CN114921495A - 一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法及应用 - Google Patents

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吴金恩
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Abstract

一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，将编码完整的猪瘟病毒结构蛋白的基因通过重组载体分别转染哺乳动物细胞，或将编码完整的猪瘟病毒结构蛋白的基因构建到杆状病毒载体上，繁殖出重组载体杆状病毒P3代病毒，并分别感染昆虫细胞，在体外成功表达出重组猪瘟病毒样颗粒疫苗，将其命名为CSFVVLPs，以其作为抗原免疫动物，能够刺激机体产生抗猪瘟病毒的特异性抗体，所获得的重组猪瘟病毒样颗粒疫苗CSFVVLPs作为预防猪瘟的新型抗原。

Description

一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法及应用，属于免疫学和动物基因工程疫苗技术领域。
背景技术
猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fevervirus，CSFV)引起猪的一种急性、烈性传染病。猪瘟病毒粒子是呈球形的衣壳表面包裹着囊膜蛋白的结构，直径约为40～70nm，囊膜蛋白表面有不规则的微纤突。CSFV基因组为单股正链RNA，具有感染性，大小约12.3kb，含有一个开放式阅读框架(ORF)，编码约3898个氨基酸残基的多聚前体蛋白，在宿主蛋白酶和自身编码的特异性蛋白酶共同作用下，多聚前体蛋白被加工为11～12种成熟的蛋白，从N端到C端顺序依次为：Npro(丝氨酸样木瓜蛋白酶)、核衣壳蛋白(C，14.3kDa)和3个囊膜糖蛋白Erns(或E0，gp42～gp48)、E1(gp22～33)、E2(gp53～55)，同时至少还编码7个非结构蛋白P7、NS2、NS3、NS4/ANS4B、NS5A和NS5B，其中，C、Ems、E1、E2组成病毒粒子的空间拓扑结构,是刺激机体产生抗病毒免疫反应的主要抗原蛋白。C可能是宿主细胞免疫反应的重要靶蛋白；Ems是CSFV的一个重要免疫原性蛋白，可诱导猪产生抗CSFV的中和抗体，抵抗致死剂量CSFV强毒株攻击；E1深埋在病毒的囊膜中，E1/E2复合物可能是起稳定病毒颗粒构型的功能；E2是CSFV最主要囊膜糖蛋白和抗原蛋白，体外重组E2抗原可诱导猪体产生高水平的中和抗体，保护免疫猪抵抗致死剂量强毒攻击。
病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)是一类新型的重组疫苗构型，VLP病毒的一种或多种蛋白构成，无病毒核酸成份，无感染性，不能自主复制，无散毒和毒力返强的风险，其拓扑结构和免疫原性与亲本病毒粒子几乎完全一致，能够替代全病毒类疫苗抗原用于疫病预防。
但目前，关于猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗在体外重组表达的相关研究未见报道。
发明内容
本发明目的之一是提供一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，将编码完整CSFV的结构蛋白基因通过重组载体分别转染至真核细胞，在体外成功表达出重组猪瘟病毒样颗粒疫苗。
本发明目的之二是提供一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗在制备免疫预防猪瘟病毒疫苗制剂中的应用。
本发明所采用的技术方案为：
一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，将编码完整的猪瘟病毒结构蛋白的基因通过重组载体转染哺乳动物细胞，或将编码完整的猪瘟病毒结构蛋白的基因构建到杆状病毒载体上，繁殖出重组载体杆状病毒P3代病毒，并感染昆虫细胞，在体外成功表达出重组猪瘟病毒样颗粒疫苗，将其命名为CSFV VLPs，以其作为抗原免疫动物，能够刺激机体产生抗猪瘟病毒的特异性抗体，所获得的重组猪瘟病毒样颗粒疫苗CSFV VLPs作为预防猪瘟的新型抗原。
所述猪瘟病毒结构蛋白的基因为C、E0、E1、E2，将其命名为E3,获得重组猪瘟病毒疫苗株结构蛋白基因C-E3和猪瘟病毒石门株结构蛋白基因S-E3的质粒。
所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞-K1即CHO-K1细胞、人胚胎肾细胞293株即HEK293细胞。
所述昆虫细胞为sf9细胞、sf21细胞、High Five细胞。
一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，将猪瘟病毒疫苗株结构蛋白基因质粒C-E3和猪瘟病毒石门株结构蛋白基因质粒S-E3的基因构建到杆状病毒载体上，分别繁殖出重组载体杆状病毒P3代病毒，并分别感染昆虫细胞系sf9细胞、sf21细胞、High Five细胞，在体外表达出重组猪瘟病毒样颗粒疫苗CSFV VLPs的具体步骤如下：
1)、材料
Bac-to-Bac donor质粒，DH10Bac感受态细胞，含有杆粒和helper的DN10Bac细胞，E.coli pFastBacTM菌株，昆虫细胞系Sf21细胞、Sf9细胞、High Five细胞，LB平板：Kan，Gen,Tetracycline，Bluo-gal和IPTG，SOC培养基，重组猪瘟病毒疫苗株结构蛋白基因C-E3质粒和重组猪瘟病毒石门株结构蛋白基因S-E3质粒；
2)、构建重组质粒
2.1置DH10Bac感受态细胞与冰上缓慢解冻；
