ES2205114T3 - Fucanos con bajo peso molecular que tienen actividad anticoagulante, antitrombinica y antitrombotica. - Google Patents

Abstract

SULFATOS DE FUCANO CON PESO MOLECULAR COMPRENDIDO ENTRE 14.000 Y 29.000 DALTONS QUE MUESTRAN UNA NOTABLE ACTIVIDAD ANTICOAGULANTE EN EL MECANISMO GLOBAL DE LA COAGULACION (TTPA) Y EN LA ULTIMA FASE DE LA COAGULACION (ACTIVIDAD ANTITROMBINICA). ESTOS COMPUESTOS SON UTILES TAMBIEN COMO FARMACOS ANTITROMBOTICOS.

Description

Fucanos con bajo peso molecular que tienen actividad anticoagulante, antitrombínica y antitrombótica.

El presente invento se refiere a nuevos fucanos dotados de actividad anticoagulante, antritrombínica y antitrombótica, su procedimiento de preparación a partir de algas pardas o Phaeophycee, y sus formulaciones relevantes para uso parenteral, oral y tópico.

Se conoce durante varios años que los fucanos extraídos de algas pardas están dotados de actividad anticoagulante (Springer G.F. et Alii "Isolation of anticoagulant fractions from crude fucoidin" Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1957 94 404-9). El conocimiento en este campo de la técnica ha ofrecido la comprensión de algunos aspectos de la relación entre la estructura y actividad farmacológica de estas sustancias. Se ha establecido que la actividad anticoagulante es directamente dependiente del contenido de sulfato, y que además aumenta con el descenso del contenido de ácido urónico (T. Nishino et Al. "Isolation, purification and characterization of fucose containing sulfated polysaccharides from the brown seaweed Ecklonia kurome and their bood-anticoagulant activities", Carbohyd. Res. 186, 119 1989; H. Mori et al "Sugar consttituents of some sulfated polysaccharides from the sprophylls of wakame (Undaria pinnatifida) and their biological activities" Mar. Algae Pharm. Sci. 2.109 1982). Además se ha encontrado que el tiempo de coagulación APTT y el tiempo de trombina TT aumenta en las fracciones de fucano con peso molecular entre 10000 y 50000 Da (Nishino et Alii. "The relationship between the molecular weight and the anticoagulant activity of two types of fucan sulfates from the brown seaweeds Ecklonia kurome" Agr. Biol. Chem. 55.791 1991). Otros autores (V. Grauffel et Alii "New natural polysaccharides with potent antithrombotic activity: fucans from brown algae" Biomaterials 10 363 1989) han indicado que para preparados de fucano obtenidos de A. nodosum, P. Canaliculata e F. vesiculosus la gama aquí antes indicada es mas amplia y se extiende desde 18000 a 80000 Da. Estos últimos compuestos evidencian además una actividad antitrombínica (expresado en unidades internaciones de trombina/mg del compuesto) que depende del peso molecular de igual modo que la actividad anticoagulante. Aquí las ilustraciones de este arte para las propiedades farmacológicas de fucanos y la relación entre su estructura y sus actividades farmacológicas, indican que los preparados mas activos se encuentran entre los que tienen pesos moleculares inferiores a 80.000 Da, que tienen además un alto contenido de azufre. A partir de esto puede entenderse el interés terapéutico potencial de dichos fucanos. Para estos respectos en particular sus procesos de fabricación en la literatura del campo se han descrito muchos, que corresponden sustancialmente a dos medios diferentes. En uno mas seguido, sobre el extracto crudo se llevan a cabo etapas de fraccionación subsiguiente, cada una explotando una propiedad física diferente de dichos polímeros de fucano. Las técnicas de fraccionación usualmente utilizadas son filtración de gel, cromatografía de intercambio de iones, precipitación fraccional efectuada por medio de tensoactivos amónicos cuaternarios, o mediante la adición de disolventes orgánicos miscibles en agua, tal como etanol o acetona. El segundo método radica en métodos de rebajar el peso molecular aplicado a fucanos de alto peso molecular, o sea, sustancias mas homogéneas desde un punto de vista químico que los extractos crudos citados anteriormente al inicio. Por lo que respecta al primer método debe adicionarse que en la literatura del campo se ha observado con frecuencia que el número de etapas requeridas aumenta en una relación directa con la cantidad de actividad farmacológica debido a estar presente en el producto final. Ejemplos apropiados de esto se proporcionan mediante los dos documentos resumidos a continuación. En S. Mauray et Alii "Venous antithrombotic and anticoagulant activities of a fucoiidan fraction" Thromb. and Haemost. 74(5) 1280 1995, se describió un fucano aislado de Ascophyllum nodosum caracterizado como sigue desde un punto químico y físico químico; peso molecular medio 20.000 Da, fucosa 48,6%, ácidos urónicos 5,8%, azufre 9%. En base de las referencias aquí dadas el procedimiento de fabricación correspondiente estuvo constituido por las etapas siguientes: (a) extrusión en un medio acuoso del material vegetal (b) fraccionación por medio de sales amónicas cuaternarias (c) fraccionación a través de cromatografía de exclusión de columna. El compuesto así obtenido indujo un alargamiento significante de tiempo en las pruebas APTT y TT, a partir de una dosis de 20 mcg/ml. Con el fin de obtener los mismos valores APTT y TT con heparina se requirieron cantidades en peso de dichos fucanos que ascendieron a 30-40 veces las utilizadas para heparina. Además de esto, inspeccionando los valores de ED50 obtenidos en el modelo experimental de trombosis aquí descritos se deduce que la actividad de dichos compuestos fue la misma que la dada por una cantidad en peso de heparina 17 veces inferior. El documento de T. Nishino et Alii Carbohyd. Res. 186 (1989) 119 (véase antes) se describió un procedimiento de preparación constituido por las etapas siguientes: (a) extracción en agua hirviente del polvo secado y molturado de Ecklonia kurome, (b) preparación con cloruro de cetilpiridinio y disolución del precipitado en 4M NaCl, (c) precipitación mediante adición de etanol y disolución en agua, (d) precipitación por medio de cloruro cálcico, recuperación del sobrenadante y liofilización, (e) fraccionación de columna de intercambio de iones y recuperación de las fracciones eluidas aplicando a la resina de lecho, soluciones de 0,95 M NaCl y, respectivamente, 2 M NaCl, (f) precipitación fraccionada llevada a cabo sobre las soluciones recogidas mediante adición de etanol conteniendo acetato cálcico, (g) cromatografía de filtración de gel. Los dos preparados de fucano se caracterizaron, respectivamente, por los parámetros físico químicos y químicos siguientes: peso molecular 32.000 y 21.000 Da, azufre 14,6 y 13,3%, fucosa 50,1 y 49,5%, ácidos urónicos 1,5 y 3,9%, rotación específica - 142º y - 129º. Las actividades de APTT y TT de dichos compuestos evidenciaron una tendencia opuesta. Los títulos de APTT, expresados en unidades/mg tomando como la referencia estandard un preparado de heparina ensayado a 167 I.U./mg, resultaron ser de 136 y 142 y por tanto muy próximos al estandard. El título TT fue por contra muy bajo, ascendiendo respectivamente a 13 y 11 I.U./mg. Dicho de otro modo dichos compuestos son muy activos en inhibir el mecanismo global de coagulación, pero difícilmente efectivos en inhibir la trombina, que es la enzima implicada en la última etapa de coagulación. Por lo que respecta a los métodos de despolimerización, la patente Europea nº 403.377 describe métodos para hacer descender el peso molecular de fucanos en donde como materiales de partida se utilizan fucanos con un alto contenido de azufre. Los últimos compuestos se preparan extrayendo el polvo secado y molturado de algas marinas en condiciones acídicas (HCl 0,01 N) en presencia de cloruro cálcico. El sobrenadante de la extracción se neutraliza luego y se recupera el soluto mediante precipitación con cloruro de cetilpiridinio. La despolimerización puede efectuarse con métodos químicos, sometiendo los compuestos de alto peso molecular a condiciones acídicas (ácido sulfúrico 1N) a una temperatura de 45ºC, o de otro modo por medio de enzimas específicas contenidas en los extractos crudos de Haliotis tuberculata o Aplysia californica, o alternativamente, mediante radiación gamma utilizando una dosis global de 11,5 Mrads. El compuesto obtenido finalmente sufre una etapa de filtración de gel con el fin de aislar la fracción que tiene un peso molecular comprendido entre 13 y 23 KDa y un contenido de azufre entre 7,8 y 11%. Puede apreciarse que los productos del invento deben tener un contenido de azufre superior en un porcentaje comprendido entre 2 y 20% que el del funcano de partida.

