WO2007028592A1 - Beeinflussung des kardialen fc-rezeptors zur behandlung der dilatativen kardiomyopathie - Google Patents

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WO2007028592A1
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Andreas Greinacher
Stephan Felix
Petra Eichler
Christiane Timpert
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Ernst-Moritz-Arndt-Universität
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    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to the use of antibodies or parts thereof, or of functional equivalents of antibodies or parts thereof, for the manufacture of a medicament for the treatment of dilated cardiomyopathy. Furthermore, the invention relates to the use of active ingredients for the preparation of pharmaceutical compositions which are able to influence the activity of the Fc receptor on cardiomyocytes in patients with dilated cardiomyopathy, that is to reduce their activity.
  • DCM Dilated cardiomyopathy
  • Dilated cardiomyopathy is the most common form of heart muscle disease. In Germany alone, around 500,000 people are affected. Men are affected more frequently than women. This concerns the forms of dilated cardiomyopathy, in which no cause of causes can be identified. This form is also referred to as idiopathic (without identifiable cause) dilated cardiomyopathy. Viral infections are suspected to be a possible cause of dilated cardiomyopathy, as many patients have been found to have viral persistence in the myocardium. In addition, many sufferers have an increased production of IgG-type immunoglobulins (antibodies), indicating an activation of the immune system by a pathogen.
  • antibodies immunoglobulins
  • the immune system can not be stimulated only by external impulses. Under certain circumstances, the body's protective mechanism can also attack one's own body: the human immune system is constructed so that it is virtually immune to any combination of protein bodies
  • autoimmune reaction is considered to be the cause of autoimmune diseases.
  • Antigens are substances that are recognized and combated by the immune system as foreign. They trigger an immune reaction (immune response).
  • the antigens that are recognized as foreign by the body are controlled by antibodies that are produced by certain cells of the immune system.
  • the Antibodies attach to the antigens and thus hinder, for example, the multiplication of viruses, or they mark bacteria, so that they can be recognized and controlled by phagocytes (macrophages, monocytes and granulocytes). In this case, for each antigen a very specific, specific antibody must be produced.
  • Fc receptors antibody binding sites
  • the body's own structures can also appear like antigens if they are falsely considered foreign by the immune system. This triggers the above-mentioned autoimmune reaction.
  • dilated cardiomyopathy it is also assumed that such autoimmune mechanisms can be held responsible for the increasing cardiac muscle weakness (H. Nishimura et al., Science 2001, 291, 319-322, T. Okazaki et al., Nat. 9, 1477-1483).
  • Autoimmune reaction presumption for the treatment of dilated cardiomyopathy is based on a purification of the blood of the patient.
  • the corresponding (auto) antibodies are filtered out of the plasma by immunoadsorption methods.
  • Immunoadsorption is an invasive method that can filter out nonspecific or specific antibodies, and generally eliminates the antibody group (immunoglobulins IgG) in question.
  • a suppression of the immune reaction suppression of the immune reaction (so-called immunosuppression) and thus a suppression of the
  • the present invention is therefore based on the object to provide a method for the treatment of dilated cardiomyopathy, which does not require the general and nonspecific filtering out of antibodies by invasive immunoadsorption and thereby can avoid the immunosuppression and the associated side effects.
  • FIG. 1 shows the effect of intact IgG / antibody fragments on isolated, field-stimulated rat myocardial cells. Changes in calcium transients and systolic cell shortening during incubation (% change from baseline _ + SEM) with:
  • the present invention provides methods of treating dilated cardiomyopathy by using antibodies or portions or equivalents of the antibodies or portions thereof to produce drugs for the treatment of dilated cardiomyopathy. Also provided are methods for the preparation of medicaments containing active agents which directly or indirectly affect the activity of the Fc receptor on cardiomyocytes and which serve to treat patients with dilated cardiomyopathy.
  • the invention is based on the unexpected finding that antibody binding sites (Fc receptors) are found not only on cells of the immune system but also on cardiomyocytes.
  • Fc receptors antibody binding sites
  • the progressive reduction in cardiac performance characteristic of dilated cardiomyopathy can be treated, for example, by blocking the Fc receptors, preferably by specific blocking, and thus by preventing the binding of antibodies to the heart muscle cells.
  • Antibodies are to be understood as meaning complete antibodies, in particular of human origin. Also used according to the invention antibody parts, in particular Fc fragments, F (ab ') 2 or F (ab') fragments etc. Also modified antibodies, such as humanized antibodies or other antibodies produced by recombinant technology, such as single-chain variable domains (so-called scFv) , can be used.
  • scFv single-chain variable domains
  • the antibodies can be prepared by techniques well known in the art and also include monoclonal and polyclonal antibodies.
  • Affect receptor directly or indirectly, i. that they reduce its activity, block at best.
  • the present invention provides the use of drugs to influence the activity of the Fc receptor for the manufacture of a medicament for the treatment of dilated cardiomyopathy.
  • the inhibitors are Fc fragments of antibodies, preferably Fc fragments of IgG antibodies, and most preferably IgG3 fragments. These fragments can be recovered by known methods, for example by cleaving antibodies with enzymes such as pepsin. It is also possible to use recombinantly produced Fc fragments, which in turn may have a modified amino acid sequence, for example by one or more exchanged, deleted or added amino acids. Methods for the recombination of genes are known to those skilled in the art.
  • agents capable of influencing, directly or indirectly, signal transduction via the Fc receptor intracellularly, i. that a lower activity of downstream physiological processes can be measured.
  • agents capable of influencing, directly or indirectly, signal transduction via the Fc receptor intracellularly, i. that a lower activity of downstream physiological processes
  • tyrosine kinase inhibitors e.g. PP2
  • Src selective inhibitor of tyrosine kinase Src
  • F (ab ') 2 "or F (ab') fragments of antibodies are used to prepare a medicament for the treatment of dilated cardiomyopathy, and particularly preferred is the use of F (ab ') 2 ⁇ or F (ab ') fragments which recognize antigens which are also recognized by (auto) antibodies of the patient to be treated.
  • F (ab ') 2 can ⁇ or F (ab') fragments in custom-made medication administered to the patient 'will.
  • Each drug may contain one or more antigen-specific F (ab ') 2' or F (ab ') fragments.
  • Suitable methods for identifying specific antibody-antigen interactions are ELISA, RIA or Western Blot assays known to those skilled in the art, to name only a few.
  • in vitro methods may be characterized by comprising the steps of: a) incubating antibodies of a subject, preferably a patient with dilated cardiomyopathy, with candidate antigen and control antigens; b) measuring the binding of antibodies to the antigens , c) determining the antigen specificity by comparing the measurement results.
  • antigens both viral, bacterial, fungal, but preferably human antigens can be mentioned.