2.2将100ulDH10Bac感受态细胞倒入预冷的15ml管，轻轻地混合；
2.3向感受态细胞中分别加入5ng的重组猪瘟病毒疫苗株结构蛋白基因C-E3质粒和重组猪瘟病毒石门株结构蛋白基因S-E3质粒，轻轻混合，冰上抚育30分钟；
2.4 42℃热激45秒，立即冰上降温2分钟，随后加入900ul室温的SOC培养基，pFastBac转化:37℃，225转震荡培养4小时；
2.5用SOC培养基对pFastBac转化产物做10倍连续稀释，每个稀释℃吸取100ul铺一个LB平板：50ug/mlKan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline，100ug/ml Biuo-gal，40ug/ml IPTG，
2.6 37℃孵育培养48小时，蓝白斑分析筛选的克隆；
2.7鉴定阳性克隆：挑10个白色克隆，重新划线在新鲜LB平板(50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline，100ug/ml Biuo-gal，40ug/ml IPTG)，37℃过夜培养；在包含Bluo-Gal和IPTG的重新划线平板上选出阳性的白色单克隆，转接新的LB(50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline)的液体培养基中；
2.8提取质粒和鉴定，按照InvitrogenTM的PureLinkTMHiPure质粒大提试剂盒抽提重组质粒DNA说明书提取质粒；利用PCR方法鉴定阳性克隆；
2.8.1使用M13引物进行PCR分析:
M13 Forward(-40)5'd[GTTTTCCCAGTCACGAC]3'；
M13 Reverse 5'd[CAGGAAACAGCTATGAC]3DNA；
2.8.2在0.5ml PCR管中加入50ul PCR反应体系
Figure BDA0003695568750000021
2.8.3 PCR扩增程序，预变性93℃3min；变性94℃45s，退火55℃45s，延伸72°5min，35循环，延伸72°7min，从反应产物吸取5-10ul进行琼脂糖电泳分析；
3)、制备重组杆状病毒
3.1制备P1代杆状病毒
3.1.1在6孔板或35mm组织培养板，每个孔中接种9X105 Sf9细胞：50IU/ml青霉素和50ug/ml链霉素，置27℃温箱吸附1小时，倒置显微镜观察吸附情况；
3.1.2转染1：100ul Opti-MEM无血清培养基加入1ug纯化杆粒DNA中，轻轻混匀，室温静置5min；转染2：6ul细胞转染试剂与50ul Opti-MEM无血清培养基轻轻混匀，室温静置5min，将转染1和转染2两者混匀，室温抚育15-45分钟；
3.1.3从细胞中除去培养基，并用2ml无血清Opti-MEM培养基冲洗后弃去清洗培养，将混合体加入到细胞培养孔中；
3.1.4 27℃培养5小时，弃去DNA/脂质体混合物，向细胞中加入2ml含有抗生素的昆虫细胞完全培养基；
3.1.5 27℃湿润条件孵育72小时，观察细胞形态的变化特点，提取P1代病毒株；
3.1.6转染后，每隔24小时观察细胞变化，转染后72小时细胞直径最大，并且开始脱落，收集P1代病毒；转入15ml离心管，500g离心5分钟除去细胞和大的碎片，分装1ml/管，此为杆状病毒P1代病毒，4℃避光保存或-80℃保存；
3.2制备P2代病毒株
向2X106细胞/孔的Sf9或Sf21细胞中加入200微升P1代病毒株，27℃湿润条件下培养细胞72小时，从每个孔收集2ml含有病毒的培养基，转到15ml的管子；500g离心5分钟弃去细胞和碎片，分装1ml/管，此为P2代病毒，-80℃保存；
3.3制备P3代病毒株
向2X106细胞/孔Sf9或Sf21细胞中加入100微升P2毒株，27℃湿润条件培养下孵育细胞72小时，从每个孔收集2ml含有病毒培养基，转到15ml的管子；500g离心5分钟弃去细胞和碎片；分装1ml/管，此为P3代病毒，用于感染昆虫细胞系作为制备CSFV VLPs的种毒，-80℃保存；
4)、最佳表达蛋白接毒剂量和收获时间
4.1 P3代毒接种剂量与CSFV VLPs产量：准备Sf9或Sf21细胞和6孔细胞板，2X106细胞/孔，细胞室温培养1小时；1小时后倒置显微镜检查细胞的吸附情况。吸取P3代毒株0.5ml、0.75ml和1.0ml加入6孔板中，分别滴加6孔板，27℃湿润条件下培养；从每个孔收集2ml含有病毒的培养基和细胞，鉴定表达水平；利用抗猪瘟病毒特异性抗体建立的双抗体夹心ELISA检测获得的CSFV VLPs的反应活性；接种1.0ml的P3代毒于Sf9细胞，获得CSFV VLPs吸光℃值与接种0.5ml体积P3代毒之间差异最为显著，当目的与0.75ml差异不显著，为了获得较为稳定的目的蛋白产量，确定1.0ml体积P3代毒为最佳接种剂量；
4.2 P3代毒接种昆虫细胞收获CSFV VLPs的时间：用1.0ml的P3代毒接种Sf9细胞，在，在感染后48小时、72小时和96小时，从每个孔收集2ml含有病毒的培养基上清和细胞，鉴定表达水平。
一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，将编码完整的猪瘟病毒结构蛋白的基因C、E0、E1、E2，将其命名为E3，通过重组载体分别转染至中国仓鼠卵巢细胞-K1即CHO-K1细胞、人胚胎肾细胞293株即HEK293细胞中制取重组猪瘟病毒样颗粒疫苗CSFV VLPs的方法如下：
1)、材料
获得编码猪瘟结构蛋白基因的方法
猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株，其细胞源为PK-15细胞，通过RT-PCR的方式获得从编码蛋白酶N至NS2目的基因片段，并与GenBank登录的CAA86367，AY805221，AY382481序列进行比较，确定获得目的基因序列的正确性；