A partir de las pruebas farmacológicas descritas en la patente Europea se aprecia que el título de APTT (o tiempo de caolin - cefalina) es muy bajo puesto que es inferior a 7 I.U./mg. A partir de las tablas de la descripción se desprende que con el fin de obtener aproximadamente el mismo tiempo de trombina de heparina se requiere una cantidad de fucano de por lo menos 15 veces superior al de la referencia estandard. Todavía sobre la despolimerización de fucano en otro documento publicado en este campo (S. Colliec et Alii "Anticoagulant properties of a funcoidan fraction" Thromb. Res. 64 143 1991) se dan los resultados obtenidos en pruebas de APTT y TT llevadas a cabo sobre un preparado de fucano que tiene un peso molecular medio de 20.000, obtenido mediante despolimerización en condiciones acídicas con la etapa de fraccionación subsiguiente llevada a cabo como se ilustra en la Patente Europea antes indicada. Se hace referencia además que con el fin de obtener en dichas pruebas la misma actividad de heparina fue necesaria una cantidad en peso de fucano 50 veces superior. En el documento de A. Nardella et Alii "Anticoagulant low molecular weight fucans produced by radical process and ion exchange chromatography of high molecular weight fucans extracted from de brown seaweed Ascophyllum nodosum" Carboyd. Res. 289 (1996) 201-208, se describe un procedimiento de despolimerización radicálico, llevado a cabo en presencia de peróxido de hidrógeno y sales cúpricas a una temperatura de 60ºC durante 5 horas, de dos fucanos de alto peso molecular, aquí referido como F1 y F2, que tiene los datos analíticos y actividades farmacológicas siguientes: preparación F1: azufre 8,1%, fucosa 31,3%, ácidos urónicos 5,7%, peso molecular 556.000 Da, Actividad APTT 9,1 I.U/mg; preparación F2: azufre 5,7%, fucosa 35,8%, ácidos urónicos 11,6%, peso molecular 516.000 Da, actividad APTT 12,1 I.U./mg. El producto despolimerizado obtenido de F1, identificado en el documento como DF1 se caracterizó como sigue: azufre 9,2%, fucosa 36,4%, ácidos urónicos 2,6%, peso molecular 8.300 Da, actividad APTT 8,2 I.U./mg. El producto despolimerizado obtenido de F2 (DF2) tiene un contenido de azufre de 9,3%, fucosa 32,2%, ácidos urónicos 6,5%, peso molecular 7.800 Da, actividad APTT 7,3 I.U./mg.

A partir del arte anterior que se ha resumido anteriormente, pueden desprenderse las conclusiones siguientes. Con el fin de obtener preparados de fucano de bajo peso molecular y alta actividad APTT, que puede ser útil como inhibidor de la cascada de coagulación, deben seguirse las ilustraciones de T. Nishino et Alii (véase antes) pero el procedimiento descrito para aislar dichos compuestos es de escaso empleo para aplicación industrial. Sin embargo comprende varias etapas de fraccionación. Por otra parte si se requieren preparados de fucano de bajo peso molecular dotadas con una actividad inhibidora de trombina superior o actividad antitrombínica (prueba TT), es preferible elegir los métodos de despolimerización descritos en la patente Europea nº 403.377. Sin embargo, como se ha evidenciado, la actividad de las sustancias obtenidas es muy baja.

Como consecuencia de lo anterior se considera que en el campo de este arte queda todavía sin resolver el problema de obtener fucanos de bajo peso molecular para ser utilizados como anticoagulantes, que muestran actividades de APTT y antitrombina mas equilibradas entre sí y al mismo tiempo mas comparables con las de la heparina.

Un primer objeto del presente invento es los fucanos de bajo peso molecular obtenibles mediante algas pardas o Phaeophycee, dotados de una actividad anticoagulante significante tanto como actividad APTT/mecanismo global de coagulación y como actividad antitrombínica, y además de una actividad antitrombótica significante, caracterizados por los parámetros químicos, físico- químicos y farmacológicos siguientes (datos sobre una base de peso en seco): azufre 12,5 - 15%, fucosa 43 - 57%, ácidos urónicos 2-9%, peso molecular 14.000 - 29.000 Da, giro específico de -137º a -170º, título APTT 40 - 80 I.U./mg, título TT 18 - 30 I.U./mg. Se prefieren las fracciones de sulfato de fucano de bajo peso molecular que tienen contenido de azufre comprendido entre 14 y 15%, fucosa 44 - 56%, ácidos urónicos 2-3,5%, rotación específica entre -160º y -170º, peso molecular 17.000 - 25.000 Da, título APTT comprendido entre 60 y 80 I.U./mg y título TT entre 23 y 30 I.U./m.g.

Ha de apreciarse que los compuestos del presente invento muestran las siguientes diferencias frente a las del arte anterior:

-

el tiempo de trombina es de 1,5 y 2,5 veces superior comparado con las fracciones de bajo peso molecular descritas en el documento de T. Nishino et Alii Carbohyd. Res. 186, 119 1989 (véase antes),

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la actividad APTT y el contenido de azufre es superior a la correspondiente de las sustancias descritas en PE 403.377.

Otro objeto del invento es el empleo de dichos compuestos como medicamentos, en particular como agentes anticoagulantes y antitrombóticos.

La actividad anticoagulante se demostró como actividades APTT y TT de conformidad con los métodos expuestos mas adelante.

Se investigó también la biodisponibilidad APTT frente a heparina seguido de administración sucutánea y resultó ser del 20% para la heparina de calcio estandard de referencia (título APTT 186 I.U./mg y, respectivamente, de 39 y 40% para preparaciones VO264.A y VO264B obtenido de conformidad con el invento (véase los ejemplos). La sustancias reivindicadas, comparado con una base en peso para heparina, evidenciaron el doble de la biodisponiblidad de heparina cálcica. Por tanto la actividad anticoagulante in vivo de los nuevos fucanos dosificados en unidades APTT es del mismo orden que la obtenida después de administración de heparina cálcica.

La actividad antitrombótica se demostró en el modelo experimental de trombosis de estasis venosa referido mas adelante. Con la preparación de ensayo VO246.B a la dosis de 10 mg/kg no se formó trombo; en las mismas condiciones experimentales la dosis mínima de heparina cálcica (referencia estandard) que impide la formación de trombos fue de 1 mg/kg, o sea solo diez veces inferior.

Los métodos analíticos utilizados para la caracterización de los fucanos fueron los siguientes.

La determinación de fucosa estuvo de acuerdo con R.J. Winzler, Methods of Biochem. Anal. vol. 2 294 1955, utilizando como estandard de referencia L (-) fucosa.

La determinación de ácido urónico estuvo de acuerdo con T.Bitter, H.Muir Anal.Biochem.4 (1962) 330, utilizando como estandard de referencia ácido D(-) glucurónico.