  • human antigens in particular heart muscle cell-specific antigens should be considered.
  • mitochondrial antigens antigens of contractile proteins, beta-1 receptors or muscarinic receptors.
  • agents capable of directly or indirectly affecting the activity of Fc receptors are used
  • the agents are capable of affecting the activity of Fc receptors on in vitro cultured cardiomyocytes when compared to those heart muscle cells to which the drug to be tested has not been added.
  • Detection of the expression of Fc receptors on the cells can be carried out by immunofluorescence and the methods given in the experimental section or, if appropriate, analysis with a fluorescence-activated cell sorter (FACS).
  • FACS fluorescence-activated cell sorter
  • the FACS process is known to the person skilled in the art.
  • agents that influence the Fc Receptors may be suitable are interferon-beta, dexamethasone, anti-TNF-alpha antibodies, anti-interferon gamma antibodies, etc. According to the invention, the use of Fc fragments of antibodies for influencing the activity of the Fc receptor is surprisingly disclosed.
  • the present application provides a screening method for finding functionally active antibodies or agents that affect the activity of Fc receptors on cardiomyocytes.
  • This method comprises the following steps: a) cultivating heart muscle cells, b) incubating the cultured cardiomyocytes with the antibody or active substance to be tested and optionally without the antibody or active substance to be tested, and optionally with a control substance (eg an Fc isotype-specific control c) measuring the activity of the Fc receptors after incubation of the heart muscle cells with the antibody or active substance to be tested and optionally without the antibody or active substance to be tested, and optionally with the control substance, d) comparing the activity of the Fc receptors using the
  • step (c) Measuring results from step (c), and e) determining whether the antibody or active substance to be tested influences the activity of the Fc receptors.
  • a suitable measurement method for determining the expression of Fc receptors is immunofluorescence or FACS analysis using cultured heart muscle cells and Fc receptor-specific antibodies. Specific examples of the measurement of Fc receptor activity are the effects on calcium transients or systolic cell shortening, which are described in detail in the experimental section below.
  • the functional antibodies or active substances according to the invention can be prepared with known excipients, such as diluents, dyes, stabilizers, etc., which are known to the person skilled in the art in the form of pharmaceutical formulations for use according to the invention.
  • the medicaments of the invention can be administered by any route, e.g. oral, parenteral, intravenous, etc.
  • the dose is determined depending on the individual to be treated.
  • the administration can take place once or several times a day.
  • dosage forms comprising more than one active ingredient or combination therapies with other drugs.
  • DCM dilated cardiomyopathy
  • IgG was obtained from plasma containing antibodies that have a negative inotropic effect on heart muscle cells. This procedure was described in Staudt A., Staudt Y., Dörr M. et al. Potential role of humeral cardiac dysfunction in patients suffering from dilated cardiomyopathy. J. Am Coli Cardiol 2004/44: 829-36.
  • the negative inotropic effects were defined as a reduction in systolic cell shortening (> 10%) caused by a decrease in calcium transients (> 10%).
  • the DCM was diagnosed by standard methods (Felix SB, Staudt A.,
  • Antibodies were purified using an anti-IgG column (Plasma Select, Teterow, Germany), exposed to experimental buffer (117 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 0.6 mM MgCl 2 ) for 30 hours 1.2 IHM KH 2 PO 4 , 1.2 mM CaCl 2 , 20 mM glucose and 10 mM HEPES; pH 7.3) dialyzed (MWCO 100 KD), incubated for inactivation of complement (56 ° C, 30 min) (Felix SB, et al, supra;. Staudt A, et al, supra) and at -7O 0 C. kept in aliquots. Similarly, IgG was obtained from healthy blood donors (controls).
  • the heart muscle cells were suspended in experimental buffer and labeled with the fluorescent calcium probe Fura 2-AM.
  • Single myocardial cells were field-stimulated (1 Hz, 5 ms) and continuously covered with experimental buffer (2 ml / min) containing IgG from patients (300 ⁇ g / ml), control IgG (300 ⁇ g / ml), anti-F (ab '). ) - antibodies (30 ⁇ g / ml) or the corresponding F (ab ') 2 - (56 ⁇ g / ml) or Fc fragments (30 ⁇ g / ml).
  • the fluorescence measurements were recorded with a photomultiplier system (IonOptix, Milton, MA).
  • Antibodies with (positive control) and without functional effect (negative control) additionally tested on the same heart muscle cell preparation were used only for a single assay of one sample.
  • F (ab ') 2 fragments from the IgG preparations were used with the aid of a pepsin digest (Biogenes, • Berlin, Germany) Patients and controls made. IgG and the corresponding F (ab 1 ) 2 fragments of each patient were used in equimolar concentrations.
  • Fc fragments of normal IgG's were prepared by standard methods (Behringwerke, Marburg, Germany).
  • heart muscle cells were preincubated with the F (ab') 2 fragments of DCM patients (56 ⁇ g / ml, 30 minutes), rinsed and extracted with goat anti-human F (ab ') IgG (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Germany; 30 ⁇ g / ml).
  • the continuously aerated medium of the digestion reaction consisted of the above-mentioned HEPES-buffered solution with a calcium concentration of 50 ⁇ M and 1% bovine serum albumin.
  • the biopsies were incubated for 15 min with prototype XXIV (4 U / ml, Sigma-Aldrich Chemie, Taufmün, Germany).
  • the biopsies were then placed in a fresh tube containing buffer with a combination of 1 mg / ml collagenase A (Worthington) and 0.5 mg / ml hyaluronidase (Sigma-Aldrich Chemie, Taufmaschinen, Germany).
  • the cells were centrifuged (4 min, 240 xg) and the supernatant was replaced with a fresh, pure collagenase A solution for a further 20 min. Incubation. To complete the digestion process, the cell pellet was washed once in the medium without enzyme. Finally, the cell pellet was resuspended in 1.5 ml of PBS buffer and passed through a filter to remove undigested tissue.
  • the isolated cardiomyocytes were allowed to attach to coverslips (Ih, 37 ° C); they were fixed with paraformaldehyde (2% in PBS, 10 min, room temperature); blocked with PBS / 3%, BSA / 0.05%, and Tween 20 for 15 min; with goat polyclonal antibodies to Fc ⁇ receptor I (CD64), Fc ⁇ receptor II (CD32), Fc ⁇ receptor IIa, Fc ⁇ receptor Ilb / c, and Fc ⁇ receptor III (CD16) (4 ⁇ g / ml, 2 h, room temperature). Goat IgG was used as a negative control, and a polyclonal goat anti-troponin I antibody served as a positive control.
  • the cells were incubated with rhodamine-conjugated bovine anti-goat IgG antibodies (30 min at room temperature, 1: 400).
