JPS63245683A - カルボン酸エステルの製造法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 激鼠直恋杜豆匁亙 本発明は、カルボン酸エステルの製造法に関する。さら
に詳しくは、本発明はカルボキシルエステラーゼを触媒
として、ヒドロキシ化合物と酸無水物とを有機溶媒中で
反応させることを特徴とするカルボン酸エステルの製造
法に関する。

複米恋逸肛 従来知られているカルボン酸エステルの合成反応は、有
機化学的合成反応と酵素反応とに大別される。

このうち有機化学的合成反応としては、硫酸等を用いて
ヒドロキシ化合物（Ｒ”ＯＨニアシル基受容体）とカル
ボン酸（ＲｂＣＯＯＨニアシル基供与体）とを縮合させ
る脱水反応 （ＲａＯＨ＋ＲｂＣ０ＯＨ→Ｒａ０−Ｃ０Ｒｂ＋Ｈ１０
）、あるいはヒドロキシ化合物（ＲａＯＨニアシル基受
容体）にエステル（ＲｂＣＯ−ＯＦｔ　ニアシル基供与
体）を反応させ、ヒドロキシ化合物にエステルのアシル
基を結合させる化学的エステル交換反応（Ｒ”ＯＨ＋　
ＲｂＣＯ−ＯＲｃ４ＲａＯ−ＣＯＲｂ＋ＲｃＯＨ）など
が知られている。

一方酵素反応としては、ヒドロキシ化合物とカルボン酸
とを基質とし、エステル加水分解反応の逆反応を利用す
るエステル合成反応、あるいはヒドロキシ化合物とエス
テルとを基質とするエステル交換反応などが知られてい
る。

発明が解決しようとする問題点 しかしながら、有機化学的合成反応には、カルボン酸、
エステル等のアシル基が結合するヒドロキシル基の位置
に特異性がなく、アシル基が結合するヒドロキシル基を
選択してエステルを製造する場合、必ずしも有用な方法
ではない。

例えば、豚赤痢感染症に対する予防治療薬として有効で
あると報告され［山崎俊幸、末永格、生用憲明：第９７
回日本獣医学会要旨集、Ｖ−５８（１９８４）、生用憲
明、中ロ武、武田継之助；第９７回日本獣医学会要旨集
、Ｖ　−５９（１９８４）］、物理化学的生物学的性質
が明らかにされている［ザ・ジャーナル・オブ・アンテ
ィビオティクス（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ａｎｔ
ｉｂｉｏｔｉｃｓ）第２４巻、１頁（１９７１）、同誌
第２６巻、６４７貢（１９７３）、ケミカル・アンド・
ファーマシューティカル・ビュレティン（Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｂｕｌｌ
ｅｔｉｎ）第２２巻、９９頁（１９７４）、同誌第２３
巻、　２２０１頁（１９，７５）１ランカシジンＡ（式
Ｉ）をランカシジンＣ（式■）から合成する場合、有機
化学的合成反応では、ランカシジンＣの８位と１４位に
存在するヒドロキシル基のうち、１４位のヒドロキシル
基のみを選択的にアセチル化することができないので適
当な方法とは言えない。

ランカシジンＡ Ｏ■ ランカシジンＣ 一方酵素反応の場合、アシル基が結合するヒドロキシル
基の位置に特異性があり、有用物質を選択的に合成する
方法として優れていると考えられる。しかしながら酵素
によるエステル交換反応は、アシル基供与体として用い
られるエステルが、触媒に用いられるカルボキシルエス
テラーゼにより加水分解を受けたり、目的とするエステ
ルを合成する反応と同時に逆反応も進行するために、多
量のアシル基供与体を必要とする。さらに、エステル交
換反応は平衡可逆反応である性質上、゛アシル基受容体
が完全に目的のエステルに転換することは望み得ない。

また酵素によるエステル加水分解反応の逆反応を利用す
るエステル合成反応は、完全な無水の状態で反応を行う
必要がある等の制約があるうえに、エステルの収量は低
く、実用には供しがたい。

問題点を解決するための手段 上記した事情に鑑み、本発明者らは、アシル基が結合す
るヒドロキシル基に特異性を有し、かつ少量のアシル基
供与体で高収率にエステルが得られる酵素反応を確立す
べく鋭意研究した結果、アシル基供与体に酸無水物を使
用し、有機溶媒中で反応させると収量が意外にも向上す
ることを見い出し、これに基づいてさらに研究した結果
、本発明を完成した。

すなわち本発明は、カルボキシルエステラーゼを触媒と
して用い、アシル基供与体としての酸無水物とアシル基
受容体としてのヒドロキシ化合物とを有機溶媒中で酵素
反応させることを特徴とするカルボン酸エステルの製造
法である。

本発明においてカルボン酸エステルが生成される際に、
触媒として用いられるカルボキシルエステラーゼ（ＥＣ
３，１，１，１）の起源としては、放線菌を含む細菌、
真菌等の微生物の他、動物、植物等あらゆる生物に求め
ることができ、例えば動物肝臓エステラーゼ［メソッド
・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ　ｌｎ　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ）第１巻、６５７頁（１９５５）］、
該文献に記載の方法で調製されたシグマ社（米国）製豚
肝臓エステラーゼ、ストレプトミセス・ロチェイΦバー
ル・ボルビリス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｃｈｅｉ　ｗａｒ、
　ｖｏｌｕｂｉｌｉｓ）由来のＴ−２６３６エステラー
ゼ［ザ・ジャーナル・オブ・アンティビオティクス、第
２４巻、１頁（１９７１）］などが挙げられる。

当該カルボキシルエステラーゼは、天然のものを用いて
もよく、精製したものを用いてもよい。

また精製の度合はいかなる程度のものでもよく、例えば
蛋白質のみを抽出した粗酵素液、さらに精製した単一蛋
白質標品などが挙げられる。

また本発明においては、反応を有利に遂行させるために
、化学的に改質して本発明で用いられる有機溶媒に可溶
化せしめたカルボキシルエステラーゼを用いてもよい。

カルボキシルエステラーゼを化学的に改質する方法とし
ては、例えば２．４−ビス（０−メトキシ−ポリエチレ
ングリコール）−６−クロロ−Ｓ−トリアジン（以下、
活性化ＰＥＧ、と略称することがある。）を酵素蛋白質
に接触させ、ポリエチレングリコールを結合させた修飾
蛋白質を調製する方法［バイオケミカル・アンド・バイ
オフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｌｏｎｓ
）第１２２巻、第２号、８４５頁（１９８４）］などが
挙げられる。

上記したように、本発明におけるカルボキシルエステラ
ーゼは、有機溶媒に可溶化せしめたもの、可溶化せしめ
ていないもののいずれのものを用いてもよいが、有機溶
媒に可溶化せしめたカルボキシルエステラーゼを用いる
のが好ましい。

本発明におけるカルボキシルエステラーゼは、通常あら
かじめ水性溶媒（例、緩衝液など）に溶解させて用いる
が、有機溶媒に可溶化せしめたカルボキシルエステラー
ゼの場合には、少量の水を含有する有機溶媒に溶解させ
て用いることもできる。

またカルボキシルエステラーゼは、後述の実施例５に示
すようにカルボキシルエステラーゼ生産菌の発酵ろ液等
をそのまま用いることも可能である。

さらに、カルボキシルエステラーゼは固定化酵素として
用いることもできる。この場合、水相をほとんど形成し
ない状態で反応を遂行させることが望ましく、例えば、
有機溶媒に可溶化せしめたカルボキシルエステラーゼを
カラム状の固定化酵素として用い、これにヒドロキシ化
合物と酸無水物とを含有する有機溶媒を通液して、反応
させる方法が挙げられる。

本発明で用いられる酸無水物としては、通常の有機合成
反応（例、ペプチド合成反応、抗生物質合成反応など）
に用いられ、分子量が３５０以下（好ましくは２３０以
下）で、有機溶媒に可溶であるものが挙げられ、例えば
、同一のカルボン酸２分子が水１分子を失って縮合した
もの（例、無水酢酸、無水プロピオン酸、無水ｎ−酪酸
、無水イソ酪酸。