Se ensayó azufre de conformidad con la técnica ICP-AES (Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometry), utilizando como estandard interno hidrato de nitrato de cobalto Co(NO_{3})_{2}, 6H_{2}O, disuelto a una concentración de 1000 mg/l en 0,5 M HNO_{3} (catalogo Merck nº 19785.0500), como un estandard de referencia una solución acuosa conteniendo una cantidad conocida de azufre (partida 302267E, C.A. 22831, Johnson Matthey-ALFA). Con la ayuda de dos buretas llenadas, respectivamente, con la solución del estandard de referencia de azufre (solución A) y del estandard interno (solución B), se preparó en 5 matraces diferentes de 100 ml de volumen 5 soluciones con una concentración de azufre de 100, 80, 60, 40 y 20 mg/l, adicionando las partes alícuotas siguientes de solución A: 10 ml; 8 ml; 6 ml; 4 ml; 2 ml. En cada matraz volumétrico se adicionó luego 0,8 ml de solución B. La cinco soluciones se llevaron luego hasta volumen con agua destilada.

La solución de la muestra con el contenido de azufre desconocido se preparó pesando en un matraz volumétrico de 100 ml alrededor de 60 mg. Luego se adicionaron unos 50 ml de agua destilada y se efectuó la mezcla hasta que se obtuvo una solución límpida. Antes de completado hasta el volumen con agua destilada se vertieron 0,8 ml de solución B en el matraz volumétrico.

La determinación del contenido de azufre en las muestras se obtuvo reportando la línea de calibraje obtenida con las soluciones estandard, que tiene en las abscisas la concentración de azufre en mg/l y en las ordenadas la relación entre la intensidad de emisión de azufre, ensayado en la longitud de onda de 182.037 nm, y que el estándar interno (cobalto), ensayado en la longitud de onda de 222.616 nm, la lectura obtenida con la muestra con titulo desconocido.

El peso molecular se determinó mediante cromatografía de permeación de gel (GPC) llevada a cabo en dos columnas conectadas en serie, Supelco Progel TSK-G 4000 SW® y Supelco Progel TSK-G 3000 SW® que tienen dimensiones de 30 cm x 7,5 mm (con un progel de precolumna TSK-SW® de dimensiones 7,5 cm x 7,5 mm) con detector de índice refractivo. El tampón fue sulfato sódico 0,2 M en agua (28,4 g en 1000 ml). El caudal de flujo fue de 0,5 ml/min y el volumen inyectado de 50 microlitros. Los estandards de peso molecular utilizados en el ensayo fueron los siguientes: maltoheptosa peso.mol 1153 g/mol (Sigma® code nº M-7753), Dextran T-10 (Pharmacia Biotech® code nº 17-0250-01) peso mol. 10.000 (M_{w}), Dextran T-40 (Pharmacia Biotech® code nº 17-0270-01) peso.mol. 40.000 (M_{w}), Dextran T-70 (Pharmacia Biotech® code nº 17-0280-01) peso mol. 69.100 (M_{w}), Dextran T-500 (Pharmacia Biotech® código nº 17-0320-01) peso mol 460.500 (M_{w}). Se pesaron 50 mg de cada uno de los compuesos anteriores y de la muestra en un matraz volumétrico de 5 ml y se disolvió en el disolvente de elución. La solución resultante se llevó luego hasta volumen y se filtró sobre una membrana Millipore® con poros de 0,22 \mum. El calibraje se efectuó a partir de la solución con el peso molecular mas alto. Se repitió la inyección tres veces tomando el tiempo de retención medio. La muestra se inyectó finalmente y se determinó el tiempo de retención correspondiente.

De este modo se obtiene una línea de calibraje en donde se expone luego el tiempo de retención medio obtenido inyectando la muestra.

El peso molecular medio (M) y el tiempo de retención (t) se exponen mediante la ecuación log M = At^{3} + Bt^{2} + Ct + D. A partir del tiempo de retención de la muestra de sulfato de fucano utilizando la línea de calibraje se determinó, con la ayuda de un programa de sofware, el peso molecular medio de la muestra.

La rotación específica se determinó sobre un polarímetro Perkin Elmer mod 241, a la temperatura de 20ºC en la línea de sodio D.

El título de APTT, expresado como I.U/mg, se determinó de conformidad con la Farmacopea de U.S.A. XXIII-1995 (ref. heparina sódica, página 737) utilizando el Kit Hemodiagnostica Stago® art. n. 26551 y mutton plasma (DITTA Glo. Ros, Vercelli). La heparina de referencia fue del estandard internacional III (NIBSC - Londres). En las pruebas a continuación descritas se utilizó los preparados de sulfato de fucano VO264.B y VO264.A y, como el compuesto de referencia, heparina cálcica fabricada por el solicitante (partida n. 9, título APTT 186 I.U./mg).

La biodisponibilidad de actividad de APTT de los preparados se determinó dividiendo el valor de actividad anticoagulante ensayyado después de administración subcutánea por el ensayado para el mismo compuesto después de administración intravenosa. En ambos casos dichos valores de actividad se han calculado como las áreas bajo la curva, obtenida trazando para cada tiempo APTT de vía de administración (en la ordenadas) frente a los tiempos en los que se toman las muestras de sangre de los animales (en las abscisas). Las pruebas APTT se llevaron a cabo de conformidad con las instrucciones dadas en el inserto del envase del kit de diagnóstico antes citado.

El suministro mediante administración subcutánea se efectuó disolviendo en una solución fisiológica los fucanos del invento a una concentración de 20 mg/0,2 ml. Para heparina cálcica se utilizó una concentración de 4 mg/0,2 ml. Para cada uno de los compuestos bajo prueba se utilizaron 4 conejos (conejos blancos de Nueva Zelanda - Allevamento del Verbano di Conelli, Arona - Italia). La administración por vía subcutánea se efectuó inyectando 0,2 ml/kg de las soluciones anteriores en un punto del dorso de los animales previamente afeitado. Se tomó sangre (2 ml) de la vena marginal de la orena en condiciones basales (tiempo 0), luego después de 30 segundos, luego a intervalos de 1 hora, continuando hasta un total de 8 horas contado desde el inicio del experimento. Como agente anticoagulante de plasma se utilizó una solución de citrato sódico al 3,8%, mezclado con sangre en una proporción de 1 parte de citrato: 9 partes de sangre. En la figura l las curvas dadas por cada uno de los compuestos probados se identifican mediante los símbolos siguientes: preparación VO264.B : +, preparación VO264.A : *; heparina cálcia: \sqbullet. Los puntos experimentales de cada curva fueron la media de cuatro datos. La actividad se calculó a partir del área entre cada curva y la línea de referencia (trazos). La línea de referencia, como se aprecia por la figura, fue paralela a las abcisas e insersectó el eje de ordenadas en el punto correspondiente al valor basal APTT. La figura l evidencia que la biodisponiblidad de los compuestos del invento se ha subestimado sistemáticamente, ya que las áreas en el punto correspondiente al tiempo del último muestreo de sangre no se cierra sobre la línea de referencia.

Para ensayar la actividad después de administración intravenosa se prepararon soluciones de los fucanos antes citados a una concentración de 5 mg/ml, y para heparina a una concentración de 1 mg/ml. Cada una de dichas soluciones se inyectó luego (volumen 1 ml/kg) en la vena marginal de la oreja de conejos (n. 4 animales). Se tomaron muestras de sangre (volumen 2 ml, adicionado de una parte alícuota de la solución de citrato sódico al 3,8% en las mismas proporciones antes referidas) de la vena marginal de la otra oreja, en condiciones basales y respectivamente a 2, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90, 120 minutos, luego de modo regular a intervalos de una hora. Trazando en una gráfica valores APTT frente al tiempo de muestreo de sangre se obtuvieron las curvas de la figura 2. Las áreas se calcularon de igual modo que antes inicialmente aquí se ha detallado. El significado de los símbolos que identifican cada una de las tres curvas de la figura 2 son iguales que los de la figura 1.

La biodisponibilidad de los compuestos de prueba se obtuvo del área bajo la curva obtenida, respectivamente, de la gráfica relevante a la administración subcutánea y la de administración intravenosa, aplicando la fórmula siguiente:

\frac{Área \ bajo \ curva_{administración \ subcutánea} \ x 100}{Area \ bajo \ curva_{administración \ intravenosa} \ x 4}

El tiempo de trombina (TT) expresado como I.U./mg, se determinó por medio del Kit Hemodiagnostica Stago® art. n. 126594. La prueba se llevó a cabo de conformidad con el mismo procedimiento expuesto en la Farmacopea de U.S.A. para la prueba APTT.

