22分泌促进由例如结肠直肠、卵巢、霍奇金淋巴瘤和成胶质细胞瘤等恶性实体引起的肿瘤浸润性Treg的数目增加(Curiel等，2004；Wagsater等，2008；Niens等，2008；Jacobs等，2010；Hiraoka等，2006)。肿瘤中Treg水平的提高阻碍有效的抗肿瘤免疫应答(Wood等，2003和Levings等，2001)，并且常常与临床结果差和肿瘤进展有关(Hiraoka等，2006和Woo等，2001)。因此，成功癌症疗法的一个主要障碍可能由Treg迁移进入肿瘤及其在肿瘤微环境中抗肿瘤免疫应答的抑制引起(Zou等，2006和Yu等，2005)。近年来，在消除Treg抑制功能并因此提高抗肿瘤免疫的努力中，在临床前和临床研究中评价了作为针对Treg的免疫治疗剂的单克隆抗体(mAb) (Mahnke等，2007；Roncarolo等，2007)。然而，用mAb免疫疗法对全身Treg耗减的产生与自身免疫有极大的预期相关性(Sakaguchi等，2008和Kohm等，2006)。避免Treg诱导的癌症免疫逃避的一个备选策略是研发直接阻碍肿瘤组织中的Treg吸引和蓄积的肿瘤相关Treg靶向疗法。

mAb在癌症免疫疗法中的一个潜力在于其阻断或调节因肿瘤所致免疫逃避的免疫轴的能力。趋化因子受体CCR4在大部分FOXP3⁺ Treg (被视为抗肿瘤免疫最有效的抑制剂和成功免疫疗法的最大障碍的免疫细胞)上高表达(Baatar等，2007)。此外，在患有不同癌症类型的患者中检出CCR4的肿瘤相关趋化因子(Mizukami等，2008；Gobert等，2009和Faget等，2011)。因此，本文所述人抗CCR4 mAb免疫疗法的靶向方法在提高癌症免疫治疗功效同时降低其副作用中提供重大优势。

本发明提供针对趋化因子(C-C基序)受体4 (CCR4)有特异性的人源化IgG4单克隆抗体。抗CCR4抗体的最初人源化描述于WO 2009/086514，其内容通过引用以其整体结合到本文中。人源化抗CCR抗体的优化变体Ab2-3 IgG1的说明描述于WO 2013/166500，其内容通过引用以其整体结合。通过使识别CCR4的N端和胞外结构域的小鼠抗CCR4单克隆抗体mAb1567人源化产生抗体。与抗体对针对纯的蛋白质容易获得的抗原的亲和力成熟不同，抗CCR4抗体的亲和力成熟由于蛋白质的7跨膜结构所致特别富有挑战性。CCR4的这种复杂结构使得筛选和选择亲和力成熟的抗体不太有效且不太可预测。

本文描述了针对CCR的人源化IgG4同种型单克隆抗体，下文称为CCR4-IgG4。与CCR4-3 IgG1相比，CCR4 IgG4具有不同的Fc结构域氨基酸序列。CCR4-3 IgG4抗体具有至少等于最初描述的CCR4-IgG1的亲和力或是其1倍、1.5倍、2倍的亲和力。

本发明的CCR4- IgG4抗体还有效地抑制CD4⁺CD25^高Treg的趋化性。本发明的CCR4-IgG4抗体还通过抑制来自肿瘤组织的Treg募集，介导肿瘤致敏T细胞的活化。重要的是，CCR4- IgG4抗体是非免疫耗减的。

因此，CCR4-IgG4抗体可用于治疗表达CCR4的肿瘤，例如皮肤T细胞淋巴瘤。此外，亲和力优化抗CCR4抗体还可通过提高抗肿瘤免疫应答，通过抑制Treg运输，而用于治疗其它肿瘤。

皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)是通过克隆来源的皮肤归巢T细胞引起的一类异源的淋巴增殖性病症。CTCL细胞一律表达CCR4。具体地说，CCR4是MF、皮肤ALCL和大致50%的结节ALCL中恶性T细胞的重要特征。与CLA不同，它确实在塞扎里综合征中和MF的大细胞转化期间表达，并且还由可累及皮肤的其它T淋巴样细胞恶性肿瘤(例如成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL))表达。CCR4的表达限于非恶性细胞中并且不存在于嗜中性粒细胞、单核细胞或B细胞中。重要的是，CCR4不存在于幼稚T细胞中，并存在于少于所有记忆T细胞的一半中。CTCL细胞上CCR4确实表达及其在其它免疫细胞上的有限表达，使得CCR4的靶向疗法成为针对这些恶性肿瘤的有吸引力的目标。

虽然在对CCR4有相对选择性的小分子抑制剂的鉴定中取得一些进展，但针对CCR4的特异性单克隆抗体由于其微妙的结合特异性是针对CTCL的免疫疗法的有吸引力的靶标。另外，通过Fc与Fcγ受体结合介导的体内效应子功能可用来杀灭肿瘤细胞。不知道最佳体内免疫耗减活性所需要的Mab的精确性质，但可选择抗体以作为受体激动剂或拮抗剂起作用，和/或促进或抑制受体二聚化和/或内化。还鉴定了抗体介导的肿瘤清除的不同免疫机制。例如，天然杀伤细胞被Mab介导募集至肿瘤可通过这些免疫效应细胞上受体的Fc-γ活化(一种称为依赖抗体的细胞毒性(ADCC)的过程)发生。其它免疫机制包括依赖补体的细胞毒性(CDC)和依赖抗体的细胞吞噬作用(ADCP)。与固有Mab活性有关的其它机制包括：阻断配体结合或异源二聚化、抑制Akt的下游信号传导和加快受体内化。后一机制特别有效，因为配体诱导的胞吞和活性受体酪氨酸激酶(RTK)的降解被视为构成促生长信号减弱基础的主要生理过程。

受趋化因子及其受体严格调节的白细胞运输具有肿瘤细胞浸润和转移的许多特征。虽然因肿瘤细胞所致趋化因子受体CCR4的表达与皮肤受累有关，但CCR4还在正常和肿瘤免疫两者中具有重要作用。在患有HTLV-1相关成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)的一组CTCL患者中，肿瘤细胞本身起调节T (Treg)细胞的作用，其有助于在面临宿主抗肿瘤免疫应答时的肿瘤存活。在其它的癌症类型中，由肿瘤细胞和肿瘤微环境产生的趋化因子TARC/CCL17和MDC/CCL22 (CCR4的特异性配体)，将CCR4⁺ Treg细胞吸引至肿瘤，在其中它们创造肿瘤逃避宿主免疫应答的有利环境。因此，治疗性抗CCR4 Mab是许多不同癌症的理想的治疗形式，不仅仅直接杀灭CCR4⁺肿瘤细胞，而且还克服CCR4 Treg细胞对肿瘤细胞的宿主免疫应答的抑制作用。

一方面，本发明提供特异性结合调节T细胞募集而不诱导淋巴细胞耗减的CCR4蛋白的高亲和力人源化单克隆抗体。这种抗体与CCR4受体的结合中断CCR4的配体或激动剂结合。竞争与CCR4结合并且在本发明的抗体存在下被阻断的示例性配体或激动剂包括但不限于CCL17、CCL22和vMIP-III。通过各种机制，抗体可降低表达CCR4的细胞(例如皮肤T细胞淋巴瘤细胞(CTCL细胞)或卵巢癌细胞)的配体诱导的趋化性。CCR4- IgG4抗体是单价的或二价的，并包含单链或双链。CCR4- IgG4抗体还可以是双特异性抗体，其中重链-轻链异二聚体的至少一个识别CCR4。在功能上，CCR4- IgG4抗体的结合亲和力为约1.5 nM^-1或更小。抗体Fc区的糖基化被修饰以改变CCR4结合或CCR4配体阻断性质。例如，Fc区的岩藻糖含量与野生型相比降低。此外，抗体包括治疗剂，其包括但不限于毒素、放射性标记、siRNA或细胞因子。

CCR4- IgG4调节T细胞迁移和活性。具体地说，CCR4- IgG4可阻断、抑制或降低Treg朝向CCL配体的迁移，并因此降低Treg的抑制剂活性，例如，调节T细胞介导的T细胞活性的抑制。另一方面，CCR4- IgG4可提高对抗原的免疫应答。例如，CCR4- IgG4提高抗原特异性T细胞活性。在其它方面，CCR4- IgG4恢复或增加T细胞增殖，例如效应T细胞增殖。再一方面，CCR4- IgG4激活T细胞以分泌细胞因子，例如IFN-γ。CCR4- IgG4还对调节T细胞和效应T细胞具有有效的免疫调节作用，导致抑制Treg募集至肿瘤组织和随之发生的针对肿瘤细胞的效应T细胞的活化。

与前述CCR4- IgG1不同，本文所述CCR4- IgG4不通过依赖补体的细胞毒性(CDC)、依赖抗体的细胞毒性(ADCC)、依赖抗体的细胞吞噬作用(ADPC)或任何其它已知机制诱导细胞死亡。

下表1A-2B中提供工程改造的CCR4- IgG4抗体的核酸和氨基酸序列。

本发明的另一个方面，包括CCR4- IgG4单克隆抗体的稳定形式，其中铰链区中的氨基酸取代允许抗体不进行体内Fab臂交换，这导致更有效的抗体结合。

所选抗体的重链和轻链互补决定区的氨基酸序列见下表9。

表9. 重链和轻链的氨基酸序列.

