KR102082276B1

KR102082276B1 - 고순도 헤파린 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR102082276B1
Application number: KR1020187009094A
Authority: KR
Inventors: 미치오 무구루마; 히로시 무라타
Original assignee: 고쿠리츠 다이가쿠 호징 미야자키 다이가쿠; 후소 야쿠힝 고교 가부시끼가이샤
Priority date: 2010-09-14
Filing date: 2011-09-13
Publication date: 2020-02-27
Also published as: AU2011303081B2; EP2617737A1; CN103209997B; US20150094460A1; WO2012036152A1; CA2811186A1; AU2011303081A1; JP2019065306A; JP6082416B2; EP3144325A1; JP6511418B2; JP2015111156A; KR20130118307A; DK2617737T3; US20130183764A1; JP2019056717A; CA2974062A1; CA2974062C; EP3144325B1; US9540454B2

Abstract

본 발명은 의약품, 화장품, 연구시약 등으로 유용한 고순도 헤파린 및 그 제조방법을, 더 상세하게는, 아질산 분해 저항성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 헤파린 및 5∼30중량%의 헤파린 수용액에 대해서, 0.2∼1배량(체적)의 에탄올을 혼합하고, 헤파린의 콜로이드상 침전물을 얻는 것을 포함하는 헤파린의 제조방법을 제공한다.

Description

고순도 헤파린 및 그 제조방법{HIGH PURITY HEPARIN AND PRODUCTION METHOD THEREFOR}

본 특허출원은 일본국 특허출원 제2010-205310호에 대해서 우선권을 주장하는 것으로, 그 전체는 본 원에 참조로 포함되는 것으로 한다.

본 발명은 부작용의 원인물질을 실질적으로 포함하지 않는, 안전성이 높고, 의약품, 화장품, 연구시약 등으로 유용한 고순도 헤파린 및 그 제조방법에 관한 것이다.

헤파린은 간, 소장, 폐, 피부 등에 존재하는 황산화된 D-글루코사민, D-글루쿠론산, L-이두론산 등을 포함하는 산성 뮤코폴리새커라이드이다.

헤파린은 강한 혈액 항응고활성을 가지고 있으며, 범발성 혈관 내 혈액응고 증후군(DIC)의 치료, 여러 혈전 색전증(정맥혈전증, 심근경색증, 폐색전증, 뇌색전증, 사지동맥혈전 색전증, 수술중ㆍ수술 후의 혈전 색전증 등)의 치료 및 예방 이외에, 혈액투석ㆍ인공심폐 등의 체외순환장치 사용시나 혈관 카테터 삽입 시 또는 수혈 및 혈액검사시 등에 있어서의 혈액응고의 방지에 사용되고 있다.

또, 헤파린은 혈액 항응고활성 이외에, 리포단백 리파아제 활성화 작용, 항혈소판 응집작용, 혈압 저하작용, 항보체작용, 암전이 억제작용, 비만세포로부터의 탈과립 저해작용, 국부염증 억제, 진통 및 근조직의 혈행촉진 작용 등의 많은 생리활성을 가지는 것도 알려져 있다.

헤파린은 주로 건강한 식용동물의 조직으로부터 추출/분획해서 제조되지만, BSE(소해면상 뇌질환) 문제 이후, 의약품으로서의 헤파린의 기원은 거의 돼지 소장점막 유래이다. 통상, 수계 용매에 돼지 소장점막을 현탁해서 단백질 소화하고, 그 후에 흡착제 등을 첨가해서(비특허문헌 1), 헤파린과, 다른 뮤코폴리새커라이드(주로 콘드로이친황산 패밀리, 헤파란황산 등)을 복합체로서 추출해서 조원료로 한다. 이어서, 이것을 배치 혼합/분획하고, 헤파린(소위 「미분획 헤파린」)을 얻는다.

상기 방법으로 수득된 헤파린(미분획 헤파린)은 헤파린 이외의 뮤코폴리새커라이드(주로 헤파란황산, 콘드로이친황산 B 및 C)를 함유하고, 그 함량은 조원료 및 제조방법에 따라 다르다는 것은 기지이다. 그렇지만, 그 불순물의 대강의 부작용이 확인되어, 허용되고 있으며, 그 결과, 미분획 헤파린은 오랫동안 의약품으로서 사용되어 왔다.

그렇지만, 2008년 초, 미국 및 독일에서, 미분획 헤파린 제제를 환자에 볼루스(급속 정맥주사) 투여했을 때에 종래와는 다른 부작용 예가 많이 보고되고, 최종적으로 80명 이상의 사망자가 발생하는 사태가 발생했다. 미국 FDA가 그 미분획 헤파린 제제 및 그 원약을 분석한 결과, 그것들은 종래품과는 분명하게 다른 것이 확인되고, 또, 그 중에 과황산화 콘드로이친황산(Over sulfated chondroitin sulfate: OSCS)이 존재하는 것이 확인되었다(비특허문헌 2∼4). 이것은, 자연계에는 존재하지 않는 물질로, 원약 제조시에 혼입되었을 가능성이 높다고 말해지고 있다.

일본 국내에 있어서는 중증의 부작용 보고는 없었지만, 일부의 미분획 헤파린 제제 및 저분자량 헤파린(Low molecular weight heparin: LMWH) 제제가 회수되고, 시장으로의 안정공급 문제가 심각화되었다.

많은 연구자에 의해 OSCS의 과학적 합성법, 구조해석 혹은 동물실험 등에 의한 유해사상의 원인구명, 특히 ¹H-NMR나 다른 시험방법 등에 의한 순도 및 안전성확인의 검토(비특허문헌 5 및 6)가 수행되고 있고, 일본국내에서는 OSCS가 유해사상의 원인물질로 특정되고, 확인/순도시험의 검토가 행정기관, 제제 메이커에서 실시되고 있다(비특허문헌 7 및 8).

한편, 헤파린의 제조 또는 정제 방법으로서는 1) 비특허문헌 1, 2) 비특허문헌 9, 3) 비특허문헌 10, 4) 특허문헌 1 등에 기재된 방법이 알려져 있다.