無水ｎ−吉草酸、無水ｎ−カプロン酸、無水安息香酸な
ど）、異なるカルボン酸２分子が水１分子を失って縮合
したもの（例、無水酢酸プロピオン酸、無水プロピオン
酸酪酸など）が挙げられるが、なかでも同一のカルボン
酸２分子が水１分子を失って縮合したものを用いるのが
好ましい。

本発明において酸無水物はアシル基供与体として用いら
れるが、供与するアシル基としては例えば、モノカルボ
ン酸由来のもの（例、アセチル基。

プロピオニル基など）、脂肪族不飽和カルボン酸由来の
もの（例、アクリロイル基、プロピオロイル基など）、
炭素環式カルボン酸由来のもの（例、ベンゾイル基、ナ
フトイル基など）などが挙げられる。

本発明で用いられる酸無水物としては、下記式■で示さ
れるものが好ましい。

Ｒ−Ｇ。

０■ ｒｔ、−ｃ。

［式中、ＲおよびＲ１はそれぞれ水素、アルキル基。

アルケニル基、アルキニル基、アリール基またはアラル
キル基を示す。］ 下記式■において、アルキル基としては、炭素数が１〜
１０の直鎖状または分枝状のアルキル基（例、メチル、
エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル。

ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル
。

オクチル、ノニル、デシルなど）、５〜１０員環の環状
アルキル基（例、シクロペンチル、シクロヘキシル、シ
クロオクチル、シクロデシルなど）が好ましく、アルケ
ニル基としては炭素数が２〜１０の直鎖状または分枝状
のアルケニル基（例、ビニル、アリル、ブタジェニル、
ヘキサジェニル、デセニルなど）、５〜１０員環の環状
アルケニル基（例、シクロペンテニル、シクロへキセニ
ル、シクロオタテニルなど）が好ましく、アルキニル基
としては、炭素数が２〜ｌＯの直鎖状または分枝状のア
ルキニル基（例、エチニル、プロピニル、ペンチニル、
デシニルなど）が好ましく、アリール基としては炭素数
が６〜１２のアリール基（例、フェニル、ナフチル、ビ
フェニリルなど）が好ましく、アラルキル基としては、
炭素数が７〜１０のアラルキル基（例、ベンジル、フェ
ネチル、フェナシルなど）が好ましい。

なかでも、ＲとＲ，が同一であるものが好ましく、とり
わけＲ，Ｒ，がともにアルキル基（好ましくは、炭素数
が１〜５のアルキル基）またはアリール基（好ましくは
、フェニル）であるものがさらに好ましい。

本発明で用いられるヒドロキシ化合物は、炭素に結合し
たヒドロキシル基を１〜１０個（好ましくは、１〜５個
）含む有機化合物であり、分子量が１，５００以下（好
ましくは、９００以下）で、有機溶媒に可溶であるもの
が挙げられ、例えばアルコール類（例、メタノール、エ
タノール、ｎ−プロパツール、イソプロパツール、ｎ−
ブタノール等の一価アルコール、エチレングリコール、
１．４−ブタンジオール等の二価アルコール、グリセリ
ン等の三価アルコールなど）、フェノール類（例、フェ
ノール、クレゾール、ベンゼントリオール、ヒドロキノ
ンなど）、複素環式化合物（例、８−キノリツール、ヒ
ドロキシピペリジンなど）、抗生物質類（例、テトラサ
イクリン類、ロイコマイシンＡ８．ランカシジンＣ，ク
ロラムフェニコール、セファロスポリン、マリドマイシ
ン、エリスロマイシンなど）、生理活性物質（フィブロ
スタチンＥ、Ｆなど）などを挙げることができ、なかで
もアルコール類、抗生物質類が好ましく、とりわけ低級
（Ｃ＊−４）アルコール、ランカシジンＣ，マリドマイ
シンが好ましい。

本発明で用いられるヒドロキシ化合物は、下記式■で示
されるものが好ましい。

Ｒ，ＯＨＩＶ　　［式中、Ｒ１は有機残基を示す。］上
記式■における有機残基は、分子量がｔ、ｏｏ。

以下の有機残基であり、例えばアルキル基、アルケニル
基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、複素環
基などが挙げられる。

上記式■において、アルキル基としては炭素数が１〜３
０の直鎖状または分枝状のアルキル基（例、メチル、エ
チル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−
ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、オクチル、ノニ
ル、ドデシル、ウンデシル、ヘニコシルなど）、５〜２
０員環のシクロアルキル基（例、シクロペンチル。シク
ロヘキシル、シクロオクチル。

シクロデシル、アダマンチルなど）が好ましく、アルケ
ニル基としては炭素数が２〜３０の直鎖状または分枝状
のアルケニル基（例、ビニル、アリル。

ブタジェニル、ヘキサジェニル、ウンデセニルなど）、
５〜２０員環のシクロアルケニル基（例、シクロペンテ
ニル、シクロへキセニル、シクロオクテニルなど）が好
ましく、アルキニル基としては炭素数が２〜３０のアル
キニル基（例、エチニル、プロピニル、ペンチニル、デ
シニル、ウンデセニルなど）が好ましく、アリール基ど
しては炭素数が６〜１４のアリール基（例、フェニル、
ナフチル、アントラニル、ビフェニリルなど）が好まし
く、アラルキル基としては炭素数が７〜１９のアラルキ
ル基（例、ベンジル、フェネチル、フェナシル、トリチ
ルなど）が好ましく、複素環基としては１〜５個の窒素
原子、１〜５個の硫黄原子または／および１〜５個の酸
素原子を含む５〜２０員環の複素環基が好ましく、該複
素環は５〜８員環の脂環式炭化水素（例、シクロペンタ
ン、シクロオクタンなど）、６〜！４員環の芳香族炭化
水素（例、ベンゼン、アントラセンなど）、４〜８員環
の複素環（例、アゼチジン、チアシクロヘキサンなど）
などと縮合していてもよい。

上記式■におけるアルキル基、アルケニル基、アルキニ
ル基、アリール基、アラルキル基は置換基を有していて
もよく、例えばヒドロキシル、アルコキシ、（例、メト
キシ、エトキシ、プロポキシ、ｔ−ブトキシなど）、ニ
トロ、置換されていてもよいアミノ（例、アシル化され
たアミノ、保護されたアミノなど）、Ｉｌ！換されてい
ても°よいスルホ（例、メチルチオ、エチルチオ、イソ
プロピルチオなど）、複索環（例、ピリジル、チェニル
、ベンゾチェニル、キノリルなど）などの置換基が挙げ
られる。

上記式■における複素環基は置換基を有していてもよく
、例えば上記式■におけるアルキル基。

アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル
基やヒドロキシル、アルコキシ（例、メトキシ。

エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｔ−ブトキシなど）、ニト
ロ、置換されていてもよいアミノ（例、アシル化された
アミノ、保護されたアミノなど）、置換されていてもよ
いスルホ（例、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピル
チオなど）などの置換基が挙げられる。

ランカシジンＣを用いる場合、有機溶媒に溶解させたも
のを用いてもよく、また後述の実施例５に示すように発
酵ろ液をそのまま用いることも可能である。

本発明においては、ヒドロキシ化合物１ｆｆｉｆｆｉモ
ルに対して、１〜１００重量モル好ましくは２〜２０重
量モルの酸無水物が用いられる。

本発明で用いられる有機５溶媒としては、ｐＨが約３〜
１０のもので、反応条件下でカルボキシルエステラーゼ
を失活させないものであればいずれでもよいが、例えば
鎖式炭化水素類（例、ｎ−ヘキサン、ｎ−へブタン、ｎ
−ペンタン、イソヘキサン、塩化メヂレン、クロロホル
ム、四塩化炭素、塩化エチレン、塩化エチリデン、塩化
ビニリデン、塩化ブチル、塩化アミル、塩化アリル、臭
化エチル、臭化エチレン、エチレンクロルプロミド、フ
ルオロトリクロルメタンなど）、環式炭化水素ｍ（例、
シクロヘキサン、メチルヘキサン、デカリン、ベンゼン
、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、テトラリン、
クロルベンゼン、０−ジクロルベンゼン、ブロムベンゼ
ン。

