PT1644037E - Partículas funcionais semelhantes a vírus influenza (vlps) - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Partículas funcionais semelhantes a virus influenza (VLPs)" Antecedentes do invento 0 vírus influenza é um membro da família Orthomyxoviridae (para revisão, ver Murphy e Webster, 1996). Existem três subtipos de vírus influenza designados por A, B e C. 0 virião influenza contém um genoma de ARN de sentido negativo segmentado. 0 virião influenza inclui as proteínas seguintes: proteínas hemaglutinina (HA), neuraminidase (NA), proteína de matriz (Ml), proteína de canal iónico de protão (M2), nucleoproteína (NP), proteína básica polimerase 1 (PB1), proteína básica polimerase 2 (PB2), proteína ácida polimerase (PA) e proteína não estrutural 2 (NS2). As HA, NA, Ml e M2 estão associadas à membrana, enquanto NP, PB1, PB2, PA e NS2 são proteínas associadas ao nucleocapsídeo. A NS1 é a única proteína não estrutural não associada a partículas de virião mas específica de células infectadas por influenza. A proteína Ml é a proteína mais abundante em partículas de influenza. As proteínas HA e NA são glicoproteínas do envelope, responsáveis pela fixação do vírus e penetração das partículas virais na célula, e as fontes dos epítopos imunodominantes principais para neutralização de vírus e imunidade protectora. Ambas as proteínas HA e NA são consideradas os componentes mais importantes para vacinas de influenza profilácticas. A infecção por vírus influenza é iniciada pela fixação da proteína HA, na superfície do virião, a um receptor celular contendo ácido siálico (glicoproteínas e glicolípidos). A proteína NA medeia o processamento do receptor de ácido siálico e a penetração do vírus na célula depende de endocitose mediada por receptor dependente de HA. Nos confins ácidos de endossomas internalizados contendo um virião influenza, a proteína HA2 sofre alterações de conformação que conduzem à fusão de membranas virais e celulares e à desencapsulação do vírus e à libertação mediada por M2 de proteínas Ml a partir de ribonucleoproteínas associadas ao nucleocapsídeo (RNPs), que migram para o interior do núcleo da célula para síntese de ARN virai. 2

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Anticorpos para proteínas HA impedem a infecção virai por neutralização da infectividade do vírus, enquanto anticorpos para proteínas NA medeiam o seu efeito nos passos iniciais de replicação virai.

Estão actualmente licenciadas vacinas de vírus influenza A e B inactivado para administração parentérica. Estas vacinas trivalentes são produzidas na cavidade alantóica de ovos de galinha embrionados, purificados por centrifugação zonal de velocidade ou cromatografia de coluna, inactivadas com formalina ou β-propiolactona, e formuladas como uma mistura das duas estirpes do tipo A e da estirpe do tipo B de vírus influenza em circulação entre a população humana para um dado ano. As vacinas influenza comerciais disponíveis são vacinas de vírus inteiro (WV) ou vacinas de vírus subvirião (SV; antigénio de superfície dividido ou purificado). A vacina WV contém viriões inactivados intactos. Vacinas SV tratadas com solventes, tais como fosfato de tri-n-butilo (Flu-Shield, Wyeth-Lederle), contêm a quase totalidade das proteínas virais estruturais e algumas dos envelopes virais. As vacinas SV solubilizadas com Triton X-100 (Fluzone, Connaught; Fluvirin, Evans) contêm agregados de monómeros HA, NA e NP principalmente, ainda que estejam presentes quantidades residuais de outras proteínas estruturais virais. Uma potencial vacina de vírus influenza atenuado vivo adaptada ao frio (FluMist, Medlmmune) foi recentemente aprovada para comercialização pela FDA para utilização comercial como uma vacina entregue intranasalmente indicada para imunização activa e para a prevenção de doença causada por vírus influenza A e B em crianças e adolescentes saudáveis de 5-17 anos de idade e em adultos saudáveis de 18-49 anos de idade. Têm sido desenvolvidos vários produtos recombinantes como candidatos a vacina de influenza recombinante. Estas abordagens têm sido focadas na expressão, produção e purificação de proteínas HA e NA de influenza tipo A, incluindo expressão destas proteínas utilizando células de insecto infectadas por baculovírus (Crawford et al, 1999; Johansson, 1999; Treanor et al., 1996), vectores virais (Pushko et al. , 1997; Berglund et al, 1999) e construções de vacina de ADN (Olsen et al., 1997). 3 ΕΡ 1 644 037/ΡΤ

Crawford et ai. (1999) demonstraram que a HA de influenza expressa em células de insecto infectadas por baculovírus é capaz de prevenir a doença de influenza letal causada pelos subtipos de influenza aviária H5 e H7. Ao mesmo tempo, outro grupo demonstrou que proteínas HA e NA de influenza expressas por baculovírus induzem respostas imunitárias em animais superiores às induzidas por uma vacina convencional (Johansson et al. , 1999). A imunogenicidade e a eficácia de hemaglutinina de vírus influenza equino expressa em baculovírus foram comparadas com as de um candidato a vacina de ADN homólogo (Olsen et al., 1997). Considerados em conjunto, os dados demonstraram que pode ser induzido um elevado grau de protecção contra o desafio por vírus influenza com proteínas HA ou NA recombinantes, utilizando várias abordagens experimentais e em diferentes modelos animais.

Lakey et al. (1996) mostraram que uma vacina de HA de influenza derivada de baculovírus era bem tolerada e imunogénica em voluntários humanos num estudo de segurança de Fase I para extrapolação da dose. Contudo, resultados de estudos de Fase II, conduzidos em vários locais clínicos, em voluntários humanos vacinados com várias doses de vacinas de influenza, constituídas de proteínas HA e/ou NA, indicaram que as vacinas de proteína de subunidade recombinante não induziram imunidade protectora [G. Smith, Protein Sciences; M. Perdue, USDA, Personal Communications]. Estes resultados indicaram que epítopos conformacionais exibidos sobre a superfície de peplómeros de HA e NA de viriões infecciosos foram importantes na indução de anticorpos neutralizantes e de imunidade protectora.

No que se refere à inclusão de outras proteínas influenza em candidatos a vacina de influenza recombinante, foram realizados vários estudos, incluindo as experiências envolvendo a nucleoproteína de influenza, NP, sozinha ou em combinação com proteína Ml (Ulmer et al., 1993; Ulmer et al., 1998; Zhou et al., 1995; Tsui et ai., 1998). Estes candidatos a vacina, que eram compostos de proteínas de virião interiores quasi-invariantes, induziram um largo espectro de imunidade que era principalmente celular (células T de 4

ΕΡ 1 644 037/PT memória CD4+ e CD8 + ) . Estas experiências envolveram a utilização do ADN ou de vectores genéticos virais. Foram necessárias quantidades relativamente grandes de ADN injectado, uma vez que resultados de experiências com doses de ADN mais pequenas indicaram pouca ou nenhuma protecção (Chen et al., 1998). Deste modo, pode ser requerida investigação pré-clinica e clinica adicional para avaliar se estas abordagens baseadas em ADN envolvendo NP e Ml de influenza são seguras, eficazes e persistentes.

Recentemente, numa tentativa para desenvolver vacinas mais eficazes para a influenza, utilizaram-se proteinas particuladas como transportadores de epitopos de proteina M2 de influenza. O racional para desenvolvimento de uma vacina baseada em M2 foi que, em estudos com animais, foi induzida imunidade protectora contra influenza por proteinas M2 (Slepushkin et al., 1995). Neirynck et al. (1999) utilizaram um domínio transmembrana de 23 aminoácidos de comprimento como um parceiro de fusão M2 amino terminal com o antigénio core de vírus de hepatite B (HBcAg) para expor o(s) epítopo(s) M2 sobre a superfície de partículas semelhantes a capsídeo HBcAg. No entanto, apesar do facto de tanto a proteína M2 a todo o comprimento como as VLPs de M2-HBcAg induzirem anticorpos detectáveis e protecção em ratinhos, era improvável que vacinas de influenza futuras fossem baseadas exclusivamente na proteína M2, dado que a proteína M2 estava presente num número de cópias baixo por virião, era fracamente antigénica, era incapaz de induzir anticorpos que se ligavam a viriões de influenza livres e era incapaz de bloquear a fixação do vírus a receptores celulares (í.e. neutralização de vírus).

Uma vez que a investigação anterior tem mostrado que as glicoproteínas de superfície de influenza, HA e NA, são os alvos primários para indução de imunidade protectora contra vírus influenza e que a Ml proporciona um alvo conservado para imunidade celular à influenza, uma nova vacina candidata pode incluir estes antigénios virais como uma partícula macromolecular de proteína, tal como partículas semelhantes a vírus (VLPs) . Adicionalmente, a partícula com estes antigénios de influenza pode exibir epitopos conformacionais 5

ΕΡ 1 644 037/PT que induzem anticorpos neutralizantes para múltiplas estirpes de virus influenza. Vários estudos têm demonstrado que proteínas de influenza recombinantes em cultura de células poderão auto-montar-se em VLPs utilizando plasmideos de expressão de mamífero ou vectores de baculovírus (Gomez-Puertas et al., 1999; Gomez-Puertas et al, 2000; Neumann et al., 2000; Latham e Galarza, 2001). Gomez-Puertas et al. (1999) demonstraram que a formação eficiente de VLP de influenza depende dos níveis de expressão de proteínas virais. Gomez-Puertas et al. 2000 examinaram a geração de VLPs em células COS-1 e reportaram que a proteína Ml, quando expressa sozinha, se monta em partículas de rebentos semelhantes a vírus. Neumann et al. (2000) estabeleceram um sistema de expressão de mamífero baseado em plasmídeo para gerar partículas de influenza infecciosas semelhantes a vírus inteiramente a partir de ADNc clonados. Latham e Galarza (2001) reportaram a formação de VLPs de influenza em células de insecto infectadas com baculovírus recombinante co-expressando genes de HA, NA, Ml e M2. Ver também W002/00885. Estes estudos demonstraram que proteínas de virião de influenza podem auto-montar-se após co-expressão em células eucarióticas.

