CN109852622A - 一种可溶性PCV3Cap蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可溶性PCV3Cap蛋白及其编码基因和应用。本发明将PCV3 Cap基因密码子进行昆虫细胞偏嗜性优化、修饰，得到新的重组基因。该重组基因能够表达可溶性的3Capm蛋白，该3Capm蛋白可以包装形成病毒样颗粒，将3Capm蛋白与佐剂制成亚单位疫苗，小鼠和猪体免疫试验均发现其可以有效诱导体液免疫和细胞免疫，表明3Capm蛋白具有较好的抗原性、免疫原性，由此可以看出本发明的3Capm蛋白可以用于疫苗研制，为PCV3 的防控提供了思路，为PCV3 疫苗的研究奠定了基础。

Description

一种可溶性PCV3Cap蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种编码可溶性PCV3 Cap蛋白的基因，还涉及一种可溶性PCV3 Cap蛋白、还涉及该可溶性PCV3 Cap蛋白的制备方法及其在制备治疗猪圆环病毒3型疫苗中的应用。

背景技术

猪圆环病毒病由猪圆环病毒引起，猪圆环病毒（PCV）分为三个血清型，PCV1、PCV2以及PCV3。普遍认为PCV1对动物没有致病性。目前，病毒感染特性和致病性研究最清楚的是PCV2。PCV2可以引起猪圆环病毒相关疾病（PCVAD），更为严重的是，PCV2的感染会损害宿主的免疫力，引起猪群免疫抑制，更容易导致其他细菌或病毒的继发感染。PCV2的感染另一个重要特点是持续性的感染，亚临床感染比例高，猪群虽然不表现临床症状，但是可以长期带毒，并向外界环境排毒，使PCV2的防控更加困难。目前，已经报道的PCV2基因型有PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e。PCV2a、PCV2b和PCV2d流行趋势在最近几年的改变，使PCV2防控工作更加复杂。自20世纪90年代发现以来，PCV2已经对养猪业造成了巨大危害。

PCV3于2016年首次发现，已经在亚洲、美洲、欧洲等很多国家和地区出现，但是感染特性和致病性研究尚无大的进展，最主要的困难是PCV3体外培养未能实现。已有研究证实PCV3不能在猪睾丸细胞（ST）、猪肾上皮细胞（PK15）、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）、非洲绿猴肾细胞（Vero）中增殖，病毒的体外培养需要尝试更多的细胞和组织。2016年，PCV3首先在患有PDNS的猪群中发现，临床表现为：患病母猪流产率升高、产出死胎、木乃伊胎，胎儿也表现出PDNS的症状，但是对常见病原体的检测结果均为阴性，定量PCR、免疫组化检测结果也表明PCV2为阴性，因此推测临床症状由PCV3引起。此外，还在有呼吸系统疾病综合征、腹泻、猪心肌炎以及多系统性炎症的猪体内检测到PCV3的存在，这些病例中，亦有与PCV2共感染的情况，推测PCV3感染也可能在一定外界环境下引起临床发病。

目前，疫苗接种是控制PCV2感染的主要途径。针对PCV2的商品化疫苗主要有勃林格的亚单位疫苗CircoFLEX、梅里亚的灭活疫苗Circovace、默沙东的亚单位疫苗Circumvent和Porcilis PCV亚单位疫苗，以及辉瑞公司的 Fostera^TM PCV灭活嵌合体疫苗以及国内SH株、LG株等灭活疫苗，青岛易邦的大肠杆菌表达系统亚单位疫苗等。其中，杆状病毒系统表达的PCV2a Cap蛋白亚单位疫苗能够诱导高水平的免疫应答，产生速度快，能够有效降低组织和血清中病毒载量，保护效果也更持久。但是，PCV3 ORF2基因和PCV2的ORF2基因表现出较大的差异，同源性仅37%左右，二者基因结构的巨大差异，表明二者不存在交叉保护作用。因此，PCV2的商品化疫苗无法满足PCV3的防治要求，开展PCV3疫苗研制十分必要。

一些病毒的结构蛋白可以组装成VLPs（病毒样颗粒），其本质是蛋白质复合物，不含遗传物质。由于VLPs含有功能性的病毒蛋白，可以进入细胞，是研究病毒结构蛋白功能的常用方法之一。截止2015年，已报道110余种VLPs，各种蛋白质表达系统均可产生VLPs。其中杆状病毒表达系统表达外源蛋白培养简单、生长速度快、培养效率高，蛋白修饰功能类似于其天然修饰方式，利于VLPs的形成和抗原性的保持。由于不含有遗传物质，VLPs不会在体内复制，提高了其生物安全性。此外，使用其免疫动物还可以区别动物自然感染和免疫作用。目前，世界上有四种VLPs疫苗批准生产，其中兽用疫苗有PCV2亚单位疫苗和兔出血热疫苗。众多VLPs疫苗正在试验中，表明以VLPs为抗原的亚单位疫苗和杆状病毒表达载体具有广阔的发展前景，因此，PCV3疫苗的研制也可以向这一方向努力。