０−クロルトルエン、α−クロルナフタリンなど）、エ
ーテル類（例、エチルエーテル、ジクロルエチルエーテ
ル、メチルセロソルブなど）、アセタール類（例、メチ
ラール、アセトアルデヒドジエチルアセタールなど）、
複素環式化合物（例、フランンフルフラール、２−メチ
ルフラン、テトラヒドロピラン。

１．２−プロピレンオキシド、エピクロルヒドリン。

１．４−ジオキサン、ビリジ９１モルホリンなど）、ケ
トン類（例、メチルエチルケトン、メチル−ｎ　−プロ
ピルケトン、メチル−ｎ−ブチルケトン、メチルイソブ
チルケトン、メチル−ｎ−アミルケトン。

ジエチルケトン、エチル−ｎ−ブチルケトン、ジアセト
ンアルコール、メシチルオキシド、シクロヘキサノン、
メチルシクロヘキサノン、アセトフェノン。

アセトニルアセトンなど）、エステル類（例、ギ酸メチ
ル、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、プロピオン
酸メチル、酪酸メチル、アセト酢酸エチル。

安息香酸メチル、サリチル酸メチル、アビエチン酸エチ
ル、シュウ酸ジエチル、マロン酸ジエチル、フタル酸ジ
エチル、アジピン酸ジオクチルなど）、リン酸エステル
類（例、リン酸トリエチルなど）、炭酸エステル類（例
、炭酸ジエチルなど）、アミン類（例、トリメチルアミ
ンなど）、アミド類（例、ホルムアミド、Ｎ、Ｎ−ジメ
チルホルムアミドなど）、ニトリル類（例、アセトニト
リルなど）、含硫化合物（例、二硫化炭素、ジメチルス
ルホキシドなど）、石油留分（例、石油エーテル、石油
ベンジン、リグロインなど）などを挙げることができる
が、水と二層形成しうるちのが好ましく、なかでもケト
ン類、エステル類が好ましく、とりわけメチルエチルケ
トン、メチル−ｎ−プロピルケトン、メチル−ｎ−ブチ
ルケトン、メチルイソブチルケトン、酢酸メチル、酢酸
エチルが好ましい。

また本発明において、前述の酸無水物、ヒドロキシ化合
物は、有機溶媒の役割を兼ねて用いることもできる。

本発明の反応は、酸無水物、ヒドロキシ化合物を有機溶
媒中に含有させ、カルボキシルエステラーゼを加え、充
分混合しながら反応を行うことが好ましい。有機溶媒に
可溶でないカルボキシルエステラーゼを用いる場合のよ
うに水を比較的多量に含む場合には、充分な混合を施す
ことにより油中水型エマルジョンを形成させて、反応を
行うことが好ましい。一方、有機溶媒に可溶であるカル
ボキシルエステラーゼを用いる場合のように極く少量の
水を含む場合には、充分な混合を施すことにより水を有
機溶媒中に溶は込ませて、−相反窓で反応を行うことも
できる。。

反応温度およびｐＨは用いる酵素、基質、溶媒の種類に
より若干の差異はあるが、通常反応温度は約５〜９０℃
、望ましくは約２０〜７０℃の範囲で、反応ｐＨは約２
〜１０．望ましくは約３〜９の範囲で反応を行うことが
好ましい。

生成されるカルボン酸エステルを採取するには、通常使
用されるエステルの分離採取手段（例、ろ過、蒸留、ａ
縮、クロマトグラフィー、再結晶など）を適宜適用でき
るが、最も簡便な方法として例えば蒸留により分別する
方法を挙げることができる。

また必要に応じて、シリカゲル、アルミナ等のカラムを
用いるクロマトグラフィーにより生成化合物を分離し、
常温で液状のものあるいは沸点が比較的低いものについ
ては蒸留により分別し、沸点が高いものについては濃縮
品出させて採取する方法を用いてもよい。

本発明のカルボン酸エステルの製造法によれば、アシル
基を選択的にヒドロキシル基と結合させることができ、
また反応がほとんど不可逆的に進行するため、少量のア
シル基゛供与体で高収率にカルボン酸エステルを得るこ
とができるので工業的に有利である。

実施例 以下に実施例および参考例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲をなん
ら限定するものではない。

なお、特に規定しない場合には、％は重量／容量％を示
ず。

参考例１　酵素の調製 グルコース３．０％、プロフロ（商品名、トレーダーオ
イル社製）１．０％、コーンステイープリカー３．５％
、硫酸マグネシウム０．０２％、リン酸第２カＩＪ　ウ
Ａ　Ｏ、１％、大豆油０．０５％、炭酸カルシウム１．
５％（百分率表示１重ｆｆｉ／容量）からなる培地５０
０１Ｒ１を、２０％苛性ソーダ水溶液を用いてｐＨ７，
０に調整したのち２Ｑ容坂ロフラスコに分注し、綿栓を
してから滅菌した。これにストレプトミセス・ロチェイ
・バール・ボルビリス［ＩＦＯ１２５０７］［ＡＴＣＣ
−２１２５０］［特開昭５９−１８３６９５号公報参照
］の斜面培養物を接種したのち、２８℃で２４時間往復
振盪培養機（８３ｓｐｓ）上で培養した。５０（２容発
酵槽に上記の培地と同じ組成の培地３０ｉ２を調製、滅
菌したのち、上記坂ロフラスコ培養物５００１Ｒ１を接
種し、通気ｆｆｉｌＶＶＭ（単位容量当りの毎分の通気
量ｆｆ１）。

攪拌回転数１５　Ｏｒｐｍで２４℃、２４時間培養して
種培養物とした。２００Ｑ容発酵槽にグリセリン１０％
、プロフロ（商品名、トレーダーオイル社製）２．０％
、コーンステイープリカー０．５％、ポリペプトン１．
０％、硫酸第１鉄０．１％、大豆油０．０１％、β−シ
クロデキストリン２．０％（百分率表示。

重量／容ｆｆ１）からなる培地１００ｅを調製し、２０
％苛性ソーダ水溶液を用いてｐＨ７，０に調整したのち
、１２０℃、２０分間の蒸気滅菌をした。これに上記の
種培養物５Ｑを移植し、通気量ｔＶＶＭ、攪拌回転数１
６５　ｒｐｍ、温度２４℃で９６時間培養した。

かくして得られた培養物６０１２をとり、これに水２０
Ｑとハイフロス−パーセル（ジョンズ・マンビル社製）
２ｋｇを加えてろ過し、７０Ｑのる液を得た。このろ液
１０２を６０１２容器に採取し、エタノール４０Ｑをこ
れに加え、攪拌枠により充分に攪拌した。５℃にて１２
時間静置し、蛋白質の沈澱を生ぜしめ、上清液をサイフ
オンにより除去して白濁沈澱物を得る。これを５℃、２
．ＯＯＯＸｇの条件で冷却遠心分離に供し、水分をでき
るだけ除去し、エタノールを加えて洗浄を行う。同条件
で遠心分離し、沈澱物を集め、５０　ｍｍ１１ｇ、　１
０℃、２４時間の条件で真空乾燥を行い、およそ２００
ｇの粉末を得た。これを５００−のトリスヒドロキシメ
チルアミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４、０，０５
Ｍ）に懸濁溶解させ、不溶部分を５℃、２．０００Ｘｇ
の条件で遠心分離して除去し、蛋白溶解液を得た。