1.2克隆菌株：大肠杆菌E.coli感受态细胞DH5α和Top10；
1.3哺乳动物细胞系：HEK293细胞和CHO-K1细胞；
1.4培养方式：有血清培养基或无血清培养基，贴壁培养或悬浮培养；
1.5表达载体：pcDNA3.1，pcDNA3.4及包含有SV40和CMV启动子的真核表达载体；
1.6转染方式：聚醚酰亚胺Polyetherimide，PEI，脂质体2000，脂质体3000，电转化；
2)、构建重组表达载体
设计扩增猪瘟病毒兔化弱毒疫苗基因的N端蛋白酶至NS2基因片段，克隆出核衣壳蛋白C、囊膜蛋白E1、Ems、E2基因，克隆到pUB322载体，转化E.coli的Top10菌株；根据载体pcDNA3.4多克隆位点的序列特征，设计无缝克隆引物上游引物E3F和下游引物E3R，扩增用于构建表达质粒，引物序列如下：
E3F：GCGGTACCGAGCTCGGATATGTCCGATGATGGCGC，
E3R：CCTTGAATTCCTCGACTAACCAGCGGCGAGTTGTTCTGTTAG；
分别用无缝克隆引物E3F和E3R扩增目的基因，切胶回收，分别加入无缝克隆试剂和目的片断，充分混匀，16℃水浴3h，转化E.coli感受态细胞DH5α，无菌条件下涂在LB：100μg/mL Amp+琼脂平板上,37℃培养16h，挑取白色菌落接种3mL LB：100μg/mL Amp+培养液中，37℃条件下220r/min培养16h，用上下游引物进行PCR鉴定，分别扩增得到目的基因片段；将鉴定阳性的菌落扩增后，用去内毒素质粒大提试剂盒提取质粒，将该重组质粒命名为C-E3，测定质粒浓度转染细胞；
3)、真核细胞转染
3.1增殖CHO-K1细胞:
光学显微镜先观察25cm2细胞瓶中CHO-K1细胞状态良好，待贴壁率达到90％左以上时，弃去培养溶液，DMEM培养液洗涤细胞3次，随后缓慢加入0.25％胰酶溶液，放入5％CO2培养箱孵育3～5min，显微镜观察细胞被彻底消化后，加入F-12K(10％FBS)培养基，中和胰酶，800rpm/min离心5min，弃上清；用F-12K，10％犊牛血清，培养基重悬细胞，轻轻吹打细胞8～10次，分散成单个细胞，随后以30％密度接种于直径100mm细胞培养皿中，待细胞融合程度达到60％～70％时进行转染；
3.2瞬时转染:
1mL PEI：1.0μg/μL，MW25kDa中加入20μg重组C-E3质粒，混匀，室温静置10min，加入2.5mL F-12K培养基，轻轻混匀，小心滴加到CHO-K1细胞表面，5.0％CO2，37℃孵育2h，弃去多余液体，重新加入10mL维持液：F-12K，2.0％犊牛血清培养基继续培养72h～120h后，收集培养上清1000rpm离心10min，弃去沉淀，4000rpm转速离心15min，收集上清，保存于-70℃，得重组CSFV VLPs。
一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的应用，在制备免疫预防猪瘟病毒疫苗制剂中的应用。
本发明制备的猪瘟病毒样颗粒疫苗(VLPs)是利用真核细胞，包括中国仓鼠卵巢细胞-K1(CHO-K1)、人胚胎肾细胞293株(HEK293)、昆虫细胞系(sf9细胞、sf21和High Five细胞)获得的。透射电镜(TEM)观察发现，细胞内和细胞培养上清中均能观察到与天然猪瘟病毒拓扑结构相同的病毒粒子，其为“膜包裹衣壳”的“中空”结构，不存在病毒核酸。免疫印迹试验、酶联免疫吸附试验和兔体免疫试验证实，病毒样颗粒抗原具有亲本CSFV粒子一样的形态结构和免疫功能。本发明符合国家提出的有效防控重大动物疫病的重大需求，为猪瘟的净化和根除提供高效的新型基因工程疫苗。
附图说明
图1为本发明实施例1的免疫印迹(WB)试验检测不同时间点CSFV VLPs中的E2蛋白的表达量；
图中：M：蛋白质标准分子量，从上到下kDa,130，100,70,55，40,35,25,15；
1.感染后48小时；2.感染后72小时；3.感染后96小时
图2为本发明实施例1所得的CSFVVLPs的磷钨酸负染的透射电镜图；
图中：A：负染CSFV VLPs；B、C和D，收获培养上清经20％和60％蔗糖35000rpm/min超速离心处理3h，磷钨酸负染；
图3为本发明实施例1所得的CSFV VLPs的免疫透射电镜图，CSFV VLPs大小在40nm-60nm；
图4为本发明实施例2中PCR鉴定猪瘟病毒疫苗株目的基因E3；
图5为本发明实施例2中免疫印迹鉴定CHO-K1细胞表达的目的蛋白；
图6为本发明实施例2中IFA鉴定CHO-K1细胞表达的重组CSFV VLPs目的蛋白；
图7为本发明实施例2中TEM观察CHO-K1细胞表达的CSFV VLPs结果(负染法)；
图8为本发明实施例2中CSFV VLPs家兔免疫试验血清抗体消长检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步详细说明。
一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，将编码完整的猪瘟病毒结构蛋白的基因通过重组载体转染哺乳动物细胞，或将编码完整的猪瘟病毒结构蛋白的基因构建到杆状病毒载体上，繁殖出重组载体杆状病毒P3代病毒，并感染昆虫细胞，在体外成功表达出重组猪瘟病毒样颗粒疫苗，将其命名为CSFV VLPs，以其作为抗原免疫动物，能够刺激机体产生抗猪瘟病毒的特异性抗体，所获得的重组猪瘟病毒样颗粒疫苗CSFV VLPs作为预防猪瘟的新型抗原。
所述猪瘟病毒结构蛋白的基因为C、E0、E1、E2，将其命名为E3、获得重组猪瘟病毒疫苗株结构蛋白基因C-E3和猪瘟病毒石门株结构蛋白基因S-E3的质粒。
所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞-K1即CHO-K1细胞、人胚胎肾细胞293株即HEK293细胞。