发明内容

本发明将PCV3 Cap基因密码子进行昆虫细胞偏嗜性优化、修饰、合成，得到编码可溶性PCV3 Cap蛋白的基因，将该基因克隆到pFastBac Dual质粒p10启动子下，得到重组质粒。再将重组质粒转化入DH10Bac感受态细胞，借由质粒上的Tn5转座单位和细胞内辅助质粒的功能将目的基因转座到杆状病毒载体Bacmid上，得到重组杆状病毒质粒。

本发明提供了一种编码可溶性PCV3 Cap蛋白的基因，该基因是在PCV3 Cap基因基础上进行昆虫细胞偏嗜性密码子优化、修饰而得，能够使其PCV3 Cap蛋白实现可溶性表达。该编码可溶性PCV3 Cap蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 或SEQ ID NO.2所示。其中，SEQ ID NO.1 和SEQ ID NO.2序列的区别是SEQ ID NO.1终止密码子前不加His标签，SEQ ID NO.2终止密码子前加His标签。

本发明提供了一种重组质粒，该重组质粒含有上述编码可溶性PCV3 Cap蛋白的基因。

进一步的，上述重组质粒是由编码可溶性PCV3 Cap蛋白的基因和pFastBac Dual载体重组而得。

本发明提供了一种重组杆状病毒质粒，该重组杆状病毒质粒含有上述编码可溶性PCV3 Cap蛋白的基因。

进一步的，上述重组杆状病毒质粒是由编码可溶性PCV3 Cap蛋白的基因和杆状病毒载体Bacmid重组而得。

本发明提供了一种可溶性PCV3 Cap蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3 或SEQ IDNO.4所示。其中，SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4序列的区别是SEQ ID NO.3不加His标签，SEQID NO.4加His标签。SEQ ID NO.4序列为：Met Arg His Arg Ala Ile Phe Arg Arg ArgPro Arg Pro Arg Arg Arg Arg Arg His Arg Arg Arg Tyr Ala Arg Arg Arg Leu PheIle Arg Arg Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn ValIle Ser Val Gly Thr Pro Gln Asp Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His Phe Ile ThrArg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Ser Phe Glu Tyr Tyr Lys Ile Leu Lys MetLys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro Ala Gln Gln Lys Lys Thr Met Phe GlyHis Thr Ala Ile Asp Leu Asp Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Leu Gln Asp AspPro Tyr Ala Glu Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Ser Lys Lys Lys His Ser ArgTyr Phe Thr Pro Lys Pro Ile Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly Gln SerLeu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr Asp Pro Thr Val GlnTrp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp PheTyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile Arg Tyr Lys Ser Val Leu His His His His His His （HIS标签）。该可溶性PCV3 Cap蛋白能够自组装形成病毒样颗粒，可溶性好、免疫原性强，具有很好的应用前景。

进一步的，该可溶性PCV3 Cap蛋白是由重组杆状病毒质粒表达而得。

本发明还提供了可溶性PCV3 Cap蛋白的制备方法，其步骤为：将重组杆状病毒质粒转染至对数期Sf9细胞，当Sf9细胞出现明显病变时，离心取所得细胞，经冻融、破碎、离心、纯化后得到可溶性PCV3 Cap蛋白。本发明蛋白基因中加入His标签后，可以方便地进行镍柱亲和层析纯化，大大节约了应用成本。

本发明还提供了该重组杆状病毒质粒或该可溶性PCV3 Cap蛋白在制备治疗猪圆环病毒3型疫苗中的应用。该重组杆状病毒质粒可以表达得到可溶性PCV3 Cap蛋白，该可溶性PCV3 Cap蛋白经过小鼠和猪体免疫试验，均发现其可以有效诱导体液免疫和细胞免疫，为PCV3 疫苗的研究奠定了基础。