如上所述，本发明的CCR4- IgG4调节T细胞活性。在某些方面，给予CCR4- IgG4逆转调节效应T细胞增殖的T细胞介导的抑制。具体地说，用CCR4- IgG4处理刺激或增加效应T细胞(Teff)的增殖，而不刺激调节T细胞(Treg)的增殖。效应T细胞由通过CD45RA和CCR7表达谱分类的4个不同的群组成：T-不同类型(Tdiff)、幼稚T细胞(Tnaive)、中枢记忆性T细胞(Tcm)和效应记忆性T细胞(Tem)。本发明的CCR4- IgG4可刺激或增加Teff群的任一种的增殖。在某些方面，增加效应T细胞增殖提高抗原特异性T细胞活性以提高对抗原的免疫应答。在某些方面，提高效应T细胞介导的免疫应答可有助于抑制肿瘤发生或缩小肿瘤大小。

在其它方面，CCR4- IgG4调节T细胞细胞因子产生和分泌。例如，给予CCR4- IgG4特别增加IFN-γ (IFNγ)产生并从T细胞中释放。在其它方面，给予CCR4- IgG4可能不影响IL-10或IL-4释放。另一方面，给予CCR4- IgG4可能不影响或可略微降低GF-β释放。细胞因子释放概况可表示通过CCR4- IgG4处理激活的特殊T细胞群，因为IFNγ分泌是Th1细胞(T-辅助1型细胞)特有的，而TGF-β和IL-10分泌是调节T细胞特有的，且IL-4由Th2 (T辅助2型细胞)释放。在某些方面，CCR4- IgG4刺激T细胞活性，其中T细胞是Th1细胞。在一些实施方案中，CCR4- IgG4刺激IFNγ的分泌，并降低或不改变TGF-β、IL-10或IL-4的分泌。

抗体

本文所用术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有与抗原特异性结合(免疫反应)的抗原结合部位的分子。所谓“特异性结合”或“与……免疫反应”意指与所需抗原的一个或多个抗原决定簇反应而不与其它多肽反应的抗体。抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、dAb (结构域抗体)、单链、F_ab、F_ab’和F_(ab')2片段、scFvs和F_ab表达文库。

单链Fv (“scFv”)多肽分子是共价连接的V_H ：:V_L异二聚体，其可自包括通过肽编码接头连接的V_H-和V_L-编码基因的基因融合物表达。(参见Huston等(1988) Proc Nat AcadSci USA 85(16):5879-5883)。描述了辨别用于将来自抗体V区的天然聚集的而非化学分离的多肽轻链和重链转化至scFv分子的多种方法，所述scFv分子可折叠成与抗原结合部位的结构大致相似的三维结构。参见例如美国专利号5,091,513、5,132,405和4,946,778。

非常大的幼稚人scFv文库已提供且可创建以提供针对大量靶分子的重排抗体基因极大的来源。可从患有感染性疾病的个体构建较小的文库以分离疾病特异性抗体。(参见Barbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9339-43 (1992)；Zebedee等, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 89:3175-79 (1992))。

一般来说，获自人的抗体分子与IgG、IgM、IgA、IgE和IgD类别的任一种有关，所述类别因存在于分子中的重链的性质而彼此不同。某些类别还具有亚类，例如IgG₁、IgG₂等。此外，在人中，轻链可为κ链或λ链。术语“抗原结合部位”或“结合部分”是指参与抗原结合的免疫球蛋白分子的一部分。抗原结合部位由(“H”)和轻(“L”)链的N端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。在重链和轻链V区内有3个高度趋异的序列段(称为“超变区”)插入在更保守的侧翼序列段(称为“构架区”或“FR”)之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白的超变区之间并与之相邻的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的3个超变区和重链的3个超变区彼此相对配置在三维空间中形成抗原结合表面。抗原结合表面与被结合的抗原的三维表面互补，重链和轻链每个的3个超变区称为“互补决定区”或“CDR”。

本文所用术语“表位”包括能够与免疫球蛋白、scFv或T细胞受体特异性结合的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子(例如氨基酸或糖侧链)的化学活性表面群聚组成，并通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，抗体可针对多肽的N端或C端肽产生。

本文所用术语“免疫结合”和“免疫结合性质”是指免疫球蛋白分子与免疫球蛋白对其有特异性的抗原之间产生的非共价相互作用类型。免疫结合相互作用的强度或亲和力可用相互作用的解离常数(K_d)表示，其中较小的K_d表示较大的亲和力。所选多肽的免疫结合性质可采用本领域众所周知的方法量化。一种这样的方法需要测量抗原结合部位/抗原复合物形成和解离的速率，其中这类速率取决于复合的配偶体的浓度、相互作用的亲和力和同等影响两个方向的速率的几何参数。因此，“结合速率常数” (K_on)和“解离速率常数”(K_off)两者可通过计算浓度及结合和解离的实际速率确定。(参见Nature 361:186-87(1993))。K_off /K_on之比使得能够消除与亲和力无关的所有参数，并等于解离常数K_d。(一般参见Davies等(1990) Annual Rev Biochem 59:439-473)。当平衡结合常数(K_d) ≤1 μM、优选≤ 100 nM、更优选≤ 10 nM、最优选≤ 100 pM-约1 pM时，本发明的抗体被称为与CCR4表位特异性结合，通过测定法例如放射性配体结合测定法或本领域技术人员已知的类似测定法测量。

本发明的CCR4蛋白或其衍生物、片段、类似物、同系物或直向同源物(ortholog)，可在产生免疫特异性结合这些蛋白质组分的抗体时用作免疫原。

本领域技术人员应认识到，有可能无需过度实验只是通过确定人单克隆抗体是否防止本发明的人单克隆抗体与CCR4结合，便确定前者是否与后者具有相同的特异性。如果受测试的人单克隆抗体与本发明的人单克隆抗体竞争，正如通过本发明的人单克隆抗体的结合降低所示，则很可能2种单克隆抗体与相同的表位或与极相关的表位结合。

测定人单克隆抗体是否具有本发明的人单克隆抗体的特异性的另一方法是使本发明的人单克隆抗体与其通常与之有反应的CCR4蛋白一起预孵育，然后加入要测试的人单克隆抗体以确定受测试的人单克隆抗体是否在其结合CCR4的能力上受抑制。如果受测试的人单克隆抗体被抑制，则很可能具有与本发明的单克隆抗体相同的或在功能上等同的表位特异性。还可通过使用CCR4并确定试验单克隆抗体是否能够中和CCR4，来进行本发明的人单克隆抗体的筛选。

本领域已知的各种方法可用于产生针对本发明的蛋白质或针对其衍生物、片段、类似物、同系物或直向同源物的多克隆或单克隆抗体。(参见例如Antibodies: ALaboratory Manual, Harlow E和Lane D, 1988, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY，通过引用并入本文)。

抗体可通过众所周知的技术纯化，例如使用A蛋白或G蛋白(其主要提供免疫血清的IgG部分)的亲和层析法。随后或备选，可将作为所寻找的免疫球蛋白的靶标的特异性抗原或其表位固定在柱上以通过免疫亲和层析法纯化免疫特异性抗体。例如D. Wilkinson论述了免疫球蛋白的纯化(由The Scientist, Inc., Philadelphia PA出版的TheScientist, 第14卷, 第8期(2000年4月17日), 第25-28页)。

术语“单克隆抗体”或“mAb”或“单克隆抗体组合物”本文所用是指只含有由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成的抗体分子的一种分子物类的一群抗体分子。具体地说，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在该群的所有分子中相同。MAb含有能够与特征在于对其有独特结合亲和力的抗原的特定表位免疫反应的抗原结合部位。

可采用杂交瘤方法，例如Kohler和Milstein，Nature，256:495 (1975)描述的那些方法，制备单克隆抗体。在杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物通常用免疫剂免疫以诱导产生或能够产生可与免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可体外免疫。

免疫剂通常可包括蛋白质抗原、其片段或其融合蛋白。一般而言，如果需要人源的细胞，则使用外周血淋巴细胞，或如果需要非人哺乳动物源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)使淋巴细胞与永生化细胞系融合，形成杂交瘤细胞(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press,(1986)第59-103页)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人源的骨髓瘤细胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可使杂交瘤细胞在合适的培养基中培养，所述培养基优选含有抑制未融合的永生化细胞的生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲代细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，用于杂交瘤的培养基通常可包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，所述物质防止HGPRT缺陷型细胞的生长。

优选的永生化细胞系是这样的细胞系，其有效融合、支持所选的产抗体细胞产生稳定的高水平抗体表达且对培养基(例如HAT培养基)敏感。更优选的永生化细胞系是鼠骨髓瘤系，其可获自例如Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego,California和American Type Culture Collection, Manassas, Virginia。还描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。(参见Kozbor, J. Immunol.,133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) 第51-63页))。

然后可就针对抗原的单克隆抗体的存在对杂交瘤细胞培养在其中的培养基进行测定。优选通过免疫沉淀法或通过体外结合测定法，例如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。这类技术和测定法是本领域已知的。例如，可通过Munson和Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)的Scatchard分析测定单克隆抗体的结合亲和力。此外，在单克隆抗体的治疗应用中，重要的是鉴定对靶抗原具有高特异性程度和高结合亲和力的抗体。

在鉴定出所需的杂交瘤细胞后，克隆可通过有限稀释方法亚克隆，并通过标准方法生长。(参见Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, AcademicPress, (1986), 第59-103页)。用于此目的的合适的培养基包括例如Dulbecco改进的Eagle培养基和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可在哺乳动物中作为腹水体内生长。

可通过常规免疫球蛋白纯化方法，例如A蛋白-琼脂糖凝胶、羟磷灰石层析法、凝胶电泳、透析或亲和层析法，从培养基或腹水流体中分离并纯化由亚克隆分泌的单克隆抗体。

还可通过例如描述于美国专利号4,816,567的重组DNA方法制备单克隆抗体。可采用常规方法(例如通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，容易地分离编码本发明的单克隆抗体的DNA并测序。本发明的杂交瘤细胞用作这类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将表达载体转染至不再另产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞(例如猿猴COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中实现单克隆抗体的合成。还可通过例如置换人重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠序列(参见美国专利号4,816,567；Morrison，Nature 368，812-13 (1994))或通过共价连接免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分，来修饰DNA。这类非免疫球蛋白多肽可取代本发明抗体的恒定结构域，或可取代本发明抗体的一个抗原结合部位的可变结构域以产生嵌合二价抗体。

完全人抗体是其中轻链和重链两者的完整序列(包括CDR)产生于人基因的抗体分子。这类抗体在本文被称为“人源化抗体”、“人抗体”或“完全人抗体”。可通过采用trioma技术；人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等, 1983 Immunol Today 4: 72))和产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(参见Cole等, 1985, 载于: Monoclonal Antibodies and CancerTherapy, Alan R. Liss, Inc., 第77-96页)，来制备人单克隆抗体。可使用人单克隆抗体，且可通过使用人杂交瘤(参见Cote等, 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030)或通过体外用EB病毒转染人B细胞(参见Cole等, 1985, 载于: MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., 第77-96页)，来产生人单克隆抗体。

另外，还可采用其它技术，包括噬菌体展示文库，产生人抗体。(参见Hoogenboom和Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581(1991))。同样，可通过将人免疫球蛋白基因座导入其中内源免疫球蛋白基因部分或完全失活的转基因动物(例如小鼠)中，来制备人抗体。在攻击时，观察到人抗体产生，这在所有方面都极类似于在人中所观察到的，包括基因重排、装配和抗体库。该方法描述于例如美国专利号5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016及Marks等,Bio/Technology 10, 779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)；以及Lonberg和Huszar,Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)。

另外可采用经修饰使得在响应抗原攻击时产生完全人抗体而非动物的内源抗体的转基因非人动物，来产生人抗体。(参见PCT公开文本WO94/02602)。使编码免疫球蛋白重链和轻链的内源基因在非人宿主中失能，并将编码人重链和轻链免疫球蛋白的活性基因座插入宿主的基因组中。例如，使用含有必要人DNA区段的酵母人工染色体，掺入人基因中。然后通过使含有少于修饰的完全互补序列的中间转基因动物杂交，获得提供所有所需修饰的动物作为子代。这类非人动物的优选实施方案是小鼠，称为Xenomouse^TM，正如PCT公开文本WO 96/33735和WO 96/34096所公开的。该动物产生分泌完全人免疫球蛋白的B细胞。抗体可直接获自用目标免疫原免疫的动物，例如多克隆抗体的制备物，或备选获自来源于动物的永生化B细胞，例如产生单克隆抗体的杂交瘤。此外，编码具有人可变区的免疫球蛋白的基因可恢复或表达以直接获得抗体，或可进一步修饰以获得抗体例如单链Fv (scFv)分子的类似物。