Sumário do invento O presente invento proporciona um método para produzir uma VLP derivada de influenza, o método compreendendo: a) construir uma construção recombinante de baculovírus codificando um conjunto de proteínas estruturais de influenza, o referido conjunto consistindo de Ml, HA e NA; b) transfectar, infectar ou transformar uma célula hospedeira adequada com o referido baculovírus recombinante, e cultivar a célula hospedeira sob condições que permitem a expressão de Ml, HA e NA; c) permitir a formação de uma VLP na referida célula hospedeira, onde as proteínas estruturais de influenza da referida VLP consistem de Ml, HA e NA; d) colher meios de células infectadas contendo uma VLP de influenza funcional; e e) purificar a VLP. 6

ΕΡ 1 644 037/PT Ο presente invento proporciona adicionalmente uma VLP ou composição compreendendo uma VLP obtenivel por este método. O invento refere-se adicionalmente à referida VLP ou composição para utilização num método para tratamento ou prevenção de influenza num vertebrado, ou para proporcionar uma resposta imunitária protectora contra influenza num vertebrado. São também aqui descritas estruturas de proteina macromoleculares que compreendem sequências de codificação de virus influenza tipo A H9N2 aviário para proteínas HA (N.° de Acesso GenBank AJ404626), NA (N.° de Acesso GenBank AJ404629), Ml (N.° de Acesso GenBank AJ278646), M2 (N.° de Acesso GenBank AF255363) e NP (N.° de Acesso GenBank AF255742) e que compreendem sequências de codificação de vírus influenza tipo A H3N2 humano para HA (N.° de Acesso GenBank AJ311466) e para NA (N.° de Acesso GenBank AJ291403). O ARN genómico codificando estes genes virais de influenza pode ser isolado a partir de isolados de vírus influenza ou a partir de tecidos de organismos infectados por influenza. Cada uma destas sequências de codificação a partir das mesmas ou de diferentes estirpes ou tipos de vírus influenza é clonada em vectores de expressão a jusante de promotores de transcrição e é expressa em células. É também aqui descrita uma estrutura de proteína macromolecular contendo (a) uma primeira proteína Ml de vírus influenza e (b) uma proteína estrutural adicional, que pode incluir uma segunda ou mais proteína Ml de vírus influenza; uma primeira, segunda ou mais proteína HA de vírus influenza; uma primeira, segunda ou mais proteína NA de vírus influenza; e uma primeira, segunda ou mais proteína M2 de vírus influenza. Se a proteína estrutural adicional não é uma segunda ou mais proteína Ml de vírus influenza, então estão incluídos ambos ou todos os membros do grupo, e.g., primeira e segunda proteínas M2 de vírus influenza. Como tal, é proporcionada uma estrutura de proteína de influenza funcional, incluindo uma partícula subviral, VLP ou estrutura de capsómero, ou uma sua porção, uma vacina, uma vacina multivalente, e suas misturas consistindo essencialmente de proteínas estruturais de vírus influenza produzidas pelo método do invento. A estrutura de proteína macromolecular de influenza pode incluir proteínas HA, NA e Ml de vírus 7 ΕΡ 1 644 037/ΡΤ influenza que são os produtos de expressão de genes de vírus influenza clonados como fragmentos sintéticos a partir de vírus do tipo selvagem. A estrutura de proteína macromolecular pode também incluir uma proteína estrutural adicional, por exemplo, uma nucleoproteína (NP), proteínas de membrana de outras espécies que não vírus influenza e uma proteína de membrana de uma fonte não influenza, que são derivadas de origens aviária ou mamífera e de diferentes subtipos de vírus influenza, incluindo vírus influenza dos subtipos A e B. A estrutura pode incluir uma estrutura de proteína macromolecular quimérica, que inclui uma porção de pelo menos uma proteína possuindo uma parte não produzida por vírus influenza. A prevenção de influenza pode ser conseguida proporcionando uma estrutura de proteína macromolecular que pode ser auto-montada numa célula hospedeira a partir de uma construção recombinante. A estrutura de proteína macromolecular do invento tem a capacidade para se auto-montar em partículas semelhantes a vírus (VLPs) homotípicas ou heterotípicas que exibem epítopos conformacionais nas proteínas HA e NA, que induzem anticorpos neutralizantes que são protectores. A composição pode ser uma composição de vacina, que contém também um transportador ou diluente e/ou um adjuvante. As VLPs de influenza funcionais induzem anticorpos neutralizantes contra uma ou mais estirpes ou tipos de vírus influenza dependendo de as VLPs de influenza funcionais conterem proteínas HA e/ou NA de uma ou mais estirpes ou tipos virais. A vacina pode incluir proteínas de vírus influenza que são proteínas de vírus influenza do tipo selvagem. Preferivelmente, as proteínas estruturais contendo a VLP de influenza, ou uma sua porção, podem ser derivadas de várias estirpes de vírus influenza do tipo selvagem. As vacinas de influenza podem ser administradas a humanos ou animais para induzir imunidade protectora contra uma ou mais estirpes ou tipos de vírus influenza.

As estruturas de proteína macromoleculares do invento podem exibir actividade de hemaglutinina e/ou actividade de neuraminidase. 8

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Como descrito acima, em alguns aspectos, o invento proporciona um método para produzir uma VLP derivada de influenza construindo uma construção recombinante que codifica genes estruturais de Ml, HA e NA de influenza. Utiliza-se uma construção recombinante para transfectar, infectar ou transformar uma célula hospedeira adequada com o baculovirus recombinante. A célula hospedeira é cultivada sob condições que permitem a expressão de Ml, HA e NA e a VLP é formada na célula hospedeira. Colhe-se o meio de células infectadas contendo uma VLP de influenza funcional e purifica-se a VLP. O invento pode também apresentar um passo adicional de co-transfecção, co-infecção ou co-transformação da célula hospedeira com uma segunda construção recombinante que codifica uma segunda proteína de influenza, incorporando desse modo a segunda proteína de influenza na VLP. Estas proteínas estruturais podem ser derivadas de vírus influenza, incluindo ΝΑ, M2 e NP, e pelo menos uma proteína estrutural é derivada de origem aviária ou mamífera. A proteína estrutural pode ser de um vírus influenza do subtipo A e B. De acordo com o invento, a célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica. Adicionalmente, a VLP pode ser uma VLP quimérica. O invento apresenta também um método de formulação de uma substância farmacêutica contendo uma VLP de influenza por introdução de construções recombinantes codificando genes virais de influenza em células hospedeiras e permitindo a auto-montagem das proteínas virais de influenza recombinantes numa VLP homotípica ou heterotípica funcional em células como descrito acima. A VLP de influenza é isolada e purificada e é formulada uma substância farmacêutica contendo a VLP de influenza. A substância farmacêutica pode ainda incluir um adjuvante. Adicionalmente, o invento proporciona um método para formulação de um fármaco, por mistura de uma substância farmacêutica contendo uma VLP de influenza com uma vesícula de lípido, i.e., uma vesícula de lípido não iónico. Assim, VLPs homotípicas ou heterotípicas funcionais podem formar-se como rebentos como partículas com envelope a partir de células infectadas. As VLPs de influenza formadas como rebentos podem ser isoladas e purificadas por ultracentrifugação ou cromatografia de coluna como substâncias de fármaco e formuladas sozinhas ou com 9

ΕΡ 1 644 037/PT adjuvantes tais como Novasomesg®, um produto da Novavax, Inc., como produtos farmacêuticos tais como vacinas. As Novasomes®, que proporcionam um efeito imunológico melhorado, são adicionalmente descritas na Patente dos E.U.A N.° 4911928. O invento proporciona a VLP ou composição para utilização num método de tratamento, prevenção ou geração de uma resposta imunitária protectora.

Como aqui descrito adicionalmente, uma substância farmacêutica de VLP de influenza pode ser formulada como reagentes de laboratório utilizados para estudos da estrutura do vírus influenza e ensaios de diagnóstico clínico. O pedido de patente descreve também um kit para tratamento de vírus influenza por administração de uma quantidade eficaz de uma composição do invento e instruções de utilização.