本发明还提供了一种治疗猪圆环病毒3型疫苗，该疫苗有效成分包括上述可溶性PCV3 Cap蛋白。

进一步的，所述治疗猪圆环病毒3型疫苗中还包括佐剂，所述佐剂优选为15A佐剂、206佐剂或铝胶佐剂，最优为铝胶佐剂。

本发明还提供了上述治疗猪圆环病毒3型疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤：

（1）将上述重组杆状病毒质粒转染至对数期Sf9细胞，当Sf9细胞出现明显病变时，离心取所得细胞，经冻融、破碎、离心、纯化后得到可溶性PCV3 Cap蛋白；

（2）将纯化后的可溶性PCV3 Cap蛋白用灭菌 PBS稀释至所需浓度，然后与佐剂混合均质或乳化均匀，得治疗猪圆环病毒3型疫苗。

本发明中相关术语的说明及解释

在本发明中，除非另有说明，否则所用的科学和技术名词具有本领域技术人员通常理解的含义。并且，本文中所用的昆虫细胞偏嗜性优化、细胞培养、细胞转化、病毒感染、免疫学实验、重组质粒、重组病毒等技术都是本领域已经有报道的技术，其步骤可以采用现有技术中公开的常规步骤进行。同时，为了更好的理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

根据本发明，所述PCV3 Cap蛋白指的是猪圆环病毒病3 型Cap蛋白。

根据本发明，所述3Capm基因指的是对PCV3 Cap蛋白的基因进行昆虫细胞偏嗜性优化后所得的基因，即本发明编码可溶性PCV3 Cap蛋白的基因。

根据本发明，所述3Capm蛋白指的是本发明不含His标签的编码可溶性PCV3 Cap蛋白的基因表达所得的可溶性PCV3 Cap蛋白，所述Capm-His蛋白指的是本发明含His标签的编码可溶性PCV3 Cap蛋白的基因表达所得的可溶性PCV3 Cap蛋白。

本发明将PCV3 Cap基因密码子进行昆虫细胞偏嗜性优化、修饰后，与pFastBacDual载体进行重组，成功得到了带有His标签和不带His标签的重组质粒。将该重组质粒转化DH10Bac感受态细胞，借由质粒上的Tn5转座单位和细胞内辅助质粒的功能将目的基因转座到杆状病毒载体Bacmid上，得到带有His标签和不带His标签的重组杆状病毒质粒。经验证，该重组杆状病毒质粒能够表达3Capm蛋白，将重组杆状病毒质粒接种Sf9细胞传到F6代，依然能够表达3Capm蛋白，说明重组杆状病毒质粒具有较好的稳定性。经电镜观察证明，该3Capm蛋白可以包装形成病毒样颗粒。将3Capm蛋白与佐剂制成亚单位疫苗，小鼠和猪体免疫试验均发现其可以有效诱导体液免疫和细胞免疫，表明3Capm蛋白具有较好的抗原性、免疫原性。以上结果表明本发明重组杆状病毒质粒表达的3Capm蛋白可以用于疫苗研制，为PCV3 的防控提供了思路，为PCV3 疫苗的研究奠定了基础。

附图说明

图1优化前后的基因序列。

图2基因优化前后密码子适应指数（A）、最优密码子频率（B）、G+C含量(C)比较；左图为优选序列，右图为原序列。

图3重组质粒双酶切鉴定图，其中，M.DL10000 Marker；1.pFastBac Dual-3Capm双酶切；2.pFastBac Dual-3Capm-His双酶切；3.pFastBacDual双酶切；4.3Capm-His基因的PCR产物；5.3Capm基因的PCR产物。

图4杆状病毒接种Sf9产生的CPE，A.正常的Sf9细胞；B.B/3Capm感染的Sf9细胞；C.B/3Capm-His感染的Sf9细胞。

图5重组蛋白Western blot鉴定，A.3Capm蛋白鉴定(猪多克隆抗体)；B.3Capm-His蛋白鉴定（猪多克隆抗体）；C.3Capm-His蛋白鉴定（His-Tag单克隆抗体）；1. sf9细胞；2.感染3capm的sf9细胞裂解上清液；3. 感染3capm的sf9细胞裂解沉淀。

图6 F1-F5代重组蛋白Western Blot鉴定，1-5. F1-F5代蛋白；6.Sf9空白对照。

图7重组蛋白3Capm纯化、鉴定与VLPs观察，A.重组蛋白3Capm蔗糖密度梯度离心纯化，1、30%~40%的蔗糖层，2、40%~50%的蔗糖层；B.重组蛋白3Capm Western Blot鉴定；C.VLPs电镜观察。