El modelo experimental de trombosis procedente de estasis venosa se llevó a cabo básicamente de conformidad con los documentos siguientes: P. Bacher et Alii "The thrombolytic potency of LMW heparin compared to urokinase in a rabbit jugular vein lysine model" Thromb. Res. 66, 151-158 1992; I. Reyers et Alii "Stasis-induced venous thrombosis" en estandarización de modelos animales de trombosis. 17º Simposio angiológico Kitzbuhel - Proceedings K. Breddin, R. Zimmermann, F.K. Schattiner editores, Stuttgart 1983, páginas 99-104; I. Reyers et Alii "Failure at diffeent doses of aspirin to modify experimental thrombosis in rats" Thromb. Res.18, 669-674, 1980.

En una solución fisiológica (volumen 10 ml) se disolvió, respectivamente, los compuestos siguientes: heparina cálcica (lote 9, fabricado por Crinos) a una concentración de 2 mg/ml y preparado de sulfatode fucano n. VO264.B a una concentración de 10 mg/ml. Los animales (conejos blancos de Nueva Zelanda, Allevamento del Berbano di Conelli, Arona - Italia), se dividieron en 3 grupos (4 conejos/grupo) y después de anestesia sufrieron traqueotomía con siguiente intubación. Luego se aislaron cuidadosamente los tejidos que circundan la vena yugular derecha en una longitud total de 3 cm, efectuándose distalmente una ligadura para reducir el flujo sanguíneo. Después de 10 minutos se administró un bolo i.v. de 1 ml/kg a través de la vena marginal de la oreja de conformidad con el esquema siguiente:

- grupo de control: solución fisiológica.

- grupo tratado con heparina: 2 mg/kg.

- grupo tratado con VO264.B: 10 mg/kg.

5 minutos después de la inyección, por encima de la ligadura se aplicaron unas pinzas hemostáticas sobre la vena con el fin de producir una lesión endotelial de 2 cm de longitud. Inmediatamente después se aplicó distalmente unas segundas pinzas para detener completamente el flujo sanguíneo. Las pinzas hemostáticas curvas se extrajeron después de 30 minutos. Después de 60 minutos se hizo lo mismo con las segundas pinzas. La ligazón se dejó por contra sobre la vena. Se recuperó el trombo dos horas después del inicio del experimento, correspondiente a una hora después del tiempo en que se había extraído la pinza. Se secó el trombo en un horno a 80ºC durante 24 horas y se pesó. Dicho modelo experimental de trombosis representa muy estrechamente lo que sucede en patología de trombosis real. En dicho modelo la estenosis venosa no impide por completo el flujo sanguíneo en vaso de modo análogo a lo que sucede in vivo cuando se forma el trombo. Se aprecia que en la hora siguiente a la separación de las segundas pinzas el trombo puede crecer todavía puesto que la estenosis inicial, como se ha indicado, permite cierto flujo sanguíneo.

Otro objeto de este invento es un procedimiento para obtener los nuevos polímeros de bajo peso molecular que comprende las etapas siguientes:

a.

extracción del polvo molturado y secado de algas con agua a temperaturas de ebullición o próximas a la ebullición (92 - 100ºC) bajo agitación durante 16 horas. Esta etapa se conoce ya por el documento de W.A.P. Black et Alii "Manufacture of algal chemicals IV. El aislamiento a escala de laboratorio de fucoidin a partir de algas marinas pardas "J. Sci. Food Agric. 3 1952, páginas 122 - 129;

b.

filtración de la suspensión precedente, ajuste el pH del filtrado hasta un valor dentro de 2 y 2,5. En este punto se formó un precipitado constituido por una porción de los alginatos que están contenidos en la masa extraída. Este sólido geloso se separó del sobrenadnate mediante filtración y se ajustó el filtrado hasta neutralidad;

c.

luego se concentró la solución sobrenadante hasta alrededor de 1/4 - 1/5 del volumen de partida en un aparato de ultrafiltración equipado con una membrana que tiene un corte de 100.000 Da. En el mismo equipo se dializó luego el retenido frente a 3 volúmenes de agua y por último pudo concentrarse, de ser necesario, con el fin de reducir el volumen final;

d.

se recuperó el extracto crudo de la solución retenida obtenida al final de la etapa precedente mediante precipitación después de salificación previa y adición subsiguiente de dos volúmenes de etanol o acetona;

e.

el extracto crudo se disolvió luego en una solución acuosa y la degradación y contemporánea despolimerización del compuesto se efectuó luego en presencia de una sal cúprica inorgánica y peróxido de hidrógeno a una temperatura de 55ºC. Por medio de pruebas de laboratorio preliminares se determinó el tiempo de reacción necesario con el fin de obtener un fucano que tuviese un peso molecular comprendido entre 14000 y 29000. La relación, como porcentaje en peso entre el ión cúprico y el extracto crudo fue de 1,3% y la relación entre el volumen (ml) de solución de peróxido de hidrógeno al 8% peso/volumen y el pego (g) de extracto crudo, estuvo comprendida entre 5,5 y 36. El pH durante la etapa estuvo comprendido entre 6,0 y 7,5. (Ref. patente estadounidense B 408030 y en el documento de N. Volpi: "Analytical techniques for studying structures of darmatan sulfate and low molecular wight heparin-Darmatan sulfate" Il Farmaco, 47 (suplemento hasta n. 5) 841 - 853 1992);

f.

al final de la reacción se filtró la solución, se adicionó una sal y se efectuó la precipitación del soluto con la adición de dos volúmenes de etanol. Luego se deshidrató el soluto y se secó, recuperando la sal mixta correspondiente de sodio y cobre II de los productos de conformidad con el invento;

g.

luego se convirtieron los compuestos en las sales sódicas correspondientes mediante tratamiento de intercambio de iones con una resina de Na^{+}. En este punto de disolvieron las sustancias en agua a una concentración comprendida entre 5 y 7% y la solución resultante pudo cargarse sobre una columna conteniendo la resina o pudo adicionarse con la relación y suspensión respectiva agitada durante el tiempo necesario para que se produjera el intercambio catiónico. El procedimiento puede controlarse por medio de un electrodo selectivo de iones de cobre. La relación en volumen entre la resina de lecho y la solución varia entre 1/2 y 2/3.

h.

Por último se efectuó la filtración de la solución, se ajustó el pH hasta un valor dentro de 6,0 y 6,5, se adicionó sal a la solución y se precipitaron los compuestos del invento mediante mezcla con dos volúmenes de etanol, recuperando luego la sal sódica de los fucanos de conformidad con el invento.

Otro objeto de este invento es el extracto crudo obtenible de algas pardas de Pheophycee con las etapas a. - d. del procedimiento anterior y caracterizado por los siguientes parámetros químicos, físico químicos y farmacológicos (datos sobre una base de peso en seco): azufre 6-8%, fucosa 31-36%, ácidos urónicos 23 - 27%, peso molecular 450.000 - 800.000, APTT 40-60 I.U./mg.

Con el procedimiento del invento es posible despolimerizar el extracto crudo obtenido después de extracción del material vegetal y separación de los alginatos mediante precipitación de ácido. Aquí no es necesario el aislamiento de un fucano de alto peso molecular mas purificado como sucede de conformidad con el procedimiento descrito en PE 403.377.

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La peticionaria ha demostrado (Ejemplo 6) que despolimerizando un fucano purificado que tiene un peso molecular de 652.000 (título APTT 67,5), obtiene a partir del extracto crudo VO246.B, por medio de acetato sódico/peróxido de hidrógeno durante 24 horas, o sea en las mismas condiciones con las que a partir del mismo extracto crudo se obtienen los preparados VO264.A y VO264.B (ejemplos de referencia 7 y 9, respectivamente), el polímero de bajo peso molecular (8800 Da) que finalmente se aisló tuvo una actividad farmacológica muy reducida (título APTT 22,1 I.U./mg) comparado con los preparados de este invento. Esto significa que a partir de un fucano de alto peso molecular puro no pueden obtenerse los productos del invento.