그렇지만, 헤파린으로부터 OSCS, 콘드로이친황산 등의 불순물을 간편 또한 효과적으로 제거할 수 있는 방법은 지금까지 알려져 있지 않다. 또, 이러한 헤파린 중의 불순물을 간편하게 검출 또는 측정하는 방법도 지금까지 알려져 있지 않다.

일본 공개특허공보 제2002-293804호

Roden, L., Dorfman, A., Acta Chemi. Scand. 13, 2121(1959) Nature Biotechnology, 2008, 26, 669-675 The New England Journal of Medicine, 2008, 359, 2674-2684 The New England Journal of Medicine, 2008, 358, 2457-2467 Beyer, T. et al., Journal of PHarmaceutical and Biomedical Analysis, 48, 13-19(2008) Guerrini, M. et al., Nature Biotechnology 26, 669-675(2008) Hashii Noritaka 들, 의약연구39(10) 651-659(2008) Jia, H., Nature Biotechnology 26, 477-478(2008) Schiller, S. etal.: J. Biol. Chem. 236, 983(1961) Schmidt, M and Dmochowski, A: Biochim. BiopHys. Acta 83, 137(1964)

본 발명의 과제는 OSCS, 콘드로이친황산 등의 불순물을 실질적으로 포함하지 않고, 안전성이 높은 고순도 헤파린, 그 제조방법 및 그 제조과정에서의 헤파린의 순도의 확인방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구한 결과, 헤파린을 소정의 조건하에서 에탄올 등의 유기용매를 사용해서 분획함으로써, OSCS, 콘드로이친황산 등의 불순물을 간편 또한 효과적으로 제거할 수 있는 것, 게다가, 이들의 불순물은 소정의 조건하에서의 아질산 분해에 대해서 저항성이므로, 당해 아질산 분해 후에 HPLC로 분석하는 것에 의해, 그 존재 및 그 양을 확인 및 측정할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명에는 이하의 것이 포함된다:

[1] 아질산 분해 저항성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 헤파린.

[2] 5∼30중량%의 헤파린 수용액에 대해서, 0.2∼1배량(체적)의 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 아세톤 및 이들의 혼합용매로부터 선택되는 유기용매를 혼합하고, 헤파린의 콜로이드상 침전물을 얻는 것을 포함하는 방법에 의해 수득되는 헤파린.

[3] 상기 [2]에서, 헤파린 수용액 중에, 염이 50∼500mM의 농도로 용해되어 있는 헤파린.

[4] 상기 [3]에서, 염이 염화나트륨 및 아세트산 나트륨으로부터 선택되는 헤파린.

[5] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에서, 콜로이드상인 헤파린.

[6] 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에서, 분자량이 3000∼30000달톤의 범위 내에 있는 헤파린.

[7] 5∼30중량%의 헤파린 수용액에 대해서, 0.2∼1배량(체적)의 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 아세톤 및 이들의 혼합용매로부터 선택되는 유기용매를 혼합하고, 헤파린의 콜로이드상 침전물을 얻는 것을 포함하는 헤파린의 제조방법.

[8] 5∼30중량%의 헤파린 수용액에 대해서, 0.2∼1배량(체적)의 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 아세톤 및 이들의 혼합용매로부터 선택되는 유기용매를 혼합하고, 헤파린을 함유하는 상청액을 얻는 것을 포함하는 방법에 의해 수득되는 헤파린.

[9] 상기 [8]에서, 헤파린 수용액중에, 염이 50∼500mM의 농도에서 용해되어 있는 헤파린.

[10] 상기 [9]에서, 염이 염화나트륨 및 아세트산 나트륨으로부터 선택되는 헤파린.

[11] 상기 [8] 내지 [10] 중 어느 하나에서, 분자량이, 1500∼12000달톤의 범위 내에 있는 헤파린.

[12] 5∼30중량%의 헤파린 수용액에 대해서, 0.2∼1배량(체적)의 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 아세톤 및 이들의 혼합용매로부터 선택되는 유기용매를 혼합하고, 헤파린을 함유하는 상청액을 얻는 것을 포함한, 헤파린의 제조방법.

[13] 헤파린을 포함해서 이루어지는 의약.

[14] 의약으로 사용하기 위한 상기 [1] 내지 [6] 및 [8] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 헤파린.

[15] 상기 [1] 내지 [6] 및 [8] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 헤파린을 함유하는 의약 조성물.

[16] 뮤코폴리새커라이드를 아질산 분해하는 것을 특징으로 하는 당해 뮤코폴리새커라이드 중에 포함되는 아질산 분해 저항성 뮤코폴리새커라이드 또는 아질산 분해성 뮤코폴리새커라이드의 검출 또는 측정방법.

본 발명의 고순도 헤파린은 부작용의 원인물질인 OSCS 등을 포함하지 않으므로, 안전성이 높고, 의약품, 화장품, 연구시약 등으로 매우 호적하게 사용할 수 있다.

본 발명의 헤파린의 제조방법에 의하면, 아질산 분해 저항성 불순물을 실질적으로 포함하지 않는 고순도 헤파린을 간편하게 얻을 수 있다. 또, 당해 방법은 공업적으로 이용 가능하다.

본 발명의 뮤코폴리새커라이드의 검출 또는 측정방법에 의하면, 뮤코폴리새커라이드 제품 중에, 아질산 분해에 대해서 서로 다른 특성을 나타내는 다른 뮤코폴리새커라이드의 혼입의 유무를 간편하게 확인할 수 있으므로, 제품의 안전성 등을 확보할 수 있다. 또, 소망하는 뮤코폴리새커라이드를 제조하는 과정에 있어서도, 아질산 분해에 대해서 서로 다른 특성을 나타내는 다른 뮤코폴리새커라이드의 혼입을 간편하게 확인할 수 있으므로, 소망하는 뮤코폴리새커라이드의 제조공정을 효과적으로 관리할 수 있고, 중간재료나 최종생성물 중으로의 다른 뮤코폴리새커라이드의 혼입을 회피할 수 있다.