これに２ｅのエタノールを加えてよく混合し、ふたたび
蛋白を沈澱させたのち５℃、２４時間の条件で静置り上
清液をサイフオンにより除去した。

沈澱部分を５℃、　２．ＯＯＯＸｇの条件で遠心分離に
供し、上清液部分を完全に除き、エタノールで洗浄し、
ふたたび同条件で遠心分離して沈澱物を採集し、た。こ
れを５０ｍｍ’ｌ１ｇ、　　ｌ　０℃、２４時間の条件
で真空乾燥を行い、およそ１００ｇの蛋白の粉末を得た
。

この粉末を３００１ｎｌのトリスヒドロキシメチルアミ
ノメタン−塩酸（＋））！　７　、４　、０．０５Ｍ）
に溶解し、不溶部分を５℃、　２，０００Ｘｇの条件で
遠心分離して除去したのち、これを口径２００ｍｍ、長
さ１５００ｍｇ＋の円筒型カラムにセファデックスＧ−
５０を充填してトリスヒドロキシメチルアミノメタン−
塩酸緩衝液（ｐＨ７、４、０，０５Ｍ）で平衡化したも
のに流し込み、２０７ｎ１１５分の流速で同緩衝液を通
液してゲルろ過クロマトグラフィーを実施した。バラニ
トロフェニル酢酸を用いてカルボキシルエステラーゼの
活性を測定する方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒＢｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第１７００．４６７頁
（１９４７）］によりカルボキシルエステラーゼ活性を
測定し、活性画分４００威を集め、これに２．４ｅのエ
タノールを加えて３Ｑ容三角フラスコ中でスターラーを
用いて混合攪拌し、蛋白の沈澱を生ぜしめた。５℃、２
４時間の条件で静置したのち、沈澱部分を５℃、２．０
００Ｘｇの条件で遠心分離して採取し、さらに５０　ｍ
ｍ１１ｇ、　１０℃、２４時間の条件で真空乾燥して、
４０ｇの蛋白の粉末を得た。これをトリスヒドロキシメ
チルアミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４、０，０５
Ｍ）　１００ｄに溶解させ、この溶解液を口径１００ｍ
ｍ、長さ１５００ｍｍの円筒型カラムにセファデックス
Ｇ　−１００を充填させたゲルカラムに流し込み、つづ
いて同緩衝液をｌｏ成１５分の流速で通液し、ゲルろ過
クロマトグラフィーを実施した。活性画分を集めて、前
述の緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファデックスＡ　−
５０（口径５０ｍｍ、長さ４００ｎ＋ｍ）カラムに流し
込み、第１［（高濃度塩液供給槽）に食塩１Ｍ５度を含
むトリスヒドロキシメチルアミノメタン−塩酸緩衝液（
ｐＨ７，４，０，０５Ｍ）２（２を充填し、第２槽（攪
拌槽）に食塩を含まないトリスヒドロキシメチルアミノ
メタン−塩酸緩衝液（ｐＨ７、４、０，０５Ｍ）　２　
Ｑを充填したものから成る塩濃度直線勾配イオン交換ク
ロマトグラフィーに供した。溶出液をフラクシジンコレ
クター（東洋５　Ｆ　−１６０に型）によりＩＱｄずつ
分画し、カルボキシルエステラーゼ活性を測定して、活
性画分３００−を採集した。これを１ｅ容三角フラスコ
中で、２００ｇの硫酸アンモニウム結晶を攪拌しながら
滴下する方法で塩析した。

塩析物を５℃、２４時間の条件で静置し、蛋白質を完全
に沈澱させたのち、５℃、２．０００Ｘｇの条件で遠心
分離して蛋白沈澱物を得た。この沈澱物をトリスヒドロ
キシメチルアミノメタン−塩酸緩衝液（ｐＨ７、４、０
，０５Ｍ）　５０−に溶解せしめ、ふたたび前述のセフ
ァ゛デックスＧ−１００カラムに流し込み、前述と同条
件でゲルろ過クロマトグラフィーを行なった。得られた
活性画分をふたたび前述と同条件でＤＥＡＥセファデッ
クスＡ−５０を用いる塩濃度直線勾配イオン交換クロマ
トグラフィーに供し、２５０ｄの活性画分を得た。これ
に硫酸アンモニウム１６７ｇを攪拌しながら滴下するこ
とにより塩析を行い、５℃、２４時間の条件で静置した
のち、沈澱物を前述と同条件で遠心分離して得た。沈澱
物を３０成のトリスヒドロキシメチルアミノメタン−塩
酸緩衝液（ｐＨ７、４、０，０５Ｍ）に溶解させ、この
溶解液を前述と同条件でセファデックスＧ−１００を用
いるゲルろ過クロマトグラフィーに供し、活性画分を得
、これをトリスヒドロキシメチルアミノメタン−塩酸緩
衝液（ｐＨ７，４、０，０５Ｍ）で平衡化した口径１０
ｍｍ、長さ１００ｍｍのＤＥＡＥセファデックスＡ−５
０カラムに吸着せしめた。同緩衝液１００ｉを通液した
のち、食塩１Ｍ５度を含有する同緩衝液２０１ｎｌに上
りカルボキシルエステラーゼ活性画分を溶出した。

この溶出画分をセロファン透析チューブに注入し、３１
２容三角フラスコ内の水２Ｑの中に入れ、５℃にて２４
時間、スターラーを用いて外液を攪拌しつつ透析した。

透析後、チューブ内液を２１２容ナス型フラスコに流し
込み、アセトン−ドライアイス中で薄膜状に凍結させた
のち、凍結真空乾燥機（バーチイス社製、Ｎｏ、１０−
１４６　ＭＲ−Ｉ３　Ａ型）に連結させ、２０　ｍｍＨ
ｇの真空条件で２４時間の凍結真空乾燥を行い、粉末状
のストレプトミセスφロチェイ・バール・ボルビリス由
来のカルボキシルエステラーゼ（ＥＣ３，ｌ、１．１）
１００ｍｇを得た。得られたカルボキシルエステラーゼ
は、ＳＤＳゲル電気泳動、超遠心パターンを測定した結
果、単一蛋白質であることが確認された。以下、このカ
ルボキシルエステラーゼをカルボキシルエステラーゼ標
品と略称することがある。

参考例２　化学的修飾酵素の調製 このカルボキシルエステラーゼ標品５０ｍｇを、８１ｄ
、の０．ＩＭホウ酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ９，５）に
溶解させ、これに２．４−ビス（０−メトキシ−ポリエ
チレングリコール）−６−クロロ−８−）リアジン（ポ
リエチレングリコールの分子量、６０００）を１．０ｇ
加え、５℃の条件で１時間攪拌した。攪拌後、リン７カ
リウム緩衝液（０，２Ｍ、ｐＨ７，０）７２ｄを加えて
混合し反応を停止させた。次に、この溶液をミリポアフ
ィルタ−ＹＭ−１０を用いる限外ろ過装置（アミコン社
製、８０５０型）に入れて、リン酸カリウム緩衝液（０
，２Ｍ、ｐＨ７，０）４００ｄを用いて洗浄し、未反応
の２．４−ビス（０−メトキシ−ポリエチレングリコー
ル）−６−クロロ−５−）リアジンを除去した。洗浄後
、ポリエチレングリコールが結合した酵素蛋白質を含む
溶液を５００ｔＲ１容ナス型フラスコに入れ、アセトン
−ドライアイスにより薄膜状に凍結したのち、２０ｓｍ
ｏｇの条件下で２４時間の凍結真空乾燥を行い、ポリエ
チレングリコールが結合したカルボキシルエステラーゼ
（以下、ＰＥＧ修飾エステラーゼと略称することがある
。）を６００ｍｇ得た。

