CN105555301B - 肽缀合颗粒 - Google Patents

肽缀合颗粒 Download PDF

Info

Publication number
CN105555301B
CN105555301B CN201480046047.XA CN201480046047A CN105555301B CN 105555301 B CN105555301 B CN 105555301B CN 201480046047 A CN201480046047 A CN 201480046047A CN 105555301 B CN105555301 B CN 105555301B
Authority
CN
China
Prior art keywords
particles
antigen
particle
plg
disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201480046047.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN105555301A (zh
Inventor
L.D.谢伊
S.D.米勒
J.W.T.亚普
D.R.盖茨
D.麦卡锡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwestern University
Original Assignee
Northwestern University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52468804&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN105555301(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Northwestern University filed Critical Northwestern University
Priority to CN202110339093.0A priority Critical patent/CN113332422A/zh
Publication of CN105555301A publication Critical patent/CN105555301A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105555301B publication Critical patent/CN105555301B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
    • A61K47/6937—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol the polymer being PLGA, PLA or polyglycolic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1641—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poloxamers
    • A61K9/1647—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A61K9/5153—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/577—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 tolerising response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6093—Synthetic polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG], Polymers or copolymers of (D) glutamate and (D) lysine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/62—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier
    • A61K2039/622—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the link between antigen and carrier non-covalent binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供了包含肽偶联的可生物降解的聚(丙交酯‑共‑乙交酯)(PLG)颗粒的组合物。具体地讲，PLG颗粒经表面官能化以允许肽分子偶联到所述颗粒的表面(例如，用于引起免疫耐受的诱导)。

Description

肽缀合颗粒
联邦政府资助
本发明根据美国国立卫生研究院颁发的R01 EB013198在政府资助下完成。政府在本发明中享有某些权利。
相关专利申请
本申请要求2013年8月13日提交的美国临时专利申请No.61/865,389、 2013年8月23日提交的美国临时专利申请No.61/869,279和2013年10月4 日提交的美国临时专利申请No.61/887,112的优先权。本申请还与2013年6 月21日提交的PCT申请No.PCT/US2013/047079相关，后者要求2012年6 月21日提交的美国临时申请No.61/662,687的优先权。以上各专利的内容据此全文以引用方式并入。
以电子方式提交的文本文件的说明
与此一起以电子方式提交的文本文件的内容全文以引用方式并入本文：序列表的计算机可读格式副本(文件名：COUR-002_01US_Seqlist.txt，记录日期：2013年8月13日，文件大小1.17兆字节)。
背景技术
炎性疾病和紊乱是这样的病症，其中异常的或以其他方式失调的炎性反应构成了疾病的病因或加剧疾病的严重性。例子包括自身免疫性疾病，如1 型糖尿病和乳糜泻。
许多这些疾病的特征在于，在组织损伤或其他损害部位处的单核细胞浸润。已在这些浸润中观察到的单核细胞的例子包括淋巴细胞、尤其是T淋巴细胞，以及单核吞噬细胞系统的细胞(MPS细胞)，如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、小胶质细胞及其他细胞。
许多在单核细胞浸润中观察到的细胞疑似在这些异常炎性反应中起作用。例如，在诸如多发性硬化之类的疾病中，已知CD4+T细胞在病理性自身免疫反应中起到中心作用。在T细胞活化的较早时间点，树突细胞和其他 MPS细胞可负责CD4+T细胞的活化。MPS细胞也可通过吞噬作用促进炎症，但在至少一些炎性疾病中，尚不清楚在不存在CD4+T细胞的情况下此类细胞是否能够起到这种作用。
根据某些细胞表面分子的表达与否，可将外周血单核细胞划分到两个组中的一组。具体地讲，人类“定居单核细胞”或“成熟单核细胞”应理解为具有CD14loCD16+表型(小鼠对应表型为CX3CR1hiCCR2-Gr1-)。另一组细胞“炎性单核细胞”或“未成熟单核细胞”应理解为具有CD14+CD16-表型 (小鼠对应表型为CX3CR1loCCR2+Gr1+)。(Geissmann F.et al.2003Immunity 19:71-82(Geissmann F.等人，2003年，《免疫》，第19卷，第71-82页)
重要的是，虽然后者在被观测到从骨髓源外周血细胞迁移到发炎组织中的意义上被理解为“炎性的”，但这些细胞尚未显示直接地或通过其他细胞的作用引起炎症。此外，这些细胞分化时可形成的各种MPS细胞也尚未显示出会引起炎症。
与不期望的免疫反应相关的紊乱中的一般性长期免疫抑制的常规临床策略是基于长期施用广泛作用的免疫抑制药物，例如信号1阻滞剂如环孢菌素A(CsA)、FK506(他克莫司)和皮质类固醇。长期使用高剂量的这些药物可具有毒性副作用。此外，即使是在那些能够耐受这些药物的患者中，对终生免疫抑制药物疗法的需要也会带来严重副作用的重大风险，包括肿瘤、严重感染、肾毒性和代谢紊乱。