产生缺乏内源免疫球蛋白重链表达的非人宿主(以小鼠为例)的方法的实例公开于美国专利号5,939,598。还可通过这样的方法获得，所述方法包括自胚胎干细胞中的至少一个内源重链基因座缺失J区段基因以防止基因座的重排并防止重排免疫球蛋白重链基因座的转录物的形成，所述缺失通过含有编码选择标记的基因的打靶载体实现；并从胚胎干细胞产生其体细胞和生殖细胞含有编码选择标记的基因的转基因小鼠。

用于产生目标抗体(例如人抗体)的一种方法公开于美国专利号5,916,771。该方法包括将含有编码重链的核苷酸序列的表达载体导入培养中的哺乳动物宿主细胞中，将含有编码轻链的核苷酸序列的表达载体导入另一种哺乳动物宿主细胞中，并将两种细胞融合形成杂交细胞。杂交细胞表达含有重链和轻链的抗体。

在对该方法的进一步改进中，鉴定免疫原上的临床相关表位的方法和选择以高亲和力与相关表位免疫特异性结合的抗体的相关方法公开于PCT公开文本WO 99/53049。

可通过含有编码上述单链抗体的DNA区段的载体表达抗体。

这些可包括载体、脂质体、裸DNA、佐剂辅助DNA (adjuvant-assisted DNA)、基因枪、导管等。载体包括化学缀合物(描述于WO 93/64701，其具有打靶部分(例如细胞表面受体的配体)和核酸结合部分(例如聚赖氨酸))；病毒载体(例如DNA或RNA病毒载体)；融合蛋白(例如描述于PCT/US 95/02140 (WO 95/22618)，其是含有靶向部分(例如对靶细胞有特异性的抗体)和核酸结合部分(例如鱼精蛋白)的融合蛋白)；质粒；噬菌体等。载体可为染色体的、非染色体的或合成的。

优选的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病毒。优选DNA病毒载体。这些载体包括痘病毒载体(pox vector)例如正痘病毒或禽痘病毒载体(orthopox或avipox vector)；疱疹病毒载体例如单纯疱疹I病毒(HSV)载体(参见Geller, A. I.等, J. Neurochem, 64:487 (1995)；Lim, F.等, 载于DNA Cloning:Mammalian Systems, D. Glover编辑(Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995)；Geller, A. I.等, Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993)；Geller, A. I.等, Proc Natl. Acad. Sci USA 87:1149 (1990))；腺病毒载体(参见LeGal LaSalle等,Science, 259:988 (1993)；Davidson等, Nat. Genet 3:219 (1993)；Yang等, J. Virol.69:2004 (1995))和腺伴随病毒载体(参见Kaplitt, M. G.等, Nat. Genet. 8:148(1994))。

痘病毒载体将基因导入细胞的细胞质中。禽痘病毒载体只引起核酸的短期表达。优选腺病毒载体、腺伴随病毒载体和单纯疱疹病毒(HSV)载体以将核酸导入神经细胞中。腺病毒载体导致比腺伴随病毒(约4个月)短的表达(约2个月)，这进而比HSV载体短。所选的具体载体将取决于靶细胞和待治疗的病况。导入可通过标准技术进行，例如感染、转染、转导或转化。基因转移方式的实例包括例如裸DNA、CaPO₄沉淀、DEAE葡聚糖、电穿孔、原生质体融合、脂转染、细胞显微注射和病毒载体。

载体可用来实质上靶向任何所需的靶细胞。例如，可采用立体定位注射以将载体(例如腺病毒、HSV)引导至所需位置。此外，可使用小型泵输注系统，例如SynchroMed输注系统，通过脑室内(icv)输注递送颗粒。也已证实基于称为对流的总体流动的方法在将大分子递送至脑的延伸区域是有效的，并可用于将载体递送至靶细胞。(参见Bobo等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91:2076-2080 (1994)；Morrison等, Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994))。可采用的其它方法包括导管、静脉内、胃肠外、腹膜内和皮下注射及口服或其它已知的给药途径。

可使用这些载体以表达可以多种方式使用的大量抗体。例如检测样品CCR4的存在。还可用来尝试与CCR4结合并破坏CCR4活性。抗体。

可改编用于产生对本发明的抗原蛋白有特异性的单链抗体的技术(参见例如美国专利号4,946,778)。另外，可改编用于构建F_ab表达文库的方法(参见例如Huse等, 1989Science 246: 1275-1281)，以允许快速有效地鉴定具有对蛋白质或其衍生物、片段、类似物或同系物有特异性的单克隆F_ab片段。含有蛋白质抗原的个体遗传型的抗体片段可通过本领域已知技术产生，包括但不限于：(i)通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F_(ab')2片段；(ii)通过还原F_(ab')2片段的二硫桥产生的F_ab片段；(iii)通过抗体分子用木瓜蛋白酶和还原剂处理产生的F_ab片段和(iv) F_v片段。

杂缀合物抗体也在本发明的范围内。杂缀合物抗体由2种共价连接的抗体组合。这类抗体被提议为例如使免疫系统细胞靶向不需要的细胞(参见美国专利号4,676,980)和用于治疗HIV感染(参见WO 91/00360、WO 92/200373、EP 03089)。预期可采用合成蛋白质化学的已知方法，包括涉及交联剂的方法，体外制备抗体。例如，免疫毒素可使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键构建。用于该目的的合适的试剂的实例包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-mercaptobutyrimidate和公开于例如美国专利号4,676,980中的那些。杂缀合物抗体也可指双特异性抗体，其中双特异性抗体由例如2个共价连接的单链抗体或scFv，或2个共价连接的来自识别不同抗原的两种抗体的可变重链-可变轻链二聚体组成。

对于效应子功能，可能需要修饰本发明的抗体，以提高例如抗体在治疗癌症中的疗效。例如，可将半胱氨酸残基引入Fc区，因此允许这个区中的链间二硫键形成。由此产生的同二聚体抗体可具有改进的内化能力和/或升高的补体介导的细胞杀死和依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。(参见Caron等, J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992)和Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992))。或者，抗体可经工程改造以具有双重Fc区，因此可具有提高的补体溶解和ADCC能力。(参见Stevenson等, Anti-Cancer DrugDesign, 3: 219-230 (1989))。

本发明还涉及包含与细胞毒性剂例如毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)缀合的抗体的免疫缀合物。

可使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、塑莲根毒蛋白A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢菌霉素。可获得用于产生放射性缀合的抗体的各种放射性核素。实例包括²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。

使用各种双官能蛋白质偶联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亚氨基噻烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(例如己二酰亚胺二甲酯HCL)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己烷二胺)、双-重氮衍生物(例如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯类(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)，制备抗体和细胞毒性剂的缀合物。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可按Vitetta, Science 238: 1098 (1987)所述制备。碳-14标记的1-异硫氰酸基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核苷酸(radionucleotide)与抗体缀合的示例性螯合剂(参见WO94/11026)。

本领域普通技术人员应认识到，各种各样可能的部分可与所得抗体或本发明的其它分子偶联。(参见例如"Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology andImmunology, J. M. Cruse和R. E. Lewis, Jr (编辑), Carger Press, New York,(1989)，其全部内容通过引用并入本文)。

偶联可通过使两种分子结合的任何化学反应实现，只要抗体和另一部分保留其各自的活性。这种连接可包括许多化学机制，例如共价结合、亲和力结合、插入、配位结合和络合。然而优选的结合是共价结合。共价结合可通过现有侧链的直接缩合或通过外部桥接分子的掺入实现。许多二价或多价连接剂可用于将蛋白质分子(例如本发明的抗体)与其它分子偶联。例如，代表性偶联剂可包括有机化合物例如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺、二异氰酸酯、戊二醛、重氮基苯和己二胺。该列表无意穷尽本领域已知的各种类别的偶联剂，而相反只是典型的更常见的偶联剂。(参见Killen和Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549(1984)；Jansen等, Immunological Reviews 62:185-216 (1982)；以及Vitetta等,Science 238:1098 (1987))。优选的接头描述于文献中。(参见例如描述MBS (M-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯的使用的Ramakrishnan, S.等, Cancer Res. 44:201-208 (1984))。另参见美国专利号5,030,719，其描述了通过寡肽接头与抗体偶联的卤化乙酰基酰肼衍生物的使用。特别优选的接头包括：(i) EDC (1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐；(ii) SMPT (4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基(pridyl)-联硫基)-甲苯((Pierce Chem. Co.，目录(21558G)；(iii) SPDP (琥珀酰亚胺基-6-[3-(2-吡啶基联硫基)丙酰胺基]己酸酯(Pierce Chem. Co.，目录号21651G)；(iv)磺基-LC-SPDP己酸(磺基琥珀酰亚胺基-6-[3-(2-吡啶基联硫基)-丙酰胺]酯(Pierce Chem. Co.目录号2165-G)；和(v)与EDC缀合的磺基-NHS (N-羟基磺基-琥珀酰亚胺：Pierce Chem. Co.，目录号24510)。

上述接头含有具有不同属性的组分，因此产生具有不同生理化学性质的缀合物。例如，烷基羧酸酯的磺基-NHS酯比芳族羧酸酯的磺基-NHS酯稳定。与磺基-NHS酯相比，含NHS-酯的接头较不溶解。此外，接头SMPT含有位阻二硫键，并可形成稳定性提高的缀合物。二硫键与其它健相比一般较不稳定，因为二硫键体外被切割，导致可获得较少的缀合物。具体地说，磺基-NHS可提高碳二亚胺偶联物的稳定性。碳二亚胺偶联物(例如EDC)当与磺基-NHS联用时，形成比仅碳二亚胺偶联反应更耐水解的酯。

在一些实施方案中，将突变引入mAb的恒定区，使得mAb的依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性改变。例如，突变是CH2结构域中的LALA突变，其中Fc区第234和235位的亮氨酸突变成丙氨酸，并消除被特异性Fc受体结合。一方面，mAb在异二聚体mAb的一个scFv分子上含有突变，这降低ADCC活性。另一方面，mAb在异二聚体mAb的两条链上含有突变，这完全消除ADCC活性。例如，引入mAb的一个或两个scFv分子的突变是CH2结构域中的LALA突变。可优化具有ADCC活性的这些mAb，使得mAb对表达被mAb识别的一种抗原的细胞显示最大选择性杀灭，然而对被mAb识别的第二种抗原显示最小杀灭。