Breve descrição dos desenhos A Figura 1 ilustra a sequência de nucleótidos do gene de neuraminidase (NA) de virus influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) aviário (SEQ ID NO:l). A Figura 2 ilustra a sequência de nucleótidos do gene de hemaglutinina (HA) de virus influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) aviário (SEQ ID NO:2). A Figura 3 ilustra a sequência de nucleótidos do gene de proteína de matriz Ml (Ml) de vírus influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) aviário (SEQ ID NO:3). A Figura 4 ilustra os vectores de transferência para construção de baculovírus recombinantes para expressão de proteínas HA, NA e Ml de influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) aviário. A Figura 4A ilustra um vector de transferência para expressão de genes individuais e a Figura 4B ilustra o vector de transferência para multi-expressão dos genes. A Figura 5 ilustra a expressão das proteínas HA, NA e Ml de vírus influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) aviário em células Sf-9S. 10

ΕΡ 1 644 037/PT A Figura 6 ilustra a purificação de VLPs de influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) aviário pelo método do gradiente de densidade de sacarose. A Figura 7 ilustra a detecção de proteina de virus influenza por cromatografia de filtração em gel. Os anticorpos utilizados nas análises Western blot são como se segue: (A) anti-H9N2 de coelho; (b) mAb anti-Ml murino; e (C) anti-BACgp64 murino. A Figura 8 ilustra a detecção de proteínas de influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) aviário incluindo partículas subvirais, VLP e complexos de VLP, por microscopia electrónica. A Figura 9 ilustra a actividade de hemaglutinação de VLPs de influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) aviário purificadas. A Figura 10 VLPs purificadas aviário. ilustra a actividade de neuraminidase de de influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) A Figura 11 ilustra os programas de imunização e colheitas de sangue para o estudo de imunogenicidade de influenza recombinante com VLPs purificadas de influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) aviário em ratinhos. A Figura 12 ilustra os resultados de um estudo de imunogenicidade em ratinhos imunizados com VLPs de influenza H9N2 recombinante. A Figura 12A ilustra soros a partir de ratinhos BALB/c imunizados com VLPs recombinantes compreendendo proteínas HA, NA e Ml de vírus influenza tipo A/H9N2/Hong Kong/1073/99 aviária. A Figura 12B ilustra soros a partir de coelhos brancos New Zealand imunizados com vírus influenza de tipo A H9N2 aviário inactivado que foram feitos reagir com blots Western contendo vírus influenza tipo A H9N2 aviário inactivado (pistas 1 e 3) ou vírus influenza tipo A H9N2 aviário adaptado ao frio (pistas 2 e 4). 11 ΕΡ 1 644 037/ΡΤ

Descrição detalhada do invento

Como aqui utilizado, o termo "baculovírus", também conhecido como baculoviridae, refere-se a uma familia de vírus de ADN de envelope de artrópodes, cujos membros podem ser utilizados como vectores de expressão para produzir proteínas recombinantes em culturas de células de insecto. 0 virião contém um ou mais nucleocapsídeos em forma de bastão contendo uma molécula de ADN de cadeia dupla circular super-enrolada (Mr 54 χ 106-154 χ 106) . 0 vírus utilizado como um vector é geralmente vírus de poliedrose nuclear (NVP) de Autographa californica. A expressão de genes introduzidos está sob o controlo do promotor forte que normalmente regula a expressão do componente de proteína poliédrica da inclusão nuclear grande na qual os vírus são incorporados nas células infectadas.

Como aqui utilizado, o termo "derivado de" refere-se à origem ou fonte, e pode incluir moléculas de ocorrência natural, recombinantes, não purificadas ou purificadas. As proteínas e moléculas do presente invento podem ser derivadas de moléculas de influenza ou não influenza.

Como aqui utilizado o termo "primeira" proteína de vírus influenza, i.e., uma primeira proteína Ml de vírus influenza, refere-se a uma proteína, tal como Ml, HA, NA e M2, que é derivada de uma estirpe particular de vírus influenza. A estirpe ou tipo do primeiro vírus influenza difere da estirpe ou tipo da segunda proteína de vírus influenza. Assim, uma "segunda" proteína de vírus influenza, i.e., a segunda proteína Ml de vírus influenza, refere-se a uma proteína, tal como Ml, HA, NA e M2, que é derivada de uma segunda estirpe de vírus influenza, que é uma estirpe ou tipo diferente da primeira proteína de vírus influenza.

Como aqui utilizado, o termo "actividade de hemaglutinina" refere-se à capacidade de proteínas contendo HA, VLPs ou suas porções para se ligarem e aglutinarem glóbulos vermelhos (eritrócitos) .

Como aqui utilizado, o termo "actividade de neuraminidase" refere-se à actividade enzimática de proteínas 12

ΕΡ 1 644 037/PT contendo NA, VLPs ou suas porções para clivarem resíduos de ácido siálico a partir de substratos incluindo proteínas tais como fetuína.

Como aqui utilizado, o termo "heterotípico" refere-se a um ou mais tipos ou estirpes diferentes de virus.

Como aqui utilizado, o termo "homotípico" refere-se a um tipo ou estirpe de virus.

Como aqui utilizado, o termo "estrutura de proteína macromolecular" refere-se à construção ou arranjo de uma ou mais proteínas.

Como aqui utilizado, o termo vacina "multivalente" refere-se a uma vacina contra múltiplos tipos ou estirpes de vírus influenza.

Como aqui utilizado, o termo "não influenza" refere-se a uma proteína ou molécula que não é derivada de vírus influenza.

Como aqui utilizado, o termo "vacina" refere-se a uma preparação de patogénios mortos ou atenuados, de determinantes antigénicos derivados, que é utilizada para induzir formação de anticorpos ou imunidade contra o patogénio. Uma vacina é administrada para proporcionar imunidade para a doença, por exemplo, influenza, que é causada por vírus influenza. O presente invento proporciona composições de vacina que são imunogénicas e proporcionam protecção. A influenza continua a ser uma preocupação de saúde pública persistente apesar da disponibilidade de vacinas de vírus inactivados específicos que são 60-80% eficazes sob condições óptimas. Quando estas vacinas são eficazes, a doença é usualmente evitada prevenindo a infecção virai. Pode ocorrer falha na vacina como resultado de diferenças antigénicas acumuladas (desvio antigénico e deriva antigénica). Por exemplo, o vírus influenza tipo A H9N2 aviário foi co-circulado com vírus influenza tipo A Sydney/97 H3N2 humano em porcos e conduziu a rearranjo genético e 13

ΕΡ 1 644 037/PT aparecimento de novas estirpes de virus influenza humano com potencial pandémico (Peiris et al. , 2001) . No caso de um tal desvio antigénico, é improvável que as vacinas actuais proporcionem protecção adequada.

Outra razão para a insuficiência de programas de vacinação da influenza é a persistência de imunidade relativamente curta induzida pelas actuais vacinas. A inadequação de medidas de controlo da influenza reflecte a utilização restrita das vacinas actuais por causa da reactogenicidade da vacina e de efeitos secundários em crianças pequenas, idosos e pessoas com alergias a componentes de ovos, que são utilizados na fabricação de vacinas de virus influenza inactivado licenciadas comercialmente.

Adicionalmente, as vacinas de virus influenza inactivado frequentemente não possuem ou contêm epítopos conformacionais de HA e NA alterados, que induzem anticorpos neutralizantes e desempenham um papel principal na protecção contra a doença. Assim, vacinas virais inactivadas, bem como algumas vacinas de proteína de subunidades de influenza monoméricas recombinantes, proporcionam protecção inadequada. Por outro lado, estruturas de proteína macromoleculares, tais como capsómeros, partículas subvirais e/ou VLPs, incluem múltiplas cópias de proteínas nativas exibindo epítopos conformacionais, que são vantajosos para imunogenicidade óptima da vacina. O presente pedido de patente descreve a clonagem de genes de HA, NA e Ml de vírus influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) aviário num único vector de expressão de baculovírus, sozinhos ou em tandem, e a produção de candidatos a vacina de influenza ou reagentes constituídos de proteínas de influenza recombinantes estruturais, que se auto-montam em estruturas de proteína macromoleculares funcionais e imunogénicas homotípicas, incluindo partículas subvirais de influenza e VLP de influenza, em células de insecto infectadas por baculovírus. O presente pedido de patente apresenta adicionalmente a clonagem de genes de HA, NA, Ml, M2 e NP de vírus influenza 14 ΕΡ 1 644 037/ΡΤ A/Sydney/5/94 (Η3Ν2) humano em vectores de expressão de baculovírus e a produção de candidatos a vacina de influenza ou reagentes constituídos de proteínas estruturais de influenza, que se auto-montam em estruturas de proteína macromoleculares funcionais e imunogénicas homotípicas, incluindo partículas subvirais de influenza e VLP de influenza, em células de insecto infectadas por baculovírus.

Adicionalmente, o presente pedido de patente descreve a clonagem do gene HA de vírus influenza A/Sydney/5/94 (H3N2) humano e dos genes de HA, NA e Ml de vírus influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) aviário num único vector de expressão de baculovírus em tandem e a produção de candidatos a vacina de influenza ou reagentes constituídos de proteínas estruturais de influenza, que se auto-montam em estruturas de proteína macromoleculares funcionais e imunogénicas heterotípicas, incluindo partículas subvirais de influenza e VLP de influenza, em células de insecto infectadas por baculovírus.

Este invento é adicionalmente ilustrado pelos exemplos seguintes que não deverão se entendidos como limitantes.