已开发出诱导抗原特异性耐受的方法，其包括抗原或肽的细胞偶联。例如，在一种方法中，肽诱导的细胞偶联耐受涉及用疾病特异性自身抗原和乙烯碳二亚胺(ECDI)偶联剂在无菌条件下收集、分离和处理外周血细胞，随后再注入供体/患者体内。这一过程是昂贵的，并且必须由熟练从业者在严密监控条件下进行，而且受到可开展该程序的中心的数量的限制。将红血细胞用作供体细胞类型使得潜在来源扩展到包括同种异体供体，从而显著增加来源细胞的供应并且可能将这种疗法的递送扩展到具备输血许可的任何环境。这些方法在来源细胞的供应和组织类型匹配以使对供体细胞的免疫反应最小化的必要性方面具有明显的限制。此外，局部处理细胞以经由EDCI偶联自身抗原存在重要的质量控制问题。此外，这些方法还需要至少一些关于寻求免疫耐受的病理抗原的知识。
最近，已描述了肽偶联颗粒，该颗粒消除了对来源细胞供应的需求并且规避了现有方法的组织分型要求，参见WO 2010/085509，其全文以引用方式并入本文。尽管如此，对偶联到颗粒外部的抗原的使用仍与增加的过敏反应相关并具有明显的化学、制造和控制问题。令人惊讶的是，当将抗原包封在颗粒内时，这些不良事件得以避免。甚至更令人惊讶的是，可改变大小和电荷以增强对特定抗原的耐受。
抗原特异性免疫耐受通常是不理想的，因为特定抗原/表位通常在人类疾病中是未知的。此外，为使抗原特异性方法有效，受试者之间的抗原可能不同，因此，将有必要确定各个患者将识别哪些抗原，或者需要在施用之前使可能的肽的文库与颗粒偶联。这些肽的合成和单独偶联既费时又昂贵。因此，需要一种解决这两个问题的疗法，从而消除对组织匹配细胞来源的需要。
发明内容
在一些实施例中，本发明提供组合物(例如，用于诱导抗原特异性耐受)，该组合物包含附接到抗原肽的载体颗粒(例如，PLG颗粒)。在某些实施例中，载体颗粒是聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)颗粒。在其他实施例中，载体颗粒是
Figure BDA0000926265050000031
稳定的聚硫化丙烯颗粒。
在一些实施例中，本发明提供组合物，该组合物包含：偶联到具有负ζ电势的载体颗粒的抗原。在一些实施例中，颗粒的ζ电势为约-100mV至约 0mV。在一些实施例中，颗粒的ζ电势为约-50mV至约-40mV。在一些实施例中，颗粒为具有约50:50、80:20至约100:0的摩尔比的共聚物。在一些实施例中，共聚物比率可为但不限于聚苯乙烯：聚(羧酸乙烯酯)/80:20、聚苯乙烯：聚(羧酸乙烯酯)/90:10、聚(羧酸乙烯酯)：聚苯乙烯/80:20、聚(羧酸乙烯酯)：聚苯乙烯/90:10、聚乳酸：聚乙醇酸/80:20或聚乳酸：聚乙醇酸/90:10 或聚乳酸：聚乙醇酸/50:50。而在其他实施例中，颗粒为聚苯乙烯颗粒、羧化聚苯乙烯颗粒、
Figure BDA0000926265050000032
稳定的聚硫化丙烯颗粒或聚(乳酸-共-乙醇酸)颗粒。在一些实施例中，颗粒为聚(乳酸-共-乙醇酸)颗粒。
在一些实施例中，颗粒具有在约0.1μm至约10μm之间的平均直径。在一些实施例中，颗粒具有在约0.2μm与约2μm之间的平均直径。在一些实施例中，颗粒具有在约0.3μm至约5μm之间的直径。在一些实施例中，颗粒具有在约0.5μm至约3μm之间的直径。在一些实施例中，颗粒具有在约 0.5μm至约1μm之间的直径。在一些实施例中，颗粒具有约0.5μm的直径。
在另外的实施例中，抗原包括自身免疫抗原、在将要移植到受试者体内的组织上表达的抗原、酶或过敏原的至少一部分。在一些实施例中，抗原包括以下物质的至少一部分：髓鞘碱性蛋白、乙酰胆碱受体、内源性抗原、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、胰β-细胞抗原、胰岛素、胰岛素原、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚单位相关蛋白(IGRP)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、II型胶原、人软骨gp39、fp130-RAPS、蛋白脂质蛋白、纤维蛋白、小核仁蛋白、甲状腺刺激因子受体、组蛋白、糖蛋白gp70、丙酮酸脱氢酶脱氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PCD-E2)、毛囊抗原、水通道蛋白4、桥粒芯糖蛋白1、桥粒芯糖蛋白 3、烟碱型乙酰胆碱受体、A-麦胶蛋白和人原肌球蛋白亚型5、百喜草花粉 (BaGP)、桃过敏原Pru p 3、αs 1-酪蛋白奶过敏原、Apig1芹菜过敏原、Bere1 巴西坚果过敏原、B-乳球蛋白奶过敏原、牛血清白蛋白、Cor a1.04榛子过敏原、卵清蛋白蛋过敏原、重组人凝血因子VIII(Advate)、抗血友病因子、人基因重组抗血友病因子(Kogenate)、重组抗血友病因子(Eloctate)、重组因子VIII Fc融合蛋白、重组抗血友病因子VIII(Refacto)、Novo VIIa、重组因子VII、依他凝血素α、人基因重组抗血友病(FVIII)因子(Helixate)、Monanine、凝血因子IX、血管性血友病因子和VIII因子浓缩物(Wilate)、西利酶 (Ceredase)、阿糖脑苷酶(Alglucerase)、伊米苷酶(Cerezyme)、伊米苷酶 (Imiglucerase)、葡糖脑苷脂酶(Elelso)、他利苷酶α(taliglucerase alfa)、法布瑞酶(Fabrazyme)、β-半乳糖苷酶(Agalsidase beta)、拉罗尼酶(Aldurazyme)、 l-艾杜糖醛酸酶、α-葡萄糖苷酶(Myozyme)、酸性葡萄糖苷酶、艾杜硫酸酯酶 (Elaprase)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、加硫酶(Naglazyme)、芳基硫酸酯酶B 或N-乙酰氨基半乳糖-4-硫酸酯酶、用于酶或凝血因子替代疗法的蛋白类治疗剂如α-葡萄糖苷酶(myozyme)、阿糖脑苷酶(alglucerase)、伊米苷酶 (imiglucerase)、他利苷酶(taliglucerase)、β-半乳糖苷酶(agalsidase beta)、l-艾杜糖醛酸酶、酸性葡萄糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙酰氨基半乳糖 -4-硫酸酯酶、抗血友病因子、因子VII、依他凝血素α、因子IX、美格鲁特(miglustat)、罗米司亭(romiplastim)、依泊汀α(epotetin alpha)、蛋白C、拉罗尼酶(laronidase)、α-葡萄糖苷酶(lumizyme)或因子VIII。
在另外的实施例中，抗原包括自身免疫抗原、在将要移植到受试者体内的组织上表达的抗原、酶或过敏原。在非限制性实施例中，抗原包括例如髓鞘碱性蛋白、乙酰胆碱受体、内源性抗原、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、胰β- 细胞抗原、胰岛素、谷氨酸脱羧酶(GAD)、II型胶原、人软骨gp39、 fp130-RAPS、蛋白脂质蛋白、纤维蛋白、小核仁蛋白、甲状腺刺激因子受体、组蛋白、糖蛋白gp70、丙酮酸脱氢酶脱氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PCD-E2)、毛囊抗原、水通道蛋白4、桥粒芯糖蛋白1、桥粒芯糖蛋白3、烟碱型乙酰胆碱受体、A-麦胶蛋白和人原肌球蛋白亚型5、百喜草花粉(BaGP)、桃过敏原 Pru p 3、αs 1-酪蛋白奶过敏原、Apig1芹菜过敏原、Bere1巴西坚果过敏原、 B-乳球蛋白奶过敏原、牛血清白蛋白、Cor a 1.04榛子过敏原、胰岛素、胰岛素原、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚单位相关蛋白(IGRP)、卵清蛋白蛋过敏原、用于酶或凝血因子替代疗法的蛋白类治疗剂如α-葡萄糖苷酶 (myozyme)、阿糖脑苷酶(alglucerase)、伊米苷酶(imiglucerase)、他利苷酶 (taliglucerase)、β-半乳糖苷酶(agalsidase beta)、l-艾杜糖醛酸酶、酸性葡萄糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙酰氨基半乳糖-4-硫酸酯酶、抗血友病因子、因子VII、依他凝血素α、因子IX、美格鲁特(miglustat)、罗米司亭 (romiplastim)、依泊汀α(epotetin alpha)、蛋白C、拉罗尼酶(laronidase)、α- 葡萄糖苷酶(lumizyme)、因子VIII。