도 1은 다른 뮤코폴리새커라이드(주로 헤파란황산(HS)/콘드로이친황산 B(CSB)/콘드로이친황산 C(CSC))를 함유하는 미분획 헤파린(Na염, UFN-SP)에 대해서, 에탄올 분획 전, 에탄올 분획 후의 상층(상청액) 및 하층(콜로이드상 침전물)에 포함되는 물질의 분포를 나타내는 HPLC의 차트이다. 도 1중의 각 기호는 다음과 같다: A) 에탄올 분획 전(실선), B) 에탄올 분획 후의 하층(콜로이드상 침전물)(파선), C) 에탄올 분획 후의 상층(상청액)(점선), D) C)중의 황산화도가 낮은 고분자 뮤코폴리새커라이드(주로 HS/CSB/CSC)(점선), E) 아질산 분해에 저항성이 있는 뮤코폴리새커라이드(주로 CSB/CSC/과황산화 콘드로이친황산(OSCS))(1점쇄선), F) 주로 펩티드글리칸(1점쇄선), G) 뮤코폴리새커라이드 중의 용출염(Na염)(각선), Ｈ)기타 저분자 화합물(에탄올 및 기타 미확인 물질)(주로 실선).
도 2는 아질산 분해에 의한 OSCS 대조물질, 즉, OSCS함유 미분획 헤파린(Na염, OSHP-SH, OSCS함량 약 12.5%), OSCS 표준품(OSCS-STD), OSCS 및 콘드로이친황산 패밀리의 혼합물인 조OSCS(CSMS-CE1 및 -CE2)의 아질산 분해 전후의 분자량변화를 나타내는 HPLC의 차트이다. 도 2 중의 각 기호는 다음과 같다: A) OSHP-SH 및 OSCS-STD ａ) 아질산 분해전의 OSHP-SH(실선), b) 아질산 분해후의 OSHP-SH(파선), c) 아질산 분해전의 OSCS-STD(점선), d) 아질산 분해후의 OSCS-STD(일점파선); B)CSMS-CE1 및 -CE2 a) 아질산 분해후의 CSMS-CE1(실선), b) 아질산 분해후의 CSMS-CE2(파선), c) CSB-STD(점선)
도 3은 아질산 분해에 의한 뮤코폴리새커라이드 대조물질, 즉, 콘드로이친황산 패밀리(CSA, CSB, CSC, CSD 및 CSE), 헤파란황산(HS) 및 케라탄황산(KS)의 분자량변화를 나타내는 HPLC의 차트이다. (아질산 분해전: 실선, 아질산 분해후: 파선)
도 4는 에탄올 분획 전의 각 미분획 헤파린의 Na염(UFN1∼5) 및 Ca염(UFC)의 아질산 분해전의 분자량분포를 나타내는 HPLC의 차트이다. 도 4중의 각 기호는 다음과 같다: a) UFN1(실선), b) UFN2(파선), c) UFN3(점선), d) UFN4(1점쇄선), e) UFN5(2점쇄선), f) UFC(▲실선)
도 5는 에탄올 분획 전의 각 미분획 헤파린의 Na염(UFN1∼5) 및 Ca염(UFC)의 아질산 분해후의 분자량분포를 나타내는 HPLC의 차트이다. 도 5중의 각 기호는 다음과 같다: a) UFN1(실선), b) UFN2(파선), c) UFN3(점선), d) UFN4(1점쇄선), e) UFN5(2점쇄선), f) UFC(▲실선)
도 6은 에탄올 분획 후의 각 미분획 헤파린의 Na염(UFN1∼5) 및 Ca염(UFC)의 아질산 분해전의 분자량분포를 나타내는 HPLC의 차트이다. 도 6중의 각 기호는 다음과 같다: a) UFN1(실선), b) UFN2(파선), c) UFN3(점선), d) UFN4(1점쇄선), e) UFN5(2점쇄선), f) UFC(▲실선)
도 7은 에탄올 분획 후의 각 미분획 헤파린의 Na염(UFN1∼5) 및 Ca염(UFC)의 아질산 분해후의 분자량분포를 나타내는 HPLC의 차트이다. 도 7중의 각 기호는 다음과 같다: a) UFN1(실선), b) UFN2(파선), c) UFN3(점선), d) UFN4(1점쇄선), e) UFN5(2점쇄선), f) UFC(▲실선)

본 발명의 고순도 헤파린은 아질산 분해 저항성 불순물을 실질적으로 함유하지 않는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서의 「헤파린」은 특별하게 한정되지 않고, 종래 기지의 원료 및 제조방법으로부터 수득된 것으로 좋은데, 예를 들면, 소위 「미분획 헤파린」, 「저분자량 헤파린」, 또 「헤파린」과 유사한 구성 당 조성과 결합양식을 가지는 「헤파란황산」 중에서, 특히 고분자량 혹은 고황산 함량의 「헤파란황산」 등을 들 수 있다.

상기 「미분획 헤파린」은 해중합처리되어 있지 않은 헤파린을 의미하고, 통상, 분자량이 3000∼30000달톤의 범위 내에 있는 것이다.

상기 「저분자량 헤파린」은 미분획 헤파린을 해중합처리해서 저분자화한 것으로, 통상, 분자량이 1500∼12000달톤의 범위 내에 있는 것이다.

상기 「헤파란황산」은, 통상, 분자량이 3000∼30000달톤의 범위 내에 있는 것이다.

또, 본 발명에 있어서의 헤파린에는 일반적으로 생체 내에 있어서 유리형과 실질적으로 동일한 생리활성 또는 약리활성을 발휘하는 것, 예를 들면, 헤파린의 유도체 및 의약적으로 허용되는 염, 부가염, 수화물 등은 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.

또, 여기에서 말하는 분자량은 수성용매에 의한 사이즈 배제 겔크로마토그래피에 의한 HPLC법에 의해 결정되는 중량평균 분자량이다.