Es de destacar que los métodos de despolimerización disponibles en el estado del arte dan compuestos diferentes cuando el extracto crudo aislado de conformidad con las etapas a) - d) del procedimiento del invento se utiliza como material de partida. Con la despolimerización del extracto crudo en condiciones acídicas (pH 2,2 a 60ºC durante 16 horas - ref. ej. 4) se obtienen compuestos conteniendo una cantidad de ácidos urónicos superior que la de fucosa. Con la despolimerización del extracto crudo mediante radiación gamma (ej. ref. 5), se aislaron compuestos con un contenido de azufre muy bajo y conteniendo una gran cantidad de productos de degradación. Los compuestos del invento pueden obtenerse solo haciendo descender el peso molecular del producto intermedio en presencia de una sal cúprica inorgánica y de peróxido de hidrógeno (ej. 7).

Otro objeto de este invento son las formas de dosificación de formulaciones que contienen como el principio activo los fucanos de bajo peso molecular del presente invento. Este puede utilizarse también en forma de sus sales farmacológicamente aceptables. Estas formulaciones pueden ser tanto para administración parenteral como oral.

Formulaciones para uso tópico (ej. ref. 16) pueden ser también para usos no farmacéuticos y tener una composición apropiada para una finalidad de esta índole.

Las formas de dosificación para uso parenteral pueden ser soluciones apirogenéticas estériles en ampollas selladas, o de otro modo liofilizados contenidos en botellas selladas para ser disueltos extemporáneamente en disolventes esteriles acuosos. En calidad de disolventes acuosos puede utilizarse soluciones isotónicas obtenidas con tampones convencionales (citrato, fosfatos) junto con conservantes conocidos. Las formulaciones orales pueden adoptar forma de comprimidos, comprimidos revestidos, cápsulas de gelatina y gránulos.

Estas formas de dosificación pueden prepararse de conformidad con técnicas conocidas. Por ejemplo, para formas de dosificación oral, en particular, pueden prepararse con las técnicas usuales, por ejemplo mediante compresión directa de polvos o granulados y puede incluir agentes ligantes, lubricantes y disgregantes.

Las formas de dosificación para administración parenteral pueden contener de 1 a 90 mg/ml del principio activo (para liolefilizados las cifras precedentes deben referirse a la concentración final del compuesto en el disolvente esteril), las de administración oral de 20 a 400 mg/dosis unitaria.

Las composiciones para uso tópico local pueden adoptar forma de geles, cremas, ungüentos, soluciones conteniendo de 0,1 a 20% en peso del principio activo.

Los datos analíticos dados en los ejemplos siguientes se calculan sobre base de peso en seco.

Los ejemplos que siguen se ofrecen para un mejor entendimiento del invento y no deben considerarse limitativos del mismo.

Ejemplo 1 Extracción de sulfato de fucano crudo, preparado n. VO246.A

Se suspendió 1 kg de polvo seco de Fucus vesiculous bajo agitación en 7 litros de agua destilada en un recipiente de reacción de 15 litros equipado con refrigerador. Cuando la suspensión estuvo lista (unos 15 minutos), se llevó a cabo a 100ºC durante 16 horas calentamiento en un de baño de aceite. Luego se enfrió la suspensión a 40ºC y se centrifugó a 3000 r.p.m. durante 20 minutos utilizando grandes tubos de prueba de centrifugación de 1 litro n. 4. El sólido a modo de jalea que quedó en el fondo de dichos tubos grandes de prueba se suspendió de nuevo en agua a la temperatura de 60ºC bajo agitación durante unos 15 minutos. Se efectuó de nuevo la centrifugación y luego al sobrenadante opalescente se adicionaron 200 mg de Clarcel FLO/MA® (perlita calcinada y molida). Después de filtración se recuperaron 6,3 litros y se adicionaron 50 ml de HCl al 37% con el fin de rebajar el pH a un valor de alrededor de 2,1. La centrifugación se efectuó de nuevo y se descartó el sólido a modo de jalea (peso 44,4 g - código de preparación n. 0195/95005-D - azufre 0,7%, ácidos urónicos 51%) y el sobrenadante se llevó hasta pH neutro adicionando una solución al 30% de NaOH. La concentración se efectuó luego manteniendo un volumen constante de 1,5 litros en un aparato de ultrafiltración Amicon® CH2-A equipado con una membrana de corte de peso molecular 100.000 Dalton. Después de la etapa de concentración se dializó la solución sobre la misma membrana, de nuevo 3 volúmenes de agua destilada. Se adicionó el retenido (1,6 litros) 112 g (7% peso/volumen) de acetato sódico anhidro y luego se agitó hasta que se obtuvo una solución homogénea. Se precipitó el soluto con 2 volúmenes de etanol. Después de decantación durante la noche se deshidrató el sólido y se secó. Se recogió finalmente 79,68 g (rendimiento de alrededor del 8%) de un compuesto (preparado n. VO246.A) que tiene los datos analíticos siguientes sobre una base de peso en seco: azufre 6,5%, fucosa 31,7%, ácidos urónicos 23,8%, peso molecular 493.000 Da, título APTT 53,4 I.U./mg, título TT 18,2 I.U./mg.

Ejemplo 2 Extracción del sulfato de fucano crudo, preparado n. VO246.B

En un recipiente de reacción de 300 litros se vertieron 175 litros de agua destilada. Se adicionaron 25 kg de polvo seco de Fucus vesiculosus y se efectuó calentamiento en camisa de vapor con el fin de alcanzar y mantener la temperatura de 92ºC durante 16 horas. Por último se hizo descender la temperatura a 30ºC y se adicionaron 5 kg de Clarcel FLO/MA®. Se llevó a cabo la filtración sobre un aparato de prensa de filtro equipado con filtros de celulosa Seitz K 800®. Se recogió el filtrado y se dispersó el sólido en agua (20 litros) a 60ºC bajo agitación, que luego se mantuvo durante 1 hora. La filtración se efectuó de nuevo sobre filtros Seitz K 800® y se unieron luego los filtrados, dando 220 litros como un conjunto. Se transfirió la solución a un recipiente de reacción, se adicionaron 5,5 kg de Clarcel CBR® (diatomita molida y calcinada), luego se enfrió a 25 - 30ºC, y se efectuó la precipitación haciendo descender el pH a 2 con la adición de alrededor de 1,5 litros de HCl al 37%. Luego se reanudó la agitación y se prosiguió durante 15 minutos y se filtró la suspensión sobre filtros Seitz K 800®. Luego se lavaron las tortas de filtración con 20 litros de una solución acídica (pH 2) y los líquidos recogidos finalmente tuvieron un volumen global de 220 litros. Luego se cargó la solución en un aparato de ultrafiltración Alfa Laval® equipado con un cartucho Millipore® de 100.000 de corte de peso molecular. En primer lugar se concentró la solución para reducir el volumen hasta 50 litros, luego se dializó a un volumen constante frente a 3 volúmenes de agua. Una vez completada la etapa se redujo adicionalmente en volumen de solución hasta 25-30 litros. Se descargó la solución del aparato, se salificó con NaCl hasta una concentración de 2% peso/volumen y se adicionaron 2 volúmenes de acetona. La suspensión formada resultante se dejó decantar y luego se recuperó el precipitado, se deshidrató, molturó y se secó. Luego se recogieron 1665 g de extracto crudo de partida n. VO246.B (rendimiento del 6,7%). Los datos analíticos sobre una base de peso en seco fueron los siguientes: azufre 7,1%, fucosa 32,0%, ácidos urónicos 25,0%, peso molecular 800.000 Da, título APTT 55 I.U./mg.