在另外的实施例中，颗粒偶联到包含一个或多个表位的抗原。在另外一个实施例中，表位与过敏性反应、自身免疫性疾病、用于酶替代疗法中的酶、溶酶体贮积病或炎性疾病或紊乱相关。在一个实施例中，表位与1型糖尿病、多发性硬化、系统性红斑狼疮、视神经脊髓炎、特发性血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、膜性肾病、大疱性类天疱疮、寻常天疱疮、重症肌无力、粘多糖贮积症、神经节苷脂沉积症、低碱性磷酸酯酶症、胆固醇酯贮积病、高尿酸血症、生长激素缺乏、肾性贫血、高雪氏病、法布里病、赫尔勒病、亨特氏病、马-拉病、A型血友病、B型血友病、血管性血友病、静脉血栓形成、暴发性紫癜、粘多糖贮积症VI、庞佩氏病、乳糜泻或炎性肠病(包括克罗恩氏病或结肠炎，例如溃疡性结肠炎)相关。在另外一个实施例中，表位存在于用于酶或凝血因子替代疗法的蛋白类治疗剂中，如α-葡萄糖苷酶(myozyme)、阿糖脑苷酶(alglucerase)、伊米苷酶(imiglucerase)、他利苷酶(taliglucerase)、β-半乳糖苷酶(agalsidase beta)、l-艾杜糖醛酸酶、酸性葡萄糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙酰氨基半乳糖-4-硫酸酯酶、抗血友病因子、因子VII、依他凝血素α、因子IX、美格鲁特(miglustat)、罗米司亭(romiplastim)、依泊汀α(epotetinalpha)、蛋白C、拉罗尼酶(laronidase)、α- 葡萄糖苷酶(lumizyme)、因子VIII。在另外一个实施例中，表位为表2或表 3中所述的表位。在一个实施例中，颗粒偶联到抗原，该抗原仅含一个与一种疾病和/或紊乱相关的表位。在另外一个实施例中，该抗原包含不止一个与相同疾病和/或紊乱相关的表位。在另外一个实施例中，该抗原包含不止一种与不同疾病和/或紊乱相关的表位。
在一些实施例中，抗原通过结合分子偶联到所述颗粒。在一些实施例中，抗原通过连接基偶联到所述颗粒。在一些实施例中，结合分子为乙烯碳二亚胺(ECDI)。在某些实施例中，抗原通过链霉亲和素-生物素复合物而连接。在一些实施例中，连接基可包括但不限于多种双官能蛋白偶联剂，如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物 (如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰酸酯) 和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。特定的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)以提供二硫键。
在一些实施例中，抗原偶联到具有负ζ电势的颗粒的外部。在一些实施例中，抗原被包封在具有负表面ζ电势的颗粒中。在一些实施例中，颗粒为可生物降解的。在一些实施例中，颗粒为表面官能化的。在一些实施例中，颗粒为羧酸酯表面官能化的。
在一些实施例中，本发明提供诱导受试者中的抗原特异性耐受的方法，该方法包括：向所述受试者施用有效量的包含抗原偶联颗粒的组合物，其中所述颗粒具有负ζ电势，并且其中所述颗粒和抗原诱导所述受试者对所述抗原的耐受。在一些实施例中，进行施用以治疗或预防疾病或病症。在一些实施例中，在发生因所述抗原导致的疾病或病症之前或之后进行施用。在一些实施例中，疾病或病症选自：自身免疫性疾病、炎性疾病、变态反应、移植排斥、溶酶体贮积病、酶缺乏、炎性反应和超免疫反应。在一些实施例中，疾病或病症选自：多发性硬化、1型糖尿病、哮喘、食物过敏、环境过敏、乳糜泻、包括克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的炎性肠病，以及由所述抗原在所述受试者中导致的降低对所述抗原的过度反应的病症。在一些实施例中，方法还包括向所述受试者反复施用所述组合物。
在另外一个实施例中，颗粒的施用导致效应T细胞的活化诱导死亡。
在另外一个实施例中，颗粒的施用导致效应T细胞无能。
在另外一个实施例中，颗粒的施用导致效应T细胞的细胞凋亡。
在另外一个实施例中，颗粒的施用导致效应T细胞转化成调节性T细胞。
在另外一个实施例中，颗粒的施用导致抗原特异性和非特异性效调节性 T细胞两者的诱导和扩增。在另外一个实施例中，颗粒的施用导致淋巴结和脾中效应T细胞的分离，从而抑制这些细胞运输到外周位点并导致炎症的能力。
在另外一个实施例中，颗粒的施用导致T细胞依赖性抗体生成的下调。
在某些实施例中，本发明提供治疗受试者中的乳糜泻的方法，该方法包括：向所述受试者施用有效量的包含抗原偶联颗粒的组合物，其中颗粒具有负ζ电势。在某些实施例中，抗原为麦胶蛋白或麦胶蛋白表位。在一些实施例中，抗原为选自SEQ ID NO:1295-1724、SEQ ID NO:1726-1766和SEQ ID NO:4986-5140的一种或多种抗原。在一些实施例中，抗原为麦胶蛋白并且抗原偶联颗粒具有约600-1500纳米的合成后平均大小和约-30至约-80mV的合成后平均电荷。在一些实施例中，颗粒具有约600-1200纳米的合成后平均大小和约-40至约-70mV的合成后平均电荷。在某些实施例中，颗粒具有约600微米的合成后平均大小和约-50mV的合成后平均电荷。在另外的实施例中，颗粒为聚苯乙烯颗粒、羧化聚苯乙烯颗粒、PLURIONICS稳定的聚硫化丙烯颗粒或聚(乳酸-共-乙醇酸)颗粒。
在一些实施例中，本发明提供治疗受试者中的糖尿病的方法，该方法包括：向所述受试者施用有效量的包含抗原偶联颗粒的组合物，其中颗粒具有负ζ电势。在一些实施例中，糖尿病为I型糖尿病。在一些实施例中，糖尿病为 II型糖尿病。
在一些实施例中，抗原为胰岛素、胰岛素原、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚单位相关蛋白(IGRP)或衍生自胰岛素、胰岛素原或IGRP的表位。在一些实施例中，抗原为选自SEQ ID NO:1767-1840、SEQ ID NO: 1842-1962、SEQ ID NO:1964-2027、SEQ ID NO:2029-2073、SEQ ID NO: 2075-2113、SEQ ID NO:2115-2197、SEQ ID NO:2199-2248、SEQ IDNO: 2250-2259、SEQ ID NO:2261-2420、SEQ ID NO:2422-2486和SEQ ID NO: 2489-2505的一种或多种抗原。在一些实施例中，抗原为胰岛素并且抗原偶联颗粒具有约300-800纳米的合成后平均大小和约-30至约-70mV的合成后平均电荷。在一些实施例中，颗粒具有约350-600纳米的合成后平均大小和约-40至约-60mV的合成后平均电荷。在一些实施例中，颗粒具有约500纳米的合成后平均大小和约-50mV的合成后平均电荷。在一些实施例中，抗原为胰岛素原并且抗原偶联颗粒具有约300-800纳米的合成后平均大小和约 -30至约-70mV的合成后平均电荷。在某些实施例中，颗粒具有约400-600 纳米的合成后平均大小和约-40至约-60mV的合成后平均电荷。在一些实施例中，颗粒具有约570纳米的合成后平均大小和约-45mV的合成后平均电荷。在一些实施例中，抗原为IGRP并且抗原偶联颗粒具有约300-800纳米的合成后平均大小和约-30至约-70mV的合成后平均电荷。在一些实施例中，颗粒具有约400-700纳米的合成后平均大小和约-40至约-60mV的合成后平均电荷。在一些实施例中，颗粒具有约600纳米的合成后平均大小和约-40mV 的合成后平均电荷。在某些实施例中，颗粒为聚苯乙烯颗粒、羧化聚苯乙烯颗粒、PLURIONICS稳定的聚硫化丙烯颗粒或聚(乳酸-共-乙醇酸)颗粒。