EXEMPLOS ESPECÍFICOS EXEMPLO 1

Materiais e Métodos

Os genes HA, NA e Ml de vírus influenza A/Hong

Kong/1073/99 (H9N2) aviário foram expressos em células de Spodoptera frugiperda (linha de células Sf-9S; ATCC PTA-4047) utilizando o sistema de expressão de bacmídeo de baculovírus. Os genes de HA, NA e Ml foram sintetizados por transcrição reversa e reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando ARN isolado a partir de vírus influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) aviário (Figuras 1, 2 e 3). Para transcrição reversa e PCR, utilizaram-se iniciadores de oligonucleótido específicos para genes de HA, NA e Ml de vírus influenza A/Hong

Kong/1073/99 (H9N2) aviário (Tabela 1) . As cópias de ADNc destes genes foram clonadas inicialmente no vector de subclonagem bacteriano, pCR2.1TOPO. A partir dos três plasmídeos baseados em pCR2.1TOPO resultantes, inseriram-se 15

ΕΡ 1 644 037/PT os genes de HA, NA e Ml a jusante dos promotores de poliedrina AcMNPV no vector de transferência de baculovírus, pFastBacl (Invitrogen), resultando em três plasmídeos baseados em pFastBacl: pHA, pNA e pMl expressando estes genes de vírus influenza, respectivamente. Depois, construiu-se um plasmídeo individual pHAM baseado em pFastBacl codificando ambos os genes HA e Ml, cada um a jusante de um promotor de poliedrina separado (Figura 4). Determinou-se a sequência de nucleótidos do gene NA com as regiões 5' e 3' adjacentes no plasmídeo pNA (SEQ ID NO:l) (Figura 1). Ao mesmo tempo, determinaram-se também as sequências de nucleótido dos genes HA e Ml com as regiões adjacentes utilizando o plasmídeo pHAM (SEQ ID NO:2 e 3) (Figuras 2 e 3).

Finalmente, um fragmento de ADN de restrição do plasmídeo pHAM, que codificava ambas as cassetes de expressão de HA e Ml, foi clonado no plasmídeo pNA. Isto resultou no plasmídeo pNAHAM codificando os genes de HA, NA e Ml de vírus influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) aviário (Figura 4). O plasmídeo pNAHAM foi utilizado para construir um baculovírus recombinante contendo genes de vírus influenza NA, HA e Ml integrados no genoma, cada um a jusante de um promotor de poliedrina de baculovírus separado. A infecção de células de insecto Sf-9S permissivas com o baculovírus recombinante resultante resultou em co-expressão destes três genes de influenza em cada célula Sf-9S infectada com este baculovírus recombinante.

Resultados

Os produtos de expressão em células Sf-9S infectadas foram caracterizados às 72 h pós-infecção (p.i.) por análise SDS-PAGE, coloração de proteína com azul de Coomassie e análise Western immunoblot utilizando anticorpos específicos de HA e Ml (Figura 5) . A análise Western immunoblot foi realizada utilizando anticorpo de coelho criado contra vírus influenza tipo A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (CDC, Atlanta, Georgia, E.U.A.), ou anticorpo monoclonal de ratinho para proteína Ml de influenza (Serotec, Reino Unido). As proteínas HA, NA e Ml das pesos moleculares esperados (64 kDa, 60 kDa e 31 kDa, respectivamente) foram detectadas por análise Western 16

ΕΡ 1 644 037/PT immunoblot. Em comparação com a quantidade de proteína HA detectada neste ensaio, a proteína NA mostrou reactividade mais baixa com soro de coelho para vírus influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2). Explicações para a quantidade de proteína NA detectável incluíram níveis de expressão mais baixos da proteína NA a partir de células Sf-9S infectadas com baculovírus recombinante, em comparação com a proteína HA, reactividade mais baixa da NA com este soro sob condições desnaturantes no ensaio Western immunoblot (devido à eliminação de epítopos de NA importantes durante electroforese em gel de ligação a membrana), avidez NA-anticorpo mais baixa em comparação com HA-anticorpo, ou uma menor abundância de anticorpos para NA no soro. O meio de cultura a partir das células Sf-9S infectadas com baculovírus recombinante, expressando proteínas HA, NA e Ml de A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), foi também sondado em relação a proteínas de influenza. Os sobrenadantes de cultura clarificados foram submetidos a ultracentrifugação a 27000 rpm de modo a concentrar complexos de proteína de vírus influenza de peso molecular elevado, tais como partículas subvirais, VLP, complexos de VLP e possivelmente, outras partículas auto-montadas constituídas de proteínas de influenza HA, NA e Ml. Os produtos de proteína sedimentados foram de novo suspensos em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,2) e purificados adicionalmente por ultracentrifugação em gradientes descontínuos em degrau de 20-60% de sacarose. Colheram-se as fracções a partir dos gradientes de sacarose e analisaram-se por análise SDS-PAGE, análise Western immunoblot e microscopia electrónica.

Foram detectadas Proteínas HA e Ml de influenza dos pesos moleculares esperados em múltiplas fracções de gradiente de densidade de sacarose por coloração com azul de Coomassie e análise Western immunoblot (Figura 6) . Isto sugeriu que proteínas virais de influenza a partir de células Sf-9S infectadas são agregadas em complexos de peso molecular elevado, tais como capsómeros, partículas subvirais, VLP, e/ou complexos de VLP. As proteínas de NA, ainda que detectadas inconsistentemente por coloração com azul de Coomassie e análise Western immunoblot, o que era provavelmente devido à incapacidade do soro de coelho anti- 17

ΕΡ 1 644 037/PT influenza para reconhecer proteína de NA desnaturada no ensaio Western immunoblot, foram consistentemente detectadas no ensaio de actividade da enzima neuraminidase (Figura 10). A presença de VLPs de peso molecular elevado foi confirmada por cromatografia de filtração em gel. Uma alíquota das fracções de gradiente de densidade de sacarose contendo proteínas virais de influenza foi carregada por cima de uma coluna de Sepharose CL-4B para fraccionamento baseado no peso. A coluna foi calibrada com Azul de Dextrano 2000, Amarelo de Dextrano e Vitamina B12 (Amersham Pharmacia) com pesos moleculares aparentes de 2000000, 20000 e 1357 daltons, respectivamente, e determinou-se o volume vazio da coluna. Como esperado, proteínas virais de influenza de peso molecular elevado migraram no volume vazio da coluna, o que era característico de proteínas macromoleculares, tais como partículas de vírus. As fracções foram analisadas por análise Western immunoblot para detectar proteínas de influenza e baculovírus. Por exemplo, foram detectadas proteínas Ml nas fracções de volume vazio, que continham também proteínas de baculovírus (Figura 7). A morfologia de VLPs e proteínas de influenza em fracções de gradiente de sacarose foi elucidada por microscopia electrónica. Para microscopia electrónica de coloração negativa, as proteínas de influenza a partir de duas fracções de gradiente de densidade de sacarose foram fixadas com glutaraldeído a 2% em PBS, pH 7,2. O exame por microscopia electrónica de amostras coradas negativamente revelou a presença de complexos de proteína macromoleculares ou VLPs em ambas as fracções. Estas VLPs exibiram diferentes tamanhos, incluindo diâmetros de aproximadamente 60 e 80 nm, e morfologias (esferas). Foram também detectados complexos maiores de ambos os tipos de partículas, bem como partículas em forma de bastão (Figura 8) . Todas as estruturas macromoleculares observadas tinham espigões (peplómeros) sobre as suas superfícies, o que é caracterí stico dos vírus influenza. Uma vez que o tamanho e aspecto de partículas de 80 nm era similar a partículas de vírus influenza do tipo selvagem, estas estruturas representavam provavelmente VLPs, que tinham similaridades distintas dos viriões de influenza do tipo selvagem, incluindo similar geometria de partícula, 18

ΕΡ 1 644 037/PT arquitectura, número de triangulação, simetria e outras características. As partículas mais pequenas de aproximadamente 60 nm podem representar partículas subvirais que diferem das VLPs tanto morfologicamente como estruturalmente. Um fenómeno similar de proteínas macromoleculares recombinantes de diferentes tamanhos e morfologias foi também reportado para outros vírus. Por exemplo, antigénio do core recombinante (HBcAg) do vírus de hepatite B forma partículas de diferentes tamanhos, que têm diferente arquitectura e número de triangulação T=4 e T=3, respectivamente (Crowther et al., 1994).

Para caracterizar as propriedades funcionais das VLPs de influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) purificadas, testaram-se amostras num ensaio de hemaglutinação (Figura 9) e num ensaio de enzima neuraminidase (Figura 10). Para o ensaio de hemaglutinação, diluições de 1 para 2 de VLPs de influenza purificadas foram misturadas com glóbulos vermelhos de cobaia a 0,6% e incubou-se a 4°C durante 1 h ou 16 h. A extensão de hemaglutinação foi inspeccionada visualmente e a diluição mais elevada de proteínas de influenza recombinantes, capaz de aglutinar glóbulos vermelhos, foi determinada e registada (Figura 9) . Mais uma vez, muitas fracções do gradiente de densidade de sacarose exibiram actividade de hemaglutinação, sugerindo que estavam presentes múltiplas formas macromoleculares e monoméricas de proteínas de influenza. O título mais elevado detectado foi 1:4000. Numa experiência de controlo, o vírus influenza A/Shangdong do tipo selvagem demonstrou um título de 1:2000. O ensaio de hemaglutinação revelou que as VLPs recombinantes consistindo de proteínas HA, NA e Ml de vírus influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) eram funcionalmente activas. Isto sugeriu que a montagem, conformação e dobragem das proteínas da subunidade HA nas VLPs eram similares ou idênticas às do vírus influenza do tipo selvagem.