本文公开的抗体还可作为免疫脂质体配制。含有抗体的脂质体通过描述于例如以下的本领域已知方法制备：Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688(1985)；Hwang等, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)以及美国专利号4,485,045和4,544,545。循环时间延长的脂质体公开于美国专利号5,013,556。

特别有用的脂质体可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发方法产生。使脂质体通过规定孔径的过滤器流出，得到具有所需直径的脂质体。可按Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)所述通过二硫化物交换反应使本发明抗体的Fab’片段与脂质体缀合。

针对CCR4的抗体的用途

用于筛选具有所需特异性的抗体的方法包括但不限于酶联免疫吸附测定法(ELISA)和本领域已知的其它免疫介导的技术。

可将针对CCR4蛋白(或其片段)的抗体用于本领域内已知的涉及CCR4蛋白的定位和/或定量的方法中(例如用于测量合适生理样品内的CCR4蛋白的水平、用于诊断方法、用于使蛋白质成像等)。在规定的实施方案中，含有抗体来源的抗原结合结构域、对CCR4蛋白或其衍生物、片段、类似物或同系物有特异性的抗体用作药理学活性化合物(下文称为“治疗剂”)。

可通过标准技术，例如免疫亲和层析法或免疫沉淀法，使用对本发明的CCR4蛋白有特异性的抗体分离CCR4多肽。在诊断上可使用针对CCR4蛋白(或其片段)的抗体以监测组织中的蛋白质水平作临床试验程序的一部分，例如以确定规定治疗方案的功效。可通过使抗体与可检测物质偶联(即物理连接)促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的实例包括链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括萤光素酶，萤光素和水母发光蛋白；而合适的放射性物质的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

本发明的抗体，包括多克隆、单克隆、人源化和完全人抗体可用作治疗剂。所述治疗剂一般可用来治疗或预防受试者的癌症，提高疫苗效力或提高天然免疫应答。将抗体制备物、优选对于靶抗原具有高特异性和高亲和力的抗体制备物给予受试者，并且由于其与靶标结合通常会发挥作用。给予抗体可破坏或抑制或干扰CCR4蛋白的活性。

治疗有效量的本发明的抗体一般涉及实现治疗目的所需的量。如上所述，这可以是抗体及其靶抗原之间的结合相互作用，这在某些情况下干扰靶标的功能。需要给予的量此外将取决于抗体对其特异性抗原的结合亲和力，并且还将取决于从其所给予的其它受试者的自由体积中耗减所给予的抗体的速率。以非限制性实例来说，治疗有效剂量的本发明的抗体或抗体片段的常见范围可为约0.1 mg/kg体重-约50 mg/kg体重。常见的给药频率的范围可为例如每天两次至一周一次。

可以药物组合物的形式给予特异性结合本发明的CCR4蛋白或其片段的抗体以及通过本文公开的筛选测定法鉴定的其它分子以治疗癌症或其它增殖性病症。在Remington:The Science And Practice Of Pharmacy 第19版. (Alfonso R. Gennaro等编辑) MackPub. Co., Easton, Pa., 1995；Drug Absorption Enhancement: Concepts,Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers,Langhorne, Pa., 1994；以及Peptide And Protein Drug Delivery (Advances InParenteral Sciences, 第4卷), 1991, M. Dekker, New York中提供了涉及制备这类组合物的原理和考虑事项以及选择组分的指导。

当使用抗体片段时，优选与靶蛋白的结合结构域特异性结合的最小抑制片段。例如，根据抗体的可变区序列，可设计肽分子以保持结合靶蛋白序列的能力。这类肽可化学合成和/或通过重组DNA技术产生。(参见例如Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90: 7889-7893 (1993))。制剂还可含有待治疗的具体适应症所需的一种以上的活性化合物，优选不会彼此不利影响的具有补充活性的活性化合物。备选或另外，组合物可包含提高其功能的作用剂，例如细胞毒性剂、细胞因子、化疗剂或生长抑制剂。这类分子适宜以对预期目的是有效的量组合存在。

还可将活性成分包封在例如分别通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊(例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊)；胶态药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳、纳米粒和纳米胶囊)或粗乳状液中。

待用于体内给药的制剂必须是无菌的。这容易通过经无菌滤过膜过滤实现。

可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质为成型制品的形式，例如膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇)、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DEPOT ^TM (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的注射用微球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物(例如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸)使得能够释放分子超过100天，但某些水凝胶释放蛋白质较短的时间。

本发明的抗体可用作检测样品中CCR4 (或其蛋白质或蛋白质片段)存在的作用剂。优选抗体含有可检测标记。抗体可为多克隆，或更优选为单克隆。可使用完整抗体或其片段(例如F_ab、scFv或F_(ab)2)。关于探针或抗体，术语“标记的”旨在包括通过使可检测物质与探针或抗体偶联(即物理连接)直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一种试剂反应间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括如下检测第一抗体：使用荧光标记的第二抗体和用生物素末端标记DNA探针使得它可用荧光标记的链霉抗生物素检出。术语“生物样品”旨在包括自受试者分离的组织、细胞和生物流体，以及存在于受试者内的组织、细胞和流体。因此，术语“生物样品”用法范围内包括血液和血液的部分或组分(包括血清、血浆)或淋巴。也就是说，本发明的检测方法可用来体外以及体内检测生物样品中的分析物mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，用于检测分析物mRNA的体外技术包括RNA杂交和原位杂交。用于检测分析物蛋白质的体外技术包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和免疫荧光法。用于检测分析物基因组DNA的体外技术包括DNA杂交。用于进行免疫测定法的程序描述于例如“ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology”,第42卷, J. R. Crowther (编辑) Human Press, Totowa, NJ, 1995；“Immunoassay”, E.Diamandis和T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996；以及“Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”, P. Tijssen, Elsevier SciencePublishers, Amsterdam, 1985。此外，用于检测分析物蛋白质的体内技术包括将标记的抗分析物蛋白质抗体引入受试者中。例如，抗体可用放射性标记进行标记，所述放射性标记在受试者中的存在和位置可通过标准成像技术检测。

药物组合物

可将本发明抗体或作用剂(本文亦称为“活性化合物”)及其衍生物、片段、类似物和同系物掺入适于给药的药物组合物中。这类组合物通常包含抗体或作用剂和药学上可接受的载体。本文所用术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给予相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣材料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的载体描述于本领域的标准参考教材Remington’s Pharmaceutical Sciences的最近版本，其通过引用并入本文。这类载体或稀释剂的优选实例包括但不限于水、盐水、林格氏液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。还可使用脂质体和非水性载体例如固定油。用于药用活性物质的这类介质和作用剂的使用是本领域众所周知的。除了任何常规介质或作用剂与活性化合物相容以外，还考虑了其在组合物中的使用。还可将补充活性化合物掺入组合物中。

配制本发明的药物组合物与其既定给药途径相容。给药途径的实例包括胃肠外，例如静脉内、皮内、静脉内、口服(例如口用)、经皮(即局部)、跨黏膜和直肠给药。用于胃肠外、皮内或皮下应用的溶液剂或混悬剂可包括下列组分：无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂例如乙酸酯、柠檬酯或磷酸酯；和调节张度的物质例如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)调节pH。可将胃肠外制剂装入安瓿、一次性注射器或用玻璃或塑料制造的多剂量小瓶中。

适于注射用的药物组合物包括无菌水性溶液剂(其中是水溶性的)或用于无菌注射用溶液剂或分散剂的临用时制备的分散剂和无菌粉剂。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、注射用抑菌水、Cremophor EL™ (BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且就存在流畅注射性而言应是流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须针对微生物(例如细菌和真菌)的污染作用进行防腐。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可通过使用包衣材料例如卵磷脂、在分散体的情况下通过保持所需粒径和通过使用表面活性剂，保持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，实现微生物作用的防止。在许多情况下，优选可在组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、氯化钠。可在组合物中包括延迟吸收的物质(例如单硬脂酸铝和明胶)，来引起注射用组合物的吸收延长。

可通过将所需量的活性化合物与按需要与上列成分的一种或组合一起掺入合适的溶剂中，接着过滤除菌，来制备无菌注射用溶液剂。一般而言，分散剂通过将活性化合物掺入含有基础分散介质和上列所需的其它成分的无菌溶媒中来制备。在用于制备无菌注射用溶液剂的无菌粉剂的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，得到来自其前述除菌过滤溶液的活性成分加任何其它所需成分的粉剂。

口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载体。可将它们包封在明胶胶囊中或压制成片剂。对于口服治疗性给药的目的，活性化合物可与赋形剂一起掺入，并以片剂、含片或胶囊剂的形式使用。口服组合物还可以使用流体载体制备以用作漱口剂，其中流体载体中的化合物口内使用、漱口并吐出或吞咽。可包括药物上相容的粘合剂和/或辅料作为组合物的部分。片剂、片剂、胶囊剂、含片等可含有下列成分的任一种或类似性质的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖、崩解剂例如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂例如胶态二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或矫味剂例如欧薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味料。

对于吸入给药，从含有合适抛射剂(例如二氧化碳等气体)的加压容器或分配器中以喷雾剂的形式递送化合物。

全身给药还可通过跨黏膜或经皮手段。对于跨黏膜或经皮给药，在制剂中使用适于通过待渗透的屏障的渗透剂。这类渗透剂通常是本领域已知的，且对于跨黏膜给药包括洗涤剂、胆盐和梭链孢酸衍生物。跨黏膜给药可通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂完成。对于经皮给药，按本领域普遍已知的，将活性化合物配制成软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂。

还可以栓剂(例如用常规栓剂基料例如可可脂和其它甘油酯)或滞留型灌肠剂的形式制备化合物用于直肠递送。

在一个实施方案中，活性化合物用保护化合物免于从身体快速清除的载体制备，例如控释制剂，包括植入剂和微囊化递送系统。可使用生物可降解的生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这类制剂的方法对本领域技术人员而言将是显而易见的。原料还可市购获自Alza Corporation和NovaPharmaceuticals，Inc。脂质体混悬液(包括靶向用抗病毒抗原的单克隆抗体感染的细胞的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。这些可按照本领域技术人员已知的方法例如美国专利号4,522,811中的描述制备。

尤其有利的是将口服或胃肠外组合物配制在剂量单位形式中以易于给药剂量均匀性。本文所用剂量单位形式是指适于作为待治疗的受试者的单位剂量的物理离散单位；各单位含有经计算产生所需治疗作用的预定量的活性化合物以及所需要的药用载体。本发明的剂量单位形式的规格受制于并直接取决于活性化合物的独特性质和要达到的具体治疗作用及配混用于治疗个体的这类活性化合物领域中的固有限制。

药物组合物可与给药说明一起包括在容器、药包或分配器中。

筛选方法

本发明提供用于鉴定调节或以别的方式干扰CCR4活性的调节剂，即候选或试验化合物或物质(例如肽、肽模拟物、小分子或其它药物)的方法(本文亦称为“筛选测定法”)。还提供鉴定可用于治疗癌症的化合物的方法。本发明还包括采用本文所述筛选测定法鉴定的化合物。