  • Isolated human heart muscle cells were treated by the same immunofluorescence protocol as the rat cardiac myocytes, but with antibody treatment performed in solution. All primary and secondary antibodies were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg, Germany).
  • the coverslips were fixed on slides with GelMount (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Germany) and examined with a fluorescence microscope (Leica DMLB, Benzheim, Germany).
  • the results are presented as mean ⁇ SEM ( ⁇ standard deviation).
  • the analyzes included comparisons between the groups (controls versus DCM patients) and within the groups. Univariate post-hoc analyzes were performed using the Mann-Whitney U test and the Wilcoxon test, according to an overall study. The significance was judged on the basis of a level of p ⁇ 0.05.
  • the F (ab ') 2 fragments lack the Fc portion of the intact IgGs. In contrast to the specific antigen-binding region of the F (ab ') 2 part, the Fc parts of different antibodies of an IgG subclass do not differ structurally.
  • we pre-incubated heart muscle cells with human Fc fragments (30 ⁇ g / mL) for 30 minutes, rinsing them, overlaying the heart muscle cells with the DCM IgG antibodies. Patients (n 6), and analyzed the inotropic effects.
  • the binding of the IgG Fc portion is via Fc ⁇ receptors.
  • Immunofluorescence was used to detect Fc ⁇ receptor II (CD32) on rat heart muscle cells stained positive with anti-Fc ⁇ -IIa antibodies, but not with antibodies to Fc ⁇ receptor IIb / anti-Fc ⁇ receptor Hc, Fc ⁇ - Receptor III or FCY Receptor I.
  • Human cardiomyocytes isolated from endomyocardial biopsies from DCM patients (n 8) were also stained positively with antibodies to the Fc ⁇ receptor IIa, but not to antibodies to Fc ⁇ receptors IIb or Fc ⁇ ⁇ Receptor Hc ( Figure 5). Goat normal IgG and troponin I antibodies served as negative and / or positive controls, respectively.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von funktionellen Antikörpern oder Teilen davon sowie von Wirkstoffen zur Herstellung von Medikamenten zur Verfügung, die eine Behandlung der dilatativen Kardiomyopathie (DCM) ermöglichen. Insbesondere dienen die Medikamente der Beeinflussung der Fc-Rezeptoren, die erstmalig auf Herzmuskelzellen nachgewiesen werden konnten. Diese Befunde und die bereitgestellten Medikamente dienen der Behandlung einer der häufigsten Herzerkrankungen.

Description

Beeinflussung des kardialen Fc-Rezeptors zur Behandlung der dilatativen Kardiomyopathie
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Antikörpern oder Teilen davon, oder von funktionellen Äquivalenten von Antikörpern oder Teilen davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der dilatativen Kardiomyopathie. Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung von Wirkstoffen zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die in der Lage sind, die Aktivität des Fc-Receptors auf Herzmuskelzellen bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie zu beeinflussen, das heißt deren Aktivität zu reduzieren.
Hintergrund der Erfindung
Die dilatative Kardiomyopathie ("dilative cardiomyopathy" , DCM) ist eine Erkrankung des Herzmuskels, bei der die Herzkammern vergrößert sind. Gleichzeitig ist die Pumpfähigkeit des Herzen eingeschränkt . Dadurch kommt es zu einer Minderversorgung des Organismus und zu den KrankheitsSymptomen einer Herzschwäche (Herzinsuffizienz, Herzrhythmusstörungen) (P. Richardson et al . , Report of the 1995 WHO/International Society and Federation of Cardiology Task Force on the Definition and Classification of Cardiomyopathies, Circulation 1996, 93, 841-842; A. Nohria et al., JAMA 2002, 287, 628-640).
Die dilatative Kardiomyopathie ist die häufigste Form der Herzmuskelerkrankung. Allein in Deutschland sind rund 500.000 Menschen betroffen. Dabei sind Männer häufiger betroffen als Frauen. Das betrifft die Formen der dilatativen Kardiomyopathie, bei der keine Entstehungsursache erkennbar ist. Diese Form wird auch als idiopathische (ohne erkennbare Ursache) dilatative Kardiomyopathie bezeichnet. Als ein möglicher Auslöser für eine dilatative Kardiomyopathie werden Virusinfektionen vermutet, denn bei vielen Betoffenen hat man in Untersuchungen eine Viruspersistenz im Herzmuskel festgestellt. Außerdem ist bei vielen Betroffenen eine erhöhte Produktion von Immunglobulinen (Antikörpern) vom Typ IgG vorhanden, was auf eine Aktivierung des Immunsystems durch einen Erreger hinweist .
Das Immunsystem kann nicht nur durch äußere Anstöße angeregt werden. Unter bestimmten Umständen kann der körpereigene Schutzmechanismus auch den eigenen Körper angreifen: das Immunsystem des Menschen ist so aufgebaut, dass es praktisch gegen jede beliebige Kombination von Eiweißkörpern
(Proteinen) aktiv werden kann. Da der Mensch selbst eine Vielzahl unterschiedlicher Eiweiße herstellt, kann das Immunsystem sich auch gegen diese körpereigenen Strukturen wenden. Um das zu verhindern, werden die Abwehrzellen im Lymphsystem im Verlauf ihrer Reifung zu Zellen mit unterschiedlichen Funktionen "ausgebildet". Abwehrzellen, die gegen den eigenen Körper gerichtet sind, werden aussortiert. Diese Fähigkeit des Immunsystems wird als Immuntoleranz bezeichnet .
Im Laufe eines Lebens kann beim Menschen die Immuntoleranz verloren gehen oder geschwächt werden. Dann entwickelt das Immunsystem Antikörper gegen das eigene Körpergewebe. Diese Antikörper werden deshalb auch als Autoantikörper bezeichnet. Eine derartige Reaktion (Autoimmunreaktion) wird als Ursache von Autoimmunerkrankungen angesehen.
Antigene sind Stoffe, die vom Immunsystem als körperfremd erkannt und bekämpft werden. Sie lösen eine Immunreaktion (Immunantwort) aus. Dabei werden die vom Körper als fremd erkannten Antigene durch Antikörper bekämpft, die von bestimmten Zellen des Immunsystems produziert werden. Die Antikörper heften sich an die Antigene und behindern so z.B. die Vermehrung von Viren, oder sie markieren Bakterien, so dass diese durch Phagozyten (Makrophagen, Monozyten und Granulozyten) erkannt und bekämpft werden können. Dabei muss für jedes Antigen ein ganz bestimmter, spezifischer Antikörper produziert werden.