Adicionalmente, foi realizado um ensaio de enzina neuraminidase em amostras de VLPs de H9N2 purificadas. Determinou-se a quantidade de actividade de neuraminidase em fracções de gradiente de densidade de sacarose utilizando fetuína como substrato. No ensaio de neuraminidase, a neuraminidase clivou ácido siálico das moléculas de substrato 19

ΕΡ 1 644 037/PT para libertar ácido siálico para medição. Adicionou-se reagente arsenito para parar a actividade de enzima. A quantidade de ácido siálico libertada foi determinada quimicamente com ácido tiobarbitúrico que produziu uma pigmentação cor-de-rosa que era proporcional à quantidade de ácido siálico livre. Mediu-se a quantidade de cor (cromóforo) espectrofotometricamente ao comprimento de onda de 549 nm. Utilizando este método, a actividade de neuraminidase foi demonstrada em fracções de gradiente de sacarose contendo VLPs de influenza (Figura 10). Como esperado, a actividade foi observada em várias fracções, com duas fracções de pico. Como controlo positivo, utilizou-se virus influenza do tipo selvagem. O virus influenza do tipo selvagem exibiu actividade de enzima neuraminidase comparável à de VLPs de influenza purificadas. Estas constatações corroboraram os resultados de HA no que se refere à conformação de proteína e sugeriram que VLPs purificadas de vírus influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) eram funcionalmente similares às do vírus influenza do tipo selvagem.

Os resultados das análises e ensaios acima indicaram que a expressão de proteínas HA, NA e Ml de vírus influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) era suficiente para a auto-montagem e transporte de VLPs funcionais a partir de células de insecto infectadas por baculovírus. Uma vez que estas VLPs de influenza representavam proteínas estruturais de influenza auto-montadas e demonstraram propriedades funcionais e bioquímicas similares às do vírus influenza do tipo selvagem, estas VLPs de influenza conservavam conformações estruturais importantes incluindo epítopos de superfície necessários para vacinas de influenza eficazes. EXEMPLO 2: Clonagem por RT-PCR de genes virais de influenza A/Hong Kong/1073/99 aviário É um objectivo do presente invento proporcionar sequências de ácido nucleico sintéticas capazes de dirigir a produção de proteínas de vírus influenza recombinantes. Estas sequências de ácido nucleico sintéticas foram obtidas por métodos de transcrição reversa e reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando ARN genómico natural de vírus influenza isolado a partir do vírus. Para o propósito deste 20 ΕΡ 1 644 037/ΡΤ pedido de patente, sequência de ácido nucleico refere-se a ARN, ADN, ADNc ou qualquer sua variante sintética que codifica a proteina. O virus influenza A/Honq Kong/1073/99 (H9N2) aviário foi fornecido pelo Dr. K. Subbarao (Centers for Disease Control, Atlanta, GA, E.U.A.). O ARN genómico virai foi isolado pelo método de extracção de ARN de fenol ácido sob condições de contenção Biosafety Levei 3 (BSL3) no CDC utilizando o reagente Trizol LS (Invitrogen, Carlsbad, CA, E.U.A.). As moléculas de ADNc dos ARN virais foram obtidas por transcrição reversa utilizando transcriptase reverse MuLV (Invitrogen) e PCR utilizando iniciadores de oligonucleótido específicos para proteínas HA, NA e Ml e ADN-polimerase Taq I (Invitrogen) (Tabela 1). Os fragmentos de PCR foram clonados no vector de subclonagem bacteriano, pCR2.1TOPO (Invitrogen), entre locais Eco RI que resultaram em três plasmideos recombinantes, contendo os clones de ADNc de HA, NA e Ml. EXEMPLO 3: Clonagem por RT-PCR de genes virais de influenza A/Sydney/5/94 (H3N2) humano O virus influenza A/Sydney/5/94 (H3N2) foi obtido no Dr. M. Massare (Novavax, Inc., Rockville, MD). O ARN genómico virai foi isolado pelo método de extracção de ARN de fenol ácido sob condições de contenção BSL2 na Novavax, Inc. utilizando o reagente Trizol LS (Invitrogen). As moléculas de ADNc dos ARN virais foram obtidas por transcrição reversa e PCR utilizando iniciadores de oligonucleótido específicos para proteínas HA, NA, Ml, M2 e NP (Tabela 2) . Os fragmentos de PCR foram clonados no vector de subclonagem bacteriano, pCR2.1TOPO, entre locais Eco RI que resultou em cinco plasmideos recombinantes, contendo os clones de ADNc de HA, NA, Ml, M2 e NP. EXEMPLO 4: Clonagem de ADNc virais de Influenza A/Hong Kong/1073/99 aviária em vectores de transferência de baculovirus A partir dos plasmideos baseados em pCR2.1TOPO, os genes de HA, NA ou Ml foram subclonados no vector de transferência de baculovirus pFastBacl (Invitrogen) no locus poliédrico e 21 ΕΡ 1 644 037/ΡΤ em locais Τη7 att e a jusante do promotor de poliedrina de baculovírus e a montante da sequência de sinal de poliadenilação. Os genes virais foram ligados com ADN-ligase T4. Para o gene de HA, um fragmento de ADN Bam Hl-Κρη I a partir de pCR2.1TOPO-HA foi inserido em ADN de plasmídeo pFastBacl digerido com Bam Hl-Κρη I. Para o gene de NA, um fragmento de ADN Eco RI a partir de pCR2.1T0P0-NA foi inserido em ADN de plasmídeo pFastBacl digerido com Eco RI. Para o gene de Ml, um fragmento de ADN Eco RI a partir de pCR2.1T0P0-M1 foi inserido em ADN de plasmídeo pFastBacl digerido com Eco RI. Bactérias E. coli DH5a competentes (Invitrogen) foram transformadas com estas misturas reaccionais de ligação de ADN, e resultaram colónias transformadas e clones bacterianos isolados. Os plasmideos baseados em pFastBacl resultantes, pFastBacl-HA, pFastBacl-ΝΑ e pFastBacl-ΜΙ foram caracterizados por mapeamento com enzimas de restrição sobre geles de agarose (Figura 4A) . As sequências de nucleótido como se mostram nas Figuras 1-3 dos genes clonados foram determinadas por sequenciação de ADN automática. A análise da sequência de ADN mostrou que os genes de influenza clonados de HA, NA e Ml eram idênticos às sequências de nucleótido para estes genes conforme publicadas anteriormente [genes NA HA, e Ml de influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (números de acesso GenBank AJ404629, AJ404626 e AJ278646, respectivamente)]. EXEMPLO 5: Clonagem de ADNc virais de influenza A/Sydney/5/94 humana em vectores de transferência de baculovirus A partir dos plasmideos baseados em pCR2.1T0P0, os genes HA, NA, Ml, M2 e NP foram subclonados no vector de transferência de baculovirus pFastBacl no locus poliédrico e em locais Tn7 att e a jusante do promotor de poliedrina de baculovirus e a montante da sequência de sinal de poliadenilação. Os genes virais foram ligados com ADN-ligase T4. Para o gene de HA, um fragmento de ADN Bam Hl-Κρη I a partir de pCR2.lT0P0-hHA3 foi inserido em ADN de plasmídeo pFastBacl digerido com Bam Hl-Κρη I. Para o gene de NA, um fragmento de ADN Eco RI a partir de pCR2. ΙΤΟΡΟ-hNA foi inserido em ADN de plasmídeo pFastBacl digerido com Eco RI. Para o gene de Ml, um fragmento de ADN Eco RI a partir de pCR2.ΙΤΟΡΟ-hMl foi inserido em ADN de plasmídeo pFastBacl 22 ΕΡ 1 644 037/ΡΤ digerido com Eco RI. Para o gene de M2, um fragmento de ADN Eco RI a partir de pCR2. lT0P0-hM2 foi inserido em ADN de plasmideo pFastBacl digerido com Eco RI. Para o gene de NP, um fragmento de ADN Eco RI a partir de pCR2. ΙΤΟΡΟ-hNP foi inserido em ADN de plasmideo pFastBacl digerido com Eco RI. Bactérias E. coli DH5oí competentes foram transformadas com estas misturas reaccionais de ligação de ADN, resultaram colónias transformadas e clones bacterianos isolados. Os plasmideos baseados em pFastBacl resultantes, pFastBacl-hHA3, pFastBacl-hNA2 pFastBacl-hMl, pFastBacl-hM2 e pFastBacl-hNP foram caracterizados por mapeamento com enzimas de restrição sobre geles de agarose. As sequências de nucleótido dos genes clonados foram determinadas por sequenciação de ADN automática. A análise da sequência de ADN mostrou que os genes de HA, NA, Ml, M2 e NP de influenza clonados eram idênticos às sequências de nucleótido para estes genes conforme publicadas anteriormente. EXEMPLO 6: Construção de vectores de transferência de baculovirus multigénicos codificando múltiplos genes virais de influenza A/Hong Kong/1073/99 aviário

De modo a construir vectores de transferência de bacmideo baseados na construção pFastBacl expressando múltiplos genes de virus influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), inicialmente um fragmento de ADN Sna BI-Hpa I a partir do plasmideo pFastBacl-ΜΙ contendo o gene de Ml foi clonado no local Hpa I de pFastBacl-HA. Isto resultou num plasmideo pFastBacl-HAM codificando ambos os genes HA e Ml dentro de cassetes de expressão independentes e expressos sob o controlo de promotores de poliedrina separados.