例如，本发明提供用于筛选调节CCR4碳酸酐酶活性的候选或试验化合物的测定法。本发明的试验化合物可采用本领域已知的组合文库方法中的多种方法获得，包括：生物文库；空间可寻址平行固相或溶液相文库；需要去卷积的合成文库方法；“一珠粒一化合物(one-bead one-compound)”文库方法；和采用亲和层析选择的合成文库方法。生物文库方法限于肽文库，而其它4种方法适用于肽、非肽寡聚体或化合物的小分子文库。(参见例如Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145)。

本文所用“小分子”意指分子量小于约5 kD、最优选小于约4 kD的组合物。小分子可为例如核酸、肽、多肽、肽模拟物、糖、脂质或其它有机或无机分子。化学和/或生物学混合物(例如真菌、细菌或藻类提取物)的文库是本领域已知的，并可采用本发明的任何测定法筛选。

用于分子文库合成的方法的实例可见于例如：DeWitt等, 1993. Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909；Erb等, 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:11422；Zuckermann等, 1994. J. Med. Chem. 37: 2678；Cho等, 1993. Science 261:1303；Carrell等, 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059；Carell等, 1994.Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061；以及Gallop等, 1994. J. Med. Chem. 37:1233。

化合物的文库可如下提供：在溶液中(参见例如Houghten, 1992. Biotechniques13: 412-421)或珠粒上(参见Lam, 1991. Nature 354: 82-84)、芯片上(参见Fodor,1993. Nature 364: 555-556)、细菌(参见美国专利号5,223,409)、孢子(参见美国专利5,233,409)、质粒(参见Cull等, 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869)或噬菌体上(参见Scott和Smith, 1990. Science 249: 386-390；Devlin, 1990. Science249: 404-406；Cwirla等, 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382；Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310和美国专利号5,233,409)。

在一个实施方案中，将候选化合物引入抗体-抗原复合物中，并测定候选化合物是否破坏抗体-抗原复合物，其中这种复合物的破坏表明候选化合物调节CCR4活性。

在另一个实施方案中，提供至少一种CCR4蛋白，其暴露于至少一种中和单克隆抗体中。检测抗体-抗原复合物的形成，将一种或多种候选化合物引入复合物中。如果在引入一种或多种候选化合物后抗体-抗原复合物遭破坏，则候选化合物可用于治疗癌症或增殖性疾病或病症，特别是肾增殖性病症。

可如下实现试验化合物干扰或破坏抗体-抗原复合物的能力的测定：通过例如使试验化合物与放射性同位素或酶促标记偶联，使得可通过检测复合物中标记的化合物，测定试验化合物与抗原或其生物活性部分的结合。例如，试验化合物可用¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³H直接或间接标记，且通过放射性发射的直接计数或通过闪烁计数来检测放射性同位素。或者，试验化合物可用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或萤光素酶进行酶促标记，且通过测定合适底物至产物的转化，来检测酶促标记。

在一个实施方案中，所述测定法包括使抗体-抗原复合物与试验化合物接触，并测定试验化合物与抗原相互作用或以别的方式破坏现有抗体-抗原复合物的能力。在这个实施方案中，测定试验化合物与抗原相互作用和/或破坏抗体-抗原复合物的能力包括试验化合物与抗体相比与抗原或其生物活性部分优先结合的能力。

在另一个实施方案中，所述测定法包括使抗体-抗原复合物与试验化合物接触，并测定试验化合物调节抗体-抗原复合物的能力。可通过例如测定在试验化合物存在下抗原与抗体结合或相互作用的能力，实现试验化合物调节抗体-抗原复合物的能力的测定。

本领域技术人员应认识到，在本文公开的任何筛选方法中，抗体可以是CCR4中和抗体。此外，抗原可以是CCR4蛋白或其部分(例如CA结构域)。

本文公开的筛选方法可以基于细胞的测定法或不含细胞的测定法进行。在不含细胞的测定法包括CCR4蛋白的膜结合形式的情况下，可能需要使用增溶剂使得蛋白质的膜结合形式保持在溶液中。这类增溶剂的实例包括非离子洗涤剂例如n-辛基葡糖苷、n-十二烷基葡糖苷、n-十二烷基麦芽糖苷、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺、Triton^® X-100、Triton^® X-114、Thesit^®、异十三烷基聚(乙二醇醚)_n、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸酯、3-(3-胆酰胺丙基)二甲基amminiol-1-丙磺酸酯(CHAPS)或3-(3-胆酰胺丙基)二甲基amminiol-2-羟基-1-丙磺酸酯(CHAPSO)。

在不止一个实施方案中，可能需要固定抗体或抗原以利于在引入候选化合物后从一种或两种非复合形式中分离复合形式，以及适应测定的自动化。在选化合物存在和不存在时抗体-抗原复合物的观察可在适于装有反应物的任何容器中完成。这类容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可提供添加允许蛋白质的一种或两种与基质结合的结构域的融合蛋白。例如，GST-抗体融合蛋白或GST-抗原融合蛋白可吸附到谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠粒(Sigma Chemical, St. Louis, MO)或谷胱甘肽衍生化微量滴定板上，然后与试验化合物混合，并在有助于复合物形成的条件下(例如在盐和pH的生理条件下)孵育混合物。在孵育后，洗涤珠粒或微量滴定板孔以除去任何未结合的组分，在珠粒的情况下为固定的基质，直接或间接测定复合物。或者，复合物可从基质上解离，抗体-抗原复合物形成的水平可采用标准技术测定。

用于将蛋白质固定在基质上的其它技术也可用于本发明的筛选测定法。例如，可利用生物素和链霉抗生物素的缀合使抗体或抗原(例如CCR4蛋白或其CA结构域)固定。可采用本领域众所周知的技术(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，Ill.)，从生物素-NHS (N-羟基-琥珀酰亚胺)制备生物素化抗体或抗原分子，并固定在链霉抗生物素包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。或者，与抗体或目标抗原起反应但不干扰目标抗体-抗原复合物的形成的其它抗体可被衍生化至板的孔中，且未结合的抗体或抗原通过抗体缀合被捕获在孔中。除本文所述用于GST固定化复合物的方法以外，用于检测这类复合物的方法包括使用与抗体或抗原起反应的这类其它抗体的复合物的免疫检测。

本发明另涉及通过前述筛选测定法的任一种鉴定的新的作用剂及其如上文所述用于治疗的用途。

诊断测定

可通过合适的测定法，例如常规的免疫测定法类型，检测本发明的抗体。例如，可进行其中将CCR4蛋白或其片段(例如CA结构域)在固相中固定的夹心测定法。保持孵育持续足够的一段时间以允许样品中的抗体与固相上的固定化多肽结合。在这最初的孵育之后，将固相从样品中分离。洗涤固相以除去未结合的物质和干扰物质例如也可存在于样品中的非特异性蛋白质。随后使含有与固定化多肽结合的目标抗体的固相与第二标记的抗体或与偶联剂(例如生物素或抗生物素蛋白)结合的抗体一起孵育。该第二抗体可以是另一种抗CCR4抗体或另一种抗体。抗体的标记是本领域众所周知的，包括放射性核素、酶(例如马来酸脱氢酶、辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶、过氧化氢酶)、荧光素(fluors) (异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻蓝蛋白、荧光胺)、生物素等。使标记的抗体与固体一起孵育，并测量与固相结合的标记。本领域的普通技术人员可容易地进行这些和其它免疫测定法。

本发明的抗CCR4抗体和scFv抗体，当与可检测部分连接时，提供用于检测“癌性组织”或倾向于异常细胞增殖因此有癌症风险的组织的手段。例如，除由原位瘤变所致变成癌性的组织以外，抗体-可检测部分缀合物还提供检测存在于远端器官和/或组织中的癌性转移组织的方法。因此这类组织可如下检测：通过在促使检出癌性组织中的可检测部分的合适条件下使疑似癌性组织与抗体-可检测部分接触，从而检测癌性组织的存在。

可检测部分可与抗体或片段直接缀合或通过使用例如荧光第二抗体间接缀合。直接缀合可通过例如荧光团与抗体或抗体片段的标准化学偶联或通过基因工程完成。可构建含有与荧光或生物发光蛋白质偶联的抗体或抗体片段的嵌合体或融合蛋白。例如，Casadei等人描述了制备能够在哺乳动物细胞中表达水母发光蛋白和抗体基因的融合蛋白的载体构建体的方法。

关于探针或抗体的本文所用术语“标记的”旨在包括通过使可检测物质与探针或抗体偶联(即物理连接)直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一种试剂反应间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括如下检测第一抗体：使用荧光标记的第二抗体和用生物素末端标记DNA探针使得它可用荧光标记的链霉抗生物素检出。术语“生物样品”旨在包括自受试者分离的组织、细胞和生物流体(例如活检样品)，以及存在于受试者内的组织、细胞和流体。也就是说，本发明的检测方法可用来体外以及体内检测生物样品的癌症、癌细胞或癌症相关细胞(例如与肿瘤或癌细胞有关的基质细胞)。例如，用于检测CCR4的体外技术包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和免疫荧光法。此外，用于检测CCR4的体内技术包括将标记的抗CCR4抗体引入受试者中。例如，抗体可用放射性标记进行标记，所述放射性标记在受试者中的存在和位置可通过标准成像技术检测。在实施方案中，本发明提供检测受试者的肿瘤或癌细胞的非侵入性方法。给予受试者本发明的抗体或scFv抗体，其中抗体与可检测部分(即通过例如荧光、化学、化学发光、放射性或本领域已知的其它手段能够检出的任何部分)连接，允许抗体定位于肿瘤，然后通过观察可检测部分检出。

在“靶向”缀合物的情况下，也就是说含有打靶部分(经设计使缀合物定位于受试者或动物内的一个或多个具体部位的分子或特征)的缀合物的情况下，定位是指当在受试者内在结合的“被定位”实体和未结合的“游离”实体之间基本上达到平衡时的状态。达到所述平衡时的速率取决于给药途径。例如，通过静脉内注射给予以定位于血栓的缀合物可在注射的几分钟内在血栓处定位或蓄积。另一方面，通过口服给予以定位于肠中的感染的缀合物可能花几小时达到定位。或者，定位可能只是指在给予实体后的选定时间受试者或动物内该实体的位置。再举例来说，在给予后当某一部分得以分布时，定位得以实现。

在所有上述情况下，本领域技术人员可对实现定位的时间进行合理估计。此外，可按照本发明的方法，例如用光电探测器，通过使可检测部分(例如发光缀合物)成像，跟踪随时间变化的定位的状态。所用的“光电探测器”应具有足够高灵敏度使得能够在合理的时间内使哺乳动物内的微光成像，并利用来自该仪器的信号绘制图像。