Ejemplo 3 Extracción de sulfato de fucano crudo n. VO246.C

Se repitió el procedimiento experimental del ejemplo precedente a partir de 25 kg de otra partida de Fucus vesiculosus. El pH de la precipitación intermedia en este caso fue de 2,5. Se obtuvieron 2100 g (rendimiento del 8,4%) del preparado VO246.C, caracterizado por los datos analíticos siguientes: azufre 7,6%, fucosa 35,8%, ácidos urónicos 26,1%, peso molecular 470.000 DA, título APTT 44 I.U./mg.

Ejemplo 4 Despolimerización en condiciones acídicas del sulfato de fucano curdo, preparación VO246.B

Se disolvieron 5 g de VO246.B en 500 ml de agua destilada en un matraz volumétrico de 1 litros, conectado a un refrigerador. Se adicionaron 10 ml de HCl lN con el fin de rebajarse el pH a 2,2 y se calentó en un baño de aceite a 60ºC durante 16 horas. Por último se enfrió la solución, se corrigió el pH a 7 con una solución de NaOH. Se dializó el líquido en un equipo de ultrafiltración Amicon® CH2-A a un volumen constante, en tres etapas consecutivas, de nuevo 5 volúmenes de agua destilada cada vez. En la primera fase (etapa A) la membrana de diálisis utilizada tuvo un corte de peso molecular de 3000 Da. En la segunda (etapa B) la membrana tuvo un corte de peso molecular 10.000 Da y en la tercera (etapa C) de 100.000 Da. Los solutos de los permeados de la etapa A, B y C se precipitaron después de concentración de las soluciones mediante evaporación bajo presión reducida y se salificó con NaCl hasta una concentración salina del 2% peso/volumen y seguido de adición de dos volúmenes de acetona. Se recogieron de este modo tres fracciones diferentes cada una con peso, respectivamente, de 57 mg (preparado 0195/95026-A)(, 6,5 mg (preparado 0195/95026-B), y luego se descartó, y 496 mg (preparado 0195/95026-C).

Los análisis de ácidos urónicos y fucosa dieron los resultados siguientes: preparación de ácidos urónicos 195/95026-A 38,0%, fucosa 8,9%; preparación de ácidos urónicos 0195/95026-C 20,1%, fucosa 21,2%.

El retenido procedente de la última etapa de diálisis (etapa C) se salificó con NaCl hasta una concentración de sal del 2% peso/volumen y el soluto precipitó con 2 volúmenes de acetona. Se obtuvieron 2,4 g (preparación 0195/95026-D) que contuvieron 32,5% de ácidos urónicos y 16,25% de fucosa.

Ejemplo 5 Despolimerización por rayos gamma del extracto crudo VO246.B

Se disolvieron 1,5 g del extracto crudo en un matraz volumétrico de 150 ml en tampón fosfato 0,1 M pH 7, llevándolo hasta volumen después de disolverse la sustancia. Luego se distribuyó dicha solución en viales de 30 ml n. 5, que se sellaron luego herméticamente y se enviaron a la firma Gammaton (Guanzate - Como) para el tratamiento de rayos gamma. Se trataron viales n. 2 con una radiación gamma de 2,5 Mrad y los otros dos con 20 Mrad. Para cada una de las dos muestras tratadas se tomó un vial y se adicionó NaCl hasta una concentración de 2% y precipitó el soluto con dos volúmenes de acetona.

De la solución tratada con 2,54 Mrad se obtuvieron 460 mg de un compuesto (preparado 0195/96041-A) que tiene un título de fosfato del 51% peso/peso de la sustancia. El peso del extracto crudo contenido fue aquí de 225 mg, con un rendimiento del 75% calculado sobre el extracto crudo de partida. Los datos analíticos calculados sobre el compuesto puro fueron como sigue: azufre: 5,1%; ácidos urónicos 16,1%, fucosa 19,3%, peso molecular 38.500 Da.

El peso del producto recuperado de la solución tratada con radiación gamma de 20 Mrad (prep. 0195/96041-D) fue de 211 mg con un contenido de fosfato de 71% peso/peso de la sustancia. Como consecuencia el peso real del extracto crudo contenido fue de 61,2 mg (rendimiento del 20% sobre el extracto crudo de partida). Los datos analíticos fueron como sigue (ref. al compuesto puro): azufre 5,55%, ácidos urónicos 3,38%, fucosa 5,79%, peso molecular 5600 Da.

Ejemplo 6 Preparación de un sulfato de fucano de alto peso molecular purificado (preparación n. VO248.A) y siguiente despolimerización durante 24 horas en acetato de cobre en presencia de peróxido de hidrógeno (preparación VO269.A)

Se disolvieron 200 g de preparado de extracto crudo n. VO 246.B en 10 litros de agua. Luego se adicionaron 200 g de NaCl y se efectuó la agitación hasta que se obtuvo una solución homogénea. Se adicionaron 7,5 litros (0,75 volúmenes) de acetona y luego se dejó durante la noche. Se recogió el precipitado y después de deshidratación y secado se obtuvieron 126,5 g. Luego se adicionaron al sobrenandante 12,5 litros de acetona (2 volúmenes del disolvente como un conjunto), recuperándose 68,3 g de sulfato de fucano purificado (preparación . V0248.A) que tiene el perfil analítico siguiente: azufre 8,9%, fucosa 48,5%, ácidos urónicos 9,7%, peso molecular 652.000 Da, giro específico -112,8º, título APTT 67,5 I.U./mg.

Se disolvieron 10 g del compuesto en 200 ml de agua destilada. Se transfirió la solución a un recipiente y luego se calentó bajo agitación por medio de un baño de aceite a 55ºC. Se adicionaron 400 mg de monohidrato de acetato cúprico y después de solución se corrigió el pH a 7,5 por medio de unas pocas gotas de NaOH 1N.

Por medio de una bomba peristáltica se adicionó al 8% peso/volumen de solución de peróxido de hidrógeno a un caudal de flujo de 2,3 ml/h. El tiempo de reacción fue de 24 horas a pH entre 6,0 y 6,5 (volumen total adicionado de peróxido de hidrógeno: 55 ml). Luego se efectuó la filtración sobre filtros de Seitz K 800®, recuperando 400 ml de una solución límpida, a la que se adicionó 28 g de acetato sódico anhidro y luego dos volúmenes de etanol. Se disolvió el precipitado gomoso en 70 ml de agua destilada, a la que se adicionaron 30 ml de resina Amberlite® IRC 718 (forma Na^{+}) y se dejó durante 6 horas bajo agitación. La solución al final resultó incolora - ligeramente opalescente, y se filtró sobre un filtro de vidrio sinterizado después de la adición de 10 g de Clarcel CBR®. Se llevó el pH a 6,5 con la adición de algunas gotas de ácido acético glacial, luego se salificó la solución con acetato sódico anhidro hasta una concentración de 7% peso/volumen y el soluto precipitó con dos volúmenes de etanol. Después de deshidratación y secado se recuperaron 2,90 g del producto despolimerizado (preparado VO 269.A - rendimiento 29%) conteniendo 12,9% de azufre, fucosa 53,2%, ácidos urónicos 2,5%, peso molecular 8.800 Da, giro específico -14,8º, título APTT 22,1 I.U./mg.