所述昆虫细胞为sf9细胞、sf21细胞、High Five细胞。
实施例1，一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，分别将猪瘟病毒疫苗株结构蛋白基因C-E3和猪瘟病毒石门株结构蛋白基因S-E3构建到杆状病毒载体上，繁殖出重组载体杆状病毒P3代病毒，并分别感染昆虫细胞系sf9细胞、Sf21细胞或High Five细胞，在体外表达出重组猪瘟病毒样颗粒疫苗CSFV VLPs的具体步骤如下：
1、材料
Bac-to-Bac donor质粒，DH10Bac感受态细胞，DN10Bac细胞(含有杆粒和helper)，E.coli pFastBacTM菌株，昆虫细胞sf9细胞、sf21细胞、High Five细胞，LB平板(Kan，Gen,Tetracycline，Bluo-gal)和IPTG，SOC培养基，重组猪瘟病毒疫苗株结构蛋白基因C-E3质粒，重组猪瘟病毒石门株结构蛋白基因S-E3质粒；
2、构建重组质粒
2.1置DH10Bac感受态细胞与冰上缓慢解冻；
2.2将100ulDH10Bac感受态细胞倒入预冷的15ml管，轻轻地混合；
2.3向感受态细胞中分别加入5ng的重组猪瘟病毒疫苗株结构蛋白基因C-E3质粒和猪瘟病毒石门株结构蛋白基因S-E3质粒，轻轻混合，冰上孵育30分钟；
2.4 42℃热激45秒，立即冰上降温2分钟，随后加入900ul室温的SOC培养基，pFastBac转化:37℃，225转震荡培养4小时；
2.5用SOC培养基对pFastBac转化产物做10倍连续稀释，每个稀释℃吸取100ul铺一个LB平板(50ug/mlKan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline，100ug/ml Biuo-gal，40ug/ml IPTG)；
2.6 37℃孵育培养48小时，蓝白斑分析筛选的克隆；
2.7鉴定阳性克隆：挑10个白色克隆，重新划线在新鲜LB平板(50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline，100ug/ml Biuo-gal，40ug/ml IPTG)，37℃过夜培养；在包含Bluo-Gal和IPTG的重新划线平板上选出阳性的白色单克隆，转接新的LB(50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，10ug/ml tetracycline)液体培养基中；
2.8提取质粒和鉴定，按照InvitrogenTM的PureLinkTMHiPure质粒大提试剂盒抽提重组质粒DNA说明书提取质粒；利用PCR方法鉴定阳性克隆；
2.8.1使用M13引物进行PCR分析:
M13 Forward(-40)5'd[GTTTTCCCAGTCACGAC]3'；
M13 Reverse 5'd[CAGGAAACAGCTATGAC]3 DNA
2.8.2在0.5ml PCR管中加入50ul PCR反应体系
Figure BDA0003695568750000061
2.8.3 PCR扩增程序，预变性93℃3min；变性94℃45s，退火55℃45s，延伸72°5min，35循环，延伸72°7min，从反应产物吸取5-10ul进行琼脂糖电泳分析。
3、制备重组杆状病毒
3.1制备P1代杆状病毒
3.1.1在6孔板或35mm组织培养板，每个孔中接种9X105Sf9细胞：50IU/ml青霉素和50ug/ml链霉素，置27℃温箱吸附1小时，倒置显微镜观察吸附情况；
3.1.2转染1：100ul Opti-MEM无血清培养基加入1ug纯化杆粒DNA中，轻轻混匀，室温静置5min；转染2：6ul细胞转染试剂与50ul Opti-MEM无血清培养基轻轻混匀，室温静置5min，将转染1和转染2两者混匀，室温抚育15-45分钟；
3.1.3从细胞中除去培养基，并用2ml无血清Opti-MEM培养基冲洗后弃去清洗培养，将混合体加入到细胞培养孔中；
3.1.4 27℃培养5小时，弃去DNA/脂质体混合物，向细胞中加入2ml昆虫细胞完全培养基(含有抗生素)；
3.1.5 27℃湿润条件孵育72小时，观察细胞形态的变化特点，提取P1代病毒株；
3.1.6转染后，每隔24小时观察细胞变化，转染后72小时细胞直径最大，并且开始脱落，收集P1代病毒；转入15ml离心管，500g离心5分钟除去细胞和大的碎片，分装1ml/管，此为杆状病毒P1代病毒，4℃避光保存或-80℃保存。
3.2制备P2代病毒株
向2X106细胞/孔的sf9细胞或Sf21细胞中加入200微升P1代病毒株，27℃湿润条件下培养细胞72小时，从每个孔收集2ml含有病毒的培养基，转到15ml的管子；500g离心5分钟弃去细胞和碎片，分装1ml/管，此为P2代病毒，-80℃保存；
3.3制备P3代病毒株
向2X106细胞/孔sf9细胞或Sf21细胞中加入100微升P2毒株，27℃湿润条件培养下孵育细胞72小时，从每个孔收集2ml含有病毒培养基，转到15ml的管子；500g离心5分钟弃去细胞和碎片；分装1ml/管，此为P3代病毒，用于感染昆虫细胞系作为制备CSFV VLPs的种毒，-80℃保存；
4、最佳表达蛋白接毒剂量和收获时间
4.1 P3代毒接种剂量与CSFV VLPs产量：准备sf9细胞、Sf21细胞或High Five细胞和6孔细胞板，2X106细胞/孔，细胞室温培养1小时；1小时后倒置显微镜检查细胞的吸附情况。吸取P3代毒株0.5ml、0.75ml和1.0ml加入6孔板中，分别滴加6孔板，27℃湿润条件下培养；从每个孔收集2ml含有病毒的培养基和细胞，鉴定表达水平；利用抗猪瘟病毒特异性抗体建立的双抗体夹心ELISA检测获得的CSFV VLPs的反应活性；检测结果如表1所示，接种1.0ml的P3代毒于Sf9细胞，获得CSFV VLPs吸光℃值与接种0.5ml体积P3代毒之间差异最为显著，当目的与0.75ml差异不显著，为了获得较为稳定的目的蛋白产量，确定1.0ml体积P3代毒为最佳接种剂量。