Zur Zerstörung der Antigene werden sie über den angebundenen Antikörper an Antikörperbindungsstellen (Fc-Rezeptoren) angelagert, die sich auf der Zellmembran der Phagozyten befinden. Durch Aktivierung kontraktiler Strukturen werden die Antikörper mitsamt den gebundenen Antigenen in das Innere der Phagozyten aufgenommen (phagozytiert) und abgebaut.
Körpereigene Strukturen können auch wie Antigene erscheinen, wenn sie vom Immunsystem fälschlicherweise als fremd angesehen werden. Dadurch wird die oben bezeichnete Autoimmunreaktion ausgelöst. Im Falle der dilatativen Kardiomyopathie wird vermutet, dass auch solche Autoimmunmechanismen für die zunehmende Herzmuskelschwäche verantwortlich gemacht werden können (H. Nishimura et al . , Science 2001, 291, 319-322; T. Okazaki et al . , Nat . Med. 2003, 9, 1477-1483) .
Herkömmliche Ansätze vor dem Hintergrund der
Autoimmunreaktionsvermutung zur Behandlung der dilatativen Kardiomyopathie setzen an einer Reinigung des Blutes des Patienten an. Dabei werden aus dem Plasma die entsprechenden (Auto-) Antikörper durch Immunadsorptionsverfahren herausgefiltert. Die Immunadsorption ist ein invasives Verfahren, das unspezifisch oder spezifisch Antikörper herausfiltern kann, und allgemein die betreffende Antikörpergruppe (Immunglobuline IgG) temporär eliminiert. Eine Unterdrückung der Immunreaktion (sogenannte Immunsuppression) und somit auch eine Unterdrückung der
Schädigung des Herzmuskelgewebes durch die Autoantikörper ist die Folge. Allerdings ist ein Ersetzen der herausgefilterten Antikörper durch körperfremde Antikörper notwendig. Nebenwirkungen sind eine verminderte oder gar fehlende Abwehrkraft gegenüber Infektionen. Des weiteren sind diese Verfahren sehr zeitaufwendig und kostenintensiv.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Behandlung der dilatativen Kardiomyopathie bereitzustellen, das nicht das allgemeine und unspezifische Herausfiltern von Antikörpern durch die invasive Immunadsorption erfordert und dadurch die Immunsuppression und die damit verbundenen Nebenwirkungen vermeiden kann.
Beschreibung der Zeichnungen
Figur 1 zeigt die Wirkung intakter IgG/Antikörperfragmente auf isolierte, feldstimulierte Ratten-Herzmuskelzellen. Veränderungen der Calcium-Transienten und der systolischen Zellverkürzung während der Inkubation (% Änderung gegenüber dem Ausgangswert _+ SEM) mit :
A) Intakten IgG aus dem Plasma gesunder Blutspender (Kontroll -IgG, n = 11)
B) Intakten IgG von DCM-Patienten (DCM IgG, n = 11)
C) F (ab' ) 2"Fragmenten der entsprechenden DCM IgG (n = 11) D) Intakten DCM-IgG nach Präinkubierung mit den F(ab')2~
Fragmenten der entsprechenden DCM-Patienten (n = 11)
E) Intakten DCM-IgG nach Präinkubierung mit den F(ab')2~ Fragmenten der Kontrollen (n = 11)
F) Intakten DCM-IgG nach Präinkubierung der Herzmuskelzellen mit humanen Fc-Fragmenten (n = 6)
G) Ziege-anti-Mensch-F (ab' ) -IgG nach Präinkubierung mit
F (ab' ) 2 -Fragmenten der entsprechenden DCM-Patienten (n = ID
+++ p < 0,001 signifikant verschieden von den Kontroll-IgG *** p < 0,001 signifikant verschieden von den DCM-IgG Figur 2 ist eine Zusammenfassung der funktionellen Befunde. Intakte IgG von DCM-Patienten induzieren negative inotrope Wirkungen (A), ihre entsprechenden F (ab' ) 2 -Fragmente hingegen nicht (B). Diese F (ab' ) 2 -Fragmente inhibierten die Wirkung intakter DCM-IgG (C) , wie auch die Fc-Fragmente normaler IgGs (D) . Die Rekonstituierung der Fc-Teile durch aufeinander folgende Inkubierung der Herzmuskelzellen mit DCM F (ab') 2- Fragmenten und Ziege-anti-Mensch-F (ab' ) -IgG induzierte eine negative inotrope Wirkung (E) ; (AG = Antigen; FcγRIIa = Fcγ- Rezeptor IIa) .
Gegenstand der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Behandlung der dilatativen Kardiomyopathie zur Verfügung, indem Antikörper oder Teile bzw. Äquivalente der Antikörper oder von deren Teilen verwendet werden, um Medikamente zur Behandlung der dilatativen Kardiomyopathie herzustellen. Ebenfalls zur Verfügung gestellt werden Verfahren zur Herstellung von Medikamenten, die Wirkstoffe enthalten, welche die Aktivität des Fc-Receptors auf Herzmuskelzellen direkt oder indirekt beeinflussen, und die der Behandlung von Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie dienen.
Die Erfindung beruht auf dem unerwarteten Befund, dass Antikörperbindungsstellen (Fc-Rezeptoren) nicht nur auf Zellen des Immunsystems zu finden sind, sondern auch auf Herzmuskelzellen. Auf der Basis dieses Befundes kann die für die dilatative Kardiomyopathie charakteristische fortschreitende Verminderung der Leistungsfähigkeit des Herzen beispielsweise durch eine Blockierung der Fc- Rezeptoren, vorzugsweise durch eine spezifische Blockierung, und damit durch Verhinderung der Bindung von Antikörpern an die Herzmuskelzellen behandelt werden.
Unter Antikörpern sind vollständige Antikörper, insbesondere humanen Ursprungs zu verstehen. Ebenfalls verwendet werden können erfindungsgemäß Antikörperteile, insbesondere Fc- Fragmente, F (ab') 2 oder F (ab' ) -Fragmente etc. Auch modifizierte Antikörper, beispielsweise humanisierte Antikörper oder andere mittels rekombinanter Technik hergestellter Antikörper, wie z.B. einzellkettige variable Domänen (so genannt scFv) , können verwendet werden.
Die Antikörper können mit Hilfe von auf diesem Fachgebiet allgemein bekannten Technologien hergestellt werden und umfassen auch monoklonale und polyklonale Antikörper.