Ejemplo 7 Despolimerización del extracto crudo VO246.B con sales de cobre para tiempos diferentes para dar preparaciones VO260.A, VO264.A y 0195/96044-C

Se disoliveron 50 g de VO246.B en 1 litro de agua. Se calentó la solución a la temperatura de 55ºC y se adicionaron 2 g de monohidrato de acetato de cobre, ajustando el pH a 7,5 con NaOH 1N. En esta etapa, por medio de una bomba peristáltica calibrada sobre un caudal de flujo de 46 ml/h, se adicionó una solución al 8% peso/volumen de peróxido de hidrógeno, manteniendo el pH entre 6 y 6,5 por medio de solución al 30% de NaOH. Después de 6 horas se tomó 1/3 (425 ml) en volumen de la solución, se salificó con acetato sódico anhidro hasta una concentración del 5% peso/volumen y se adicionaron 2 volúmenes de etanol. El precipitado así obtenido (9 g) se disolvió en agua hasta una concentración del 5% peso/volumen (180 ml) y se aplicó a una columna llenada con resina Amberlite® IRC 718 (forma Na^{+}), con un lecho de alrededor de la mitad del volumen del agua utilizada para disolver el residuo. El caudal de flujo fue de 40 ml/h. Se salificó el eluato de columna con acetato sódico anhidro y se efectuó luego precipitación con etanol de conformidad con el procedimiento antes expuesto. Se obtuvieron 7,0 g (rendimiento del 42%) de una partida de preparación n. VO260.A, que tiene las características analíticas siguientes: azufre 9,9%, fucosa 38,3 %, ácidos urónicos 15,1%, peso molecular 88.500 Da, giro específico - 119,6º, título APTT 58,1 I.U./mg, título TT 14,8 I.U./mg.

Después de 24 horas el volumen de la solución fue de 2 litros. Se tomó un litro y se sometió a las mismas etapas anteriormente descritas para la obtención de la preparación VO260.A., dando 2,6 g (rendimiento del 15,6%) de la partida de preparación n. VO 264.A con 14,5% de azufre, 56,2% de fucosa, 2,3% de ácidos urónicos, peso molecular 22.500 Da, giro específico - 1650, título APTT 74,9 I.U./mg, título TT 23 I.U./mg.

Sobre una parte alícuota de la solución de despolimerización restante se prosiguió la adición de peróxido de hidrógeno durante 24 horas (tiempo de despolimerización total 48 horas). Por último se procesó la solución como las dos partes alícuotas antes citadas, en donde en este caso se ajustó el pH de la solución hasta 6,7 por medio de ácido acético concentrado, inmediatamente antes de la precipitación de etanol. Se obtuvo 1 g (rendimiento de 6,2%) de la partida de preparación n. 0195/96044-C. El compuesto se caracterizó por los parámetros analíticos siguientes: azufre 15%, peso molecular 9.700 Da. título APTT 23,6 I.U./mg, título TT 6,7 I.U./mg.

Ejemplo 8 Despolimerización durante 6 horas de funcan crudo, preparado VO246.C y aislamiento del preparado VO260.C

Se disolvieron 200 g del compuesto en 4 litros de agua destilada. De conformidad con una prueba preliminar llevada a cabo de conformidad con el método descrito en el ejemplo precedente 6, se determinó que el tiempo de reacción fue de 6 horas. Se calentó la solución a 55ºC y bajo agitación se adicionaron 8 g de monohidrato de acetato de cobre. Se ajustó el pH a 7,5 mediante adición de alrededor de 8 ml de solución de NaOH al 30%. En este punto se adicionó una solución de peróxido de hidrógeno 8% peso/volumen con un caudal de flujo de alrededor de 183,3 ml/h (1,1 litros como un conjunto). Durante la reacción se mantuvo el pH a un valor entre 6,5 y 7,0 mediante adición apropiada de cantidades reducidas de solución al 30% de NaOH. Por último se adicionó trihidrato de acetato sódico a la solución hasta una concentración del 11% peso/volumen, y luego dos volúmenes de etanol. Se recogió el precipitado, de deshidrató y secó. Se recogieron así 79 g de un sólido, que se disolvió después en 1,2 litros de agua destilada. Luego se efectuó centrifugación a 33000 r.p.m con el fin de aclarar por lo menos en parte la turbidez de la solución. Se adicionaron 800 ml de Amberlite® IRC 718 (forma Na^{+}) y se dejó la suspensión bajo agitación durante la noche. Se recuperó la solución y se lavó la resina con dos volúmenes de agua destilada. Luego se efectuó la filtración sobre un embudo buckner, sobre el que se había estratificado primero 15 g de Clarcel CBRR, obteniéndose una solución límpida cuyo volumen fue de alrededor de 2,8 litros y pH de 8,9. Luego se ajustó el pH a 6,5 mediante la adición de unas pocas gotas de ácido acético glacial. Después de adicionó acetato sódico anhidro hasta una concentración del 7% peso/volumen y se efectuó precipitación con la adición de dos volúmenes de etanol. Después de deshidratación y secado se obtuvieron 60,1 g (rendimiento de 30,1%) del preparado VO260.C, que tiene el perfil analítico siguiente: azufre 12,6%, fucosa 47%, ácidos urónicos 8,1%, peso molecular 29.000 Da, giro específico - 138,2º, título APTT 49,6 I.U./mg, título TT 21 I.U./mg.

Ejemplo 9 Despolimerización de sulfato de funcano crudo, preparación VO246.B con sales de cobre durante 24 horas y aislamiento de la preparación VO264.B

Se disolvieron 100 g de VO246.B en 2 litros de agua. De conformidad con una prueba preliminar llevada a cabo de conformidad con el método descrito en el ejemplo 6 precedente, se determinó que el tiempo de reacción fue de 24 horas. Se adicionaron 4 g de acetato cúprico monohidrato. Se corrigió el pH a 7,5 con NaOH al 30% y luego se calentó a 55ºC. Por medio de una bomba peristáltica se adicionó una solución peso/volumen al 8% de peróxido de hidrógeno (caudal de flujo 45,8 ml/h) manteniendo el pH entre 6 y 6,5. Después de 24 horas se adicionó el volumen de solución de H_{2}O_{2} en la cantidad de 1100 ml. La solución final resultó muy opalescente y se centrifugó. Se adicionó el sobrenandante de acetato sódico anhidro hasta una concentración del 7% peso/volumen. Se precipitó el soluto con 2 volúmenes de etanol, se deshidrató y se secó. Se recuperaron 23,25 g que se disolvieron en 400 ml de agua. Se adicionaron 260 ml de resina Amberlite® IRC 718 (forma Na^{+}) y se inició la agitación y prosiguió durante la noche. Luego se efectuó la filtración sobre un embudo sinterizado, lavándose luego dicho filtro con 100 ml de agua destilada. Se ajustó el pH del filtrado a 7 con la adición de ácido acético, se adicionó acetato sódico anhidro a concentración del 7% peso/volumen seguido de dos volúmenes de etanol. Después de deshidratación y secado se obtuvieron 16,4 g de un sólido (preparación VO264.B - rendimiento 16,4%). Se encontraron las características analíticas siguientes: azufre 14,3%, fucosa 44,2%, ácidos urónicos 3,4%, peso molecular 17.500 Da, giro específico - 168,6º, título APTT 69,5 I.U./mg, título TT 28 I.U./mg.

Ejemplo 10 Despolimerización con sales de cobre durante 48 horas del extracto crudo VO246.C y aislamiento de la preparación VO267.A

Se disolvieron 200 g del extracto crudo en 4 litros de agua destilada. De conformidad con una prueba preliminar llevada a cabo según el método descrito en el ejemplo precedente 6, se determinó en primer lugar que el tiempo de reacción fue de 48 horas. Se efectuó calentamiento a 55ºC y luego se adicionó, bajo agitación, 8 g de acetato de cobre monohidrato. Se ajustó el pH a 7,5 con alrededor de 8 ml de una solución al 30% de NaOH. En esta etapa se adicionó una solución de peróxido de hidrógeno al 8% peso/v a un caudal de flujo de 23 ml/h (1,1 litros como un conjunto). El pH durante la reacción se mantuvo entre 6,0 y 6,5 con la adición de una pequeña cantidad de solución al 30% de NaOH. Después de 48 horas se llevó a cabo la filtración utilizando filtros Seitz K 800®. Se adicionó acetato sódico trihidrato hasta una concentración de 11% peso/volumen y luego precipitó el soluto con la adición de dos volúmenes de etanol. Se deshidrató el residuo gomoso y se secó, dando 57,5 g. Se redisolvió en 900 ml de agua destilada y 600 ml de resina Amberlite® IRC 718 (forma Na^{+}). Se dejó la suspensión bajo agitación durante la noche. Se realizó la filtración por medio de un embudo sinterizado y se filtró de nuevo la solución resultante a través del mismo embudo sobre el cual se había depositado previamente un lecho de Clarcel CBR®. Se ajustó el pH a 6,5 con la adición de unas pocas gotas de ácido acético concentrado, se adicionó acetato sódico anhidro, lo que dio concentración del 7% peso/volumen y precipitó el soluto con dos volúmenes de etanol. Se recogió el sólido (preparación VO267.A)(se deshidrató y se secó, dando 42,8 g (rendimiento del 21,4% sobre el extracto crudo). El análisis del compuesto dio los resultados siguientes: azufre 14,2%, fucosa 49,8%, ácidos urónicos 5,3%, peso molecular 14.700 Da, giro específico - 139,6º, título APTT 45 I.U. /mg, título TT 19 I.U./mg.