본 발명에 있어서의 「아질산 분해」란 실질적으로 헤파린을 분해하며, 또한, 후술하는 OSCS, 콘드로이친황산 등의 불순물을 분해하지 않는 조건하에서의 아질산 분해처리라면 좋은데, 예를 들면, pH 1.0∼7.0(바람직하게는 pH 2.0∼5.0), 반응온도 -10∼40℃(바람직하게는 -5∼10℃), 반응시간 0.5∼60분(바람직하게는 5∼15분), 대상물질(헤파린 등) 1g에 대한 아질산(특히 아질산 Na)의 사용량 10∼1000mg(바람직하게는 50∼100mg) 등의 비교적 저pH 또한 저온하에서 단시간으로의 조건하에서의 아질산 분해처리를 의미한다.

상기 「아질산 분해 저항성 불순물」이란 상기 아질산 분해에 대해서 저항성을 나타내는 헤파린 중의 불순물을 의미하고, 예를 들면, 헤파린을 상기 아질산 분해 후에 HPLC(예를 들면, 후술하는 조건 하)로 분석했을 경우, 아질산 분해전의 헤파린의 용출위치에 대응하는 위치에 용출되는 물질을 의미한다. 이러한 물질로서는 예를 들면, 과황산화 콘드로이친황산(OSCS), 콘드로이친황산 A(콘드로이틴-4-황산: CSA), B(데르마탄황산: CSB), C(콘드로이틴-6-황산: CSC), D(콘드로이틴-2, 6-황산: CSD), E(콘드로이틴-4, 6-황산: CSE), 등의 뮤코폴리새커라이드이고, 기본골격으로 갈락토사민과 우론산(글루쿠론산 혹은 이두론산)의 2당 단위구조를 가지는 것, 또 기본골격으로 글루코사민과 갈락토오스의 2당 단위구조를 가지는 케라탄황산(KC)을 들 수 있다.

상기 「아질산 분해 저항성 불순물」을 「실질적으로 함유하지 않는다」란 대상의 헤파린을, 일본약국법 제15개정 해설서에 기재된 「파르나파린 나트륨」규격시험법의 「분자량」의 항을 참고로 한 조건의 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석했을 경우에 수득되는 헤파린의 용출위치(예를 들면, 이하의 구체예에서는 용출시간으로 10∼20분)에 나타나는 굴절율(RI)로 검출된 피크의 총면적값에 대해서, 해당 헤파린을 상기 아질산 분해하고, 동일한 조건의 HPLC로 분석했을 경우에, 헤파린의 용출위치에 나타나는 피크의 총면적값이, 5%이하, 바람직하게는 1%이하, 더 바람직하게는 0.5%이하인 것을 의미한다.

상기 HPLC의 조건의 구체예로서는 예를 들면, 이하의 조건이 들 수 있다:

검출 시스템: SHIMADZU사 제품, 관리시스템(LC Colution), 시차굴절계(RI:RID-10A)

칼럼 및 가드칼럼: TOSO사 제품, TSK gel G-2000 SWXL 및 TSK guard column SWXL

칼럼 온도 40℃

이동상: 0.2mol/ℓ 황산 Na(pH5.0)

유량: 0.5㎖/분.

본 발명의 고순도 헤파린은 예를 들면, 아질산 분해 저항성 불순물 등을 포함하는 원료 헤파린을, 소정의 조건하에서 에탄올 등의 유기용매를 사용해서 분획하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있다.

상기 분획에 사용하는 유기용매로서는 예를 들면, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올 혹은 아세톤 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다. 그 중에서도, 최종생성물으로의 잔류를 고려했을 경우, 에탄올이 가장 바람직하다.

이하, 본 발명의 일례로서, 유기용매로서 에탄올을 사용했을 경우(에탄올 분획)를 들어서 설명하지만, 에탄올 대신에 다른 유기용매를 사용했을 경우도 동일하게 본 발명을 실시할 수 있다.

본 발명에 있어서의 에탄올 분획은 5∼30중량%(바람직하게는 10∼20중량%)의 헤파린 수용액에 대해서, 0.2∼1배량(바람직하게는 0.4∼0.6배량)(체적)의 에탄올을 혼합하고, 헤파린의 콜로이드상 침전물을 얻는 것을 특징으로 한다. 당해 방법은 간편하고, 공업적으로 이용가능하다.

종래, 헤파린을 백색침전으로서 얻기 위해서, 에탄올 침전법이 이용되고 있다. 그렇지만, 종래의 에탄올 침전법이 적용되는 헤파린 수용액중의 헤파린 농도는 1∼5중량%으로, 본 발명의 에탄올 분획에 비해서 대폭 낮다. 또, 헤파린 수용액에 혼합하는 에탄올의 양은 2∼10배량(체적)으로, 본 발명의 에탄올 분획에 비해서 현저에 크다. 즉, 본 발명의 에탄올 분획은 종래의 에탄올 침전법과 명확하게 구별된다.

상기 에탄올 분획에 있어서의 원료 헤파린으로서는 특별하게 한정되지 않고, 미분획 헤파린의 원료, 미분획 헤파린, 저분자량 헤파린 등의 다양한 정제단계 및 불순물 농도의 헤파린을 사용할 수 있다. 단, 소망하는 헤파린을 콜로이드상 침전물로서 회수하는 경우, 원료 헤파린의 분자량은 바람직하게는 3000∼30000달톤, 더 바람직하게는 5000∼15000달톤이다.

상기 에탄올 분획 시에, 원료 헤파린을 정제수, 주사용수 등의 물에 상기 농도범위 가 되도록 용해시켜서 헤파린 수용액을 조제한다.

상기 헤파린 수용액은 헤파린의 특성에 의해 수용액의 pH의 상승에 따라 용매에 의한 침전 생성이 더욱 예민하게, 또 pH의 저하에 따라 용매에 의한 침전 생성이 더욱 완만하게 되는 점으로부터, 그 pH가 산성∼중성 부근인 것이 바람직하고, 예를 들면, pH 2.5∼7.5, 바람직하게는 pH 4.0∼7.0이다.