在其中可能使用极明亮的发光部分和/或检测定位于待成像的受试者或动物表面附近的发光融合蛋白的情况下，可使用一副“夜视”镜或标准高灵敏度摄影机，例如SiliconIntensified Tube (SIT)摄影机(例如来自Hammamatsu Photonic Systems,Bridgewater, N.J.)。然而，更通常需要更灵敏的光检测方法。

在极低的光水平下，每单位面积的光子通量变得如此低，使得待成像的景物不再显得连续。相反地，使得它由在时间和空间两者上彼此不同的光子所代表。在临检器上观察时，这类图像似乎是光闪烁点，每个代表了单个检出的光子。通过累计数字图像处理器中随时间推移的这些检出光子，可获取并绘制图像。与其中给每个图像点指派强度值的常规摄影机形成对比，在光子计数成像中信号的振幅没有意义。目的只是检测信号(光子)的存在并圣信号随时间推移相对于其位置的出现计数。

下述至少两种类型的光电探测器可检测各个光子并产生可通过图像处理器分析的信号。与放大光子信号不同，减噪光检测器(Reduced-Noise Photodetection device)通过降低光子检测器的本底噪声达到灵敏度。噪声主要通过使检测器阵列冷却来降低。器件包括称为“薄背式(backthinned)”冷却CCD摄影机的电荷耦合器件(CCD)摄影机。在更灵敏的仪器中，冷却通过例如液氮(其使CCD阵列的温度达到约-120℃)实现。“薄背式”是指缩短待检测的光子跟踪、从而提高量子效率的光程长度的超薄背板。特别灵敏的薄背式低温CCD摄影机是可获自Photometrics, Ltd. (Tucson, Ariz.)的“TECH 512”，系列200摄影机。

“光子放大器”在它们击中检测屏前放大光子。这个类别包括带有增强器(例如微通道增强器(microchannel intensifier))的CCD摄影机。微通道增强器通常含有与摄影机的检测屏垂直和同延伸的金属通道阵列。微通道阵列置于待成像的样品、受试者或动物和摄影机之间。进入阵列的通道中的大多数光子在离开前接触通道侧面。施加在阵列上的电压导致从各光子碰撞中释放许多电子。来自这类碰撞的电子以“散弹”方式离开其起始通道，并由摄影机检测。

可通过连续引入增强性微通道阵列，使得在第一阶段产生的电子进而引起第二阶段的电子的放大信号，达到甚至更大的灵敏度。然而，灵敏度的增加在损失空间分辨率的情况下达到，所述空间分辨率随每个额外的放大阶段而降低。示例性基于微通道增强器的单光子检测器是可获自Hamamatsu的C2400系列。

图像处理器处理由光电探测器产生的信号，所述光电探测器对光子计数以绘制例如可在监视器上显示或在图像打印机上打印的图像。这类图像处理器通常作为包括上述灵敏的光子计数摄影机的系统的一部分出售，因此可获自相同来源。图像处理器常常与个人计算机(例如IBM兼容性PC或Apple Macintosh (Apple Computer, Cupertino, Calif.))连接，所述计算机可作为购买的成像系统的一部分包括或不包括在内。一旦图像为数字化文件的形式，它们便可通过各种图像处理程序(例如“ADOBE PHOTOSHOP”、Adobe Systems、Adobe Systems, Mt. View, Calif.)操作并打印。

在一个实施方案中，生物样品含有来自试验受试者的蛋白质分子。一种优选的生物样品是通过常规方法从受试者中分离的外周血白细胞样品。

本发明还包括用于检测生物样品中CCR4或表达CCR4的细胞的存在的试剂盒。例如，试剂盒可包含：能够检测生物样品中的癌细胞或肿瘤细胞的标记的化合物或作用剂(例如抗CCR4 scFv或单克隆抗体)；用于测定样品中的CCR4的量的工具；和用于将样品中的CCR4的量与标准物进行比较的工具。在一些实施方案中，标准物是非癌细胞或其细胞提取物。可将化合物或作用剂包括在合适的容器中。试剂盒另可包括使用试剂盒检测样品中的癌症的使用说明。

双特异性抗体

双特异性抗体(bsAb)是包含2个可变结构域或scFv单元的抗体，使得所得抗体识别2种不同的抗原。本发明提供识别CCR4和第二抗原的双特异性抗体。示例性第二抗原包括肿瘤相关抗原、细胞因子和细胞表面受体。在一些实施方案中，第二抗原可以是CAIX (碳酸酐酶IX或G250)、PD-L1、IL21、IL21R、HVEM、CD160、TIM3或GAL9。

本发明的双特异性抗体包括重链和轻链组合或本文公开的CCR4-IgG4抗体的scFv。

本发明的双特异性抗体可采用本领域已知方法构建。在一些实施方案中，双特异性抗体是单一多肽，其中各识别不同抗原的2个不同的重链-轻链异二聚体或2个不同的scFv抗体或其片段通过足够长度的接头多肽连接，以允许2个scFv分子间的分子内缔合以形成具有2条重链和2条轻链的双特异性抗体。在一个实施方案中，scFv分子之一识别CCR4，例如本文所述scFv抗体的任一种。在其它实施方案中，双特异性抗体由通过共价或非共价键连接的一个以上多肽(例如2个单独的scFv抗体或其片段)组成，其中scFv抗体之一识别CCR4。

在一个实施方案中，双特异性抗体采用“孔中结(knob into hole)”方法构建(Ridgway等, Protein Eng 7:617-621 (1996))。在该方法中，使2个不同的可变结构域的Ig重链还原以选择性的断开重链配对同时保留重链-轻链配对。将识别2个不同的抗原的2个重链-轻链异二聚体混合以促进异质连接配对，这通过工程改造的CH3结构域的“孔中结”介导。

在另一个实施方案中，可通过来自两个或更多个不同抗体的重链-轻链异二聚体交换产生其中第一重链-轻链异二聚体识别CCR4和第二重链-轻链异二聚体识别第二抗原的杂合抗体，来构建双特异性抗体。用于产生由2个来自2种不同抗体的重链-轻链异二聚体组成的双特异性抗体的机制类似于人IgG4的形成，其还起双特异性分子的作用。IgG重链的二聚化受分子内力的驱动，例如使各重链的CH3结构域和二硫桥配对。CH3结构域中特定氨基酸的存在(R409)显示促进二聚体交换和IgG4分子的构建。抗体铰链区中的重链间二硫桥还进一步稳定重链配对。具体地说，在IgG4中，铰链区在氨基酸226-230含有氨基酸序列Cys-Pro-Ser-Cys (与含有序列Cys-Pro-Pro-Cys的稳定的IgG1铰链区相比)。229位处丝氨酸的这种序列差异与IgG4在铰链区中形成新的链内二硫键的趋势有关(Van der NeutKolfschoten, M.等, 2007, Science 317:1554-1557和Labrijn, A.F.等, 2011,Journal of immunol 187:3238-3246)。

在另一个实施方案中，谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物的使用可用于从2种截然不同的完全抗体产生双特异性抗体。例如，使其各识别不同抗原的完全抗体与还原谷胱甘肽一起孵育以将抗体分成重链-轻链异二聚体或分子。可将重链-轻链异二聚体与氧化谷胱甘肽(GSSG)混合，这允许重新装配和再次氧化以形成高纯的双特异性抗体。

因此，本发明的双特异性抗体可如下产生：通过将R409残基引入CH3结构域并将Cys-Pro-Ser-Cys序列引入识别CCR4或第二抗原的抗体的铰链区，使得重链-轻链二聚体交换以产生识别CCR4的1个重链-轻链二聚体和识别第二抗原的第二重链-轻链二聚体的抗体分子，其中第二抗原是本文公开的任何抗原。还可加入还原剂(例如还原谷胱甘肽)促进交换，来提高重链-轻链异二聚体交换。如本文所公开的，还可改变已知的IgG4分子，使得重链和轻链识别CCR4或第二抗原。由于其中Fc区不同于其它IgG亚型的IgG4分子的固有特征所致(因为它与例如由某些白细胞表达的补体和Fc受体等免疫应答的效应器系统相互作用不佳)，构建本发明的双特异性抗体的该方法的应用可能是有益的。这种特殊性质使这些基于IgG4的双特异性抗体对治疗应用有吸引力，其中需要抗体结合靶标，并且在功能上改变与靶标有关的信号传导途径，但不引发效应子活性。

在一些实施方案中，将突变引入bsAb的恒定区，使得bsAb的依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性改变。例如，突变是CH2结构域中的LALA突变，其中Fc区第234和235位的亮氨酸突变成丙氨酸，且通过Fc受体消除结合。一方面，bsAb在异二聚体bsAb的一个scFv分子上含有突变，这降低ADCC活性。另一方面，bsAb在异二聚体bsAb的两条链上含有突变，这完全消除ADCC活性。例如，bsAb的一个或两个scFv分子引入的突变是CH2结构域的LALA突变。可使具有可变的ADCC活性的这些bsAb优化，使得bsAb显示针对表达被bsAb识别的一种抗原的细胞的最大选择性杀灭，然而显示针对被bsAb识别的第二抗原的最小杀灭。

本发明提供识别CCR和第二抗原的双特异性抗体。在一个实施方案中，第二抗原是PD-L1。在另一个实施方案中，第二抗原是CAIX。在其它实施方案中，第二抗原是CA-IX、PD-L1、IL21、IL21R、HVEM、CD160、TIM3、GITR、LAG3或GAL9。

本文公开的双特异性抗体可用于治疗疾病或医学病况，例如癌症。癌症是例如实体癌，例如肾细胞癌、乳腺癌或前列腺癌。在其它实施方案中，癌症是其中当与未患癌症的组织或受试者相比时CAIX、PD-L1或HVEM过量表达的癌症。本发明的双特异性抗体可用于治疗、预防或减轻癌症的症状。

本发明的双特异性抗体可用于增加T细胞增殖，其中T细胞是调节T细胞。本发明的双特异性抗体对于提高或加强T细胞应答(例如抗原特异性T细胞应答)可能是特别有用的。本发明的双特异性抗体还可用于逆转调节效应T细胞增殖的T细胞介导的抑制。

融合蛋白

本发明提供含有与第二蛋白质有效连接的本文公开的CCR4-IgG4抗体或其功能片段的融合蛋白。第二蛋白质可为例如细胞因子或生长因子。在特别优选的实施方案中，细胞因子是IL-2或TGF-β。在一些其它实施方案中，第二蛋白质可以是治疗剂，例如毒素或可检测部分，例如用于检测的荧光蛋白质。在一些实施方案中，本发明的CCR4-IgG4抗体可与一种以上其它的蛋白质或肽(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种其它的蛋白质或肽序列)有效连接。