Ebenfalls von der Erfindung umfasst, sind funktionelle Äquivalente der Antikörper oder deren Fragmente. Diese funktionellen Äquivalente können mit Hilfe der im experimentellen Teil beschriebenen Verfahren in vitro identifiziert werden. Sie umfassen beispielsweise Proteine (PoIy- oder Oligopeptide), kleine organische Moleküle etc., so lange diese in der Lage sind, die intrazellulären Calcium- Transienten und/oder die systolische Zellverkürzung zu beeinflussen, indem sie die Aktivität des Herzmuskel-Fc-
Rezeptors direkt oder indirekt beeinflussen, d.h. dass sie dessen Aktivität reduzieren, bestenfalls blockieren.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Wirkstoffen zur Beeinflussung der Aktivität des Fc-Rezeptors zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der dilatativen Kardiomyopathie bereit.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Inhibitoren um Fc-Fragmente von Antikörpern, bevorzugt Fc- Fragmente von IgG-Antikörpern und ganz besonders bevorzugt IgG3 -Fragmente . Diese Fragmente können mit Hilfe bekannter Verfahren gewonnen werden, beispielsweise durch die Spaltung von Antikörpern mit Enzymen wie Pepsin. Es können auch rekombinant hergestellte Fc-Fragmente verwendet werden, die wiederum eine modifizierte Aminosäuresequenz aufweisen können, indem beispielsweise einzelne oder mehrere ausgetauscht, deletiert oder Aminosäuren hinzugefügt wurden. Verfahren zur Rekombination von Genen sind dem Fachmann einschlägig bekannt.
Ebenfalls bevorzugt zur Herstellung von Medikamenten zur
Behandlung von dilatativer Kardiomyopathie werden Wirkstoffe verwendet, die in der Lage sind, direkt oder indirekt die Signaltransduktion über den Fc-Rezeptor intrazellulär zu beeinflussen, d.h. dass eine geringere Aktivität von nachgeschalteten physiologischen Vorgängen messbar ist. Beispiele für derartige Wirkstoffe sind Tyrosinkinase- Inhibitoren, z.B. PP2 , welches ein selektiver Inhibitor der Tyrosinkinase Src ist. Die Wirkung dieser Wirkstoffe kann anhand der im experimentellen Teil beschriebenen Verfahren untersucht werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden F (ab') 2" oder F (ab' ) -Fragmente von Antikörpern verwendet, um ein Medikament zur Behandlung von dilatativer Kardiomyopathie herzustellen. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von F(ab')2~ oder F(ab')- Fragmenten, die Antigene erkennen, welche auch von (Auto-) Antikörpern des zu behandelnden Patienten erkannt werden.
Um die Spezifität der Antikörper gegen bestimmte Antigene zu untersuchen, können in vitro Untersuchungen mit den Antikörpern des betreffenden Patienten durchgeführt werden. Hierbei werden Antikörper mit potenziell erkannten Antigenen inkubiert. Im Vergleich mit Kontrollantigenen kann so ermittelt werden, mit welchen Antigenen die Antikörper des Patienten spezifisch reagieren. So können individuell ausgewählte F(ab')2~ oder F (ab' ) -Fragmente in maßgeschneiderten Medikamenten an den Patienten verabreicht' werden. Jedes Medikament kann ein oder mehrere antigenspezifische F(ab')2~ oder F (ab' ) -Fragmente enthalten. Geeignete Verfahren zur Identifizierung spezifischer Antikörper-Antigen- Interaktionen sind dem Fachmann bekannte ELISA-, RIA- oder Western-Blot Assays, um nur einige zu nennen. Diese in vitro Verfahren können dadurch charakterisiert werden, dass sie die folgenden Schritte umfassen: a) Inkubieren von Antikörpern einer Testperson, vorzugsweise eines Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie, mit Kandidaten-Antigen und Kontroll - Antigenen, b) Messung der Bindung von Antikörpern an die Antigene, c) Ermitteln der Antigenspezifität durch Vergleich der Messergebnisse .
Als potenzielle Antigene können sowohl virale, bakterielle, pilzliche, vorzugsweise jedoch humane Antigene genannt werden. Bei den humanen Antigenen ist insbesondere an Herzmuskelzellen-spezifische Antigene zu denken. Besonders zu erwähnen sind Mitochondrien-Antigene, Antigene von kontraktilen Proteinen, von Beta-1-Rezeptoren oder von muskarinergen Rezeptoren.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden Wirkstoffe verwendet, die in der Lage sind, die Aktivität von Fc-Rezeptoren direkt oder indirekt zu beeinflussen, um
Medikamente zur Behandlung der dilatativen Kardiomyopathie herzustellen. Das bedeutet, dass die Wirkstoffe in der Lage sind, die Aktivität der Fc-Rezeptoren auf in vitro kultivierten Herzmuskelzellen zu beeinflussen, wenn sie mit solchen Herzmuskelzellen verglichen werden, zu denen der zu testende Wirkstoff nicht hinzugegeben wurde. Der Nachweis der Expression von Fc-Rezeptoren auf den Zellen kann mittels Immunfluoreszenz und den im experimentellen Teil angegebenen Verfahren oder gegebenenfalls einer Analyse mit einem Fluoreszenz-aktivierten-Zell-Sorter (FACS) durchgeführt werden. Das FACS-Verfahren ist dem Fachmann bekannt. Beispiele für Wirkstoffe, die zur Beeinflussung der Fc- Rezeptoren geeignet sein könnten, sind Interferon-Beta, Dexamethason, Anti-TNF-alpha-Antikörper, Anti-Interferon- Gamma-Antikörper etc. Erfindungsgemäß wird überraschenderweise die Verwendung von Fc-Fragmenten von Antikörpern zur Beeinflussung der Aktivität des Fc-Rezeptors offenbart .
Des weiteren stellt die vorliegende Anmeldung ein Screening- Verfahren zur Verfügung, das dem Auffinden von funktionell aktiven Antikörpern oder Wirkstoffen, die die Aktivität von Fc-Rezeptoren auf Herzmuskelzellen beeinflussen, dient. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte: a) Kultivieren von Herzmuskelzellen, b) Inkubieren der kultivierten Herzmuskelzellen mit dem zu testenden Antikörper oder Wirkstoff sowie gegebenenfalls ohne den zu testenden Antikörper oder Wirkstoff, und gegebenenfalls mit einer Kontrollsubstanz (z.B. einer Fc-Isotyp-spezifischen Kontrolle) , c) Messen der Aktivität der Fc-Rezeptoren nach Inkubation der Herzmuskelzellen mit dem zu testenden Antikörper oder Wirkstoff sowie gegebenenfalls ohne den zu testenden Antikörper oder Wirkstoff, und gegebenenfalls mit der Kontrollsubstanz, d) Vergleichen der Aktivität der Fc-Rezeptoren anhand der
Messergebnisse aus Schritt (c) , und e) Bestimmen, ob der zu testende Antikörper oder Wirkstoff die Aktivität der Fc-Rezeptoren beeinflusst .