在一些实施例中，本发明提供治疗正在接受酶替代疗法的受试者的方法，该方法包括：向所述受试者施用有效量的包含抗原偶联颗粒的组合物，其中颗粒具有负ζ电势。在一些实施例中，受试者正在接受酶替代疗法以治疗选自血友病、A型血友病、B型血友病、血管性血友病、粘多糖贮积症、神经节苷脂沉积症、低碱性磷酸酯酶症、胆固醇酯贮积病、高尿酸血症、生长激素缺乏、肾性贫血、高雪氏病、法布里病、赫尔勒病、庞佩氏病、亨特氏病和马-拉病的疾病。在一些实施例中，抗原偶联颗粒包含选自重组人凝血因子VIII(Advate)、抗血友病因子、人基因重组抗血友病因子(Kogenate)、重组抗血友病因子(Eloctate)、重组因子VIII Fc融合蛋白、重组抗血友病因子VIII(Refacto)、Novo VIIa、重组因子VII、依他凝血素α、人基因重组抗血友病(FVIII)因子(Helixate)、Monanine、凝血因子IX、血管性血友病因子和VIII因子浓缩物(Wilate)、西利酶(Ceredase)、阿糖脑苷酶(Alglucerase)、伊米苷酶(Cerezyme)、伊米苷酶(Imiglucerase)、葡糖脑苷脂酶(Elelso)、他利苷酶α(taliglucerase alfa)、法布瑞酶(Fabrazyme)、β-半乳糖苷酶(Agalsidase beta)、拉罗尼酶(Aldurazyme)、l-艾杜糖醛酸酶、α-葡萄糖苷酶(Myozyme)、酸性葡萄糖苷酶、艾杜硫酸酯酶(Elaprase)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、加硫酶 (Naglazyme)、芳基硫酸酯酶B或N-乙酰氨基半乳糖-4-硫酸酯酶的一种或多种酶。在一些实施例中，颗粒为聚苯乙烯颗粒、羧化聚苯乙烯颗粒、 PLURIONICS稳定的聚硫化丙烯颗粒或聚(乳酸-共-乙醇酸)颗粒。在某些实施例中，颗粒为具有约80:20至约100:0的摩尔比的共聚物。在某些实施例中，颗粒为聚苯乙烯颗粒、羧化聚苯乙烯颗粒、PLURIONICS稳定的聚硫化丙烯颗粒或聚(乳酸-共-乙醇酸)颗粒。在其他实施例中，颗粒为聚(乳酸-共- 乙醇酸)颗粒并具有约50:50聚乳酸：聚乙醇酸的共聚物比率。在一些实施例中，颗粒为聚(乳酸-共-乙醇酸)颗粒并具有约50:50聚乳酸：聚乙醇酸的共聚物比率。
在另外一个实施例中，施用本发明的颗粒会防止受试者中中性粒细胞和其他粒细胞的累积。在另外一个实施例中，将本发明的颗粒施用给患有癌症的受试者。
在一个实施例中，施用本发明的颗粒会增强受损组织的再生。在另外一个实施例中，颗粒增强上皮细胞的再生。在再一个实施例中，颗粒增强神经元的髓鞘再生。在另一个实施例中，受试者患有自身免疫性疾病。在又另一个实施例中，受试者患有炎性肠病，包括溃疡性结肠炎和/或克罗恩氏病。在又另一个实施例中，受试者患有多发性硬化。
在一些实施例中，组合物经静脉内施用。在一些实施例中，组合物经皮下、经口、经肌内、经淋巴管内、经门静脉或经气雾剂施用。在一个实施例中，施用带负电的颗粒会诱导受试者中的抗原特异性耐受。在一个实施例中，诱导抗原特异性耐受的颗粒包含与过敏性反应、自身免疫性疾病和/或炎性疾病相关的一个或多个表位。在一个实施例中，表位选自表2或3中所述的那些。在一个实施例中，带负电的颗粒为聚苯乙烯、金刚石、
Figure BDA0000926265050000091
稳定的聚硫化丙烯或聚(乳酸-共-乙醇酸)颗粒。在一个实施例中，颗粒被羧化。在一个实施例中，颗粒具有小于约-100mV的ζ电势。在一个实施例中，颗粒具有约-75mV与0mV之间，例如-50mV与0mV之间、或-100mV与-50mV 之间、或-75mV与-50mV之间、或-50mV与-40mV之间的ζ电势。在一个实施例中，颗粒具有约0.1μm至约10μm，例如约0.2μm至约2μm、或约0.3μm 至约5μm、或0.5μm至约3μm、或约0.5μm至约1μm的平均直径。
在一个实施例中，受试者患有自身免疫性疾病。在一个实施例中，自身免疫性疾病为多发性硬化、硬皮病、I型糖尿病、类风湿性关节炎、甲状腺炎、系统性红斑狼疮、雷诺氏综合征、舍格伦综合征、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性心肌炎、炎性肠病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、系统性红斑狼疮、视神经脊髓炎、特发性血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、膜性肾病、大疱性类天疱疮、寻常天疱疮、重症肌无力、乳糜泻、溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。在一个实施例中，颗粒包含全长多肽或其片段。在一个实施例中，颗粒包含一个或多个髓鞘碱性蛋白表位。在一个实施例中，髓鞘碱性蛋白表位来自SEQ ID NO:4975或SEQID NO:4976。在一个实施例中，颗粒包含一个或多个髓鞘少突胶质细胞糖蛋白表位。在一个实施例中，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白表位来自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4978。在一个实施例中，颗粒包含一个或多个胰岛素表位。在一个实施例中，一个或多个胰岛素表位来自SEQID NO:4981。在一个实施例中，颗粒包含一个或多个谷氨酸脱羧酶表位。在一个实施例中，谷氨酸脱羧酶表位来自SEQ ID NO: 4982。在一个实施例中，颗粒包含一个或多个蛋白脂质蛋白表位。在一个实施例中，蛋白脂质蛋白表位来自SEQ ID NO:4977。在一个实施例中，颗粒包含一个或多个麦胶蛋白表位。在一个实施例中，麦胶蛋白表位包含SEQ ID NO:4983-4985。
在一些实施例中，本发明还提供一种制备具有负ζ电势的免疫修饰颗粒的方法，所述方法包括：将免疫修饰颗粒前体与缓冲溶液在有效形成具有负ζ电势的免疫修饰颗粒的条件下接触。在一些实施例中，免疫修饰颗粒前体通过共聚而形成。在一些实施例中，缓冲溶液具有碱性pH。在一些实施例中，缓冲溶液为碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢锂、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠或磷酸二氢锂。
在一些实施例中，本发明提供一种组合物，该组合物包含包封在表面官能化脂质体的核心内的抗原。在另外一个实施例中，脂质体由比率为30:30:40 的磷脂酰胆碱：磷脂酰甘油：胆固醇构成。在再另一个实施例中，所述抗原包括自身免疫抗原、在将要移植到受试者体内的组织上表达的抗原或过敏原。在一些实施例中，颗粒为聚(乳酸-共-乙醇酸)颗粒并具有约50:50聚乳酸：聚乙醇酸的共聚物比率。在一些实施例中，颗粒包含PEMA。在一些实施例中，PEMA以约0.1％至约2.0％存在。
附图说明
图1示出了(A)聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)颗粒的显微图。B和C示出了通过动态光散射分析对表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的表征，这些分析包括大小分布、平均大小(nm)、ζ电势(mV)以及OVA323-339和PLP139-151肽与PLG-PEMA颗粒的肽偶联效率(％)。在18.2MΩ水中在马尔文激光粒度仪(Malvern Zetasizer Nano ZS)(马萨诸塞州韦斯特伯鲁的马尔文仪器公司 (Malvern Instruments,Westborough,MA))上以2.5×105计数/秒的计数率分析表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒。表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒群体每批差异为5-15％，但一般具有567nm的Z-平均直径、670nm 的峰值直径和0.209的多分散指数。