图8间接ELISA方法检测小鼠血清中抗体情况。

图9 小鼠淋巴细胞增殖反应的检测。

图10 间接ELISA方法检测仔猪血清中抗体情况。

图11 仔猪淋巴细胞增殖应答。

具体实施方式

下面通过附图和具体的实施方式对本发明进行进一步的解释和说明，并对本发明所得可溶性蛋白的免疫性能进行验证。下述说明仅是示例性的，并不对其保护范围进行限定。

实施例1

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株、细胞和试剂

大肠杆菌菌株E.coli DH10Bac（携带有杆状病毒Bacmid骨架）、草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢细胞Sf9、pFastBacDual载体和杆状病毒载体Bacmid均购自ThermoFisher公司、His-Tag单抗和SPA-HRP购自碧云天公司、猪多克隆抗体（抗体效价1:12800）由本实验室保存。Grace培养基、澳洲胎牛血清和sf-900Ⅲ SFM无血清培养基购自Gibco公司；Lipofectamine 3000购自Invitrogen公司；SPA-HRP购自博士德公司；质粒提取试剂盒购自BIOMIGA公司；DNA回收试剂盒购自鼎国公司。其他下文提到但此处并无记载的质粒、细胞或试剂，均能从市场中购买得到。

基因合成与引物设计

1.2.1 ORF2基因密码子优化

PCV3 ORF2基因序列来自于NCBI公布的PCV3-US/MO2015毒株（GenBank：KX778720.1），为了利于3Cap蛋白的可溶性表达，在起始密码子ATG前加上KOZAK序列（ATCAAA），并将基因密码子优化为昆虫细胞偏嗜性的密码子，编码氨基酸不变，优化后的基因即为编码可溶性PCV3 Cap蛋白的基因，其序列如SEQ ID NO.1所示。将该基因送至南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并插入质粒pVAX1中，得到重组质粒，命名为pVAX1-3Capm。密码子优化前后的碱基序列对比如图1所示。

引物设计

根据优化后得到的SEQ ID NO.1所示的3Capm基因序列设计引物。设计引物时，在上游引物加入XhoI酶切位点，起始密码子ATG前加KOZAK序列（ATCAAA），下游引物加入KpnI酶切位点，终止密码子前加和不加His标签（CACCACCACCACCACCAC）各设计一条引物。所得引物如下表1所示：

1.3 3Capm和3Capm-His基因的克隆

以pVAX1-3Capm为模板，使用上述引物扩增出密码子改造后完整的3Capm和3Capm-His基因，3Capm基因的序列如SEQ ID NO.1所示，3Capm-His基因的序列如SEQ ID NO.2所示。PCR反应体系：2×PCR Mix（含Taq酶)） 12.5μL，pVAX1-3Capm质粒 1μL，上下游引物各1μL，加ddH₂O 至总体积25μL。PCR反应条件：95℃ 预变性5 min；95℃ 变性30 s；56℃ 退火30s；72℃延伸 50 s；35个循环；72℃ 10 min。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，测序确认后分别保存。

质粒pFastBac Dual-3Capm和pFastBac Dual-3Capm-His的构建

将3Capm基因和pFastBac Dual载体分别用XhoI和Kpn 双酶切，回收后进行连接，将连接产物转入感受态E.coli DH5α后，挑取阳性克隆测序确认，提取质粒并命名pFastBacDual-3Capm；同样方法获得pFastBac Dual-3Capm-His。

重组杆状病毒质粒reBac-3Capm和reBac-3Capm-His的获得

质粒pFastBac Dual-3Capm和pFastBac Dual-3Capm-His转化入E.coli DH10Bac感受态细胞内，借由质粒上的Tn5转座单位和细胞内辅助质粒的功能将目的基因转座到杆状病毒载体Bacmid上。经由抗生素（卡那霉素，四环素，庆大霉素）和两次蓝白斑筛选后，提取重组杆状病毒质粒，分别利用目的基因的特异性引物和载体上的M13通用引物常规进行PCR鉴定，得到重组杆状病毒质粒，分别命名为reBac-3Capm和reBac-3Capm-His。

重组病毒样颗粒的表达

将2种重组杆状病毒质粒分别转染至对数期Sf9细胞，当细胞出现明显病变时，收获培养基上清，1000rpm离心10min，上清即为F1代病毒，4℃避光保存。用0.01M PBS溶液吹下该孔细胞，收集细胞悬液，超声波裂解，离心后收集裂解上清和沉淀。将F1代重组杆状病毒接种Sf9细胞，28℃培养，细胞出现明显病变时按上述同样方法收集样品，上清即为F2代病毒。继续接种病毒，收获每一代病毒和细胞，进行蛋白表达稳定性鉴定。所用培养基为sf-900ⅢSFM无血清培养基。