Ein geeignetes Messverfahren zur Bestimmung der Expression der Fc-Rezeptoren ist die Immunfluoreszenz oder die FACS- Analyse anhand kultivierter Herzmuskelzellen und Fc-Rezeptor- spezifischer Antikörper. Spezielle Beispiele für die Messung der Aktivität der Fc-Rezeptoren sind die Beeinflussung der Calcium-Transienten oder der systolischen Zellverkürzung, die im experimentellen Teil unten ausführlich beschrieben werden. Die erfindungsgemäß funktionellen Antikörper oder Wirkstoffe können mit bekannten Hilfsstoffen, wie Verdünnungsmitteln, Farbstoffen, Stabilisatoren, etc., welche dem Fachmann bekannt sind, in Form pharmazeutischer Formulierungen zur erfindungsgemäßen Verwendung hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Medikamente können auf jedem Weg verabreicht werden, z.B. oral, parenteral, intravenös etc. Die Dosis wird in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Individuum bestimmt. Die Verabreichung kann ein- oder mehrmals täglich erfolgen. Ebenfalls umfasst von der Erfindung sind Darreichungsformen, die mehr als einen Wirkstoff umfassen, bzw. Kombinationstherapien mit anderen Medikamenten .
Experimenteller Teil
Herstellung von Plasma-IgG
Von 11 Patienten mit dilatative Kardiomyopathie (DCM) wurde IgG aus Plasma gewonnen, das Antikörper enthält, die eine negative inotrope Wirkung auf Herzmuskelzellen ausüben. Dieses Verfahren wurde in Staudt A., Staudt Y., Dörr M. et al . , Potential role of humeral in cardiac dysfunction of patients suffering from dilated cardiomyopathy . J. Am Coli Cardiol 2004/44:829-36 beschrieben. Die negativen inotropen Wirkungen wurden als Reduzierung der systolischen Zellverkürzung (>10%) definiert, die durch eine Abnahme der Calcium-Transienten (>10%) verursacht wird. Die DCM wurde mit Standardverfahren diagnostiziert (Felix SB, Staudt A. ,
Dorffei WV, et al . Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent Immunoglobulin Substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomised study. J. Am Coli Cardiol. 2000/35:1590-8). Antikörper wurden mit Hilfe einer Anti-IgG-Säule (PlasmaSelect , Teterow, Deutschland) gereinigt, über 30 Stunden gegen Experimentierbuffer (117 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 0,6 mM MgCl2 1,2 IHM KH2PO4, 1,2 mM CaCl2, 20 mM Glucose und 10 mM HEPES; pH 7,3) dialysiert (MWCO 100 KD), zur Inaktivierung von Komplement inkubiert (56°C, 30 min) (Felix SB, et al . , supra; Staudt A, et al . , supra) und bei -7O0C in Aliquots aufbewahrt. Auf gleiche Weise wurde IgG von gesunden Blutspendern (Kontrollen) gewonnen.
Messung der intrazellulären Calcium-Transienten und der systolischen Zellverkürzung
Die Isolierung ventrikulärer Herzmuskelzellen aus adulten Wistar-Ratten und die Messungen der intrazellulären Calcium- Transienten und der systolischen Zellverkürzungen wurden nach bekannten Verfahren durchgeführt (Felix SB, et al . , supra; Kubin T, Ando H, Scholz D, et al . Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival . Am J Physiol 1999 ; 276 :H2179-87) .
Die Herzmuskelzellen wurden in Experimentierbuffer suspendiert und mit der fluoreszierenden Calciumsonde Fura 2- AM markiert. Einzelne Herzmuskelzellen wurden feldstimuliert (1 Hz, 5 ms) und kontinuierlich mit Experimentierbuffer (2 ml/min) bedeckt, welcher IgG von Patienten (300 μg/ml) , Kontroll-IgG (300 μg/ml), anti-F(ab')- Antikörper (30 μg/ml) beziehungsweise die entsprechenden F(ab')2-(56 μg/ml) oder Fc-Fragmente (30 μg/ml) enthält. Die Fluoreszenzmessungen wurden mit einem Photomultiplier-System (IonOptix, Milton, MA) aufgezeichnet. Veränderungen der intrazellulären Calcium- Transienten wurden aus dem Verhältnis der Fluoreszenzintensität bei zwei Wellenlängen abgeleitet. Ein Videoanalysesystem (IonOptix, Milton, MA) wurde für die Messungen der Zelllänge verwendet (siehe Staudt A, et al . Supra; Ren J, Walsh MF, Hamaty M, Sowers JR, Brown RA. Altered inotropic response to insulin-like growth factor I in diabetic rat heart : influence of intracellular Ca2+ and nitric oxide . Am J Physiol 1998 ; 275 :H823-30) . Die relative Veränderung der Calcium-Transienten und der systolischen Zellverkürzung wurde als Mittelwert der Experimente an mindestens sechs verschiedenen Herzmuskelzellen von sechs verschiedenen Herzmuskelzell -Präparationen je IgG-Präparation definiert Felix SB, et al . , supra) . Die Experimente wurden geblindet durchgeführt. Bei allen Experimenten wurden
Antikörper mit (positive Kontrolle) und ohne funktionelle Wirkung (negative Kontrolle) zusätzlich an der gleichen Herzmuskelzell-Präparation getestet. Jede Herzmuskelzelle wurde nur für eine einzige Untersuchung von einer Probe verwendet.
Um zu bestimmen, ob die funktionellen Wirkungen durch den F(ab')2-Teil der Antikörper verursacht werden, wurden mit Hilfe eines Pepsinverdaus (Biogenes,• Berlin, Deutschland) F (ab ') 2-Fragmente aus den IgG-Präparaten der Patienten und der Kontrollen hergestellt. IgG und die entsprechenden F (ab1) 2 Fragmente jedes Patienten wurden in äquimolaren Konzentrationen verwendet. Zur Untersuchung der Beteiligung des Fc-Teils der Antikörper an den funktionellen Wirkungen, wurden Fc-Fragmente normaler IgG' s durch Standardverfahren hergestellt (Behringwerke, Marburg, Deutschland) . Zur Rekonstituierung der Fc-Teile der IgG-F (ab ') 2-Fragmente, wurden Herzmuskelzellen mit den F (ab ' ) 2-Fragmenten von DCM- Patienten (56 μg/ml; 30 Minuten) präinkubiert , gespült und mit Ziege-anti-Mensch-F (ab ' ) -IgG (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Deutschland; 30 μg/ml) bedeckt.