実施例１ ランカシジンＣ１１ｍＭ、無水酢酸５０ｍＭとなるよう
にメチルイソブチルケトン中に溶解させ、このものを２
ｗｉとり、２０ｍ容の共栓付き試験管に入れ、これにト
リスヒドロキシメチルアミノメタン−マレイン酸緩衝液
（０，２Ｍ、ｐＨ７，０）中に１２Ｄ／−の濃度でＰＥ
Ｇ修飾エステラーゼを溶解せしめた酵素液を０．３１ｎ
ｌ加え、３７℃、８０ｓｐｍの条件で試験管振盪機によ
り振盪を行なった。表１に示す時間に溶媒層より採取し
、以下に述べる高速液体クロマトグラフィー法（以下、
ＨＰＬＣ法と略称することがある。）によりランカシジ
ンＡの生成量を測定した。ＨＰＬＣ法は、高速液体クロ
マトグラフィー装置（高車製作所製、ＬＣ−５Ａ型）を
用い、マイク西ボラシルカラム（３００Ｘ３，９１ｍφ
、ウォーターズ社製、米国）を用いて、温度４５℃、流
速１．２−／分の条件で行なった。この条件下でクロマ
トグラフィーを行なうと、ランカシジンＣは７．０分、
ランカシジンＡは３．５分の保持時間で溶出した。ラン
カシジンＡの定量は、２５４ｎｏ＋の紫外線吸収検出器
を用いて行なつた。

対照として、無水酢酸５０５Ｍの代わりに酢酸エチル３
００ｍＭまたは酢酸１０ｈＭを用いて同様に実施した。

結果は表１に示すとおりとなった。

表１の結果から、無水酢酸は酢酸エチル、酢酸に比べて
、ランカシジンＡの生成速度、生成量の点ではるかに優
れていることが明らかである。また、酢酸では実用に供
し得ないことも明らかである。

実施例２ 反応時間を２０分に固定し、アセチル基供与体の濃度を
表２に示すように変動させ、実施例１と同じ操作を繰り
返した。結果は表２に示すとおりとなった。

（以下余白） 表２　アセチル基供与体によるランカシジンＡの生成ｆ
ｆ１（＋ａＭ）注）アセチル基供与体として酢酸を用い
て、酢酸エチルと同じ濃度で実施したが、ランカシジン
Ａの生成は認められなかった。

酵素反応に適用されるミカエリス・メンテンの式（式■
）［東京化学同人（株）発行「生化学辞典」第１版、　
１２３９頁（１９８４）］を変形したラインライ−バー
・パークの式（式■）［同辞典第１版、　１３１４頁（
１９８４）］を利用して、アセチル基供与体に無水酢酸
を用いた反応と酢酸エチルを用いた反応とを比較した。

υ＝ゴ州制左Ｌ　　　■ 上＝　」ｊ−昌ゴ　　」−一・・・・・・・・・■ｖ　
　　Ｖｍａｘ　　　　、　＋Ｖｍａｘυ：　　反応速度 Ｖａ＋ａｘ：　　最大反応速度 ［Ｓ］。：　基質濃度 Ｋｍ：　　　ミカエリス定数 なお、［Ｓ］。に表２のアセチル基供与体濃度を、υに
表２のランカシジンＡ生成量を代入して、最小自乗法に
よりＫｍおよびＶ　ｍａｘの値を求めた。結果は表３に
示すとおりとなった。

表３ 表３の結果から、アセチル基供与体として無水酢酸を用
いると、酢酸エチルを用いる場合に比べてＫｍ値が極め
て小さくなるので、少量の基質で充分な反応生成物が得
られることが明らかである。

実施例３ １０Ｃ容グラスライニング反応槽（攪拌付き）にあらか
じめ３７℃に保温しである２Ｑのメチルイソブチルケト
ンを入れ、これにランカシジン０１０ｇを投入して溶解
させる。つぎに参考例２で得られたＰＥＧ修飾エステラ
ーゼ１．２ｇを、あらかじめトリスヒドロキシメヂルア
ミノメタンーマレイン酸緩衝液（０，２Ｍ、ｐＨ７，０
）３００ｒａｌに溶解せしめたものを投入して混合した
のち、無水酢酸１０旙を有機溶媒中に加えて、３７℃で
４０分攪拌しながら反応を行なった。反応後、蒸留水２
ａを加えて攪拌混合後、ｌＯｅ容分成分液ロート中れ、
水溶液部分を除去した。さらに、これに重炭酸ソーダ水
２％（重！ｌ／容量）を５０〇−加え、充分に攪拌混合
したのち水溶液部分を除いた。重炭酸ソーダ水による洗
浄を同様にもう一度実施し、過剰の酸を除去した。その
後、蒸留水２ａによる洗浄を分岐ロート中で２回実施し
たのち、溶媒部分を３Ｑ容三角フラスコに移して、これ
に芒硝１００ｇを添加して２時間静置した。ろ紙ろ過で
芒硝を除いたのち、減圧濃縮乾固し、１０ｇのランカシ
ジンＡの粗結晶を得た。

この粗結晶をＩＱのクロロホルムに溶解させ、シリカゲ
ル（メルク社製）を充填してクロロホルムで平衡化した
カラム（口径８０ｍｍ、長さ５００　ａｍ）に流し込み
、ランカシジンＡをシリカゲルカラムに吸着させた。こ
のカラムを２Ｑのクロロホルムで通液洗浄後、酢酸エチ
ル、クロロホルム（３ニア容積比）混液で溶出し、溶出
画分を東洋フラクションコレクター（５Ｆ　−１８０に
型）を用いて２０ｄずつ分画して、紫外部吸収を指標と
してランカシジンＡの溶出画分を採集した。これを減圧
濃縮乾固して、得られたランカシジンＡ粉末にＩＱの酢
酸エチルを加えて溶解させたのち、ふたたび減圧濃縮に
供して４０ｔＩ＆に濃縮した。これを５℃に冷体すると
、ランカシジンＡの結晶が品出された。この結晶をグラ
スフィルターに集め、ｎ−ヘキサンで洗浄し、４０℃、
　２０　ａ＋ａ＋ＩＩｇの条件で真空乾燥に供すると、
８．１ｇのランカシジンＡの結晶が得られた。この結晶
の融点、旋光度、紫外部吸収値０元素分析値は完全に文
献［ザ・ジャーナル・オブ・アンティビオティクス、第
２４巻、１３頁（１９７１）］と一致した。”ＨＰ　Ｌ
　Ｃ法を用いて行なった保持時間もランカシジンＡの標
準品と一致した。

実施例４ １０１２グラスライニング反応槽（攪拌付き）に２Ｑの
メチルイソブチルケトンを入れ３７℃に保温したのち、
ランカシジン０１０ｇを溶解させた。これに、参考例１
で得られたカルボキシルエステラーゼ標品を２ｉｇ／ｌ
ｌｌ１．の濃度でトリスヒドロキシメチルアミノメタン
−マレイン酸緩衝液（０，２Ｍ。

ｐＨ７，０）に溶解せしめたものをＩＱ加え、次に１０
ｄの無水酢酸を有機溶媒中に加えて、４０分間。

３７℃で攪拌混合した。反応終了後、蒸留水２Ｑを加え
て攪拌混合後、１０ｆｆ容分液ロートに移し、以下実施
例３と同じ操作を繰り返してランカシジンＡの結晶を５
．８ｇ得た。

実施例５ 参考例１におけるストレプトミセス・ロチェイ・バール
・ボルビリスを培養して得られた発酵液のる液には、ス
トレプトミセス・ロチェイ・バール・ボルビリス由来の
カルボキシルエステラーゼが含まれているが、ストレプ
トミセス・ロチェイ・バール・ボルビリスはランカシジ
ンＣを培養液中に分泌するいわゆるランカシジンＣの生
産菌であることはすでに知られており［ザ・ジャーナル
・オブ・アンティビオティクス、第２４巻、１頁（１９
７１）］、実施例１に記載のＨＰＬＣ法に従ってランカ
シジンＣの含量を測定すると、３５００μｇ／ｄの濃度
のランカシジンＣを含有していることが確認されたので
、本実施例では参考例１で得られる発酵ろ液を、本発明
のカルボキシルエステラーゼおよびヒドロキシ化合物の
両者を含有するものとして用いた。