图2示出了PLG纳米颗粒诱导抗原特异性耐受。使用免疫优势蛋白脂质蛋白PLP139-151表位(PLG-PLP139-151)诱导耐受性以预防复发性实验性自身免疫性脑炎(R-EAE)。在相对于免疫时间(第0天)的第-7天用PLP139-151-PLGA (N＝5)、OVA323-339-PLGA(N＝5)或未结合的PLGA(N＝5)处理小鼠。通常在约第12天至第14天观测到疾病高峰期，并对小鼠的临床疾病进行评分。不具有肽或用对照肽OVA323-339修饰的颗粒未能阻止疾病的诱导。然而，除了在第20天与第30天之间表现出低于1的低临床评分外，用PLP139-151修饰的 PLGA颗粒产生的临床评分均为0(无疾病)。
图3示出了所施用颗粒的类型对小鼠模型中EAE的发生有影响。A)示出了平均临床评分，而B)示出了EAE动物的平均累积评分。在相对于免疫时间(第0天)的第-7天用OVA323-339-PLS(N＝5)、OVA323-339-PLGAPHOSPOREX (N＝5)、OVA323-339-PLGAPEMA(N＝5)、PLP139-151-PLA(N＝5)、 PLP139-151-PLGAPHOSPOREX(N＝5)或PLP139-151-PLGPEMA(N＝5)处理小鼠。通常在约第12天至第14天观测到疾病高峰期，并对小鼠的临床疾病进行评分。用对照肽OVA323-339修饰的任何组成的颗粒未能阻止疾病的诱导。然而， PLP139-151偶联的PLG微珠在下调对R-EAE的诱导中比PLP139-151偶联商业 (phosphorex)PLG或聚苯乙烯更有效。
图4示出了那些在第28天用可溶性OVA处理的小鼠与那些用 OVA-PLG颗粒处理的动物相比表现出温度降低。在递送颗粒1小时内未观测到体温降低。
图5示出了在缓解期间施用PLP-PLG不引起任何与过敏反应相关的死亡。在六至八周龄雌性SJL/J小鼠中通过皮下注射CFA中的PLP139-151诱导 EAE，并监测和记录临床疾病的发生。在相对于疾病诱导的第21天，给小鼠静脉内注射可溶性PLP139-151(空心方形)、可溶性OVA323-339(空心圆形) 或偶联到PLG纳米颗粒的相同肽(实心)。在注射之后，每10分钟监测并记录动物的温度持续1小时(A)。
图6示出了在疾病诱导之前七天静脉内施用的PLP139-151-PLG的最佳剂量。相较于用OVA323-339-PLG处理的SJL/J小鼠，对临床疾病的发展进行测量(A)。给六至八周龄雌性SJL/J小鼠静脉内注射PLP139-151(方形)或 OVA323-339(圆形)偶联的PLG纳米颗粒。通过在7天(B)、25天(C)或50天 (D)后皮下注射CFA中的PLP139-151来诱导EAE。持续100天跟踪图B的动物的临床疾病。在相对于疾病诱导的第8天，在图B中所示的小鼠亚组中进行迟发型超敏(DTH)反应(E)。将来自图B中PLP139-151/CFA初免组 (OVA323-339-PLG和PLP139-151-PLG)的所选代表性动物用初免PLP139-151表位和OVA323-339对照肽进行耳部激发。24小时后测定作为DTH的量度的耳肿胀，并扣除激发之前的反应。给六至八周龄雌性SJL/J小鼠静脉内注射PLP178-191(三角形)、OVA323-339(圆形)或PLP139-151(方形)偶联的PLG 纳米颗粒或单独的未偶联颗粒(空心圆形)(F)。7天后通过皮下注射CFA 中的PLP178-191诱导EAE，并在所示时间点监测疾病。
图7A-D示出了当静脉内或腹膜内施用PLG-PLP139-151颗粒时预防性耐受最有效。用静脉内施用的PLP139-151-PLG处理的动物未发生疾病并且在大多数时间点平均临床评分为0。
图8A-F示出了施用OVA323-339-PLG颗粒抑制了所处理动物中的Th1和 Th17反应。
图9A-C示出了在用PLP139-151-PLG处理的动物的脊髓内的免疫细胞浸润减少，并且其与天然组织的类似性高于OVA323-339-PLG处理的动物的组织。 OVA323-339-PLG处理的动物针对CD45、CD4和CD11b具有阳性染色；而 PLP139-151-PLG处理的动物针对这些因子具有最少染色。
图10A-C示出了施用PLP139-151-PLG颗粒抑制所处理小鼠的脊髓中的血脑屏障(BBB)破坏和巨噬细胞活化。将动物用完全弗氏佐剂(CFA)、OVA323-339 PLG颗粒或PLP139-151-PLG颗粒处理。测定了EAE的临床评分和发生率百分比(B)并且经由体内成像观测了脊髓(A和C)。
图11A和B示出了经由体内成像展示的所处理小鼠的脊髓。C-F是显示图像数据的量化的图表。
图12示出了施用其中包封了PLP139-151的PLG颗粒抑制小鼠中R-EAE 的诱导。包封自身抗原的能力允许使用蛋白质的复杂混合物或甚至在表面结合情况下不可能的器官匀浆，从而允许更高的抗原覆盖度并因此更有效地应对表位扩展。
图13示出了用PLP139-151-PLG颗粒和抗CD25抗体处理的动物有时展示出比用PLP139-151-PLG颗粒和对照IgG抗体处理的动物更高的平均临床评分。
图14示出了由PLP139-151-PLG颗粒诱导的在活动性和过继性EAE中的治疗性耐受。在六至八周龄雌性SJL/J小鼠中通过过继转移2.5×106个 PLP139-151活化母细胞来诱导过继性EAE。在疾病诱导之后2天(A)、14天(C)、 18天(E)或21天(F)，给小鼠静脉内注射偶联到500nm PLG纳米颗粒的 PLP139-151(方形)或OVA323-339(圆形)肽。将临床疾病评分与用抗原偶联的脾细胞处理之后的临床疾病评分进行比较(A)。在第42天从PLP139-151或 OVA323-339耐受化的小鼠收集脑和脊髓用于组织学分析。将来自图板A的小鼠的切片针对PLP蛋白和CD45进行染色。将来自图板C的小鼠的脊髓切片用勒克司坚牢蓝(Luxol Fast Blue)染色(D)。脱髓鞘和细胞浸润的区域由箭头指示。
图15示出了描绘在用缀合到OVA323-339或PLP139-151的SP或PLG颗粒处理之后具有活动性EAE和过继性EAE的小鼠的平均临床评分的图表。在疾病诱导之后10天(A)或2天(B)，给小鼠静脉内注射PLP139-151-SP、 PLP139-151-PLG或OVA323-339-SP或偶联到500nm纳米颗粒的OVA323-339–PLG 肽，并且确定平均临床评分。在两种情况下，施用PLP139-151-PLG颗粒均诱导小鼠中的耐受。
图16示出了在PLP-PLG耐受化小鼠中中枢神经系统免疫细胞的浸润也显著减少。在通过过继转移进行EAE诱导之后2天给SJL/J小鼠静脉内注射与PLP139-151(方形)或OVA323-339(圆形)偶联的500nm PLG纳米颗粒。在疾病高峰期(第14天)，将脑和脊髓去除并且通过流式细胞术计算淋巴细胞(B)、APC(C)、小胶质细胞(D)、外周树突细胞(E)、髓样树突细胞(F)和巨噬细胞(G)的数量。这些群体的设门策略描绘于(A)中。将CNS细胞制备物用 PM和离子霉素刺激5小时，然后针对IL-17A和IFN-γ进行细胞内染色(H)。
图17示出了施用包封在PLG颗粒中的PLP139-151肽在颗粒与PBS一起施用时诱导耐受。然而，施用抗PD-1抗体使此耐受降低。
图18示出了施用包封在PLG颗粒中的PLP139-151肽在颗粒与PBS一起施用时诱导耐受。施用抗CD40抗体使此耐受降低，但通过添加抗IL-12抗体使此耐受降低得以逆转。
图19示出了预防性施用OVA-PLG使IL-4、IL-5、IL-13和IL-10的分泌减少，并且使肺中血清OVA IgE和嗜酸性粒细胞的水平降低。