또, 상기 헤파린 수용액은 헤파린의 특성에 의해 이온강도의 상승에 따라 용매에 의한 침전 생성이 더욱 예민하게, 또 이온강도의 저하에 따라 용매에 의한 침전 생성이 더욱 완만하게 되는 점, 또 염 농도가 낮은 경우에는 콜로이드 침전을 형성하기 어려워져 원심조작 등이 필요하게 되는 점으로부터, 염이 용해되어 있는 것이 바람직하다.그 염 농도로서는 예를 들면, 50∼500mM, 바람직하게는 100∼250mM이다. 염으로서는, 헤파린이 주로 의약품으로서 사용되는 점에서, 약학적으로 허용되는 염, 예를 들면, 염화나트륨, 아세트산 나트륨, 등을 들 수 있다.

따라서 헤파린 수용액은 헤파린을 생리식염수에 용해시킨 것일 수도 있다.

상기 에탄올 분획에 있어서의 처리온도 및 처리시간은 헤파린의 콜로이드상 침전물이 수득되는 처리온도 및 처리시간이면 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면, -10∼40℃(바람직하게는 5∼25℃)의 온도에서, 예를 들면, 0.5∼48시간(바람직하게는 4∼24시간) 실시할 수 있다.

상기 에탄올 분획에 의해서, 불순물인 아질산 분해 저항성 불순물은 상청액 중에 남지만, 헤파린은 콜로이드상이 되고, 침전한다. 따라서 콜로이드상 침전물을 상청액과 분리하는 것에 의해, 아질산 분해 저항성 불순물을 실질적으로 포함하지 않는 고순도 헤파린을 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서의 「콜로이드상」헤파린 또는 「콜로이드상」침전물은 헤파린이 콜로이드의 분산상을 형성하고 있는 것으로써, 본 발명에 있어서의 분획에서 사용하는 물 및 유기용매의 혼합액 중에 있어서, 계면 및 층을 형성해서 침전하고 있는 것이고, 예를 들면, 통상 사용하는 마이크로오더의 분자사이즈 체의 것으로부터 한외여과막과 같은 여지(예를 들면, 분자량 절단 사이즈가 500∼50000MW)를 사용해서 실질적으로 여과해서 모으는 것이 곤란한(여지를 사용해서 그 침전물과 물/유기용매 혼합액을 분리하는 것이 곤란하다) 상태에 있는 것을 의미한다.

한편, 분자량이 1500∼12000, 바람직하게는 평균 분자량이 2500∼7500인 헤파린을 원료 헤파린으로 했을 경우, 상기 에탄올 등의 유기용매에 의한 분획은 다음과 같이 해서 실시하는 것이 바람직하다.

당해 분획에 사용하는 유기용매로서는 예를 들면, 에탄올, 메탄올, 이소프로판올 혹은 아세톤 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다. 그 중에서도, 최종 생성물으로의 잔류를 고려했을 경우, 에탄올이 가장 바람직하다.

이하, 상기 분획의 예로서, 유기용매로서 에탄올을 사용했을 경우(에탄올 분획)을 들어서 설명하지만, 에탄올 대신에 다른 유기용매를 사용했을 경우도 동일하게 실시할 수 있다.

상기 원료 헤파린을, 정제수, 주사용수 등의 물에 상기 농도범위가 되도록 용해시켜서 헤파린 수용액을 조제한다. 수용액의 pH의 상승에 따라 용매에 의한 침전 생성이 예민에, 또 pH의 저하 에 따라 용매에 의한 침전 생성이 보다 완만해지는 점으로부터, 그 pH가 산성∼중성부근인 것이 바람직하고, 예를 들면, pH 2.5∼7.5, 바람직하게는 pH 4.0∼7.0이다.

또, 이온강도의 상승에 따라 용매에 의한 침전 생성이 더욱 예민하게, 또 이온강도의 저하 에 따라 용매에 의한 침전 생성이 더욱 완만하게 되는 점, 또 염 농도가 낮은 경우에는 콜로이드 침전을 형성하기 어렵게 되어 원심조작 등이 필요하게 되는 점으로부터 배치조작에 적합하지 않기 때문에, 염이 용해되어 있는 것이 바람직하다.그 염 농도로서는 예를 들면, 50∼500mM, 바람직하게는 100∼250mM이다. 염으로서는 약학적으로 허용되는 염, 예를 들면, 염화나트륨, 아세트산 나트륨 등을 들 수 있다.

에탄올 분획은 5∼30중량%(바람직하게는 10∼20중량%)의 헤파린 수용액에 대해서, 0.2∼1배량(바람직하게는 0.25∼0.6배량)(체적)의 에탄올을 혼합하고, 아질산 분해 저항성 불순물의 침전물을 얻는다.

이 경우, 불순물인 아질산 분해 저항성 불순물은 침전하지만, 헤파린은 상청액 중에 남는다. 따라서 상청액을 침전물과 분리하는 것에 의해, 아질산 분해 저항성 불순물을 실질적으로 포함하지 않는 고순도 헤파린을 얻을 수 있다.

상기 에탄올 분획 후, 종래의 방법에 따라서, 정제 처리(에탄올 침전법 등), 건조처리(감압건조 등) 등을 실시하는 것에 의해, 아질산 분해 저항성 불순물을 실질적으로 포함하지 않는 고순도 헤파린을 백색분말로서 얻을 수 있다.