表1双抗体夹心ELISA分析不同剂量P3代毒接种Sf9细胞CSFV VLPs产量
Figure BDA0003695568750000071
4.2 P3代毒接种昆虫细胞收获CSFV VLPs的时间：用1.0ml的P3代毒接种Sf9细胞，在感染后48小时、72小时和96小时，从每个孔收集2ml含有病毒的培养基上清和细胞，鉴定表达水平。免疫印迹结果显示(图1)，感染后96小时，检测的CSFV E2蛋白条带最量，将感染后96小时作为收获CSFV VLPs最佳时间。
5、透射电镜观察重组CSFV VLPs
5.1透射电镜观察。收获感染96小时的细胞培养上清经20％和60％蔗糖35,000rpm/min超速离心处理3h，磷钨酸负染，透射电镜观察到直径30-60nm大小囊膜包衣壳的病毒样颗粒结构，病毒粒子周围能发现典型的囊膜负染区域(如图2,A)，不同倍数的视野下均能观察到类似的病毒样颗粒结构(图2,B.C和D)，初步判断成功获得重组猪瘟病毒样颗粒产物。
5.2免疫电镜鉴定重组CSFV VLPs
将步骤5.1收获的超离产物稀释100倍，加入1︰1000稀释的CSFV抗血清，4℃过夜孵育，15，000rpm离心30分钟，吸取沉淀制作电镜观察样品，透射电镜观察发现。如图3所示，负染样品病毒样颗粒大小约为60nm，外侧边缘较为模糊，直径变大，是周围吸附了一层抗体分子所致，说明该颗粒能够与抗CSFV的特异性抗血清发生结合，进一步证实电镜观察到的病毒样颗粒结构为特异的猪瘟病毒样颗粒。我们利用昆虫细胞在体外成功组装出猪瘟的病毒样颗粒。
5.3蔗糖梯度离心纯化重组CSFV VLPs
具体方法：制备20％和60％浓℃蔗糖垫，35000rpm/min超速离心处理3h，1ml/管收集样品，用双抗体夹心法检测抗原的分布特点，检测结果发现目的蛋白主要集中在第2.3和4管中，第5管中也有少量目的蛋白(表2)。
表2制备20％和60％浓度蔗糖梯度纯化重组CSFV VLPs
Figure BDA0003695568750000081
6、重组CSFV VLPs动物免疫试验
6.1小鼠免疫试验
(1)免疫方案。201佐剂乳化CSFV VLPs抗原(表3中用E3表示CSFVVLPs免疫抗原)，15ug/只接种BALB/c，设1只PBS对照小鼠后肢肌肉接种，每隔7天采血，直至免疫后21天，
(2)检测方法。检测CSFV特异性抗体。采用间接ELISA方法检测抗体。方法简述，2000倍稀释包被重组表达E2抗原，100μl/孔，过夜包被，1×PBST(0.5％Tween 20，pH 7.2)洗涤4次，小鼠血清用1×PBST做1∶20，1∶40，1∶80，1∶160倍稀释，100μl/孔，37℃孵育45min，弃去孔内液体，1×PBST洗涤4次，加入羊抗鼠1：1000稀释的HRP-IgG，37℃孵育45min，弃去孔内液体，1×PBST洗涤4次，加入100μl/孔TMB避光室温孵育12min，加100μl/孔2M H2SO4终止液，450nm波长下读取吸光度值(OD450)。
(3)结果统计。表3结果表明，所有实验组小鼠血清稀释度测的OD值呈稳定的线性关系。免疫后一周，S2组小鼠血清抗体在1∶160稀释时，OD450值为1.322；S10组小鼠在免疫后3周，血清抗体在1∶160稀释时OD450值为0.776；PBS对照组OD450＜0.2。小鼠免疫结果说明，CSFV VLPs抗原能够刺激小鼠免疫系统产生抗CSFV E2蛋白的特异性抗体，该抗原具有良好的免疫原性。
Figure BDA0003695568750000091
6.2家兔免疫试验
(1)免疫和检测计划。201佐剂乳化CSFV VLPs抗原，23ug/只接种3只SPF级新西兰大白兔，设1只重组E2抗原对照，1只空白对照，后腿肌肉内侧和背部皮下分点注射，每隔7天采血，分离血清，阻断ELISA方法检测猪瘟病毒血清抗体。
(2)检测结果。抗原接种后7天所有CSFV VLPs免疫家兔抗体均转为阳性(判断标准：阻断率≥40％为阳性，阻断率≤30％为阴性，介于两者之间为可疑)，免疫后42天抗体依然保持阳性(表4)，对照组血清抗体阻断率始终＜30％，而已知免疫原性的阳性对照E2抗原的抗体阻断率在免疫后7天为73％，判定为阳性。本实验结果说明重组CSFV VLPs能够刺激家兔产生针对猪瘟病毒的特异性抗体。
表4 CSFV VLPs免疫实验兔血清抗体检测结果
Figure BDA0003695568750000092
实施例2，一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，将编码完整的猪瘟病毒结构蛋白基因C、E0、E1、E2，将其命名为E3，通过重组载体分别转染至中国仓鼠卵巢细胞-K1即CHO-K1细胞、人胚胎肾细胞293株即HEK293细胞中制取猪瘟病毒样颗粒疫苗CSFV VLPs的方法如下：
1.材料
1.1获得编码猪瘟结构蛋白基因的方法
猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株(细胞源，PK-15细胞)，通过RT-PCR的方式获得从编码蛋白酶N至NS2目的基因片段，并与GenBank登录的CAA86367，AY805221，AY382481等序列进行比较，确定获得目的基因序列的正确性；
1.2克隆菌株：大肠杆菌E.coli感受态细胞DH5α和Top10；
1.3哺乳动物细胞系：HEK293细胞和CHO-K1细胞；
1.4培养方式：有血清培养基或无血清培养基，贴壁培养或悬浮培养；
1.5表达载体：pcDNA3.1，pcDNA3.4及包含有SV40和CMV启动子的真核表达载体；
1.6转染方式：聚醚酰亚胺Polyetherimide，PEI，脂质体2000，脂质体3000，电转化；