在一些实施方案中，本文公开的CCR4-IgG4抗体或其功能片段与第二蛋白质直接连接。在其它实施方案中，CCR4-IgG4抗体或其功能片段通过接头(例如柔性多肽链)与第二蛋白质连接。接头可以是任何长度的任何合适的接头，但长度可为至少1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个氨基酸。在一个实施方案中，接头是天然存在于宿主的免疫球蛋白分子中的氨基酸序列，使得接头的存在不导致哺乳动物针对接头序列的免疫应答。包括一种以上的其它蛋白质与CCR4-IgG4抗体的本发明融合蛋白可具有连接各个其它蛋白质或肽序列的多个接头序列。

本发明的融合蛋白可通过技术人员已知的重组方法构建。例如，可使含有编码本发明的CCR4-IgG4抗体的核酸序列的表达载体与编码第二蛋白质的核酸序列有效连接，并可引入表达系统中以翻译和产生融合蛋白。或者，本领域技术人员应容易地利用从头蛋白质合成技术以产生本文所述融合蛋白。

治疗方法

本发明提供治疗有癌症风险(或易患癌症)的受试者或其它细胞增殖相关疾病或病症的预防性和治疗性方法两者。这类疾病或病症包括但不限于例如与CCR4异常表达有关的那些疾病或病症。例如，所述方法用于治疗、预防或减轻例如以下血癌的症状：皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、霉菌肉芽肿病(MF)、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤(皮肤ALCL)、塞扎里综合征(Sezary syndrome)或成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)。或者，所述方法用于治疗、预防或减轻例如肾细胞癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、宫颈癌、脑癌、肝癌、胰腺癌或胃癌等实体瘤的症状。在其它实施方案中，本发明的抗体，例如本发明的双特异性抗体可用于治疗特征在于过量表达CAIX、PD-L1、HVEM的肿瘤的癌症。例如，识别CAIX和CCR4的双特异性抗体可用于治疗具有过量表达CAIX的肿瘤的癌症。例如，识别PD-L1和CCR4的双特异性抗体可用于治疗具有过量表达PD-L1的肿瘤的癌症。例如，识别HVEM和CCR4的双特异性抗体可用于治疗具有过量表达HVEM的肿瘤的癌症。

因此，一方面，本发明提供通过给予受试者本发明的单克隆抗体或scFv抗体预防、治疗或减轻受试者癌症症状或细胞增殖性疾病或病症的方法。例如，CCR4-IgG4抗体可以治疗有效量给予。

有癌症或细胞增殖相关疾病或病症风险的受试者包括有癌症家族史的患者或暴露于已知或疑似致癌物的受试者。预防药的给药可发生在癌症显现之前，使得预防疾病或延迟其进展。

另一方面，通过使细胞与本发明的CCR4抗体接触抑制肿瘤细胞生长或降低抑制性T细胞活性。细胞是表达CCR4的任何细胞。例如细胞是T-细胞。

本发明还包括提高或增强对抗原的免疫应答的方法。通过给予受试者本发明的单克隆抗体或scFv抗体，提高或增强免疫应答。抗原是病毒(例如HIV)、细菌、真菌或肿瘤抗原。免疫应答是天然免疫应答。所谓天然免疫应答意指是感染的结果的免疫应答。感染是慢性感染。

或者，免疫应答是由于接种诱导的应答。因此，另一方面，本发明提供通过给予受试者本发明的单克隆抗体或scFv抗体和疫苗来提高疫苗效力的方法。抗体和疫苗序贯或同时给予。疫苗是肿瘤疫苗、细菌疫苗或病毒疫苗。

例如通过提高抗原特异性T效应子功能，加强免疫应答。

组合方法

本发明提供通过给予与CCR4蛋白的相同表位或备选CCR4蛋白的2个不同表位结合的2种抗体来治疗患者的癌症。此外，通过给予与CCR4结合的第一抗体和与CCR4以外的蛋白质结合的第二抗体治疗癌症。

此外，本发明提供与CCR4蛋白结合的抗体和抗肿瘤剂例如小分子、生长因子、细胞因子或包括例如肽、肽模拟物、拟肽、多核苷酸、脂质衍生的介质、小的生物胺、激素、神经肽和蛋白酶等生物分子在内的其它治疗剂的给药。小分子包括但不限于无机分子和有机小分子。合适的生长因子或细胞因子包括IL-2、GM-CSF、IL-12和TNF-α。小分子文库是本领域已知的。(参见Lam, Anticancer Drug Des., 12:145, 1997)。

在下列实施例中将进一步描述本发明，所述实施例不限制权利要求书中描述的本发明的范围。

实施例

实施例1：通用方法

抗体和流式细胞术分析

通过将单链可变区(scFv)与人IgG1 Fc区符合读框地克隆至pcDNA3.1-铰链载体并且通过将重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)克隆至TCAE5.3载体，构建mAb2-3和KM2760的IgG和scFv-Fc形式。对于IgG4克隆，免疫球蛋白重链恒定区γ 4的cDNA序列来自GenBank：BC111019.1，被用来替换TCAE5.3中的IgG1 Fc区，构建mAb2-3 IgG4。同样，还构建了IgG4的稳定形式(参见其它数据) (参见新的参考文献)。抗体在293T或293F细胞中产生，并通过A蛋白-琼脂糖凝胶(Amersham)亲和层析法纯化。

趋化性

将Treg细胞接种在37℃下、含或不含mAb2-3 IgG1或mAb2-3 IgG4的Transwell-迁移孔(5 μM孔隙；Corning)中3小时，并从含有来自IGROV-1、OVCAR-5或OVCAR-8细胞的条件培养基的底槽中收获迁移细胞。通过将迁移Treg的数目除以输入细胞的数目，计算迁移细胞的百分比。人CD4+ T细胞通过CD4+ T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotech)分离，并在37℃下与mAb2-3 IgG1或mAb2-3 IgG4一起置于Transwell-迁移测定法中3小时，如上在响应IGROV-1、OVCAR-5或OVCAR-8细胞的条件培养基时对迁移细胞(CD4+CD25高)进行计数。通过将迁移的CD4+CD25高细胞的数目除以具有相当CD4+和CD25+水平的输入细胞的数目，计算迁移细胞的百分比。

依赖抗体的细胞介导的细胞毒性测定法

ADCC测定法采用LDH释放测定方法进行。简单地说，SCID/Beige小鼠嗜中性粒细胞、人PBMC或纯化的人NK细胞和嗜中性粒细胞用作效应细胞，Mac-1、Cf2Th-CCR4或Cf2Th细胞用作靶细胞。将靶细胞以1×10⁴人细胞/孔的密度接种到96孔板中，然后加入合适浓度的抗体。在1小时孵育后，加入新的效应细胞以达到合适的E/T比例。在37℃下孵育(PBMC持续4小时，NK细胞持续16小时嗜中性粒细胞持续6小时)后，通过以300×g离心5分钟从各孔中回收上清液。上清液采用非放射性细胞毒性测定试剂盒(Promega，WI)测量。使用ELISA读数器，测定板在490 nm处的吸光度。对于51Cr释放测定法，将1×106个Mac-1细胞用100 μCi (3.7MBq)的Na51Cr (Amersham International)在37℃下标记1小时，充分洗涤，并用作靶标。将51Cr标记的靶细胞(5000个/孔)接种到96孔板中。实验以12.5:1、25:1和50:1的不同的PBMC(效应物)与Mac-1 (靶标)之比按一式三份进行，在37℃下孵育4小时，然后测定释放到上清液中的51Cr。细胞毒性通过下式进行：

%细胞毒性= 100×(E – SE – ST)/(M – ST)，其中E是来自与效应细胞和抗体一起孵育的靶细胞的LDH的实验释放，SE是来自效应细胞的LDH的自发释放，ST是来自靶细胞的LDH的自发释放，M是来自与10% triton-X一起孵育的靶细胞的LDH的最大释放。

调节T细胞抑制测定法

使用抗CD4和抗CD25抗体(Biolegend)，通过FACSCanto II流式细胞仪，分选CD4+CD25高和CD4+CD25-T细胞。在用结合的抗CD3 (0.05 µg/ml)和可溶性抗CD28 (1 µg/ml)抗体(Biolegend，CA)包被的圆底96孔板中在含或不含CD4+CD25高Treg (2500或1250个细胞)时培养CD4+CD25-Teff (2500个细胞)。在含或不含c1567IgG时将25,000个照射的(300rad)CD3耗减PBMC加入共培养的孔中。使用闪烁计数器，在第5天通过掺入3H-胸苷，测量T细胞的增殖。在所有分析中，使Teff在Treg共培养物中的百分比增殖归一化至Teff在单一Teff培养物中的增殖；对于该归一化，单一Teff培养物的增殖被视为100%。对于活化，将板用抗CD3在37℃下包被2小时，并用PBS洗涤两次。

荷有CCR4+ CTCL肿瘤的小鼠模型

在SCID/Beige小鼠(Charles River)中建立人类癌症异种移植物。给6周小鼠背外侧静脉内注射细胞。在注射24小时后，将小鼠随机分配到不同的治疗组，用3 mg/kg的mAb2-3IgG1或mAb2-3 IgG4和小鼠IgG4 (一周两次持续3周)或5 mg/kg的对照scFv-Fc、c1567-scFv-Fc、h1567-scFv-Fc治疗，并通过i.p.注射等体积的盐水(一周两次持续4周)。使用数字测径器或Xenogen成像，一周两次测量并监测小鼠体重和肿瘤大小。应用方程式长×(宽)2 × 0.52，计算肿瘤体积。按照Dana-Farber Cancer Institute动物管理和使用委员会的准则进行动物护理。

统计分析

应用双侧未配对斯氏t检验分析数据。对于所有分析，我们将0.05以下的P值视为显著。所有值表示为均值 ±标准差(S.D)。

应用GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA)，应用双因素ANOVA与Bonferroni事后检验和未配对双尾t检验进行统计分析。小于0.05的P值被视为在统计上显著的。

体外依赖抗体的细胞介导的细胞毒性测定法

按照生产商规定的CytoTox96非放射性细胞毒性测定程序(Promega，Madison，WI)，采用乳酸脱氢酶(LDH)释放测定方法进行ADCC。自SCID-BEIGE小鼠纯化的小鼠嗜中性粒细胞或来自PBMC的纯化的人NK细胞用作效应细胞，CCR4+ Mac1肿瘤细胞用作靶细胞。简单地说，将纯化的SCID-BEIGE小鼠嗜中性粒细胞或NK细胞以1 x 10⁴个细胞/孔的密度接种在存在h1567或11A微型抗体(minibodies)的圆底96孔板中。在孵育1小时后，以80:1 (小鼠嗜中性粒细胞)或2:1 (人NK细胞)的效应细胞-靶细胞比(E:T)加入新鲜制备的效应细胞。在37℃下孵育2小时后，通过以300xg离心5分钟取出各孔的上清液。通过测量490 nm波长下的吸光度，测定上清液的LDH活性。按照下式计算细胞毒性(%)：