このろ液ｌＱを１０（２容グラスライニング反応槽（ｆ
ｉ拌付き）に入れて３７℃に保温し、これにあらかじめ
３７℃に保温したメチルイソブチルケトンＩＱを混合し
、さらに無水酢酸ｌＯ−を有機溶媒中に添加して３７℃
で６０分間攪拌した。反応終了後、低温遠心分離機（ト
ミー精工製、ＲＤ−２１Ｖ型）により２０００Ｘｇ、５
℃の条件で遠心分離し、さらにこの液を１０Ｑ容分液ロ
ートに入れて上層の溶媒部分を採取した。蒸留水２Ｑを
加えて洗浄し、以下実施例３と同じ操作により２．８ｇ
のランカシジンＡを採取した。

実施例６ 実施例３における無水酢酸ＩＯ−の代わりに、無水プロ
ピオン酸１０ｍを用いて、実施例３と同じ操作で実施し
た。

反応後の溶媒中の生成物については、ザ・ジャーナル・
オブ・アンティビオティクス、第２６巻。

６４７頁（１９７３）に記載されている合成法で調製し
たランカシジンＣ−１４−プロピオネートを標準品とし
て、実施例１に記載のＨＰＬＣ法に従って同定し確認し
た。すなわち上記ＨＰＬＣｉ法により、２．４０分の保
持時間を有するランカシジンＣ−１４−プロピオネート
が９　、１　ｇ／Ｑの濃度で溶媒中に含まれていること
が確認された。

実施例３と同じ操作でランカシジンＣ−１４−プロピオ
ネートを精製分離すると、７．２ｇの同化合物が採取さ
れ、融点、旋光度１元素分析値１分子吸光係数は完全に
文献値［ザ・ジャーナル・オブ　　。

・アンティビオティクス第２６＠、６４７頁（１９７３
）］と一致した。

実施例７ 実施例６における′無水プロピオン酸の代わりに無水ｎ
−ｆ１３酸、無水イソ酪酸、無水ｎ−カプロン酸。

無水安息香酸を用いた。それぞれ生成されたエステル化
合物について、実施例１に記載のＨＰＬＣ法を実施する
と、保存時間はそれぞれ２．０３分。

１．８９分、４．０６分、４．９０分であった。分離・
採取方法は実施例３と同じ操作で行い、それぞれランカ
シジンＣ−１４−ｎ−ブチレート、ランカシジンＣ−１
４−イソブチレート、ランカシジンＣ−１４−カプレー
ト、ランカシジンＣ−１４−ベンゾエートが得られ、そ
の収量はそれぞれ５゜７０ｇ、５．６０ｇ、３．１０ｇ
、３．２１ｇであった。

それぞれの化合物の融点、旋光度１元素分析値。

分子吸光係数は完全に文献値［ザ・ジャーナル・オブ・
アンティビオティクス、第２６巻、６４７頁（１９７３
）］と一致した。

実施例８ エタノールＩＭを含むメチルイソブチルケトン２ｇを、
１０１２容グラスライニング反応槽（担拌付き）に入れ
て３７℃に保温し、参考例２で得られたＰＥＧ修飾エス
テラーゼを１２ｍｇ／ｍの濃度でトリスヒドロキシメチ
ルアミノメタン−マレイン酸緩衝液（０，２Ｍ、ｐＩ（
７，０）に溶解せしめたものを、この反応槽に３００威
加える。これに表４に示す濃度で無水酢酸を加え、３７
℃で２０分間反応させた。反応終了後、メチルイソブチ
ルケトン層を採取し、下記の条件でガスクロマトグラフ
ィー（ＧＣ）に供し、生成される酢酸エチルと酢酸を定
量した。ガスクロマトグラフィーの条件は、高車製作所
製ＧＯ−９Ａを用い、カラムにボラパックＰ　（Ｐｏｒ
ａｐａｋ　ＰＸ　６０〜８０メツシユ、内径３ｍｍ。

長さ２ｍ、ウォーターズ社製）、検出器にガスクロマト
グラフィー検出器（高車製作所製、ＦＩＤ型）を用い、
水素ガス圧０　、５　ｋｇ／ａｍ”、水素ガス流速３５
威／分、空気圧０．５ｋｇ／ａｍ”、空気流速４８０Ｍ
／、／分、カラム温度１４０℃、注入器および検出器の
温度を１５０℃とした。この条件下で、試料の注入量を
５μｇとして実施した。各成分の保持時間は、生成物で
ある酢酸エチルが４．１分であり、エタノールは１．３
分、酢酸は２．６分、メチルイソブチルケトンは６．０
分であった。標準品（和光純薬製試薬、特級）を基準と
して各成分の定量を行い、表４に示す結果が得られた。

表４ 無水酢酸　　　酢酸エチル　　酢　酸 ２．５　　　　　２．４　　　　　２．５５．０　　　
　　５．２　　　　　４．９１０　　　　　　９．８　
　　　　　ｇ、２１５　　　　　　１５．２　　　　　
１２．３２０　　　　　　１９．３　　　　　１８．３
３０　　　　　　２４．０　　　　　２３．８４０　　
　　　　２５．１　　　　　２４．５実施例９ 実施例８の表４における無水酢酸添加濃度３０ｍＭの場
合につき、生成された酢酸エチルを以下に示す方法で分
離採取した。反応液に蒸留水５Ｑを加え充分に攪拌混合
したのち、１０Ｑ容分液ロートに移し、１時間静置した
のち、水溶液部分を除去した。次に重炭酸ソーダ水溶液
２％（重量／容量）を５００７ｎ１加え分岐ロートで充
分に混合したのち、１時間静置し水溶液部分を除去し、
さらに溶媒部分に５ｅの蒸留水を加え、同様な操作をし
て水溶液部分を除いた。このような重炭酸ソーダ水溶液
による洗浄操作をさらに３回繰り返し、反応液中にある
酵素蛋白質、エタノールおよび酢酸を除去した。ふたた
び蒸留水５ｅによる洗浄をしたのち、回分式分留塔によ
り、７７℃、常圧による蒸留を行い、酢酸エチルを分取
した。本化合物は２０℃における比重、屈折率、沸点が
完全に文献値［メルク・インデックス（Ｍｅｒｃｋ　Ｉ
ｎｄｅｘ）第８版（１９６８）］と一致した。

実施例１Ｏ 参考例２と同じ方法で、２．４−ビス（０−メトキシ−
ポリエチレングリコール）−６−クロロ−５−トリアジ
ンを用いて、豚肝臓由来カルボキシルエステラーゼ（Ｅ
Ｃ３，１，１，１，シグマ社製５（米国））のＰＥＧ修
飾エステラーゼを調製した。これを用いて実施例８と同
じ方法で無水酢酸とエタノールより酢酸エチルを生成さ
せる反応を実施し、実施例８と同じ定量方法により酢酸
エチルおよび酢酸の生成量を定量した。結果を表５に示
す。

表５ 無水酢酸　　　酢酸エチル　　酢　酸 ２．５　　　　　２．４　　　　　２．６５．０　　　
　　５．０　　　　　４．９１Ｇ　　　　　　　９．５
　　　　　８．３１５　　　　　　１４．９　　　　　
１３．０２０　　　　　　１８．５　　　　　１７．８
３０　　　　　　２３．５　　　　　２２．９４０　　
　　　　２４．０　　　　　２４．１実施例１１ 実施例１０の表５における無水酢酸添加濃度３０ＩＩＭ
の場合につき、生成された酢酸エチルの分離採取を実施
例９と同じ操作で実施した。３．０５ｇの酢酸エチルを
採取し、２０℃における比重。

屈折率、沸点が完全に文献値［メルク・インデックス、
第８版（１９６８）］と一致することを確かめた。

実施例１２ エタノールＩＭ濃度を含むメチルイソブチルケトン２ｅ
を、１０Ｑ容グラスライニング反応槽（ａ拌付き）に入
れて３７℃に保温し、参考例１と同じ操作で調製された
ストレプトミセス・ロチェイ・バール・ボルビリス由来
のＰＥＧ修飾エステラーゼを１２Ｄ／−の濃度でトリス
ヒドロキシメチルアミノメタン−マレイン酸緩衝液（０
，２Ｍ、ｐＨ７，０）に溶解せしめたものを３００−加
える。