1.7仪器设备：透射电子显微镜，激光共聚焦扫描显微镜，倒置荧光显微镜，酶标仪，PCR仪，常温离心机，低温离心机；
1.8其余试验材料为常规材料。
2.构建重组表达载体
重组载体构建和鉴定参照《分子克隆实验指南(第四版中文版)，冷泉港实验室出版，贺福初、陈薇、杨晓明等翻译》所述的分子生物学实验技术进行。
设计扩增猪瘟病毒兔化弱毒疫苗基因的N端蛋白酶至NS2基因片段，克隆出核衣壳蛋白C、囊膜蛋白E1、Ems、E2基因，将其命名为E3，克隆到pUB322载体，转化E.coli的Top10菌株。根据载体pcDNA3.4多克隆位点的序列特征，设计无缝克隆引物上游引物E3F和下游引物E3R，扩增用于构建表达质粒，引物序列如下：
E3F：GCGGTACCGAGCTCGGATATGTCCGATGATGGCGC，
E3R：CCTTGAATTCCTCGACTAACCAGCGGCGAGTTGTTCTGTTAG；
分别用无缝克隆引物E3F和E3R扩增目的基因，切胶回收，分别加入无缝克隆试剂和目的片断，充分混匀，16℃水浴3h，转化E.coli感受态细胞DH5α，无菌条件下涂在LB(100μg/mL Amp+)琼脂平板上,37℃培养16h，挑取白色菌落接种3mL LB(100μg/mL Amp+)培养液中，37℃条件下220r/min培养16h，用上下游引物进行PCR鉴定，分别扩增得到目的基因片段；将鉴定阳性的菌落扩增后，用去内毒素质粒大提试剂盒提取质粒，将该重组质粒命名为C-E3，测定质粒浓度转染细胞；
3.真核细胞转染
以CHO-K1细胞系为例描述重组E3质粒的化学方法瞬时转染方式、转染过程、培养方式及表达蛋白的鉴定方式，其余HEK293和CHO细胞及其衍生细胞株的操作与之相同。
贴壁培养的HEK293瞬时转染方法与CHO-K1相同。
3.1增殖CHO-K1细胞:
光学显微镜先观察25cm2细胞瓶中CHO-K1细胞状态良好，待贴壁率达到90％左以上时，弃去培养溶液，DMEM培养液洗涤细胞3次，随后缓慢加入0.25％胰酶溶液，放入5％CO2培养箱孵育3～5min，显微镜观察细胞被彻底消化后，加入F-12K(10％FBS)培养基，中和胰酶，800rpm/min离心5min，弃上清；用F-12K，10％犊牛血清，培养基重悬细胞，轻轻吹打细胞8～10次，分散成单个细胞，随后以30％密度接种于直径100mm细胞培养皿中，待细胞融合程度达到60％～70％时进行转染。
3.2瞬时转染:
1mL PEI(1.0μg/μL，25kDa)中加入20μg重组C-E3质粒，混匀，室温静置10min，加入2.5mL F-12K培养基，轻轻混匀，小心滴加到CHO-K1细胞表面，5.0％CO2，37℃孵育2h，弃去多余液体，重新加入10mL维持液(F-12K，2.0％犊牛血清)培养基继续培养72h～120h后，收集培养上清1000rpm离心10min，弃去沉淀，4000rpm转速离心15min，收集上清，得重组CSFVVLPs，保存于-70℃。
4、重组VLP蛋白鉴定。
4.1免疫印迹鉴定重组蛋白
配制12％的SDS-PAGE蛋白电泳胶，取步骤3.2瞬时转染收集的上清，20μL/孔体积上样，未转染的上清液作为对照；湿转法转移蛋白条带与PVDF膜，加入封闭液(PBST，5％马血清，5％脱脂奶粉，pH7.2)，4℃封闭过夜，PBST反复洗涤4～5次；加入1∶1000猪瘟病毒抗体阳性血清，4℃封闭过夜孵育，PBST洗涤4～5次；1∶1000加入HRP标记兔抗猪二抗，37℃孵育2h；PBST洗涤4～5次，用ECL试剂盒曝光显色，结果如图5所示。重组E3质粒转染的CHO-K1培养上清和细胞中能够观察到大小与预测一致的、特异性的C、E0和E2条带，说明重组目的蛋白在CHO-K1细胞中成功表达。
4.2间接免疫荧光(IFA)鉴定重组蛋白
按照步骤3.2的操作方法，在可用于激光共聚焦显微镜观察的细胞培养皿转染重组E3质粒，转染后120h轻轻用PBS溶液清洗细胞2次，弃净PBS溶液，每孔加入500μL体积4％的多聚甲醛，固定CHO-K1细胞30min，用PBST溶液充分洗涤4～5次，加入1.0‰浓度TritonX-100透化细胞5min，PBST洗涤4～5次，加入1:500倍稀释的猪瘟病毒抗体阳性血清，4℃封闭过夜孵育，PBST洗涤4～5次；1∶1000加入FITC标记的兔抗猪抗体作为二抗，37℃避光孵育2h；PBST洗涤4～5次，用激光共聚焦显微镜检测观察，结果如图6所示，CHO-K1细胞能够观察到特异性的绿色荧光，说明目的蛋白在CHO-K1细胞中成功表达。
4.3透射电子显微镜(TEM)观察VLP病毒样粒子(负染法)
用转染后120h细胞上清样品制备电镜样品。将上清3000rpm离心15min，去除细胞碎片，吸取10μL滴到铜网正面，吸附3min，用滤纸吸干多余液体，加20μL的PBS洗涤铜网，重复洗涤3次，最后一次用滤纸彻底吸干残存液体，加入2.0％磷钨酸，染色1min，彻底吸干残液，然后将铜网置于有多层滤纸的平皿中，干燥不少于12h，随后利用TEM观察。结果如图7所示。可观察到明显典型的病毒样粒子，直径大小在40-70nm左右，中间有六角形的衣壳结构，周围包裹囊膜，放大后能够看到囊膜表面有微纤突样结构，说明成功获得重组的猪瘟病毒样颗粒(CSFV VLPs)。
4.4重组猪瘟VLP抗原兔体免疫试验
将健康试验兔随机分为2组，206佐剂乳化CSFV VLPs 2只，PBS空白组1只，抗原，1ml/只，猪瘟CSFV VLPs(猪瘟VLP)组注射10μg/只；后腿内侧肌肉分点接种抗原，免疫1次。抗体监测。在免疫前0天(0d)采血，免疫后17d，24d采集血清，用IDEXX公司的猪瘟抗体检测试剂盒进行血清抗体检测。猪瘟CSFV VLPs组家兔在免疫后开始逐渐上升，免疫后10d时检测所有抗原免疫兔的抗猪瘟病毒的抗体阻断率＞40％，全部为阳性(判定标准：抗体阻断率≥40％为阳性，抗体阻断率＜30％为阴性，介于两者之间为可疑)。兔体免疫试验说明，CHO细胞表达的CSFV VLPs抗原能够刺激家兔产生抗猪瘟病毒蛋白的血清抗体，具有良好的免疫原性(图8)，能够作为疫苗用于猪瘟防控。