Isolierung menschlicher Herzmuskelzellen aus Endomyokardial- Biopsaten
Die Isolierung menschlicher Herzmuskelzellen wurde durchgeführt wie beschrieben (Peeters GA, Sanguinetti MC, Eki Y, et al . Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. Am J Physiol 1995;268:H1757-66) . Von DCM-Patienten (n = 8) erhielten wir
8-10 Endomyocardialbiopsate aus dem interventrikulären Septum des rechten Ventrikels (Staudt A, Schaper F, Stangl V, et al . Immunohistological changes in dilated cardiomyopathy induced by immunoadsorption therapy and subseguent Immunoglobulin Substitution. Circulation 2001 ; 103 : 2681-6) . Ein Teil der Endomycardialbiopsate wurde in eiskalter HEPES-gepufferter Salzlösung (120 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,5 mM MgSO4, 5,0 mM Natriumpyruvat , 20 mM Glucose, 10 mM HEPES, und 6 mM Nitrilotriessigsäure (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Deutschland) ) sofort für die Zellisolierung ins Labor überführt : . Die Biopsate wurden in ein 2 ml Röhrchen für den enzymatischen Verdau in ein Wasserbad (35°C) gestellt. Das kontinuierlich begaste Medium der Verdaureaktion bestand aus der oben erwähnten HEPES-gepufferten Lösung mit einer Calcium Konzentration von 50 μM und 1% Rinderserumalbumin. In einem ersten Schritt wurden die Biopsate für 15 min mit Protease vom Typ XXIV (4 U/ml; Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Deutschland) inkubiert. Dann wurden die Biopsate in ein frisches Röhrchen gegeben, das Puffer mit einer Kombination aus 1 mg/ml Collagenase-A (Worthington) und 0,5 mg/ml Hyaluronidase (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Deutschland) enthält. Nach 20 min wurden die Zellen zentrifugiert (4 min, 240 xg) und der Überstand wurde für weitere 20 min Inkubation durch eine frische, reine Kollagenase-A-Lösung ersetzt. Um den Verdauprozess zu beenden, wurde das Zellpellet einmal im Medium ohne Enzym gewaschen. Schließlich wurde das Zellpellet in 1,5 ml PBS- Puffer resuspendiert und durch einen Filter gegeben, um unverdautes Gewebe zu entfernen.
Indirekte Ixnmunfluoreszenz
Den isolierten Herzmuskelzellen wurde ermöglicht, sich auf Deckgläschen anzuheften (Ih, 37°C) ; sie wurden mit Paraformaldehyd fixiert (2% in PBS, 10 min, Raumtemperatur); mit PBS/3%, BSA/0,05%, und Tween 20 für 15 min blockiert; mit polyklonalen Antikörpern aus der Ziege gegen den Fcγ-Rezeptor I (CD 64), gegen Fcγ-Rezeptor II (CD 32), Fcγ-Rezeptor IIa, Fcγ-Rezeptor Ilb/c, and Fcγ-Rezeptor III (CD 16) (4 μg/ml , 2 h, Raumtemperatur) gefärbt. IgG aus Ziegen wurde als Negativkontrolle verwendet, und ein polyklonaler Antikörper aus Ziegen gegen Troponin I diente als Positivkontrolle. Zum Nachweis wurden die Zellen mit Rhodamin-konjugiertem Rinder- anti-Ziege-IgG-Antikörpern (30 min bei Raumtemperatur, 1:400) inkubiert. Isolierte menschliche Herzmuskelzellen wurden nach dem gleichen Immunfluoreszenz-Protokoll wie die Ratten- Herzmuskelzellen behandelt, aber mit einer Antikörperbehandlung, die in Lösung durchgeführt wurde. Alle primären und sekundären Antiköper wurden von Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg, Deutschland) bezogen. Die Deckgläschen wurden mit GelMount (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Deutschland) auf Objektträgern fixiert und mit einem Fluoreszenzmikroskop (Leica DMLB, Benzheim, Deutschland) untersucht.
Statistik
Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM (± Standardabweichung) dargestellt. Die Analysen schlössen Vergleiche zwischen den Gruppen (Kontrollen gegenüber DCM- Patienten) und innerhalb der Gruppen ein. Univariate post-hoc Analysen wurden mit Hilfe des Mann-Whitney U-Tests und des Wilcoxon-Tests durchgeführt, nach einer Gesamtuntersuchung. Die Signifikanz wurde auf der Grundlage eines Niveaus von p < 0, 05 beurteilt.
Ergebnisse
Wirkungen intakter IgGs und von F (ab') 2 -Fragmenten von DCM- Patienten
Die intakten IgG-Fraktionen (300 μg/mL) aus dem Plasma von 11 DCM-Patienten mit negativen inotropen Antikörpern (mittleres Alters = 46 ± 3 Jahre; 10 Männer / 1 Frau; EF < 30%, NYHA
III-IV) reduzierten die Calcium-Transienten um -14 ± 1% und die systolische Zellverkürzung bei Ratten-Herzmuskelzellen um -19 ± 1% (p < 0,001 gegenüber Kontroll - IgG) . Kontroll-IgG zeigte keine Wirkung. Die F (ab1) 2 Fragmente der IgGs der Patienten und der Kontrollen zeigten keine funktionellen Wirkungen (p < 0,001 vs . DCM IgG), was darauf hinweist, dass die Bindung von F (ab1) 2 an das Antigen selbst nicht ausreichend ist, um negative inotrope Wirkungen zu induzieren (siehe Fig. 1) .
Wenn man Herzmuskelzellen mit den F(ab')2 Fragmenten (56 μg/mL) von jedem der 11 DCM-Patienten für 30 Minuten präinkubierte, mit Puffer spülte und die Herzmuskelzellen mit intakten IgGs des jeweiligen Patienten bedeckte, blockierten die F (ab ' ) 2"Fragmente die negative inotrope Wirkung der intakten IgGs des Patienten (p < 0,001 gegenüber IgG von DCM- Patienten) (Fig.l). F (ab ' ) 2-Fragmente von Kontroll-IgGs (n = 6) inhibierten die Wirkungen der intakten IgGs von DCM- Patienten hingegen nicht. Dies weist darauf hin, dass die F (ab' ) 2"Fragmente von DCM-Patienten die Bindung intakter Antikörper an ihr jeweiliges Antigen inhibieren. Das heißt das dieses ein Prozess ist, der offensichtlich für die
Induzierung der beobachteten funktionellen Wirkungen der IgGs von DCM-Patienten auf Herzmuskelzellen (Fig. 2) notwendig ist.