图20示出了包封在PLG颗粒中的OVA预防性抑制纵隔淋巴结的OVA 特异性体外回忆反应。在用25μg OVA再刺激之后所观测到的淋巴结增殖在那些用OVA-PLG处理的动物中减少(A)。此外，用OVA-PLG处理使在用 OVA再刺激之后细胞因子的释放减少。在用OVA-PLG处理的小鼠中IL-4、 IL-5、IL-13和IL-10的水平降低(B)。
图21A和B示出了治疗性施用OVA-PLG使IL-4、IL-5、IL-13和IL-10 的分泌减少，并且使肺中血清OVA IgE和嗜酸性粒细胞的水平降低。
图22示出了包封在PLG颗粒中的OVA治疗性下调支气管肺泡灌洗液中的OVA特异性Th2细胞因子优于OVA偶联的PLG颗粒。在第0天和第 14天将小鼠用OVA/明矾以10μg/小鼠的剂量进行腹膜内处理。在第28天和第42天向小鼠静脉内施用偶联到PLG颗粒的OVA或包封在PLG颗粒中的 OVA。在第56天至第58天之间，用雾化OVA处理小鼠三次。这些图表描绘了用偶联到PLG颗粒的OVA(A)或包封在PLG颗粒内的OVA(B)处理动物时的细胞因子分泌。
图23示出了在用p31-PLG颗粒处理之后1型糖尿病动物的血糖水平。施用p31肽偶联的PLG颗粒产生了与在施用MOG35-55肽偶联的颗粒之后所见的血糖水平相比更低的血糖水平(A和B)。在p31-PLG处理的小鼠中，与MOG35-55肽-PLG处理的小鼠相比在动物中所观测到的IFNγ分泌细胞的百分比也降低(C)。
图24A-B示出了p31-PLG诱导的耐受需要Treg。通过过继转移在小鼠中诱导了1型糖尿病。在将活化细胞转移至NOD.SCID小鼠中两小时之后，将小鼠用p31-PLG或MOG35-55PLG颗粒耐受化。Treg的耗竭消除了通过施用p31-PLG颗粒而诱导的耐受。
图25示出了施用胰岛素偶联的PLG颗粒显著增加了在300天内未发生糖尿病的小鼠的百分比(69.6％相较于22.7％；p＝0.0027)。在6周、8周和10周龄时经由静脉内施用将NOD小鼠用BSA(N＝22)或胰岛素(N＝23) 偶联的PLG颗粒进行处理。然后分析小鼠的糖尿病的发生。
图26示出了在受体小鼠中观测到的CD45.1供体细胞的百分比。在第-7 天将雌性CD45.2小鼠用OVA-PLG或Dby-PLG进行耐受化。在第-1天，将小鼠以200拉德进行照射，然后在第0天移植来自雄性CD45.1小鼠的1×106、 5×106或1×107个骨髓细胞。然后在第1天将受体小鼠用OVA-PLG、Dby-SP 或Dby-PLG进行耐受化并且收获血液用于对嵌合性的FACS分析。
图27示出了在第1天用OVA-PLG、Dby-SP或Dby-PLG进行耐受化之后受体小鼠中的供体CD45.1细胞的百分比。一只阳性对照小鼠未展示出显著的植入(约10％)。所有阴性对照小鼠均未植入供体细胞。一只Dby-SP 小鼠未展示出显著的植入(约10％)。两只OVA-PLG小鼠植入了供体细胞 (约10％)：一只到第16周完全排斥。一只Dby-PLG小鼠在第12周开始排斥并且到第16周为10％。截至第16周Dby-PLG组在10％-56％的植入范围内。OVA-PLG小鼠展示出：1)自发植入，2)OVA323与Dby之间的序列同源性，或3)颗粒的致耐受性。Dby-PLG允许比Dby-SP和OVA-PLG更多的植入。
图28示出了定时耐受对受体小鼠中CD45.1细胞的百分比有影响。阳性对照显示出植入(约4％)少于预期(约10％)。一只阴性对照小鼠具有5％的植入。在所有3个OVA-PLG组中，在第-7天、第+1天组中的一只小鼠显示出植入(12％)。在第1天的耐受比在第-7天的耐受更具临床相关性。
图29示出了在施用后3小时可检测到偶联到抗原或不含抗原的香豆素 -6PLGA颗粒，但在施用后24小时不可检测。在施用后3小时颗粒可检测，但在施用后24小时不可检测。初次接受试验的未注射小鼠(顶部行)与静脉内荧光PLGA/PEMA微粒注射的小鼠脾(左侧列)、肝(中间列)和肺(左侧列)切片(注射后3小时(中间行)和注射后24小时(底部行)，用DAPI 复染)相比较。
图30示出了在6小时和15小时后与肝中的F4/80+细胞共定位的PLGA 颗粒。
图31示出了在静脉内输注后24小时边缘区巨噬细胞主要摄取TAMRA 标记的PLP139-151偶联颗粒。最高百分比的PLP139-151+细胞是边缘区巨噬细胞。
图32描绘了相对于PLP139-151/CFA初免天数的日平均临床评分。在 SJL/J小鼠中通过使用核心内含有可溶性PLP139-151的表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒来诱导免疫耐受抑制了PLP139-151/CFA诱导的R-EAE。
图33示出了用包封的OVA-PLG处理的小鼠显示出最大的嗜酸性粒细胞累积的降低。
图34示出了与未处理或对照处理的动物相比用包封的OVA-PLG处理的小鼠显示出最大的血清IgE水平的降低。
图35示出了通过动态光散射分析对核心内含有可溶性PLP139-151的表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的表征。在18.2MΩ水中在马尔文激光粒度仪(MalvernZetasizer Nano ZS)(马萨诸塞州韦斯特伯鲁的马尔文仪器公司 (Malvern Instruments,Westborough,MA))上以1.792×105计数/秒的计数率分析表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒。表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的群体具有584nm的Z-平均直径、679nm的峰值直径和0.162的多分散指数。这些结果代表了遵循上述方案进行的6个批次的合成。
图36示出了通过ζ电势测量对核心内含有可溶性PLP139-151的表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的表征。在18.2MΩ水中在马尔文激光粒度仪(Malvern ZetasizerNano ZS)(马萨诸塞州韦斯特伯鲁的马尔文仪器公司 (Malvern Instruments,Westborough,MA))上以6.67×104计数/秒的计数率分析表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒。表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的群体具有-48.9mV的峰值ξ电势和5.14mV的ζ偏差。这些结果代表了遵循上述方案进行的6个批次的合成。
图37示出了通过动态光散射分析对核心内含有可溶性卵清蛋白的表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的表征。在18.2MΩ水中在马尔文激光粒度仪(MalvernZetasizer Nano ZS)(马萨诸塞州韦斯特伯鲁的马尔文仪器公司 (Malvern Instruments,Westborough,MA))上以1.822×105计数/秒的计数率分析表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒。表面官能化的聚(丙交酯-共- 乙交酯)颗粒的群体具有569.7nm的Z-平均直径、700.3nm的峰值直径和0.230 的多分散指数。这些结果代表了遵循上述方案进行的3个批次的合成。
图38示出了通过ζ电势测量对核心内含有可溶性卵清蛋白的表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的表征。在18.2MΩ水中在马尔文激光粒度仪 (Malvern ZetasizerNano ZS)(马萨诸塞州韦斯特伯鲁的马尔文仪器公司 (Malvern Instruments,Westborough,MA))上以2.67×104计数/秒的计数率分析表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒。表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的群体具有-52.2mV的峰值ξ电势和5.38mV的ζ偏差。这些结果代表了遵循上述方案进行的3个批次的合成。