３７℃で１０分間攪拌後、これに７．８ｇの無水プロピ
オン酸を有機溶媒中に添加したのち、さらに３７℃で２
０分間攪拌して反応させた。

反応終了後、反応液に５Ｑの蒸留水を加えて充分に攪拌
混合したのち、１０Ｇ容分液ロートに移し、１時間静置
浸水溶液部分を除去した。次に重炭酸ソーダ水溶液２％
（重量／容ｆｆ１）を５００ｄ加え、分液ロート中で充
分に攪拌混合したのち、１時間静置して水溶液部分を除
き、さらに溶媒部分に５Ｑの蒸留水を加え、同様な操作
をして水溶液部分を除去した。このような重炭酸ソーダ
水溶液による洗浄操作を３回−繰り返し、反応液中にあ
る酵素蛋白質、エタノールおよび酢酸を除去した。

この溶媒部分を回分式分留塔に入れ、常圧、９９℃で蒸
留を行い、蒸留物として５．５ｇのプロピオン酸エチル
を採取した。本化合物は２０℃における比重、屈折率、
沸点が完全に文献値［メルク・インデックス、第８版（
１９６８）］と一致した。

実施例１３ 実施例１２における無水プロピオン酸の代わりに、無水
ｎ−酪酸９．４ｇを添加して同じ操作を実施した。回分
式分留塔により常圧、１７８℃の蒸留によりｎ−酪酸エ
チル６．３ｇを採取した。本化合物は２０℃における比
重、屈折率、沸点が完全に文献値［メルク・インデック
ス、第８版（１９６８）］と一致した。

実施例１４ 実施例１２における無水プロピオン酸の代わりに、無水
ｎ−カプロン酸１２．９ｇを添加して同じ操作を実施し
た。回分式分留塔により常圧。

２０８℃の蒸留でｎ−カプロン酸エチル６．１ｇを採取
した。本化合物は２０℃における比重、屈折率、沸点が
完全に文献値［メルク・インデックス。

第８版（１９６８）］と一致した。

実施例１５ 実施例１２におけるエタノールの代わりにｎ−プロパツ
ールを用いて、実施例１２と同じ操作で実施した。回分
式分留塔により常圧、１２４℃において、プロピオン酸
ｎ−プロピル６．０ｇを蒸留して採取した。２０℃にお
ける比重、屈折率、沸点が文献値［メルク・インデック
ス、第８版（１９６８）］と完全に一致した。

実施例１Ｇ 実施例１２におけるエタノールの代わりにｎ　−プロパ
ツール、無水プロピオン酸の代わりに無水ｎ−酪酸９．
４ｇを用いて、実施例１２と同じ操作で実施した。回分
式分留塔により、常圧、１４３℃の蒸留により、５．８
ｇのｎ−酪酸ｎ−プロピルを採取した。本化合物は２０
℃における比重、屈折率、沸点が完全に文献値［°メル
ク・インデックス。

第８版（１９６Ｂ）］と一致した。

実施例１７ 実施例１２におけるエタノールの代わりにイソプロパツ
ールを用い、無水プロピオン酸の代わりに無水酢酸６．
１ｇを用いて、実施例■２と同じ操作で実施した。回分
式分留塔により、常圧、８９℃の蒸留において、５．０
ｇの酢酸イソプロピオニルを採取した。本化合物は２０
℃における比重。

屈折率、沸点が完全に文献値〔メルク・インデックス、
第８版（１９６８）コと一致した。

実施例１８ 実施例１２におけるエタノールの代わりにｎ−ブタノー
ルを用い、無水プロピオン酸の代わりに無水酢酸６，１
ｇを用いて、実施例１２と同じ操作で実施した。回分式
分留塔により、常圧、１２６℃の蒸留をして、５．２ｇ
の酢酸ｎへブチルを採取した。本化合物は２０’ＣＪこ
おひる比重、屈折率、沸点が完全に文献値［メルク・イ
ンデックス、第８版（１９６８）］と一致した。

実施例１９ 実施例１２におけるエタノールの代わりにｎ　−ブタノ
ールを用いて、実施例１２と同じ操作で実施した。回分
式分留塔により、常圧、１４７℃の蒸留をして、プロピ
オン酸ｎ−ブチル５．１ｇを採取した。本化合物は２０
℃における比重、屈折率。

沸点が完全に文献値［メルク・インデックス、第８版（
１９６８）］と一致した。

実施例２０ 実施例１２における無水プロピオン酸の代わりに無水安
息香酸１３．６ｇを用いて、実施例１２と同じ操作で実
施した。回分式分留塔により、常圧。

２１２℃の蒸留をして、安息香酸エチル９．２ｇを採取
した。本化合物は２０℃における比重、屈折率、沸点が
完全に文献値［メルク・インデックス。

第８版（１９６ｇ）］と一致した。

実施例２Ｉ 実施例１２におけるエタノールの代わりにエチレングリ
コールを用い、無水プロピオン酸の代わりに無水酢酸１
２．２ｇを用いて、同じ操作で実施した。回分式分留塔
により常圧、１８２℃の蒸留をして、酢酸エチレングリ
コール２．Ｏｇを採取した。さらに１９１’Ｃの蒸留に
より、二酢酸エチレングリコール２．２ｇを採取した。

本化合物は２０℃における比重、屈折率、沸点が完全に
文献値［メルク・インデックス、第８版（１９６８）］
と一致した。

実施例２２ ２００ｇ容発酵槽に、デキストリンｌＯ％、プロフロ（
商品名、トレーダーオイル社製）０．５％、脱脂大豆粉
２．０％、コーンステイープリカー１．０％、コーング
ルテンミール１．３％、パラアミノ安息香酸０．０２５
％、硫酸アンモニウム０．２％１食塩０．５％、硫酸第
１鉄０．１％、硫酸銅０．００５％、硫酸ニッケル０．
０３％、β−シクロデキストリン２．４％。

ＦＳ−アンチフオームＦ　２０（消泡剤、ダウコーニン
グ社（米国）製、商品名）０．２％（百分率表示１重量
／容量）からなる培地１００（２を調製したのち、１２
０℃、２０分間の蒸気滅菌をした。これに参考例１と同
じ種培養物５ｅを移植し、通気量１ｖＶＭ、攪拌回転数
１．６５　ｒｐｍ、温度２５℃で９６時間培養した。

かくして得られた培養物６０Ｑをとり、これに水２０＆
とハイツロスーパーセル（ジジンズ・マンビル社製）２
ｋｇを加えてろ過し、７ｏＱのる液を得た。実施例１に
記載されているＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃ法に従ってランカシジン
Ｃの含量を測定すると、本ろ液中？こは４１１）Ｏ１ｔ
ｇ／−の濃度でランカシジンＣが含有されていることを
認めた。これをｌ１２ずつ、■から３まで番号を付した
１ｏ１２容グラスライニング反応槽＜ａ押付き）３基に
それぞれ加え、１番には無水酢酸を１００ｍＭ含有する
メチルイソブチルケトン１１２を加え、２番には酢酸エ
チルを２００ｍＭ含有するメチルイソブチルケトンｌＩ
２．３番には酢酸を２００℃Ｍ含有するメチルイソブチ
ルケトン１ρを加え、３７℃でそれぞれ６０分攪拌する
ことによりランカシジンＣのアセチル化反応を行なった
。反応後に、それぞれ溶媒層より少量（１−程度）の試
料を採取して、実施例１に記載のＩ（ＰＬＣ法によるラ
ンカシジンＡの定量を行い、反応収率（ランカシジンＣ
全量に対する、生成されたランカシジンＡの量の百分率
比）を算出し、表６に示した。さらにそれぞれについて
、実施例３と同じ方法でランカシジンＡを精製採取し、
重量を表６に収量として示した。表６の結果から、無水
酢酸をアセチル基供与体として用いた場合が、反応収率
、収量とも最も優れていることが明らかである。