Claims (7)

1.一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，将编码完整的猪瘟病毒结构蛋白的基因通过重组载体转染哺乳动物细胞，或将编码完整的猪瘟病毒结构蛋白的基因构建到杆状病毒载体上，繁殖出重组载体杆状病毒P3代病毒，并感染昆虫细胞，在体外成功表达出重组猪瘟病毒样颗粒疫苗，将其命名为CSFV VLPs，以其作为抗原免疫动物，能够刺激机体产生抗猪瘟病毒的特异性抗体，所获得的重组猪瘟病毒样颗粒疫苗CSFV VLPs作为预防猪瘟的新型抗原。
2.根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，所述猪瘟病毒结构蛋白的基因为C、E0、E1、E2，将其命名为E3,获得重组猪瘟病毒疫苗株结构蛋白基因C-E3和猪瘟病毒石门株结构蛋白基因S-E3的质粒。
3.根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞-K1即CHO-K1细胞、人胚胎肾细胞293株即HEK293细胞。
4.根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，所述昆虫细胞为sf9细胞、sf21细胞、High Five细胞。
5.根据权利要求1或2或4所述的一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，将猪瘟病毒疫苗株结构蛋白基因质粒C-E3和猪瘟病毒石门株结构蛋白基因质粒S-E3的基因构建到杆状病毒载体上，分别繁殖出重组载体杆状病毒P3代病毒，并分别感染昆虫细胞系sf9细胞、sf21细胞、High Five细胞，在体外表达出重组猪瘟病毒样颗粒疫苗CSFVVLPs的具体步骤如下：
1)、材料
Bac-to-Bac donor质粒，DH10Bac感受态细胞，含有杆粒和helper的DN10Bac细胞，E.coli pFastBacTM菌株，昆虫细胞系Sf21细胞、Sf9细胞、High Five细胞，LB平板：Kan，Gen,Tetracycline，Bluo-gal和IPTG，S0C培养基，重组猪瘟病毒疫苗株结构蛋白基因C-E3质粒和重组猪瘟病毒石门株结构蛋白基因S-E3质粒；
2)、构建重组质粒
2.1置DH10Bac感受态细胞与冰上缓慢解冻；
2.2将100ulDH10Bac感受态细胞倒入预冷的15ml管，轻轻地混合；
2.3向感受态细胞中分别加入5ng的重组猪瘟病毒疫苗株结构蛋白基因C-E3质粒和重组猪瘟病毒石门株结构蛋白基因S-E3质粒，轻轻混合，冰上抚育30分钟；
2.442℃热激45秒，立即冰上降温2分钟，随后加入900ul室温的SOC培养基，pFastBac转化:37℃，225转震荡培养4小时；
2.5用SOC培养基对pFastBac转化产物做10倍连续稀释，每个稀释℃吸取100ul铺一个LB平板：50ug/mlKan，7ug/mlGentamicin，10ug/mltetracycline，100ug/ml Biuo-gal，40ug/ml IPTG，2.637℃孵育培养48小时，蓝白斑分析筛选的克隆；
2.7鉴定阳性克隆：挑10个白色克隆，重新划线在新鲜LB平板(50ug/ml Kan，7ug/mlGentamicin，10ug/mltetracycline，100ug/ml Biuo-gal，40ug/ml IPTG)，37℃过夜培养；在包含Bluo-Gal和IPTG的重新划线平板上选出阳性的白色单克隆，转接新的LB(50ug/mlKan，7ug/mlGentamicin，10ug/mltetracycline)的液体培养基中；
2.8提取质粒和鉴定，按照InvitrogenTM的PureLinkTM HiPure质粒大提试剂盒抽提重组质粒DNA说明书提取质粒；利用PCR方法鉴定阳性克隆；
2.8.1使用M13引物进行PCR分析:
M13 Forward(-40)5'd[GTTTTCCCAGTCACGAC]3'；
M13 Reverse 5'd[CAGGAAACAGCTATGAC]3DNA；
2.8.2在0.5ml PCR管中加入50ulPCR反应体系
Figure FDA0003695568740000021
加入38.5ul双蒸水补足总体积50ul；
2.8.3 PCR扩增程序，预变性93℃ 3min；变性94℃ 45s，退火55℃ 45s，延伸72° 5min，35循环，延伸72° 7min，从反应产物吸取5-10ul进行琼脂糖电泳分析；
3)、制备重组杆状病毒
3.1制备P1代杆状病毒
3.1.1在6孔板或35mm组织培养板，每个孔中接种9X105Sf9细胞：50IU/ml青霉素和50ug/ml链霉素，置27℃温箱吸附1小时，倒置显微镜观察吸附情况；
3.1.2转染1：100ul Opti-MEM无血清培养基加入1ug纯化杆粒DNA中，轻轻混匀，室温静置5min；转染2：6ul细胞转染试剂与50ul Opti-MEM无血清培养基轻轻混匀，室温静置5min，将转染1和转染2两者混匀，室温抚育15-45分钟；
3.1.3从细胞中除去培养基，并用2ml无血清Opti-MEM培养基冲洗后弃去清洗培养，将混合体加入到细胞培养孔中；
3.1.4 27℃培养5小时，弃去DNA/脂质体混合物，向细胞中加入2ml含有抗生素的昆虫细胞完全培养基；
3.1.5 27℃湿润条件孵育72小时，观察细胞形态的变化特点，提取P1代病毒株；
3.1.6转染后，每隔24小时观察细胞变化，转染后72小时细胞直径最大，并且开始脱落，收集P1代病毒；转入15ml离心管，500g离心5分钟除去细胞和大的碎片，分装1ml/管，此为杆状病毒P1代病毒，4℃避光保存或-80℃保存；