鉴定

用P2代感染细胞，当有明细病变时，收获细胞，PBS洗２次，500rpm离心5~10min收获细胞沉淀，加入SDA-PAGE loading Buffer混匀后进行SDA-PAGE验证。同时电转硝酸纤维素膜进行Western Blot鉴定，用含5% 脱脂奶粉的 PBST（含0.1% Tween-20的PBS）封闭液封闭2ｈ，PBST洗涤3次（5min·次^-1），两种杆状病毒表达的蛋白3Capm和3Capm-His分别使用猪多克隆抗体（效价1:12800）和His-Tag单抗孵育。猪多克隆抗体稀释倍数1:500，His-Tag单抗稀释倍数1:5000。室温封闭2h，一抗孵育时间为室温2h，PBST洗涤3次（5min·次^-1），二抗孵育时间为室温1h，PBST洗涤3次（5min·次^-1），用ECL化学发光液检测目的蛋白表达情况。

猪多克隆抗体制备方法是：挑选血清中PCV3抗原检测和抗体检测均为阴性的猪，将纯化后的3Cap蛋白用PBS稀释成2 mg/mL，与等量ISA-206佐剂混合后充分乳化，免疫剂量为1mL（1mg）/头，免疫方式为颈部肌肉注射。每隔3周加强免疫一次，每周前腔静脉采血，测定抗体效价。效价大于1:10000时杀猪取血，血液于37℃放置30min后4℃静置1h，析出的血清4000rpm 4℃离心5min，上清即为制备的猪多克隆抗体。分装后-20℃保存。

重组蛋白纯化

蛋白样品收获：Sf9细胞接毒4~5d后，收获细胞悬液进行离心，4℃ 1000rpm离心10min，上清即为收获的杆状病毒液，沉淀使用1/10体积PBS重悬后在-20℃冰箱冻融一次，再进行超声破碎，破碎后12000rpm离心10min上清是可溶性的3Capm和3Capm-His目的蛋白。

蛋白纯化：将可溶性3Capm和3Capm-His目的蛋白分别经过BECKMAN COULTER离心机12000rpm 4℃离心30min，以去除细胞碎片及杂质；分别使用0.45μm和0.22μm的滤膜将蛋白液过滤，除去细菌及大颗粒杂蛋白；将蛋白滤过液4℃ 40000rpm超速离心4h，使用1/20原体积的0.01M PBS重悬沉淀；重悬蛋白样4℃放置过夜；分别将2.4ml的30wt%、40 wt %、50wt %和60 wt %的蔗糖溶液使用细长的注射器针头缓慢加入离心管的底部，制备蔗糖梯度；吸取已重悬的浓缩蛋白液2.4ml缓慢加到制备好的蔗糖梯度上，4℃，40000rpm，超速离心2.5h；用注射器针头将不同蔗糖梯度间的白色的纯化蛋白吸出，用5ml 0.01M PBS重悬；4℃40000rpm超速离心2h，将沉淀用2ml 0.01M的PBS重悬，保存备用。

（病毒样颗粒）的观察

收集的每层蛋白样品经Western Blot鉴定，含有3Capm和3Capm-His目的蛋白的样品负染后用透射电子显微镜观察VLPs的形态。

疫苗制备

将重组杆状病毒质粒接种 Sf9 细胞，3 天左右出现明显病变后，用 PBS 重悬细胞，冻融三次并超声裂解后取上清。用离子交换方法纯化，获得重组3Capm和3Capm-His蛋白。根据BCA方法测定蛋白浓度，将蛋白用灭菌 PBS稀释，将3Capm蛋白PBS溶液分别与15A佐剂、206佐剂、铝胶佐剂混合均质或乳化均匀，制成疫苗，蛋白终浓度为20μg/ml，4℃保存，分别记为3Capm VLP-15A、3Capm VLP-206和3Capm VLP-AL，简称为VLP-15A、VLP-206和VLP-AL。

小鼠免疫试验

取 50 只雌性 ICR 小鼠，随机分为5组，每组 10 只，第1-4组分别接种 VLP（不加佐剂）、VLP-15A、VLP-206和 VLP-AL，每只背部皮下多点注射200μL，第5组注射200μL PBS对照，免疫后3 周，加强免疫。首次免疫后第 3周和第6周，每组取五只小鼠剖杀，采集血液分离血清，测定PCV3 Cap ELISA抗体效价；取脾淋巴细胞进行淋巴细胞增殖实验。