Ejemplo 11 Despolimerización de sulfato de fucano crudo VO246.A durante 18 horas y aislamiento del compuesto VO 246.A/1

Se disolvieron 50 g del compuesto VO246.A en agua. De conformidad con una prueba preliminar llevada a cabo según el método descrito en el ejemplo 6, se determinó que el tiempo de reacción fue de 18 horas. El pH durante la reacción se mantuvo entre 7,0 y 7,5 con la adición de cantidades reducidas de una solución al 30% de NaOH. Siguió luego el procedimiento del ejemplo 6 con la adición de las mismas cantidades de acetato de cobre y solución de peróxido de hidrógeno al 8% peso/volumen (volumen total adicionado 2775 ml). Se obtuvieron 11,5 g de un compuesto (VO246.A/1) que tiene el perfil analítico siguiente: azufre 14,8%, fucosa 49,3%, ácidos urónicos 2,1%, peso molecular 25.000 Da, giro específico - 162, título APTT 27 I.U./mg.

En los ejemplos 12 - 15 que siguen, que describen formulaciones para usos farmacéuticos y no, mediante la expresión "sulfato de fucano de bajo peso molecular" se entiende un preparado de sulfato de fucano que cae dentro de los presentes límites de este invento.

Ejemplo 12 Formulación para administración subcutánea

sulfato de fucano de bajo peso molecular	20 mg
agua bidestilada	0,2 ml

Ejemplo 13 Formulación para administración i.v

sulfato de fucano de bajo peso molecular	80 mg
agua bidestilada	4 mg

Ejemplo 14 Preparación para uso oral (comprimido)

sulfato de fucano de bajo peso molecular	180 mg
manitol	300 mg
sacarosa	240 mg
polivinilpirrolidona	14 mg
estearato de magnesio	9 mg

Ejemplo 15 Composición para uso tópico local

Gel
sulfato de fucano de bajo peso molecular	12 g
isopropanol	25 g
1,2 propilenglicol	0,7 g
trietanolamina	1,2 g
carbopol	1,1 g
perfumes y agua bidestilada suficiente hasta	100 g
Crema
sulfato de fucano de bajo peso molecular	18 g
estearato de polioxietilenglicol	11 g
alcohol cetilestearílico	14 g
propilenglicol	9 g
perfumes, conservantes y agua bidestilada suficiente hasta	100 g

loción acuosa
sulfato de fucano de bajo peso molecular	7 g
glicerina	7 g
alcohol etílico	10 ml
perfumes, conservantes y agua bidestilada suficiente hasta	100 g

Ejemplo 16 Otras formulaciones para uso tópico

Loción acuosa para uso cosmético
sulfato de fucano de bajo peso molecular	0,5-5 g
propilenglicol	1,5 g
alcohol etílico	15 ml
perfumes, conservantes y agua bidestilada suficiente hasta	100 g
Emulsión con actividad detergente
sulfato de fucano de bajo peso molecular	4 g
gliceril ricinoleato PEG 15	14 g
polisorbato 21	7 g
aceite de almendras	3 g
perfumes y agua bidestilada suficiente hasta	100 g

Claims (9)

1. Sulfatos de fucano con bajo peso molecular obtenible a partir de algas pardas de Pheophycee que tienen una actividad anticoagulante significante tanto como actividad APTT/mecanismo global de coagulación y como actividad antitrombínica, y además de una actividad antitrombótica significante, caracterizados por los parámetros químicos, físico-químicos y farmacológicos siguientes (datos sobre una base de peso en seco): azufre: 12,5-15%, fucosa 43-57%, ácidos urónicos 2-9%, peso molecular 14000-29000 Da, giro específico a partir de -130º a -170º, título APTT 40-80 I.U./mg, título TT 18-30 I.U./mg.

2. Sulfatos de fucano, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado por los parámetros químicos, físico-químicos y farmacológicos siguientes (datos sobre una base seca): azufre: 14-15%, fucosa 44-56%, ácidos urónicos 2-3,5%, giro específico a partir de -160º a -170º, peso molecular 17000-25000 Da, título APTT 60-80 I.U./mg, título TT 23-30 I.U./mg.

3. Fucanos, de conformidad con las reivindicaciones 1-2, obtenidos de Fucus vesiculosus.

4. Fucanos, de conformidad con la reivindicación 1-3, para uso como medicamentos.

5. Uso de fucanos, de conformidad con la reivindicación 4, para la preparación de fármacos activos como anticoagulantes y como antitrombóticos.

6. Uso, de conformidad con la reivindicación 5, en donde dichos fármacos tienen una composición apropiada para administración subcutánea.

7. Procedimiento para obtener los fucanos de las reivindicaciones 1-4 que comprende las etapas siguientes:

a.

extracción del polvo molido y secado de algas con agua a temperaturas de ebullición o casi (92-100ºC) bajo agitación durante 16 horas.

b.

filtración, ajuste del pH del filtrado hasta un valor comprendido entre 2 y 2,5, separación del precipitado del sobrenadante por filtración y ajuste del pH del sobrenandante hasta neutralidad.

c.

concentración de la solución hasta alrededor de 1/4-1/5 del volumen de partida en un aparato de ultrafiltración equipado con una membrana que tiene un corte de 100.000 Da, diálisis subsiguiente frente a 3 volúmenes de agua y, opcionalmente, concentración de la solución final.

d.

Recuperación del extracto crudo mediante precipitación después de salificación y adición de dos volúmenes de etanol o acetona a la solución obtenida al final de la etapa precedente.

e.

degradación y despolimerización del extracto crudo en solución acuosa en presencia de una sal cúprica y 8% de peróxido de hidrógeno al 8% peso/volumen a una temperatura de 55ºC y de un pH entre 6,0 y 7,5, durante el tiempo necesario para obtener un compuesto que tiene peso molecular comprendido entre 14000 y 29000, siendo la relación ponderal entre el ión cúprico y el extracto crudo de 1,3% y la relación entre el ml de 8% de peróxido de hidrógeno utilizado y los gramos de extracto crudo comprendida entre 5,5 y 36.

f.

filtración y salificación de la solución, precipitación del soluto con la adición de dos volúmenes de etanol.

g.

disolución del compuesto obtenido en agua y tratamiento con una resina de intercambio de iones Na^{+}.

h.

filtración, ajuste del pH hasta un valor dentro de 6,0 y 6,5, salificación de la solución y precipitación de los compuestos de conformidad con el invento con la adición de dos volúmenes de etanol.

8. Extracto crudo obtenible a partir de algas pardas de Pheophycee mediante las etapas a. - d. del procedimiento de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado por los parámetros químicos, físico químicos y farmacológicos siguientes (datos sobre una base de peso en seco): azufre 6-8%, fucosa 31-36%, ácidos urónicos 23 - 27%, peso molecular 450.000 - 800.000, APTT 40 - 60 I.U./mg.

9. Formulaciones de conformidad con las reivindicaciones 5-6 para la administración parenteral, oral y tópica.