3.2制备P2代病毒株
向2X106细胞/孔的Sf9或Sf21细胞中加入200微升P1代病毒株，27℃湿润条件下培养细胞72小时，从每个孔收集2ml含有病毒的培养基，转到15ml的管子；500g离心5分钟弃去细胞和碎片，分装1ml/管，此为P2代病毒，-80℃保存；
3.3制备P3代病毒株
向2X106细胞/孔Sf9或Sf21细胞中加入100微升P2毒株，27℃湿润条件培养下孵育细胞72小时，从每个孔收集2ml含有病毒培养基，转到15ml的管子；500g离心5分钟弃去细胞和碎片；分装1ml/管，此为P3代病毒，用于感染昆虫细胞系作为制备CSFV VLPs的种毒，-80℃保存；
4)、最佳表达蛋白接毒剂量和收获时间
4.1 P3代毒接种剂量与CSFV VLPs产量：准备Sf9或Sf21细胞和6孔细胞板，2X106细胞/孔，细胞室温培养1小时；1小时后倒置显微镜检查细胞的吸附情况。吸取P3代毒株0.5ml、0.75ml和1.0ml加入6孔板中，分别滴加6孔板，27℃湿润条件下培养；从每个孔收集2ml含有病毒的培养基和细胞，鉴定表达水平；利用抗猪瘟病毒特异性抗体建立的双抗体夹心ELISA检测获得的CSFV VLPs的反应活性；接种1.0ml的P3代毒于Sf9细胞，获得CSFVVLPs吸光℃值与接种0.5ml体积P3代毒之间差异最为显著，当目的与0.75ml差异不显著，为了获得较为稳定的目的蛋白产量，确定1.0ml体积P3代毒为最佳接种剂量；
4.2 P3代毒接种昆虫细胞收获CSFV VLPs的时间：用1.0ml的P3代毒接种Sf9细胞，在，在感染后48小时、72小时和96小时，从每个孔收集2ml含有病毒的培养基上清和细胞，鉴定表达水平。
6.根据权利要求1或2或3所述的一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，其特征在于，将编码完整的猪瘟病毒结构蛋白的基因C、E0、E1、E2，将其命名为E3，通过重组载体分别转染至中国仓鼠卵巢细胞-K1即CHO-K1细胞、人胚胎肾细胞293株即HEK293细胞中制取重组猪瘟病毒样颗粒疫苗CSFV VLPs的方法如下：
1)、材料
1.1获得编码猪瘟结构蛋白基因的方法
猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株，其细胞源为PK-15细胞，通过RT-PCR的方式获得从编码蛋白酶N至NS2目的基因片段，并与GenBank登录的CAA86367，AY805221，AY382481序列进行比较，确定获得目的基因序列的正确性；
1.2克隆菌株：大肠杆菌E.coli感受态细胞DH5α和Top10；
1.3哺乳动物细胞系：HEK293细胞和CHO-K1细胞；
1.4培养方式：有血清培养基或无血清培养基，贴壁培养或悬浮培养；
1.5表达载体：pcDNA3.1，pcDNA3.4及包含有SV40和CMV启动子的真核表达载体；
1.6转染方式：聚醚酰亚胺Polyetherimide，PEI，脂质体2000，脂质体3000，电转化；
2)、构建重组表达载体
设计扩增猪瘟病毒兔化弱毒疫苗基因的N端蛋白酶至NS2基因片段，克隆出核衣壳蛋白C、囊膜蛋白E1、Ems、E2基因，克隆到pUB322载体，转化E.coli的Top10菌株；根据载体pcDNA3.4多克隆位点的序列特征，设计无缝克隆引物上游引物E3F和下游引物E3R，扩增用于构建表达质粒，引物序列如下：
E3F：GCGGTACCGAGCTCGGATATGTCCGATGATGGCGC，
E3R：CCTTGAATTCCTCGACTAACCAGCGGCGAGTTGTTCTGTTAG；
分别用无缝克隆引物E3F和E3R扩增目的基因，切胶回收，分别加入无缝克隆试剂和目的片断，充分混匀，16℃水浴3h，转化E.coli感受态细胞DH5α，无菌条件下涂在LB：100μg/mLAmp+琼脂平板上,37℃培养16h，挑取白色菌落接种3mL LB：100μg/mL Amp+培养液中，37℃条件下220r/min培养16h，用上下游引物进行PCR鉴定，分别扩增得到目的基因片段；将鉴定阳性的菌落扩增后，用去内毒素质粒大提试剂盒提取质粒，将该重组质粒命名为C-E3，测定质粒浓度转染细胞；
3)、真核细胞转染
3.1增殖CHO-K1细胞:
光学显微镜先观察25cm2细胞瓶中CHO-K1细胞状态良好，待贴壁率达到90％左以上时，弃去培养溶液，DMEM培养液洗涤细胞3次，随后缓慢加入0.25％胰酶溶液，放入5％CO2培养箱孵育3～5min，显微镜观察细胞被彻底消化后，加入F-12K(10％FBS)培养基，中和胰酶，800rpm/min离心5min，弃上清；用F-12K，10％犊牛血清，培养基重悬细胞，轻轻吹打细胞8～10次，分散成单个细胞，随后以30％密度接种于直径100mm细胞培养皿中，待细胞融合程度达到60％～70％时进行转染；
3.2瞬时转染:
1mL PEI：1.0μg/μL，MW25kDa中加入20μg重组C-E3质粒，混匀，室温静置10min，加入2.5mL F-12K培养基，轻轻混匀，小心滴加到CHO-K1细胞表面，5.0％CO2，37℃孵育2h，弃去多余液体，重新加入10mL维持液：F-12K，2.0％犊牛血清培养基继续培养72h～120h后，收集培养上清1000rpm离心10min，弃去沉淀，4000rpm转速离心15min，收集上清，保存于-70℃，得重组CSFV VLPs。
7.如权利要求1-6中任一项所述的一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的应用，其特征在于，在制备免疫预防猪瘟病毒疫苗制剂中的应用。
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