仔猪免疫试验

选取20头PCV3、PCV2和PRRSV抗原抗体均为阴性的28~30日龄仔猪，随机分为4组，每组5头，第1-3组分别接种 VLP、 VLP-15A、 VLP-AL疫苗，每头猪背颈肌肉注射1mL，第4组为PBS阴性对照组。首次免疫后3周进行二免，免疫剂量和方法同一免。免疫后21和42天，分别测定PCV3 Cap ELISA抗体效价。免疫后28、42天，每组采集抗凝血分离外周血单核细胞（PBMC），测定淋巴细胞增殖反应。

抗体检测

采用CBS将纯化的3Capm蛋白稀释为2μg/mL，4℃过夜包被酶标板；用含有0.05wt%吐温的0.05M PBS（简称PBST, pH7.2）洗板3次，每次5min；拍干后加入含5wt%脱脂乳的PBST封闭，200μl/孔，37℃，2h；洗板；1:50~1:20000稀释的待检血清和阴性对照血清，100μl/孔，37℃，1h；洗板；加入1:10000稀释的HRP-SPA，100μl/孔，37℃孵育1h；洗板；加入TMB底物反应液，100μl/孔，37℃底物反应10min；加入2M H₂SO₄，50μl/孔，终止底物反应后读取OD450值。以P/N值大于2.1的血清最高稀释倍数判定为该血清样品抗体效价。

淋巴细胞增殖试验

选取免疫后小鼠，无菌取出小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，用含10wt%胎牛血清的1640培养液重悬细胞；计数并将细胞数目稀释成1×10⁶个/mL，向96孔板的每孔加入100µL细胞悬液。用纯化的3Capm 蛋白作为刺激抗原(5μg/mL)，对照孔加入相同蛋白浓度的PK-15细胞上清液，每个样品做3个重复孔。在37℃培养6h后加入20μL 5mg/mL MTT，37℃继续培养6h。弃去培养液，每孔加入100μL的DMSO，振荡融解结晶，测定OD570nm吸光值。计算刺激指数（SI）：SI＝刺激孔OD值/未刺激孔OD值。

猪体免疫试验中，淋巴细胞增殖试验采集免疫后28、42天采集仔猪抗凝血，分离PBMCs，用1mL含10wt%血清、1wt%非必需氨基酸的1640重悬悬细胞并计数，铺于24 孔板至 1×10⁵个/孔。用纯化的3Capm 蛋白作为刺激抗原(5μg/mL)，对照孔加入相同蛋白浓度的PK-15细胞上清液。其它方法同上。

结果

2.1 3Capm和3Capm-His目的基因的获得

比较优化前后的3Capm基因序列密码子特性，由图2 A可见，优化后的3Capm基因的密码子适应指数（CAI）明显升高，达到0.95，表明3Capm基因较原基因有更高的昆虫细胞偏嗜性，易于蛋白表达。从图2 B可以看出，优化后的3Capm基因最优密码子频率（FOP）也大幅度提高，利于外源基因表达。另外，优化后的序列的G+C含量较之前也有一定提高，如图2 C所示。

重组质粒的鉴定

分别将PCR获得的目的基因3Capm和3Capm-His克隆到pFastBacDual质粒p10启动子下，获得重组质粒pFastBacDual-3Capm和pFastBacDual-3Capm-His。PCR鉴定阳性后，提取重组质粒进行双酶切鉴定，切出的条带与目的基因大小一致，测序结果均正确，双酶切鉴定结果图3所示。

重组杆状病毒的获得

将重组rBac-3Capm和rBac-3Capm-His转染Sf9昆虫细胞，28℃温箱培养84h，可以看到接毒的细胞出现明显病变，细胞变大变圆，边界模糊，部分细胞崩解，而正常细胞边界清晰，形态较小，如图4所示。培养液上清即为病毒液F1代，分别命名为B/3Capm和B/3Capm-His。PBS重悬细胞后进行超声裂解，分别收集裂解上清和沉淀，沉淀使用等量PBS重悬。

重组蛋白Western blot鉴定

将2.3中收获的蛋白样品3Capm和3Capm-His加Loading Buffer煮样后，进行SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定。3Capm蛋白鉴定使用一抗为猪多克隆抗体，3Capm-His蛋白分别使用猪多克隆抗体或His-Tag单抗作为一抗。检测结果如图5所示，25KDa位置有目的条带，表明杆状病毒可以成功表达目的蛋白。

重组蛋白表达稳定性鉴定

将B/3Capm F1代传代至F5代，收获每一代病毒和蛋白样品。Western Blot鉴定每一代杆状病毒的表达情况，结果如图6，可知重组杆状病毒有较好的稳定性。