%细胞毒性= 100 × (E – SE – ST)/(M – ST)，其中E是由效应物-靶标共培养物引起的LDH释放，SE是来自效应细胞LDH的自发释放，ST是来自靶细胞LDH的自发释放，M是来自用裂解溶液(10% Triton-X)孵育的靶细胞的LDH的最大释放。所有测量以一式三份进行。

实施例2：由CLL2介导的体外Treg化学吸引以剂量依赖性方式被mAB2-3 IgG4抑制

通过FACS针对CCR4配体CCL22的表达,测定卵巢癌细胞系IGROV-1、OVCAR-5和OVCAR-8。所有卵巢癌细胞系具有可观的CCL22表达水平，OVCAR-8除外。将来自3个癌细胞系每个的细胞培养上清液用于化学吸引测定法。具体地说，进行了transwell测定法以评价CD4+/CD25+Treg细胞至含有来自3个卵巢癌细胞系之一的上清液的transwell底槽的迁移。在具有卵巢癌细胞条件培养基的transwell中孵育的Treg引起细胞100%迁移至底槽。相比之下，其中底槽含有新鲜培养基的transwell测定引起Treg小于40%迁移至底槽。当底槽含有来自IGROV-1细胞或OVCAR-5细胞的上清液时，添加mAb2-3 IgG1或mAb2-3 IgG4任一个引起Treg至底槽的迁移显著减少。(参见图1A-B)。

mAb2-3 IgG4剂量对抑制人淋巴细胞迁移至含有CCL22丰富培养基transwell底槽的能力的作用表明，0.8μg/ml引起人淋巴细胞至底槽的迁移减少大于50%，而加入20μg/ml引起transwell的迁移几乎完全抑制。(参见图3B)。

实施例3：由CLL2介导的体内Treg化学吸引被mAB2-3 IgG4抑制

将INGROV-1细胞静脉内注射至无免疫应答的小鼠背外侧，接着生长一段时间。小鼠随后接受用萤光素酶标记的Treg细胞(CD4+/CD25+/CD127dim/-)的尾静脉注射。这些小鼠然后用3mg/kg mAb2-3 IgG1、3mg/kg mAb2-3 IgG4或等体积的PBS作为对照治疗，以评价标记的Treg至肿瘤部位的迁移。体内生物发光测定法表明，在给予mAb2-3 IgG1或mAb2-3 IgG4后，Treg至肿瘤区域的迁移减少。(参见图2)。

实施例4：mAb2-3 IgG4不引起淋巴细胞耗减

人外周血单核细胞(PBMC)通过尾静脉给无免疫应答的小鼠注射，并允许掺入循环中。随后给予小鼠mAb2-3 IgG1或mAb2-3 IgG4，接着24小时休息时间后分析PBMC。收集血液，通过FACS分析评价人来源的Treg的量。数据表明，与给予PBS对照后所观察到的相比，在给予mAb2-3 IgG1后，Treg的量显著降低。相比之下，当与给予PBS或对照IgG后所观察到的量相比时，在给予mAb2-3 IgG4抗体后，Treg的量没有统计上的显著差异。这些数据表明mAb2-3IgG4不耗减循环中总的Treg量，而mAb2-3 IgG1不引起Treg耗减。

在给药后人来源的PBMC内的其它T细胞群的特征显示，当与给予mAb2-3 IgG1后这些细胞的量相比时，在给予mAb2-3 IgG4后存在更大量的T-效应细胞和T-幼稚细胞。(参见图3)。

总的来说，这些数据和实施例3提供的数据显示，mAb2-3 IgG4调节调节T细胞募集而不诱导T淋巴细胞耗减。

实施例5：在Treg细胞存在下肿瘤致敏T细胞介导IGROV-1细胞死亡和分泌IFN-γ差异

为了评价肿瘤致敏T细胞引起的IFN-γ分泌的动力学，使INGROV-1肿瘤致敏的T细胞与肿瘤脉冲的树突细胞(DC)或未脉冲的DC一起孵育，接着测量培养基中的IFN-γ水平。在与肿瘤脉冲的树突细胞(DC)孵育后或与CD3/CD28珠粒共孵育后，IGROV-1肿瘤致敏T细胞保持IFN-γ分泌的高水平。相比之下，与肿瘤致敏T细胞共孵育的未脉冲的DC引起肿瘤致敏T细胞较少的IFN-γ分泌。其它实验的目的在于评价Treg细胞对由肿瘤致敏T细胞引起的IFN-γ分泌的影响。这些数据显示在与自体或同种异体Treg细胞一起孵育后IFN-γ水平降低。(参见图4B-C)。

其它体外研究的目的在于评价在自体或同种异体Treg细胞存在下与肿瘤致敏T细胞一起孵育后IGROV-1细胞死亡的量。数据表明，当与在Treg群不存在时孵育的肿瘤致敏T细胞相比，在与肿瘤致敏T细胞和自体或同种异体Treg细胞一起孵育后，IGROV-1细胞死亡的量降低。(参见图4D)。

实施例6：在给予mAb2-3 IgG4后体内肿瘤大小的缩小

无免疫应答的小鼠接受5X10⁶个IGROV-1肿瘤细胞，允许肿瘤生长直到这些肿瘤达到50mm³的平均值。随后，通过尾静脉注射1X10⁷ IGROV-1致敏T细胞、1X10⁶个Treg细胞和1mg/kg mAb2-3 IgG1、1mg/kg mAb2-3 IgG4、对照IgG4或PBS。给予抗体每周两次共35天。这些实验的数据显示与对照IgG4和PBS相比，加入mAb2-3 IgG1或mAb2-3 IgG4引起肿瘤大小显著缩小。(参见图5A-B)。

实施例7：抗CCR4抗体对Teff的增殖和Treg的抑制功能的消除

使人PBMC或CD4+ T细胞以与Treg为10:1比例与20 µg/ml对照IgG1、mAb2-3 IgG1或mAb2-3 IgG4一起孵育。通过流式细胞术、蛋白质印迹和染色，检测人PBMC的增殖和来自CD4+ T细胞的转导信号。这些数据显示，加入mAb2-3 IgG1或mAb2-3 IgG4引起Treg活性抑制对人PBMC的抑制，降低SA-β-gal和p-P38表达，并且恢复CD27和CD28的表达，这提供共刺激信号，且是淋巴细胞活化所需要的。

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21. Gobert, M.等, Regulatory T cells recruited through CCL22/CCR4 areselectively activated in lymphoid infiltrates surrounding primary breasttumors and lead to an adverse clinical outcome (在原发性乳腺肿瘤周围的淋巴样细胞浸润物中选择性激活通过CCL22/CCR4募集的调节T细胞并导致不利的临床结果).Cancer Res 69, 2000-2009 (2009)。

22.Faget, J.等, Early detection of tumor cells by innate immune cellsleads to T(reg) recruitment through CCL22 production by tumor cells (通过先天免疫细胞早期检测肿瘤细胞导致通过由肿瘤细胞引起的CCL22产生的T(reg)募集).Cancer Res 71, 6143-6152 (2011)。

其它实施方案

虽然结合其详细说明描述了本发明，但上述描述只是说明，并不限制本发明的范围，其由随附权利要求书的范围限定。其它方法、优势和改动在随附权利要求书的范围内。

Claims (26)

1. 一种与人CC趋化因子受体4 (CCR4)结合并具有IgG4重链恒定区的分离的人源化单克隆抗体。

2.权利要求1的抗体，其中

a. 可变重链区(V_H)包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，且可变轻链区(V_L)包含SEQ IDNO: 4的氨基酸序列；

b. 可变重链区(V_H)包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列，且可变轻链区(V_L)包含SEQ IDNO: 18的氨基酸序列；

c. 可变重链区(V_H)包含SEQ ID NO: 20的氨基酸序列，且可变轻链区(V_L)包含SEQ IDNO: 22的氨基酸序列；

d. 可变重链区(V_H)包含SEQ ID NO: 24的氨基酸序列，且可变轻链区(V_L)包含SEQ IDNO: 25的氨基酸序列；

e. 可变重链区(V_H)包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列，且可变轻链区(V_L)包含SEQ IDNO: 30的氨基酸序列；

f. 可变重链区(V_H)包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列，且可变轻链区(V_L)包含SEQ IDNO: 46的氨基酸序列；和

重链恒定区包含SEQ ID NO: 6或SEQ ID: 8。

3.权利要求2的抗体，其中所述抗体具有约1.5nM^-1或更小的结合亲和力。

4.与治疗剂连接的权利要求1-3中任一项的抗体。

5.权利要求4的抗体，其中所述治疗剂是毒素、放射性标记、siRNA、小分子或细胞因子。

6.权利要求5的抗体，其中所述细胞因子是IL-2或TGF-β。

7.一种包含权利要求1或2的抗体和与第二抗原免疫特异性结合的抗体的双特异性抗体。

8.权利要求7的双特异性抗体，其中所述第二抗原是肿瘤相关抗原或T细胞功能调节分子。

9.权利要求8的双特异性抗体，其中所述肿瘤相关抗原是CA-IX、ErbB2或HVEM。

10.权利要求8的双特异性抗体，其中所述T细胞功能调节分子是PD-L1、GITR、IL21、IL21R、CD160、TIM3、LAG3或GAL9。

11.一种细胞，其产生权利要求中1-10任一项的抗体。

12.一种通过给予所述受试者权利要求1-10中任一项的抗体抑制所述受试者的调节T细胞(Treg)迁移的方法。

13.权利要求12的方法，其中不耗减淋巴细胞。

14.权利要求12的方法，其中不耗减效应T细胞。

15.权利要求12的方法，其中不耗减Treg。

16.一种提高受试者对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括给予所述受试者权利要求1-10中任一项的抗体。

17.权利要求16的方法，其中所述抗原是病毒抗原、细菌抗原或肿瘤相关抗原。

18.权利要求16的方法，其中所述抗体的所述给予引起抗原特异性T细胞活性的提高。

19.权利要求16的方法，其中所述抗体的所述给予引起T细胞增殖的增加。

20.权利要求16的方法，其中效应T细胞增加。

21.一种逆转效应T细胞增殖的调节T细胞介导的抑制的方法，所述方法包括使T细胞与权利要求1-10中任一项的抗体接触。

22.一种治疗或减轻癌症的症状的方法，所述方法包括给予有需要的受试者包含权利要求1-10中任一项的抗体的组合物。

23.权利要求22的方法，其中所述癌症是实体癌或血癌。

24.权利要求23的方法，其中所述血癌是皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、霉菌肉芽肿病(MF)、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤(皮肤ALCL)、塞扎里综合征或成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)。

25. 权利要求23的方法，其中所述癌症是过量表达CA IX、PD-L1或HVEM的实体癌或癌症。

26.权利要求23的方法，其中所述实体癌是肾细胞癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、宫颈癌、脑癌、肝癌、胰腺癌、肾癌或胃癌。