Finalmente, um fragmento de ADN Sna BI-Avr II a partir de pFastBacl-HAM, contendo as cassetes de expressão de HA e Ml, foi transferido para ADN de plasmideo pFastBacl-ΝΑ digerido com Hpa I-Avr II. Isto resultou no plasmideo pFastBacl-NAHAM codificando três cassetes de expressão independentes para expressão de genes de HA, NA e Ml de influenza e expressos sob o controlo de promotores de poliedrina separados (Figura 4B). 23

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Noutro exemplo, o gene de H3 a partir de pFastBacl-hHA3 (ver Exemplo 5) foi clonado em pFastBacl-NAHAM como um quarto gene de influenza virai para a expressão e produção de VLPs de influenza heterotipicas. EXEMPLO 7: Geração de baculovirus recombinante multigénico codificando genes de NA, HA e Ml de virus influenza A/Hong Kong/1073/99 aviário em células de insecto O vector de transferência de bacmideo resultante multigénico pFastBacl-NAHAM foi utilizado para gerar um baculovirus recombinante multigénico codificando genes de HA, NA e Ml de virus influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) aviário para expressão em células de insecto. ADN de bacmideo recombinantes foram produzidos por recombinação especifica nas sequências de ADN de poliedrina e Tn7 att entre ADN de pFastBacl-NAHAM e o genoma de baculovirus ÃcMNPC alojado em células E. coli DH10BAC competentes (Invitrogen) (Figura 4B) . ADN de bacmideo recombinante foi isolado pelo método de ADN de plasmideo miniprep e transfectado em células Sf-9S utilizando o lipido catiónico CELLFECTIN (Invitrogen). Após transfecção, isolaram-se baculovirus recombinantes, purificaram-se em placa e amplificaram-se em células de insecto. Prepararam-se reservas de virus em células de insecto Sf-9S e caracterizaram-se quanto à expressão de produtos genéticos HA, NA e Ml de influenza virai aviário. O baculovirus recombinante resultante foi designado bNAHAM-H9N2 . EXEMPLO 8: Expressão de proteínas recombinantes de influenza A/Hong Kong/1073/99 em células de insecto Células de insecto Sf-9S mantidas como culturas em suspensão em balões de shaker a 28°C em meio isento de soro (HyQ SFM, HyClone, Ogden, UT) foram infectadas a uma densidade celular de 2 χ 106 células/ml com o baculovirus recombinante, bNAHAM-H9N2, a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 3 pfu/célula. A infecção por virus prosseguiu durante 72 h para permitir a expressão de proteínas de influenza. A expressão de proteínas HA e Ml de vírus influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) aviário em células de insecto infectadas foi confirmada por análises de SDS-PAGE e 24 ΕΡ 1 644 037/ΡΤ

Western immunoblot. A análise SDS-PAGE foi realizada sobre geles NuPAGE de gradiente linear de 4-12% (Invitrogen) sob condições reduzidas e desnaturantes. Os anticorpos primários na análise Western immunoblot foram anti-soro policlonal de coelho criado contra virus influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) aviário obtido no CDC e anti-soro monoclonal murino para proteina Ml de influenza (Serotec, Reino Unido). Os anticorpos secundários para análise Western immunoblot foram anti-soro IgG de cabra conjugado com fosfatase alcalina criado contra IgG (H+L) de coelho ou rato (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD, E.U.A.)· Os resultados destas análises (Figura 5) indicaram que as proteínas HA e Ml eram expressas nas células de insecto infectadas por baculovírus. EXEMPLO 9: Purificação de complexos de proteina macromoleculares e de partículas semelhantes a vírus influenza H9N2 aviário recombinante

Os sobrenadantes de cultura (200 ml) de células de insecto Sf-9S infectadas com o baculovírus recombinante bNAHAM-H9N2, que expressava produtos genéticos HA, NA e Ml de vírus influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) aviário, foram colhidos por centrifugação a baixa velocidade. Os sobrenadantes de cultura foram clarificados por centrifugação numa centrifugadora Sorvai RC-5B superspeed durante 1 h a 10 000 x g e 4°C utilizando um rotor GS-3. Os vírus e VLPs foram isolados a partir dos sobrenadantes de cultura clarificados por centrifugação numa ultracentrifugadora Sorvai OTD-65 durante 3 h a 27 000 rpm e 4°C utilizando um rotor de suportes oscilantes Sorvai TH-641. Ressuspendeu-se o sedimento de vírus em 1 ml de PBS (pH 7,2), carregou-se sobre um gradiente descontínuo em degrau de sacarose de 20-60% (p/v), e resolveu-se por centrifugação numa ultracentrifugadora Sorvai OTD-65 durante 16 h a 27 000 rpm e 4°C utilizando um rotor Sorvai TH-641. Foram colhidas fracções (0,5 ml) a partir do topo do gradiente de sacarose.

Analisaram-se as proteínas influenza nas fracções de gradiente de sacarose por análises SDS-PAGE e Western immunoblot como descrito acima no Exemplo 6. As proteínas HA e Ml foram encontradas nas mesmas fracções de gradiente de 25

ΕΡ 1 644 037/PT sacarose (Figura 6) conforme mostrado por análise Western blot e isto sugeriu que as proteínas HA e Ml estavam associadas como complexos de proteína macromoleculares. As proteínas HA e Ml foram encontradas em fracções ao longo do gradiente de sacarose sugerindo que estas proteínas virais recombinantes estavam associadas com complexos de proteína macromoleculares de diferentes densidades e composições. EXEMPLO 10: Análise de proteínas e VLPs de influenza H9N2 aviário recombinante por cromatografia de filtração em gel

Macromoléculas de proteína tais como VLPs e proteínas monoméricas migram de modo diferente em colunas de cromatografia de filtração em gel ou exclusão de tamanhos com base na sua massa, tamanho e forma. Para determinar se as proteínas de influenza recombinantes a partir de fracções de gradiente de sacarose eram proteínas monoméricas ou complexos de proteína macromoleculares tais como VLPs, preparou-se uma coluna de cromatografia (7 mm χ 140 mm) com um volume de leito de resina de 14 ml de Sepharose CL-4B (Amersham) . A coluna de exclusão de tamanhos foi equilibrada com PBS e calibrada com Azul de Dextrano 2000, Amarelo de Dextrano e Vitamina B12 (Amersham Pharmacia) com pesos moleculares aparentes de 2000000, 20000 e 1357, respectivamente, para avaliar o volume vazio da coluna. O Azul de Dextrano 2000 foi eluído a partir da coluna no volume vazio (fracção de 6 ml). Como esperado, os complexos de proteína de influenza recombinante foram também eluídos a partir da coluna no volume vazio (fracção de 6 ml) . Este resultado era característico de um complexo de proteína macromolecular de peso molecular elevado tal como as VLPs. As proteínas virais nas fracções da coluna foram detectadas por análise Western immunoblot como descrito acima no Exemplo 6. As proteínas Ml foram detectadas nas fracções de volume vazio (Figura 7) . Como esperado as proteínas de baculovírus estavam também no volume vazio. EXEMPLO 11: Microscopia electrónica de VLPs de influenza recombinante

Para determinar se os complexos de proteína macromoleculares isolados em gradientes de sacarose e 26 ΕΡ 1 644 037/ΡΤ contendo proteínas de influenza aviária recombinante tinham morfologias similares aos viriões de influenza, foi realizado um exame ao microscópio electrónico de amostras coradas negativamente. Complexos de proteína de vírus influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) aviário recombinante foram concentrados e purificados a partir de sobrenadantes de cultura por ultracentrifugação em gradientes descontínuos de sacarose como descrito no Exemplo 7. Alíquotas das fracções de gradiente de sacarose foram tratadas com glutaraldeído a 2% em PBS, pH 7,2, absorvidas sobre grelhas revestidas a carbono/plástico descarregadas frescas e lavadas com água destilada. Coraram-se as amostras com fosfotungstato de sódio a 2%, pH 6,5, e observaram-se utilizando um microscópio electrónico de transmissão (Philips). As micrografias electrónicas de amostras coradas negativamente de complexos de proteína de influenza H9N2 aviário recombinante a partir de duas fracções de gradiente de sacarose mostraram partículas esféricas e em forma de bastão (Figura 8) a partir das duas fracções de gradiente de sacarose. As partículas tinham diferentes tamanhos (60 e 80 nm) e morfologias. Foram também detectados complexos maiores de ambos os tipos de partículas, bem como partículas em forma de bastão (Figura 8) . Todas as estruturas de complexo de proteína observadas exibiram projecções na superfície tipo espigões assemelhando-se a peplómeros de HA e NA de vírus influenza. Uma vez que o tamanho e o aspecto das partículas de 80 nm eram similares aos das partículas de vírus influenza do tipo selvagem, estas estruturas representavam provavelmente VLPs de influenza com envelope. As partículas mais pequenas de aproximadamente 60 nm representavam provavelmente partículas subvirais que diferiam das VLPs anteriores tanto morfologicamente como estruturalmente. EXEMPLO 12: Análise de caracteristicas funcionais de proteínas de influenza pelo ensaio de hemaglutinação influenza tais como que eram as VLPs e de ensaios