본 발명에 따라서 수득되는 고순도 헤파린은 부작용의 원인물질인 OSCS등의 불순물을 실질적으로 함유하지 않기 때문에 안전성이 높고, 또 종래의 헤파린과 동일한 생리활성을 나타내므로, 종래의 헤파린과 동일한 의약용도에 매우 호적하게 적용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 고순도 헤파린은 강한 혈액 항응고활성을 가지고 있어, 범발성 혈관 내 혈액응고 증후군(DIC)의 치료, 여러 혈전 색전증(정맥혈전증, 심근경색증, 폐색전증, 뇌색전증, 사지동맥혈전 색전증, 수술 중ㆍ수술 후의 혈전 색전증 등)의 치료 및 예방 외에, 혈액투석ㆍ인공심폐 등의 체외순환장치 사용시나 혈관 카테터 삽입시 또는 수혈 및 혈액검사 시 등에 있어서의 혈액응고의 방지에 사용할 수 있다. 또, 본 발명의 고순도 헤파린은 리포단백 리파아제 활성화 작용, 항혈소판 응집작용, 혈압 저하작용, 항보체작용, 암전이 억제작용, 비만세포로부터의 탈과립 저해작용, 국부염증억제, 진통 및 근조직의 혈행 촉진작용 등의 많은 생리활성을 가지기 때문에, 이들의 작용에 의거하는 각종 질병의 예방 또는 치료제로서 사용할 수도 있다.

본 발명의 고순도 헤파린은 종래의 헤파린과 마찬가지로, 통상의 방법에 의해 제제화하고, 주사제나 경구제로서 투여할 수 있다. 예를 들면 이하와 같은 투여법에 의해 투여되지만, 그 투여량 혹은 투여속도는 통상 본제 투여후, 전혈 응고시간 또는 전혈 활성화 부분 트론보프라스틴 시간을 측정하면서, 연령, 증례, 적응영역 혹은 목적에 의해 결정된다.

예를 들면, 정맥내 점적투여법에서는, 헤파린의 5,000∼50,000헤파린 단위에 상당하는 양을 5% 포도당 주사액, 생리식염액 또는 링거액 1, 000㎖로 희석하고, 1분에 20∼30방울 전후의 속도로 정맥 내에 점적 투여한다. 또, 정맥내 간헐주사법에서는 헤파린의 5,000∼50,000 헤파린 단위에 상당하는 양을 4∼8시간 마다 정맥 내에 주사한다. 피하주사ㆍ근육내 주사법에서는 1회 5,000∼10,000 헤파린 단위에 상당하는 양의 헤파린을 4시간 마다 피하주사 또는 근육 내 주사한다.

체외순환 시(혈액투석ㆍ인공심폐)에 있어서의 사용에 있어서, 인공신장에서는 각 환자의 적정 사용량은 투석전의 헤파린 감수성 시험의 결과에 의거해서 산출되지만, 전신 헤파린화법의 경우, 통상 투석 개시에 앞서, 1,000∼3,000 헤파린 단위에 상당하는 양의 헤파린을 투여하고, 투석 개시 후는, 1시간당 500∼1,500 헤파린 단위에 상당하는 양을 지속적으로, 또는 1시간마다 500∼1,500 헤파린 단위에 상당하는 양을 간헐적으로 추가한다. 국소 헤파린화법의 경우에는, 1시간당 1,500∼2,500 헤파린 단위에 상당하는 양을 지속 주입한다. 또, 인공 심폐관류 시에는 시술ㆍ방법에 따라 다르지만, 150∼300 헤파린 단위/kg에 상당하는 양을 투여하고, 추가로 체외순환시간의 연장에 따라 적당하게 추가 투여한다.

경구투여의 경우에는 500∼2,000 헤파린 단위/g에 상당하는 양의 헤파린을 1일 1∼수회 복용한다. 외용제의 경우에는 100∼500 헤파린 단위/g에 상당하는 양의 헤파린의 연고로서 사용되고, 적당량을 1일 1∼수회 도찰 또는 거즈 등에 발라서 첩부한다.

좌제의 경우에는 1,000∼4,000 헤파린 단위/g에 상당하는 양의 헤파린을 1일 1∼2회 항문 또는 질에 적용한다.

또, 본 발명의 고순도 헤파린은 종래의 헤파린와 마찬가지로, 화장품, 연구시약 등으로 호적하게 사용할 수 있다.

본 발명은 또, 뮤코폴리새커라이드를 아질산 분해하는 것을 특징으로 하는 당해 뮤코폴리새커라이드 중에 포함되는 아질산 분해 저항성 뮤코폴리새커라이드 또는 아질산 분해성 뮤코폴리새커라이드의 검출 또는 측정방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서의 「아질산 분해 저항성 뮤코폴리새커라이드」로서는, 상기 아질산 분해 저항성 불순물로서 예시된 뮤코폴리새커라이드 등을 들 수 있다. 또, 「아질산 분해성 뮤코폴리새커라이드」는 상기 아질산 분해에 의해 분해되는 뮤코폴리새커라이드를 의미하고, 예를 들면, 헤파린, 헤파란황산 등을 들 수 있다.

또, 상기 방법에 있어서의 「아질산 분해」는 상기 아질산 분해와 같다.

상기 방법에 사용되는 뮤코폴리새커라이드로서는 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면, 헤파린, 헤파란황산, 콘드로이친황산, 케라탄황산 등을 들 수 있다.

뮤코폴리새커라이드의 아질산 분해 후, 예를 들면, 상기 HPLC법을 사용해서, 당해 뮤코폴리새커라이드 중에 포함되는 아질산 분해 저항성 뮤코폴리새커라이드 또는 아질산 분해성 뮤코폴리새커라이드를 검출 또는 측정할 수 있다. 즉, 대상 뮤코폴리새커라이드를 상기 아질산 분해 후, HPLC에 의해 분석했을 경우, 대상 뮤코폴리새커라이드가 아질산 분해성 뮤코폴리새커라이드(헤파린 등)이며, 또한, 대상 중에 아질산 분해 저항성 뮤코폴리새커라이드(콘드로이친황산 등)이 포함되어 있는 경우, 아질산 분해전의 아질산 분해성 뮤코폴리새커라이드에 상당하는 피크가 소멸하는 동시에, 아질산 분해 저항성 뮤코폴리새커라이드에 상당하는 피크가 검출되게 된다. 반대로, 대상 뮤코폴리새커라이드가 아질산 분해 저항성 뮤코폴리새커라이드(콘드로이친황산 등)이며, 또한, 대상 중에 아질산 분해성 뮤코폴리새커라이드(헤파린 등)이 포함되어 있을 경우, 아질산 분해전의 아질산 분해 저항성 뮤코폴리새커라이드에 상당하는 피크는, 아질산 분해 후, 아질산 분해성 뮤코폴리새커라이드에 상당하는 분만 피크가 축소되게 된다.