Um zu untersuchen, ob die Antikörper der verschiedenen DCM- Patienten an die gleichen oder an verschiedene Antigen- Bindungsstellen binden, wurden Herzmuskelzellen mit F(ab')2~ Fragmenten eines Patient präinkubiert , gespült, und dann mit IgG-Antikörpern eines anderen Patienten bedeckt. Die F (ab 1^- Fragmente von drei verschiedenen Patienten wurden auf diese Weise gegenüber Antikörpern von drei anderen DCM-Patienten getestet. Als Hinweis auf für die Beteiligung verschiedener Herzmuskel -Antigene bei 8 von 9 Blockierungs-Experimenten wurde erachtet, dass die F (ab ' ) 2-Fragmente von DCM-Patienten nicht die Wirkungen funktionell aktiver, intakter Antikörper anderer DCM-Patienten inhibierten. Beteiligung des Fc-Teils der Antikörper an den funktionellen Wirkungen
Den F (ab ' ) 2 -Fragmenten fehlt der Fc-Teil der intakten IgGs. Im Gegensatz zu der spezifischen Antigen-Bindungsregion des F (ab ' ) 2~Teils , unterscheiden sich die Fc-Teile verschiedener Antikörper einer IgG-Unterklasse strukturell nicht. Um die Beteiligung des Fc-Teils an den funktionellen Wirkungen der Autoantikörper zu untersuchen, prä-inkubierten wir Herzmuskelzellen mit menschlichen Fc-Fragmenten (30 μg/mL) für 30 Minuten, spülten diese, überdeckten die Herzmuskelzellen mit den IgG-Antikörpern von DCM-Patienten (n = 6) , und analysierten die inotropen Wirkungen. Während die Fc-Fragmente selbst keine Wirkung zeigten, hemmte eine Präinkubation von Herzmuskelzellen mit Fc-Fragmenten normaler IgGs die funktionellen Wirkungen der IgGs aus DCM-Patienten vollständig (p < 0,001 gegenüber IgG von Patienten) (Fig. 1) .
Um zu bestätigen, dass sowohl der F(ab')-Teil als auch der Fc-Teil der IgGs der DCM-Patienten für die funktionellen
Wirkungen der Antikörper benötigt werden, rekonstituierten wir den Fc-Teil der F (ab ' ) 2 -Fragmente von DCM- IgG-Antikörpern durch aufeinander folgende Inkubierung von Ratten- Herzmuskelzellen mit den F (ab ' ) 2-Fragmenten von DCM-IgG, gefolgt von intaktem Ziege-anti-Mensch-F (ab ' ) IgG. Das führte wieder zur Reduzierung der systolischen Zellverkürzung (-20 ± 2%) der Calcium-Transienten (-14 ± 2%) und ist vergleichbar mit den intakten IgGs der Patienten (p < 0,001 gegenüber Kontroll-IgG, Fig. 1). Die aufeinander folgende Inkubierung von Herzmuskelzellen mit F(ab')2 Fragmenten von Kontroll-IgG und Ziege-anti-Mensch-F (ab ') -IgG zeigte keine funktionellen Wirkungen. Dieses ist ein weiterer Beweis dafür, dass IgGs von DCM-Patienten funktionelle Wirkungen auf Herzmuskelzellen nur dann ausüben, wenn sie mit dem F(ab')-Teil und dem Fc- Teil an die Herzmuskelzellen binden können (Fig. 2) . Nachweis von Fcγ-Rezeptoren auf Herzmuskelzellen der Ratte und des Menschen
Die Bindung des IgG-Fc-Teils erfolgt über Fcγ-Rezeptoren. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz wurden die Fcγ-Rezeptoren-II (CD32) auf Ratten Herzmuskelzellen nachgewiesen, die mit Anti-Fcγ-IIa Antikörpern positiv gefärbt wurden, jedoch nicht mit Antikörpern gegen Fcγ-Rezeptor IIb / Anti-Fcγ-Receptor Hc, Fcγ-Rezeptor III oder FCY Rezeptor I. Menschliche Herzmuskelzellen, die aus Endomyokardialbiopsaten von DCM- Patienten isoliert wurden (n = 8) , wurden ebenfalls positiv mit Antikörpern gegen den Fcγ-Rezeptor IIa gefärbt, jedoch nicht mit Antikörper gegen Fcγ-Rezeptoren IIb oder Fcγ~ Rezeptor Hc (Fig. 5) . Normales IgG der Ziege und Antikörper gegen Troponin I dienten als negative und bzw. positive Kontrollen.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines Wirkstoffs zur Beeinflussung der Aktivität des Fc-Rezeptors auf Herzmuskelzellen zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von dilatativer Kardiomyopathie .
2. Verwendung eines Antikörpers oder eines Teils davon oder eines funktionellen Äquivalents eines Antikörpers oder eines Teils davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von dilatativer Kardiomyopathie.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Wirkstoff oder der Antikörper oder Teil davon oder das funktionelle Äquivalent eines Antikörpers oder eines Teils davon ein Fc- Rezeptor-Inhibitor ist.
4. Verwendung gemäß Anspruch 3, worin der Fc-Rezeptor- Inhibitor das Fc-Fragment eines Antikörpers ist.
5. Verwendung gemäß Anspruch 4, worin das Fc-Fragment ein IgG-Fc-Fragment ist.
6. Verwendung gemäß Anspruch 5, worin das Fc-Fragment ein IgG3 -Fc-Fragment ist.
7. Verwendung gemäß Anspruch 1, worin der Wirkstoff die Signaltransduktion durch den Fc-Rezeptor beeinflusst.
8. Verwendung gemäß Anspruch 7, worin der Wirkstoff ein Tyrosinkinaseinhibitor ist.
9. Verwendung gemäß Anspruch 2, worin der Teil eines Antikörper ein F (ab')- oder F (ab' ) 2 "Fra9ment ist.
10. Verwendung gemäß Anspruch 9, worin das F(ab')- oder F (ab' ) 2-Fragment patientenspezifisch ist.
11. Screening-Verfahren zum Auffinden von funktionell aktiven Antikörpern oder zum Auffinden von Wirkstoffen, die die Aktivität von Fc-Rezeptoren auf Herzmuskelzellen beeinflussen, umfassend die folgenden Schritte: a) Kultivieren von Herzmuskelzellen, b) Inkubieren der kultivierten Herzmuskelzellen mit dem zu testenden Antikörper oder Wirkstoff sowie gegebenenfalls ohne den zu testenden Antikörper oder Wirkstoff, und gegebenenfalls mit einer KontrollSubstanz , c) Messen der Aktivität der Fc-Rezeptoren nach Inkubation der Herzmuskelzellen mit dem zu testenden Antikörper oder Wirkstoff sowie gegebenenfalls ohne den zu testenden Antikörper oder Wirkstoff, und gegebenenfalls mit der Kontrollsubstanz, d) Vergleichen der Aktivität der Fc-Rezeptoren anhand der Messergebnisse aus Schritt (c) und e) Bestimmen, ob der zu testende Antikörper oder Wirkstoff die Aktivität der Fc-Rezeptoren beeinflusst .
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