Para determinar se as VLPs e proteínas de purificadas possuíam actividades funcionais, hemaglutinação e actividade de neuraminidase, caracteristicas do vírus influenza, testaram-se proteínas de influenza purificadas em hemaglutinação e neuraminidase. 27

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Para o ensaio de hemaglutinação, prepararam-se séries de diluições de 1 para 2 de fracções de gradiente de sacarose contendo VLPs de influenza ou controlo positivo de virus influenza tipo A do tipo selvagem. Depois, misturaram-se com glóbulos vermelhos de cobaia a 0,6% em PBS (pH 7,2) e incubaram-se a 4°C durante 1 a 16 h. Como controlo negativo, utilizou-se PBS. Determinou-se visualmente o nivel de hemaglutinação, e determinou-se a diluição de fracção mais elevada capaz de aglutinar glóbulos vermelhos de cobaia (Figura 9). O titulo de hemaglutinação mais elevado observado para as VLPs e proteínas de influenza purificadas foi 1:4000, que era mais elevado do que o titulo exibido pelo controlo de influenza do tipo selvagem, que era 1:2000. EXEMPLO 13: Análise de caracteristicas funcionais de proteinas de influenza pelo ensaio de neuraminidase A quantidade de actividade de neuraminidase em fracções de gradiente de sacarose contendo VLP de influenza foi determinada pelo ensaio de neuraminidase. Neste ensaio, a NA (uma enzima) actuou sobre o substrato (fetuina) e libertou ácido siálico. Adicionou-se reagente de arsenito para parar a actividade da enzima. A quantidade de ácido siálico libertada foi determinada quimicamente com o ácido tiobarbitúrico que produziu uma pigmentação cor-de-rosa proporcional ao ácido siálico livre. Mediu-se a quantidade de cor (cromóforo) num espectrofotómetro ao comprimento de onda de 549 nm. Os dados, como ilustrados na Figura 8, mostraram que foi produzida uma quantidade significativa de ácido siálico por fracções dos gradientes de sacarose contendo VLP e que estas fracções correspondiam àquelas fracções exibindo actividade de hemaglutinação. EXEMPLO 13: Imunização de ratinhos BALB/c com VLPs funcionais de influenza H9N2 homotipica recombinante A imunogenicidade das VLPs de influenza recombinante foi avaliada por imunização de ratinhos seguida por análise Western blot de soros imunológicos. VLPs recombinantes (1 yg/injecção) constituídos de proteínas virais HA, NA e Ml de vírus influenza tipo A/Hong Kong/1073/99 aviário e 28

ΕΡ 1 644 037/PT purificados em gradientes de sacarose foram inoculados subcutaneamente na região deltoide de dez (10) ratinhos BALB/c fêmeas ao dia 0 e ao dia 28 (Figura 11) . Administrou-se PBS (pH 7,2) similarmente como um controlo negativo em cinco (5) ratinhos. Os ratinhos foram sangrados a partir da cavidade supraorbital ao dia 1 (pré-sangria) , ao dia 27 (sangria primária) e ao dia 54 (sangria secundária). Os soros foram colhidos a partir das amostras de sangue após coagulação de um dia para o outro e centrifugação.

Para análise Western blot, 200 ng de virus influenza tipo A H9N2 aviário inactivado ou virus influenza tipo A H9N2 aviário adaptado ao frio, bem como padrões de proteína pré-corados com SeeBlue Plus 2 (Invitrogen), foram desnaturados (95°C, 5 minutos) e submetidos a electroforese sob condições reduzidas (β-mercaptoetanol 10 mM) sobre geles NuPAGE de gradiente de poliacrilamida de 4-12% (Invitrogen) em tampão MES a 172 volts até o pigmento de controlo de azul de bromofenol desaparecer. Para os geles de proteína, as proteínas submetidas a electroforese foram visualizadas por coloração com reagente Azul de Coomassie Coloidal (Invitrogen). Transferiram-se as proteínas do gel para membranas de nitrocelulose em metanol pelo procedimento Western blot padrão. Soros de ratinhos imunizados com VLP e de coelhos imunizados com vírus influenza H9N2 aviário inactivado (soro de controlo positivo) foram diluídos 1:25 e 1:100, respectivamente, em solução de PBS (pH 7,2) e utilizados como anticorpo primário. Membranas ligadas a proteína, que estavam bloqueadas com caseína a 5%, foram feitas reagir com anti-soros primários durante 60 minutos à temperatura ambiente com agitação constante. Após lavagem das membranas de anticorpo primário com solução salina tamponada com fosfato contendo Tween 20, anti-soros secundários [conjugado de IgG de cabra anti-murino - fosfatase alcalina (1:10000) ou conjugado de IgG de cabra anti-coelho fosfatase alcalina (1:10000)] foram feitos reagir durante 60 minutos com a membrana. Após lavagem das membranas de anticorpo secundário com solução salina tamponada com fosfato contendo Tween 20, as proteínas de ligação de anticorpo sobre as membranas foram visualizadas por revelação com o substrato cromogénico tal como NBT/BCIP (Invitrogen). 29 ΕΡ 1 644 037/ΡΤ

Os resultados da análise Western blot (Figura 12) foram que proteínas com pesos moleculares similares às proteinas virais HA e Ml (75 e 30 kDa, respectivamente) ligaram-se aos soros de controlo positivo (Figura 12B) e aos soros de ratinhos imunizados com as VLPs de influenza H9N2 recombinante (Figura 12A). Estes resultados indicaram que as VLPs de influenza H9N2 recombinante sozinhas eram imunogénicas em ratinhos por esta via de administração. São feitas as referências seguintes:

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Outras concretizações

Os peritos na especialidade reconhecerão, ou serão capazes de determinar utilizando apenas experimentação de rotina, muitos equivalentes das concretizações especificas do invento aqui descritas. Pretende-se que estes equivalentes estejam abrangidos na medida em que estes caiam dentro das reivindicações seguintes: TABELA 1

Fracção#* Título 1 < 1:500 3 < 1:500 5 1:500 7 1:1000 9 1:2000 11 1:2000 12 1:4000 14 1:500 16 < 1:500 PBS * * < 1:500 A/Shangdong/9/93** * 1:1000 * Fracções a partir do gradiente de sacarose de 20-60% ** Controlo Negativo *** Controlo positivo 33 ΕΡ 1 644 037/ΡΤ TABELA 2 Vírus Estirpe Gene Iniciador de RT-PCR Tipo A (H3N2) Sydney/5/97 Hemaglutinina (HA) Directo 5'-A GGATCCATGAAGACTATCATTGCTTTGAG-3' Reverso 5'-A GGTACCTCAAATGCAAATGTTGCACCTAATG-3' Neuraminidase (NA) Directo í*-OGGGACAAGTTIXn-ACAAAAAAGCAOGCTTAGAAG GAGATAGAACC A.TC AATCCAAATCAAAAGATAATAAC-3’ Reverso j 'GGGGACCACTTTGTACAAG AAAGCTGCGTCCTATAT aggcatgagattgat0tcccc-3· Matriz (Ml) Directo 5'-AAA GAATTC ATG AGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGTA-3' Reverso 5'-AAA TTCGAA TTACTCCAGCTCTATGCTGACAAAATGAC-3' M2 Directo 5’-A GAATTC ATG AGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGCCT ATCAGAAACGAATOGGGGTGC-3’ Reverso 5'-AAA TTCGAA TTACTCCAGCTCTATGCTGACAAAATGAC-3' Nucleoproteína (NP) Directo 5'-A GAATTC ATG GCGTCCCAAGGCACCAAACG3' Reverso 5’*A gcggccgotàattgtcgtactcctctgcattgtctccgaa GAAATAAG*3’ Tipo B Harbin Hemaglutinina (HA) Directo 5'-A GAATTC ATG AAGGCAATAATTGTACTACTCATGG-3' Reverso 5’-A GCGGCCGCfTATAGA CAGATGGAGCAAGAAACATTGTC TCTGGAGA-3’ Neuraminidase (NA) Directo 5'-A GAATT CATG CTACCTTCAACTATACAAACG-3' Reverso 5'-A GCGGCCGCTTACAGAGCCATATCAACACCTGTGACAGTG-3' 34

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Novavax, Inc. <120> PARTÍCULAS FUNCIONAIS SEMELHANTES A VÍRUS INFLUENZA (VLPs) <130> 19065/2028 <150> US 10/617,569 <151> 2003-11-7 <160> 3 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> 1 <211> 1404