重组蛋白纯化及病毒样颗粒观察

将B/3Capm病毒接种SF9细胞培养96h，制备细胞裂解液，超速离心10倍浓缩，再经过30wt%、40wt%、50wt%和60wt%的蔗糖密度梯度离心，蛋白分层如图7A所示，可见离心后蛋白主要分布于30%~40%的梯度及40%~50%的梯度之间，将这两层的蛋白分别收集后超速离心脱去蔗糖，煮样进行Western Blot鉴定，鉴定结果如图7B，可见目的蛋白主要集中在40%~50%的蔗糖密度之间，取样进行电镜观察，可以观察到形成的VLPs，如图7 C所示。B/3Capm-His的蛋白分布和形状与B/3Capm相同，也可以形成病毒样颗粒。

小鼠免疫试验

2.7.1 ELISA抗体：小鼠免疫后 21天和42天摘眼球采血，分离血清，间接 ELISA方法检测 PCV3特异性抗体。结果显示，在免疫后第3周，VLP-AL、VLP-15A和VLP-206组PCV3特异性ELISA抗体都显著上升（p<0.001），抗体效价达1：2500以上。同时，VLP组抗体效价达1：2000以上，PBS组PCV3抗体均为阴性（图8）。

淋巴细胞增殖检测

取首免后第28天和42天的小鼠脾脏，分离脾淋巴细胞，进行PCV3特异性的淋巴细胞增殖试验。结果表明：免疫后42天VLP-AL、VLP-206、VLP-15A组淋巴细胞增殖明显，与对照组极显著差异（p<0.01）；VLP组也可以检测到淋巴细胞增殖(见图9)。

仔猪免疫试验

2.8.1 ELISA抗体

结果见图10。仔猪免疫后第21天即可产生较高水平抗体，VLP-AL、VLP-15A和VLP抗体效价相似。加强免疫后，VLP-AL、VLP-15A和VLP组的PCV3特异性ELISA 抗体效价明显升高（P<0.0001），抗体效价达1：4000以上，其中VLP-AL抗体效价最高，而对照组 PCV3 抗体均为阴性。

淋巴细胞增殖检测

分别采集首免后第28天和第42天仔猪抗凝血，分离外周血单核细胞，进行PCV3特异性的淋巴细胞增殖试验。结果表明：VLP-AL、VLP-15A组淋巴细胞增殖明显高于对照组（P<0.05）（见图11），同时；VLP组也可以检测到淋巴细胞增殖。

本发明将PCV3 ORF2基因进行昆虫细胞密码子偏嗜性优化，克隆到双启动子表达载体pFastBac Dual的p10启动子下，实现了重组蛋白的可溶性表达。通过蔗糖密度梯度纯化，负染后透射电镜观察，在40%~50%密度之间的蛋白样品中观察到VLPs。VLPs在结构和功能上与病毒相似，能够被宿主细胞识别，激活机体的免疫应答。本发明成功构建表达PCV3Cap蛋白的重组杆状病毒质粒，纯化后能观察到VLPs形成，具有较好应用前景，为PCV3疫苗研制奠定了重要基础。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种可溶性PCV3Cap蛋白及其编码基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 663

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ctcgagatca aaatgcgcca ccgtgctatc ttcaggagga ggcctaggcc aagaaggagg 60

aggagacacc gccgtcgtta cgctagacgc cgtctgttca tcaggagacc taccgccggt 120

acttactaca ccaagaagta ctccactatg aacgtgatca gcgtcggcac cccacaggac 180

aacaagcctt ggcacgctaa ccacttcatc actcgcctga acgagtggga aaccgccatc 240

tccttcgagt actacaagat cctgaagatg aaagtgactc tgtctcctgt catctcaccc 300

gctcagcaga agaagactat gttcggccac accgctatcg acctggacgg agcctggacc 360

actaacacct ggctgcagga cgacccttac gccgaatcca gcactaggaa ggtcatgacc 420

tccaagaaga agcacagcag atacttcact ccaaagccta tcctcgctgg aaccacttct 480

gctcacccag gacagtctct gttcttcttc tcccgcccca ccccatggct gaacacttac 540

gaccctactg tgcagtgggg tgccctgctg tggtctatct acgtcccaga gaagactggt 600

atgaccgact tctacggcac caaggaagtg tggatccgtt acaagtcagt cctgtaaggt 660

acc 663

<210> 2

<211> 681

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ctcgagatca aaatgcgcca ccgtgctatc ttcaggagga ggcctaggcc aagaaggagg 60