상기 뮤코폴리새커라이드의 검출 또는 측정방법에 의하면, 뮤코폴리새커라이드 제품 중에, 아질산 분해에 대해서 서로 다른 특성을 나타내는 다른 뮤코폴리새커라이드의 혼입의 유무를 간편하게 확인할 수 있으므로, 제품의 안전성 등을 확보할 수 있다. 또, 소망하는 뮤코폴리새커라이드를 제조하는 과정에 있어서도, 아질산 분해에 대해서 서로 다른 특성을 나타내는 다른 뮤코폴리새커라이드의 혼입을 간편하게 확인할 수 있으므로, 소망하는 뮤코폴리새커라이드의 제조공정을 효과적으로 관리할 수 있고, 중간재료나 최종 생성물중으로의 다른 뮤코폴리새커라이드의 혼입을 회피할 수 있다.

이하에, 실시예를 들어서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이것들에 한정되는 것은 아니다.

실시예

[시험 방법]

(1) 아질산 분해

고온하에서의 약산성 영역(pH 4.0 부근)에서의 부반응을 저감시키기 위해서, 본 처리는 모두 빙냉하에서 실시했다. 또, 반응 종료후의 과잉의 아질산 Na의 축적을 피하기 위해서, 각 시료에 대한 아질산Na의 첨가량은 시료 1g당 60mg로 했다.

미리 주사용수(일본약전 적합품)에 녹인 각 시료용액에, 소정량의 아질산Na를 첨가해서 교반한 후, HCl로 pH를 1.5 전후로 조정해서 반응을 개시했다. 30분 후, NaOH로 pH를 5.0으로 조정해서 반응을 종료시키고, 에탄올을 첨가해서 고화, 건조해서 백색분말을 얻었다.

(2) HPLC법

각 시료 중에 포함되는 물질의 분자량분포를 HPLC법에 의해 확인했다. HPLC법의 조건은, 일본약국법 제15개정 해설서에 기재된 「파르나파린 나트륨」규격 시험법의 「분자량」의 항에 준했다. 사용한 HPLC의 조건을 이하에 나타낸다.

검출 시스템: SHIMADZU사 제품, 관리시스템(LC solution), 시차굴절계(RI: RID-10A)

칼럼 및 가드칼럼: TOSO사 제품, TSK gelg-2000 SWXL 및 TSK guard column SWXL

칼럼 온도: 40℃

이동상: 0.2mol/ℓ 황산 Na(pH5.0)

유량: 0.5㎖/분.

[ 참고예 1]

과황산화 콘드로이친황산(OSCS) 표준품(OSCS-STD, 일본공정서 협회), OSCS 함유 미분획 헤파린(Na염, OSHP-SH, OSCS함량 약 12.5%, C사제품, 로트 No.1060-07-0033), OSCS 및 콘드로이친황산 패밀리의 혼합물인 조OSCS(CSMS-CE1 및 -CE2, Ｎ사제품, OSCS함유 미분획 헤파린(Na염: 로트No.PH-64107 및 pH-64507)으로부터 헤파린/헤파란황산의 함량을 약 95%이하로 저감해서 조제)을, 상기의 방법으로 아질산 분해하고, 상기의 방법으로 HPLC을 실시하고, 아질산 분해 전후의 분자량 변화를 확인했다(도 2). 그 결과, OSCS-STD, CSMS-CE1 및 -CE2에 대해서, 2당 단위의 피크 시프트를 동반하는 분해 및 저분자화는 확인되지 않았다. OSHP-SH(OSCS 함량 약 12.5%)에 대해서, 2당 단위의 피크 시프트를 동반하는 분해 및 저분자화가 확인되고, RI에 의해 검출된 아질산 분해 미분해물의 피크의 면적값은 아질산 분해전의 피크의 면적값의 약 12.1%이었다. 또, OSHP-SH의 미분해물의 피크는 OSCS-STD의 피크과 가까운 분자량을 나타냈다(도 2-A). 또, CSMS-CE1 및 -CE2의 피크는 콘드로이친황산 B(CSB-STB, 순도 > 95%, 돼지 소장점막 추출물로부터 조제)과 가까운 분자량을 나타냈다(도 2-B).

[ 참고예 2]

콘드로이친황산 패밀리(시약 특급품)의 A, B, C, D 및 Ｅ형(CSA, CSB, CSC, CSD 및 CSE), 헤파란황산(HS) 및 케라탄황산(KS)을 생화학공업(주)에서 구입하고, 상기 방법으로 아질산 분해하고, 상기의 방법으로 HPLC를 실시하고, 아질산 분해 전후의 분자량변화를 확인했다(도 3, 점선에서 좌측). 그 결과, 콘드로이친황산 패밀리 및 KS에 대해서, 2당 단위의 피크 시프트를 동반하는 분해 및 저분자화는 확인되지 않았다. 한편, HS는 2당 단위의 피크 시프트를 동반하는 분해 및 저분자화가 확인되었다(도 3, 점선에서 우측).

참고예 1 및 2의 결과로부터, 과황산화 콘드로이친황산(OSCS) 및 콘드로이친황산 패밀리(CSA, CSB, CSC, CSD 및 CSE)는 아질산 분해 저항성이고, 한편, 헤파란황산(HS)은 아질산 분해에 의해 분해되는 것임을 알았다.