<212> ADN <213> Aviário <400> 1 atgaatccaa atcaaaagat aatagcactt ggctctgttt ctataactat tgcgacaata 60 tgtttactca tgcagattgc catcttagca acgactatga cactacattt caatgaatgt 120 accaacccat cgaacaatca agcagtgcca tgtgaaccaa tcataataga aaggaacata 180 acagagatag tgcatttgaa taatactacc atagagaagg aaagttgtcc taaagtagca 240 gaatacaaga attggtcaaa accgcaatgt caaattacag ggttcgcccc tttctccaag 300 gacaactcaa ttaggctttc tgcaggcggg gatatttggg tgacaagaga accttatgta 360 tcgtgcggtc ttggtaaatg ttaccaattt gcacttgggc agggaaccac tttgaacaac 420. aaacactcaa atggcacaat acatgatagg agtccccata gaaccctttt aatgaacgag 480 ttgggtgttc catttcattt gggaaccaaa caagtgtgca tagcatggtc cagctcaagc 540 tgccatgatg ggaaggcatg gttacatgtt tgtgtcactg gggatgatag aaatgcgact 600 gctagcatca tttatgatgg gatgcttacc gacagtattg gttcatggtc taagaacatc 660 ctcagaactc aggagtcaga atgcgtttgc atcaatggaa cttgtacagt agtaatgact 720 gatggaagtg catcaggaag ggctgatact aaaatactat tcattagaga agggaaaatt 780 gtccacattg gtccactgtc aggaagtgct cagcatgtgg aggaatgctc ctgttacccc 840 cggtatccag aagttagatg tgtttgcaga gacaattgga agggctccaa tagacccgtg 900 ctatatataa atgtggcaga ttatagtgtt gattctagtt atgtgtgctc aggacttgtt 960 ggcgacacac caagaaatga cgatagctcc agcagcagta actgcaggga tcctaataac 1020 gagagagggg gcccaggagt gaaagggtgg gcctttgaca atggaaatga tgtttggatg 1080 ggacgaacaa tcaagaaaga ttcgcgctct ggttatgaga ctttcagggt cgttggtggt 1140 tggactacgg ctaattccaa gtcacaaata aataggcaag tcatagttga cagtgataac 1200 tggtctgggt attctggtat attctctgtt gaaggaaaaa cctgcateaa caggtgtttt 1260 tatgtggagt tgataagagg gagaccacag gagaccagag tatggtggac ttcaaatagc 1320 atcattgtat tttgtggaac ttcaggtacc tatggaacag gctcatggcc cgatggagcg 1380 aatatcaatt tcatgtctat ataa 1404 <210> 2 <211> 1683

<212> ADN <213> Aviário <400> 2 35 ΕΡ 1 644 037/ΡΤ atggaaacaa tatcactaat aactatacta ctagtagtaa cagcaagcaa tgcagataaa 60 atctgcatcg gccaccagtc aacaaactcc acagaaactg tggacacgct aacagaaacc 120 aatgttcctg tgacacatgc caaagaattg ctccacacag agcataatgg aatgctgtgt 180 gcàacaagcc tgggacatcc cctcattcta gacacatgca ctattgaagg actagtctat 240 ggcaaccctt cttgtgacct gctgttggga ggaagagaat ggtcctacat cgtcgaaaga 300 tcatcagctg taaatggaac gtgttaccct gggaatgtag aaaacctaga ggaactcagg 360 acacttttta gttccgctag ttcctaccaa agaatccaaa tcttcccaga cacaacctgg 420 aatgtgactt acactggaac aagcagagca tgttcaggtt cattctacag gagtatgaga 480 tggctgactc aaaagagcgg tttttaccct gttcaagacg cccaatacac aaataacagg 540 ggaaagagca ttcttttcgt gtggggcata catcacccac ccacctatac cgagcaaaca 600 aatttgtaca taagaaacga cacaacaaca agcgtgacaa cagaagattt gaataggacc 660 ttcaaaccag tgatagggcc aaggcccctt gtcaatggtc tgcagggaag aattgattat 720 tattggtcgg tactaaaacc aggccaaaca ttgcgagtac gatccaatgg gaatctaatt 780 gctccatggt atggacacgt tctttcagga gggagccatg gaagaatcct gaagactgat 840 ttaaaaggtg gtaattgtgt agtgcaatgt cagactgaaa aaggtggctt aaacagtaca 900 ttgccattcc acaatatcag taaatatgca tttggaacct gccccaaata tgtaagagtt 960 aatagtctca aactggcagt cggtctgagg aacgtgcctg ctagatcaag tagaggacta 1020 tttggagcca tagctggatt catagaagga ggttggccag gactagtcgc tggctggtat 1080 ggtttccagc attcaaatga aaggcaattg ataaaataac tatgaaataa ttgatcatga aagattgatg accaaataca gaaaatcaaa aaacactcga aagagggcac tgggctccaa aaatgtgatg atcagtgcat agagaggaat caagactaga acttacaaaa tcctcaccat tttgctgcct tcctgttctg taa tcaaggggtt ggtatggctg atccaaggtg aataatatag attcagtgag gttgaaacta agacgtatgg gcatataatg tgagcatgat gcgaacgtga tgctatggaa gatgggaaag ggaaacaatt cggaacggga aaggcagaaa atagaggggg ttattcgact gtcgcctcat ggccatgtcc aatggatctt cagataggga ttcaactcaa 1140 tcgacaagat gaacaagcaa 1200 gactcaatat gatcaataat 1260 cagaattgct agtactactt 1320 acaatctata taacaaggtg 1380 gctgtttcga gctataccat 1440 cctataatag gagaaagtat 1500 ttaagctgga atctgaggga 1560 ctcttgtgct tgcaatgggg 1620 gcagatgcaa catttgtata 1680 1683 <210> 3 <211> 759 <212> ADN <213> Aviário <400> 3 atgagtettc aaagccgaga gctctcatgg gggtttgtgt caaaatgccc aagaagctga actggtgcgc gaagtggctc tcccacaggc ctagccagca gaagccatgg actcacccta cagaaacgga taaccgaggt cgaaacgtac tcgcgcagag acttgaggat aatggctaaa gacaagacca tcacgctcac cgtgcccagt taaatgggaa tggagaccca agagggaaat gacattccat ttgccagttg catgggtctc ttggcctagt atgtgccact agatggcgac taccaccaac ctacggctaa ggccatggag aagtcgcaag tcaggctagg gttccagtgc aggtctaaaa tgggagtgca aatgcagaga gttctctcta gtttttgcag atcctgtcac gagcgaggac aacaacatgg ggagcaaagg atatacaacc tgtgaacaga ccactaatca cagatggctg caaatggtgc gatgatctta ttcaagtga tcatcccatc ggaagaacac ctctgactaa tgcagcgtag acagggcagt aagttgcact ggatgggaac ttgctgatgc ggcatgagaa gatcaagtga aggctatgag ttgaaaattt aggccccctc 60 agatcttgag 120 ggggatttta 180 acgatttgtc 240 taaactatac 300 cagttactca 360 agtgaccaca 420 ccaacatcgg 480 cagaatggta 540 gcaggcagca 600 gacaattggg 660 gcaggcttac 720 759

Lisboa, 2012-03-26

Claims (13)

1. ΕΡ 1 644 037/PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Método para produzir uma VLP derivada de influenza, o método compreendendo: a) construir uma construção recombinante de baculovirus codificando um conjunto de proteínas estruturais de influenza, o referido conjunto consistindo de Ml, HA e NA; b) transfectar, infectar ou transformar uma célula hospedeira adequada com o referido baculovirus recombinante, e cultivar a célula hospedeira sob condições que permitem a expressão de Ml, HA e NA; c) permitir a formação de uma VLP na referida célula hospedeira, onde as proteínas estruturais de influenza da referida VLP consistem de Ml, HA e NA; d) colher meios de células infectadas contendo uma VLP de influenza funcional; e e) purificar a VLP.
2. 2. Método da reivindicação 1, onde pelo menos uma de Ml, HA e NA é derivada de origens aviária ou mamífera.
3. 3. Método da reivindicação 1, onde a referida Ml é derivada de origem aviária.
4. 4. Método da reivindicação 1, onde pelo menos uma das referidas Ml, Hl e NA é derivada do grupo consistindo de vírus influenza do subtipo A e B.
5. 5. Método de qualquer uma das reivindicações 1-4, onde a célula hospedeira é uma célula eucariótica.
6. 6. Método de qualquer uma das reivindicações 1-5 onde a VLP compreende uma VLP quimérica.
7. 7. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, compreendendo adicionalmente formular uma substância de fármaco compreendendo a VLP de influenza.
8. 8. Método da reivindicação 7, onde a substância de fármaco compreende adicionalmente um adjuvante. ΕΡ 1 644 037/PT 2/2
9. 9. Método da reivindicação 7, onde a substância de fármaco é uma vacina.
10. 10. Método da reivindicação 7, compreendendo adicionalmente misturar a substância de fármaco contendo uma VLP de influenza com uma vesícula de lípido.
11. 11. Método da reivindicação 10, onde a vesícula de lípido é uma vesícula de lípido não iónico.
12. 12. VLP ou composição compreendendo uma VLP obtenível pelo método de qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
13. 13. VLP ou composição da reivindicação 12 para utilização num método de tratamento ou prevenção de influenza num vertebrado, ou para proporcionar uma resposta imunitária protectora contra influenza num vertebrado. Lisboa, 2012-03-26