aggagacacc gccgtcgtta cgctagacgc cgtctgttca tcaggagacc taccgccggt 120

acttactaca ccaagaagta ctccactatg aacgtgatca gcgtcggcac cccacaggac 180

aacaagcctt ggcacgctaa ccacttcatc actcgcctga acgagtggga aaccgccatc 240

tccttcgagt actacaagat cctgaagatg aaagtgactc tgtctcctgt catctcaccc 300

gctcagcaga agaagactat gttcggccac accgctatcg acctggacgg agcctggacc 360

actaacacct ggctgcagga cgacccttac gccgaatcca gcactaggaa ggtcatgacc 420

tccaagaaga agcacagcag atacttcact ccaaagccta tcctcgctgg aaccacttct 480

gctcacccag gacagtctct gttcttcttc tcccgcccca ccccatggct gaacacttac 540

gaccctactg tgcagtgggg tgccctgctg tggtctatct acgtcccaga gaagactggt 600

atgaccgact tctacggcac caaggaagtg tggatccgtt acaagtcagt cctgtaacac 660

caccaccacc accacggtac c 681

<210> 3

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Met Arg His Arg Ala Ile Phe Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg His Arg Arg Arg Tyr Ala Arg Arg Arg Leu Phe Ile Arg Arg

20 25 30

Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val

35 40 45

Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asp Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His

50 55 60

Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Ser Phe Glu Tyr

65 70 75 80

Tyr Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro

85 90 95

Ala Gln Gln Lys Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu Asp

100 105 110

Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu

115 120 125

Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Ser Lys Lys Lys His Ser Arg Tyr

130 135 140

Phe Thr Pro Lys Pro Ile Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly

145 150 155 160

Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr

165 170 175

Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro

180 185 190

Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile

195 200 205

Arg Tyr Lys Ser Val Leu

210

<210> 4

<211> 220

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Met Arg His Arg Ala Ile Phe Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg

1 5 10 15

Arg Arg His Arg Arg Arg Tyr Ala Arg Arg Arg Leu Phe Ile Arg Arg

20 25 30

Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val

35 40 45

Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asp Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His

50 55 60

Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Ser Phe Glu Tyr

65 70 75 80

Tyr Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro

85 90 95

Ala Gln Gln Lys Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu Asp

100 105 110

Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu

115 120 125

Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Ser Lys Lys Lys His Ser Arg Tyr

130 135 140

Phe Thr Pro Lys Pro Ile Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly

145 150 155 160

Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr

165 170 175

Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro

180 185 190

Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile

195 200 205

Arg Tyr Lys Ser Val Leu His His His His His His

210 215 220

Claims (10)

1.一种编码可溶性PCV3Cap蛋白的基因，其特征是：该基因的序列如SEQ ID NO.1或SEQID NO.2所示。

2.一种重组质粒，其特征是：含有权利要求1所述的编码可溶性PCV3 Cap蛋白的基因，优选的，该重组质粒由权利要求1所述的编码可溶性PCV3 Cap蛋白的基因和pFastBac Dual载体重组而得。

3.一种重组杆状病毒质粒，其特征是：含有权利要求1所述的编码可溶性PCV3 Cap蛋白的基因，优选的，该重组杆状病毒质粒由权利要求1所述的编码可溶性PCV3 Cap蛋白的基因和杆状病毒载体Bacmid重组而得。

4.一种可溶性PCV3 Cap蛋白，其特征是：其氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求4所述的可溶性PCV3 Cap蛋白，其特征是：其为病毒样颗粒。

6.根据权利要求4所述的可溶性PCV3 Cap蛋白，其特征是：由权利要求3所述的重组杆状病毒质粒表达而得。

7.权利要求3所述的重组杆状病毒质粒或权利要求4-6中任一项所述的可溶性PCV3Cap蛋白在制备治疗猪圆环病毒3型疫苗中的应用。

8.一种治疗猪圆环病毒3型疫苗，其特征是：有效成分包括权利要求4-6中任一项所述的可溶性PCV3 Cap蛋白。

9.根据权利要求8所述的治疗猪圆环病毒3型疫苗，其特征是：还包括佐剂，所述佐剂为15A佐剂、206佐剂或铝胶佐剂。

10.一种可溶性PCV3 Cap蛋白和治疗猪圆环病毒3型疫苗的制备方法，其特征是包括以下步骤：

（1）将权利要求3所述的重组杆状病毒质粒转染至对数期Sf9细胞，当Sf9细胞出现明显病变时，离心取所得细胞，经冻融、破碎、离心、纯化后得到可溶性PCV3 Cap蛋白；

（2）将纯化后的可溶性PCV3 Cap蛋白用灭菌 PBS稀释至所需浓度，然后与佐剂混合均质或乳化均匀，得治疗猪圆环病毒3型疫苗。