图39示出了证实核心内含有可溶性PLP139-151肽的表面官能化脂质体在多发性硬化小鼠模型中诱导免疫耐受的图表。将动物用核心内含有可溶性 PLP139-151肽的表面官能化脂质体(圆形)或含有可溶性OVA323-339肽(方形) 的表面官能化脂质体进行处理。那些接受PLP139-151肽脂质体的动物的平均临床评分低于接受OVA323-339肽脂质体的动物。
图40示出了所施用颗粒的电荷对小鼠模型中EAE的发展有影响。图(A) 示出了平均临床评分，而图(B)示出了EAE动物的平均累积评分。小鼠接受了结合到抗原的具有-60mv或-25mv电荷的TIMP(致耐受性免疫修饰颗粒)。将小鼠用OVA323-339-TIMP-60mv、OVA323-339-PLGA-25mv、PLP139-151-TIMP-60mv或PLP139-151-PLGA-25mv处理，并对临床疾病评分。带更多负电的颗粒 TIMP-60mv比PLGA-25mv颗粒更有效地诱导耐受。
图41示出了免疫修饰颗粒的电荷对于将免疫修饰颗粒靶向抗原呈递细胞具有重要意义。将野生型或MARCO+/-动物用PS-IMP或溶媒处理。结果表明，具有降低的负电荷的颗粒的效率更低，因为其与清道夫受体MARCO 的相互作用更少(A)。单独的抗MARCO抗体不能提供与PLGA IMP类似的效率(B)。
图42展示了在EAE鼠模型中的耐受所需的关键颗粒参数。图(A)示出了最有效的平均粒度是500nm。将小鼠用500nm OVA323-339-PSB、100nm PLP139-151-PSB、500nm PLP139-151-PSB、1.75μm PLP139-151-PSB或4.5μm PLP139-151-PSB处理，并对临床疾病评分。图(B)示出了在静脉输注24小时后荧光标记的具有50:50丙交酯:乙交酯比率的颗粒明显从脾、肝和肺中被清除。
图43展示了具有包封的抗原的TIMP优于肽偶联的颗粒。在鼠过敏模型中，将动物暴露于作为过敏原的OVA，然后进行以下处理：假-PLG、无处理、具有偶联到颗粒外部的OVA的PLGA颗粒(A)或具有包封在颗粒(TIMP) 内的OVA的PLGA颗粒(B)。图(A)示出了OVA-PLG表面偶联颗粒未能降低TH2反应。图(B)示出了TIMPPEMA-60mv(包封在颗粒内的OVA)抑制TH2 反应。图(C)示出了TIMPPEMA-60mv(包封在颗粒内的OVA)抑制回忆反应。
具体实施方式
本发明人发现：偶联到抗原的纳米颗粒可诱导对自身免疫性疾病的耐受并降低免疫反应。这些颗粒可诱导耐受，而不论抗原是结合到颗粒的表面还是包封在颗粒内。因此，这些颗粒可用于治疗特征在于过度炎性免疫反应的任何疾病或病症，如自身免疫性疾病或过敏性反应。
如本文所用的“颗粒”是指任何非组织来源的物质组合物，其可为微球或微球状实体、微珠或脂质体。术语“颗粒”、术语“免疫修饰颗粒”、术语“载体颗粒”和术语“微珠”根据上下文可以互换使用。另外，术语“颗粒”可用于涵盖微珠和微球。
如本文所用的“带负电的颗粒”是指经修饰而具有小于零的净表面电荷的颗粒。
“羧化颗粒”或“羧化微珠”或“羧化微球”包括经修饰而在其表面上包含羧基的任何颗粒。在一些实施例中，羧基的添加增强了吞噬细胞/单核细胞从血循环中摄取颗粒，例如通过与清道夫受体如MARCO相互作用。可使用能添加羧基的任何化合物来实现颗粒的羧化作用，所述化合物包括但不限于聚(乙烯-马来酸酐)(PEMA)。
如本文所用的“抗原部分”是指被宿主的免疫系统识别的任何部分，例如肽。抗原部分的例子包括但不限于自身抗原、酶和/或细菌或病毒蛋白、肽、药物或组分。不受理论的约束，虽然羧化微珠自身可被免疫系统识别，但出于本发明的目的，其上没有附接任何其他物质的羧化微珠并不视为“抗原部分”。
如本文所用的“裸微珠”或“裸颗粒”或“裸微球”是指未经羧化的微珠、颗粒或微球。
如本文所用的“促炎介质”或“促炎多肽”是指诱导、维持或延长受试者的炎症的多肽或其片段。促炎介质的例子包括但不限于细胞因子和趋化因子。
如本文所用，术语“炎性单核细胞”是指表达CD14/CD26和CCR2的任何组合的任何骨髓细胞。
如本文所用，术语“抑制性中性粒细胞”是指中性粒细胞，和/或单核细胞源性抑制细胞。
如本文所用，术语“Th细胞”或“辅助T细胞”是指CD4+细胞。CD4+ T细胞有助于其他白细胞的免疫过程，包括B细胞成熟成浆细胞和记忆B细胞，以及细胞毒性T细胞和巨噬细胞的活化。T细胞在由MHC II类分子呈递肽抗原时被活化，所述分子在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达。
如本文所用，术语“Th1细胞”是指产生促炎介质的Th细胞的亚群。 Th1细胞分泌细胞因子以促进免疫反应，并且部分地通过介导中性粒细胞和巨噬细胞向受感染组织的募集而在针对病原体的宿主防御中发挥作用。Th1 细胞分泌包括IFN-γ、IL2、IL-10和TNFα/β的细胞因子以协调针对诸如病毒和某些细菌之类的细胞内病原体的防御。
如本文所用，术语“Th2细胞”是指这样一个Th细胞亚群，其介导针对细胞外寄生虫、细菌、过敏原和毒素的抗体介导免疫反应的活化和维持。 Th2细胞通过产生诸如IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-13和IL-17E(IL-25)之类的各种细胞因子而介导这些功能，这些细胞因子负责抗体的生成、嗜酸性粒细胞的活化和多种巨噬细胞功能的抑制，从而提供非吞噬细胞依赖性保护反应。
如本文所用，术语“Th17细胞”是指Th细胞的亚群。Th17细胞分泌细胞因子以促进免疫反应，并且通过介导中性粒细胞和巨噬细胞向受感染组织的募集而在针对病原体的宿主防御中发挥作用。TH17细胞分泌诸如IL17、 IL21、IL22、IL24、IL26和TNFα之类的细胞因子以协调针对包括真菌和细菌的细胞外病原体的防御。
如本文所用的“偶联”是指抗原被固定到颗粒外部或包封在颗粒内。因此，偶联到颗粒的抗原既包括表面偶联也包括包封在颗粒内。
如本文所用的术语“IMP”是指未偶联到抗原的免疫修饰颗粒。如本文所用的术语“TIMP”是指偶联到抗原的耐受化免疫修饰颗粒。在一些实施例中，抗原被附接到TIMP的表面。在其他实施例中，抗原被包封在TIMP 内。
颗粒可具有任何颗粒形状或构象。然而，在一些实施例中，优选使用不太可能在体内结块的颗粒。这些实施例内的颗粒的例子是具有球形形状的那些。
本发明的另一方面涉及一种组合物，该组合物包含具有负ζ电势且不含抗原部分的免疫修饰颗粒。在另外一个实施例中，本发明提供包含偶联到抗原的具有负ζ电势的免疫修饰颗粒的组合物。在另外一个实施例中，抗原偶联到颗粒的外部。在一个优选的实施例中，抗原被包封在颗粒内。
本发明的另一方面涉及一种制备具有负ζ电势且不含抗原部分的免疫修饰颗粒的方法。该方法涉及：将免疫修饰颗粒前体与缓冲溶液在有效形成具有负ζ电势的免疫修饰颗粒的条件下接触。在本发明的一些实施例中，免疫修饰颗粒前体经由共聚而形成。颗粒微结构可取决于共聚方法。
在一些实施例中，抗原肽分子通过结合分子和/或连接基团偶联到载体颗粒(例如，免疫修饰颗粒)。在一些实施例中，抗原肽和/或细胞凋亡信号转导分子偶联到载体(例如，PLG颗粒)包括一种或多种共价和/或非共价相互作用。在一些实施例中，抗原肽被附接到具有负ζ电势的载体颗粒的表面。在一些实施例中，抗原肽被包封在具有负ζ电势的载体颗粒内。
在一个实施例中，与免疫修饰颗粒接触的缓冲溶液可具有碱性pH。碱性溶液的合适碱性pH包括7.1、7.5、8.0、8.5、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、 12.0、12.5、13.0和13.5。缓冲溶液也可由任何合适的碱及其结合物制成。在本发明的一些实施例中，缓冲溶液可包括但不限于碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢锂、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠或磷酸二氢锂及其结合物。