[ 실시예 1]

시료로서, 다른 뮤코폴리새커라이드(주로 헤파란황산/콘드로이친황산 B/콘드로이친황산 C)을 함유하는 미분획 헤파린(Na염, UFN-SP, C사 제품, 로트No.1035-0792)(500g)을 10ℓ 화학 중공탱크에 정량하고, 생리식염액(일본약전적합품)을 첨가해서 5ℓ로 했다(pH6.0). 이 용액에, 에탄올(2.5ℓ; Wako Junyaku사, 시약 특급품)을 첨가해서 교반한 후, 실온(25℃)에서 24시간 이상 스탠딩했다(에탄올 분획). 콜로이드상 침전물(하층)과 상청액(상층)의 2층으로 분배된 것을 확인한 후, 상청액을 30ℓ 화학 중공탱크로 옮겨서 에탄올(20ℓ)을 첨가해서 격렬하게 교반했다. 콜로이드상 침전물을 30ℓ 화학 중공탱크로 옮겨서 생리식염액(3ℓ)을 첨가해서 교반한 후, 에탄올(20ℓ)을 첨가해서 격렬하게 교반했다. 각각의 처리 후, 24시간 스탠딩했다. 양쪽의 탱크 바닥에 침전한 백색 석출물을 각각 부흐너 깔때기 상에서 회수한 후, 에탄올로 세정하고, 5산화 인 존재 하, 실온에서 24시간 감압 건조했다. 최종적으로 콜로이드상 침전물로부터 418.2g의 백색분말을 회수(회수율83.6%)했다.

상기 UFN-SP에 대해서, 에탄올 분획 전, 에탄올 분획 후의 상층(상청액) 및 하층(콜로이드상 침전물)에 포함되는 물질의 분포를 상기 HPLC법으로 확인했다. 그 결과를 도 1에 나타낸다.

또, 수득된 생성물을 상기 방법으로 아질산 분해하고, 아질산 분해 전후의 생성물 중 에 포함되는 물질(헤파린 및 아질산 분해 저항성 불순물)의 양을, 상기 방법으로 HPLC를 실시하고, 용출시간 10∼20분 의 사이에 나타난 피크의 총면적으로 산출했다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.

[ 비교예 1]

상기 UFN-SP를 상기 방법으로 아질산 분해했다. 아질산 분해의 전후의 시료 중에 포함되는 물질의 분포를 상기 HPLC법으로 확인했다. 또, 아질산 분해 전후의 생성물 중에 포함되는 물질(헤파린 및 아질산 분해 저항성 불순물)의 양을, 상기 방법으로 HPLC를 실시하고, 용출시간 10∼20분 사이에 나타난 피크의 총면적으로 산출했다.그 결과를 표 1에 나타낸다.

[ 비교예 2∼7]

¹H-NMR법을 사용한 시험에 있어서 OSCS유래의 신호가 육안상 미검출 혹은 헤파린의 13C유래의 새틀라이트 신호가 아닌 것이 확인된 Na염 5시료(UFN1∼5) 및 Ca염 1시료(UFC)를, 상기 방법으로 아질산 분해했다. 아질산 분해의 전후의 시료 중에 포함되는 물질의 분포를 상기 HPLC법으로 확인했다(도 4 및 5). 또, 아질산 분해 전후의 생성물 중에 포함되는 물질(헤파린 및 아질산 분해 저항성 불순물)의 양을, 상기 방법으로 HPLC를 실시하고, 용출시간 10∼20분 사이에 나타난 피크의 총면적으로 산출했다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.

[ 실시예 2∼7]

상기 비교예 1∼6과 동일한 시료에 대해서, 실시예 1과 마찬가지로, 에탄올 분획을 실시했다. 이어서, 수득된 각 생성물을, 상기 방법으로 아질산 분해했다. 아질산 분해의 전후의 시료 중에 포함되는 물질의 분포를 상기 HPLC법으로 확인했다(도 6 및 7). 또, 아질산 분해 전후의 생성물 중에 포함되는 물질(헤파린 및 아질산 분해 저항성 불순물)의 양을, 상기 방법으로 HPLC를 실시하고, 용출시간 10∼20분 사이에 나타난 피크의 총면적으로 산출했다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.

Claims

염화나트륨 및 아세트산 나트륨으로부터 선택되는 염이 50∼500mM의 농도로 용해되어 있는 5∼30중량%의 헤파린 수용액으로서, 상기 헤파린이 아질산 분해 저항성 불순물을 함유하고, 상기 아질산 분해 저항성 불순물이 pH 1.0∼7.0, 반응온도 -10∼40℃, 반응시간 0.5∼60분, 헤파린 1g에 대한 아질산의 사용량 10∼1000mg의 조건하에서 헤파린을 분해 후에 HPLC로 분석한 경우, 아질산 분해전의 헤파린의 용출위치에 대응하는 위치에 용출되는 아질산 분해 저항성 불순물을 함유하는 헤파린 수용액에 대해서, 0.2∼1배량(체적)의 에탄올을 혼합하고, 헤파린을 함유하는 콜로이드상 침전물을 얻는 것을 포함하는 헤파린의 제조방법.
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제1항에 있어서, 헤파린의 분자량이 3000∼30000달톤의 범위 내에 있는 헤파린의 제조방법.
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염화나트륨 및 아세트산 나트륨으로부터 선택되는 염이 50∼500mM의 농도로 용해되어 있는 5∼30중량%의 헤파린 수용액으로서, 상기 헤파린이 아질산 분해 저항성 불순물을 함유하고, 상기 아질산 분해 저항성 불순물이 pH 1.0∼7.0, 반응온도 -10∼40℃, 반응시간 0.5∼60분, 헤파린 1g에 대한 아질산의 사용량 10∼1000mg의 조건하에서 헤파린을 분해 후에 HPLC로 분석한 경우, 아질산 분해전의 헤파린의 용출위치에 대응하는 위치에 용출되는 아질산 분해 저항성 불순물을 함유하는 헤파린 수용액에 대해서, 0.2∼1배량(체적)의 에탄올을 혼합하고, 헤파린을 함유하는 상청액을 얻는 것을 포함하는 헤파린의 제조방법.
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제7항에 있어서, 헤파린의 분자량이 1500∼12000달톤의 범위 내에 있는 헤파린의 제조방법.
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