注）　ｌ；無水酢酸１００ｍＭ（溶媒中の濃度）２；酢
酸エチル２００＋ｎＭ（溶媒中の濃度）３；酢酸　　２
００ｍＭ（溶媒中の濃度）反応収率；ろ液１１２中に含
まれるランカシジンＣの量（４、１ｇ）に対する反応後
生酸されたランカシジンＡの量の百分率 収量；　精製採取されたランカシジンＡの量実施例２３ ２０艷容の共栓付き試験管３本を用意し、このうち２本
にプロピオン酸エチル２滅を入れ、他の１本にメチルイ
ソブチルケトン２Ｍｔを入れる。これらにマリドマイシ
ン■ （式Ｖ　：　Ｒｒ　＝　Ｒ＊　＝　ＣＯＣＨ鵞ＣＨｓ　
、　Ｒ３＝　Ｈ）をそれぞれＩＯＢ加え、よく攪拌して
溶解させた。

プロピオン酸エチルを入れた２本の試験管をそれぞれ反
応系（１）１反応系（２）として、メチルイソブチルケ
トンを入れたものを反応系（３）とし、参考例１で得ら
れたカルボキシルエステラーゼを２ａ＋ｇ／蔵の濃度で
トリスヒドロキシメチルアミノメタン−マレイン酸緩衝
液（０，２Ｍ、ｐＨ７，０）に溶解せしめたものを２−
ずつこれらの反応系に加えた。反応系（２）および（３
）には無水プロピオン酸を２０μｇずつ溶媒中に添加し
て、ただちに試験管振盪機にかけ、共栓をして３０分間
、２８℃にて振盪した。振盪後、各反応系の溶媒部分を
マイクロピペットで５０μＱずつ採取し、これらを薄層
クロマトグラフ４−（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　６０　、厚
さ０．２５＋ａｍ　２０　ｘ　２０ｃｍ、メルク社、米
国）に添着させた。反応系（１）、（２）、（３）に相
当する３個の試料のほかに、マリドマイシン■（式Ｖ　
：　Ｒｔ　＝　Ｒ鵞＝　ＣＯＣＨ＊　ＣＨｓ　、　Ｒｓ
　＝　Ｈ）および９−プロビオニルマリドマイシン■（
式Ｖ　：　Ｒｓ　＝　Ｒ＊　＝　Ｒｓ　＝Ｃ０ＣＨ＊Ｃ
Ｈａ）を添着させて、アセトン−トルエン（１：１）の
溶媒系により薄層クロマトグラフィーを実施した。

ヨード気流中で発色させる方法により、マリドマイシン
■および９−プロピオニルマリドマイシン■のＲｆがそ
れぞれ０．４６および０．５７であることを確認した後
、各反応系試料のマリドマイシン■および９−プロビオ
ニルマリドマイシン■に相当する部分の薄層をかきとり
、少量の酢酸エチルにより抽出したのち、アグリカルチ
ユラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇ
ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃ
ｈｅｓ＋ｆｓｔｒｙ）、４３巻。

８４７頁、（１９７９年）に記載のマリドライシン類抗
生物質の比色定量法に従って、基質（マリドマイシン■
）および反応生成物（９−プロピオニルマリドマイシン
■）を定量した。結果は、表−７に示すとおりとなった
。

（単位　ｍｇ） 注） 反応系（１）；プロピオン酸エチル　　　　２−反応系
（２）；プロピオン酸エチル　　　　２蔵無水プロピオ
ン酸　　　　２０μｅ 反応系（３）：メチルイソブチルケトン　　２１ｎｌ無
水プロピオン酸　　　　２０μＱ 実施例２４ １ＯＱ容のグラスライニング反応槽（攪拌付き）にあら
かじめ２８℃に保温したメチルイソブチルケトン２Ｑを
入れ、これにマリドマイシンｌｌ０ｇを投入し溶解させ
た。つぎに、参４例１で得られたカルボキシルエステラ
ーゼ５００ｍｇをトリスヒドロキシメチルアミノメタン
−マレイン酸緩衝液（０，２Ｍ、ｐＨ７，０）２１２に
溶解せしめたものを加えた。溶媒層に２０ｄの無水プロ
ピオン酸を加え、攪拌をして１時間の反応に供した。反
応後、反応液を１０ｆｆ容分液ロートに移し、水層部分
を除いた。さらにこれに重炭酸ソーダ水（２％）（Ｗ／
ｖ）５００ｄを加え、十分攪拌混合した後水層部分を除
いた。重炭酸ソーダ水による洗浄をもう一度実施した後
、蒸留水２Ｑによる洗浄を分岐ロート中で２回実施した
。溶媒部分を３Ｑ容三角フラスコに移して、これに芒硝
１００ｇを添加して２時間静置した。ろ紙ろ過により芒
硝を除いた後、減圧濃縮乾固し、ｌＯｇの９−プロピオ
ニルマリドマイシン■祖結晶を得た。

この粗結晶をトルエン１ｇに溶解せしめ、トルエンで平
衡化したシリカゲル（メルク社、米国）カラム（口径８
０ｍｍ、長さ５００　ｎｏｎ）に流し込み、９−プロピ
オニルマリドマイシン■を吸着させた。

続いてトルエン３Ｑを通液した後、２．５Ｑ容のトルエ
ン−アセトン（Ｌ：０．５）混合溶媒で溶出し、さらに
トルエン−アセトン（１：１）混合溶媒により溶出した
。溶出画分は東洋フラクションコレクター（５Ｆ−１６
０型）を用いて２ＯＴｎＩｌずつ分画し、実施例２３で
示した薄層クロマトグラフィーによる９−プロピオニル
マリドマイシン■同定法により、本化合物を同定した。

本化合物含有画分を集め、減圧濃縮して９．１ｇの白色
結晶を採取した。

本結晶の元素分析値はＣ：Ｈ：’Ｎ＝５９．７：８．０
：１．６、旋光度は［α］Ｄ＝−６１．３°（ｃ＝１゜
ＣＨＣ（２ｓ）と測定され、これらの値はアンチマイク
ロバイアル・エージエンツ・アンド・ケモテラピー（Ａ
ｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃ
ｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）。

第４巻、１４２頁（１９−７３年）に記載された値と一
致した。また、ＩＲスペクトルはケモテラピー（ＣＨＥ
ＭＯＴＨＥＲＡＰＹ）第２１巻、９０８頁（１９７３年
）に記載されたスペクトルと一致した。

本結晶はメタノール、エタノール、アセトンに溶けやす
く、クロロホルムにやや溶けやすく、水にほとんど溶け
ない（以上、本結晶の性状）。

本結晶５ｍｇを採り、アセトン２ｔｄを加えて溶かした
のち、塩酸２ｄを加えて振り混ぜるとき、赤紫色を呈す
る。さらに、クロロホルム２ｔｎｌを加えて振り混ぜ、
静置するとき、クロロホルム層は弱い紫色を呈する。本
結晶２０ｍｇ及びヂオセミカルバジド２ｍｇを採り、エ
タノール２蔵を加え、還流冷却器を付け、水浴上で１時
間加熱する。冷浸、反応液の０．２蔵を採り、エタノー
ル５０ｄを加えて混和した液につき、吸収スペクトルを
測定するとき、波長２７０−２７３ｎｍに吸収の極大を
示す。（以上、本結晶の確認試験）。これらの性状およ
び確認試験結果は、日本抗生物質医薬品基準解説（１９
８６年、薬業時報社）４５７頁の記載（プロピオン酸マ
リドマイシン）と一致した。

発明の効果 本発明のカルボン酸エステルの製造法によれば、アシル
基を選択的にヒドロキシル基と結合させることができ、
また反応力ずほとんど不可逆的に進行するため、少量の
アシル基供与体で高収率にカルボン酸エステルを得るこ
とができるので工業的に有利である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. カルボキシルエステラーゼを触媒として、ヒドロキシ化
   合物と酸無水物とを有機溶媒中で反応させることを特徴
   とするカルボン酸エステルの製造法。