在本发明的一个实施例中，免疫修饰颗粒包含共聚物。这些共聚物可具有不同的摩尔比。本发明免疫修饰颗粒的合适共聚物比率可为25:75、30:70、 35:65、40:60、45:55、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、 81:19、82:18、83:17、84:16、85:15、86:14、87:13、88:12、89:11、90:10、 91；:9、92:8、93:7、94:6、95:5、96:4、97:3、98:2、99:1或100:0。在另一个实施例中，共聚物可为周期性、统计、线性、支链(包括星形、刷状或梳状共聚物)共聚物。在一些实施例中，共聚物比率可为但不限于聚苯乙烯：聚 (羧酸乙烯酯)/80:20、聚苯乙烯：聚(羧酸乙烯酯)/90:10、聚(羧酸乙烯酯)：聚苯乙烯/80:20、聚(羧酸乙烯酯)：聚苯乙烯/90:10、聚乳酸：聚乙醇酸/50:50、聚乳酸：聚乙醇酸/80:20或聚乳酸：聚乙醇酸/90:10。
在一个实施例中，本发明的颗粒通过将包含聚合物(例如，PLGA)的组合物添加到聚(乙烯-马来酸酐)(PEMA)的溶液中而制备。PEMA在溶液中的浓度可在约0.1％与约10％之间。在一个实施例中，PEMA在溶液中的浓度在约0.2％与约5％之间。在另一个实施例中，PEMA在溶液中的浓度在约 0.1％与4％之间。在另一个实施例中，PEMA在溶液中的浓度在约0.1％与2％之间。在另一个实施例中，PEMA在溶液中的浓度在约0.5％与1％之间。在一个实施例中，PEMA在溶液中的百分比为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、 0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、 5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％。在一个实施例中，PEMA在溶液中的百分比为约0.5％。在另一个实施例中，PEMA在溶液中的百分比为约1.0％。可以使用的其他化合物包括但不限于聚(乙烯-交替 -马来酸酐)、聚(异丁烯-共-马来酸)、聚(甲基乙烯基醚-交替-马来酸)、聚(甲基乙烯基醚-交替-马来酸单乙酯)、聚(甲基乙烯基醚-交替-马来酸酐)、与1,9- 癸二烯交联的聚(甲基乙烯基醚-交替-马来酸酐)粉末和/或聚(苯乙烯-交替-马来酸)钠盐。
在一个实施例中，颗粒为脂质体。在另外一个实施例中，颗粒是由以下摩尔比的以下脂质构成的脂质体：30:30:40的磷脂酰胆碱：磷脂酰甘油：胆固醇。在再另一个实施例中，颗粒被包封在脂质体内。
每个颗粒的大小无需均匀，但颗粒通常必须具有足以实现以下效果的大小：螯合在脾或肝中，并通过受体或非受体介导的机制触发被抗原呈递细胞 (包括内皮细胞或其他MPS细胞)吞噬或摄取。优选地，颗粒大小为微米级或纳米级，以便增强溶解度，避免可能的因体内聚集引起的并发症，并有利于胞饮作用。粒度可为从间隙空间摄取到淋巴细胞成熟的区域中的因素。具有约0.1μm至约10μm的直径的颗粒能够触发吞噬作用。因此，在一个实施例中，颗粒具有这些限值内的直径。在另一个实施例中，颗粒具有约0.3μm 至约5μm的平均直径。在又另一个实施例中，颗粒具有约0.5μm至约3μm 的平均直径。在另一个实施例中，颗粒具有约0.2μm至约2μm的平均直径。在另外一个实施例中，颗粒具有约0.1μm、或约0.2μm或约0.3μm或约0.4μm 或约0.5μm或约1.0μm或约1.5μm或约2.0μm或约2.5μm或约3.0μm或约3.5μm或约4.0μm或约4.5μm或约5.0μm的平均大小。在一个特定实施例中，颗粒具有约0.5μm的大小。在一些实施例中，颗粒的总体重量小于约 10,000kDa、小于约5,000kDa、或小于约1,000kDa、500kDa、400kDa、300kDa、 200kDa、100kDa、50kDa、20kDa、10kDa。组合物中的颗粒不需要具有均匀的直径。举例来说，药物制剂可包含多个颗粒，其中的一些为约0.5μm，而其他为约1.0μm。具有这些给定范围内的粒度的任何混合物都将为可用的。
本发明的颗粒可具有特定的ζ电势。在某些实施例中，ζ电势为负。在一个实施例中，ζ电势小于约-100mV。在一个实施例中，ζ电势小于约-50mV。在某些实施例中，颗粒具有-100mV与0mV之间的ζ电势。在另外一个实施例中，颗粒具有-75mV与0mV之间的ζ电势。在另外一个实施例中，颗粒具有-60mV与0mV之间的ζ电势。在另外一个实施例中，颗粒具有-50mV与0mV之间的ζ电势。在又另一个实施例中，颗粒具有-40mV与0mV之间的ζ电势。在另外一个实施例中，颗粒具有-30mV与0mV之间的ζ电势。在另外一个实施例中，颗粒具有-20mV与+0mV之间的ζ电势。在另外一个实施例中，颗粒具有-10mV与-0mV之间的ζ电势。在另外一个实施例中，颗粒具有-100mV与-50mV之间的ζ电势。在另一个具体实施例中，颗粒具有-75mV与-50mV之间的ζ电势。在一个特定实施例中，颗粒具有-50mV与 -40mV之间的ζ电势。
在一些实施例中，对载体的电荷(例如，正电、负电、中性)进行选择以赋予面向具体应用的有益效果(例如，生理相容性、有益的表面-肽相互作用等)。在一些实施例中，载体具有净中性电荷或负电荷(例如，以减少对一般来讲具有净负电荷的细胞表面的非特异性结合)。在某些实施例中，载体能够直接或间接结合到需要对其耐受的抗原(在本文也称为抗原特异性肽、抗原肽、自身抗原、诱导抗原或耐受抗原)。在一些情况下，载体具有多个结合位点(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10…20…50…100个或更多个)以便具有暴露在表面上的多个抗原特异性肽拷贝或多个不同的抗原 (例如，以增加耐受反应的可能性)。在一些实施例中，载体展示出单一类型的抗原肽。在一些实施例中，载体在表面上展示出多种不同的抗原肽。在一些实施例中，载体表面展示出用于所选部分(例如，抗原肽)的共价附接的官能团。在一些实施例中，载体表面官能团提供与所选部分(例如，抗原肽)的非共价相互作用的位点。在一些实施例中，载体具有这样的表面，使得结合部分可不通过形成化学键而吸附到其上。
颗粒的大小和电荷对于耐受诱导至关重要。虽然颗粒基于包封在其中的抗原而在大小和电荷上有所不同(有关具体颗粒的例子，参见表1)，但是一般来讲，本发明的颗粒在处于约100纳米与约1500纳米之间并具有0至约-70mV的电荷时能有效诱导耐受，并在为400-800微米并具有约-25mV与 -70mV之间的电荷时最有效地诱导耐受。此外，如表1中所示，部分地由于颗粒的浓度以及在冻干过程中存在蔗糖和D-甘露糖醇，颗粒的平均粒度和电荷在冻干过程中可略为改变，因此，在下面既给出合成后平均值也给出冻干后平均值。如本文所用，术语“合成后大小”和“合成后电荷”是指颗粒在冻干之前的大小和电荷。术语“冻干后大小”和“冻干后电荷”是指颗粒在冻干之后的大小和电荷。
表1代表性颗粒分析
Figure BDA0000926265050000231
在一些实施例中，颗粒为非金属的。在这些实施例中，颗粒可由聚合物形成。在一个优选的实施例中，颗粒为在个体中可生物降解的。在该实施例中，颗粒可以多个剂量在个体中提供，而颗粒不会在个体中累积。合适颗粒的例子包括聚苯乙烯颗粒、PLGA颗粒、PLURIONICS稳定的聚硫化丙烯颗粒和金刚石颗粒。
优选地，颗粒表面由使非特异性或不需要的生物相互作用最小化的材料构成。颗粒表面与间质之间的相互作用可为在淋巴吸收中起作用的因素。颗粒表面可包被有防止或减少非特异性相互作用的材料。通过用亲水层如聚 (乙二醇)(PEG)及其共聚物如
Figure BDA0000926265050000232
(包括聚(乙二醇)-bl-聚(丙二醇)-bl-聚(乙二醇)的共聚物)包被颗粒使空间稳定，可降低与间质的蛋白的非特异性相互作用，如皮下注射后改善淋巴吸收所证实。所有这些事实表明了颗粒的物理性质在淋巴吸收方面的重要性。可生物降解的聚合物可用于制备所有或一些聚合物和/或颗粒和/或层。可生物降解的聚合物可发生降解，例如由官能团与溶液中的水反应所引起。如本文所用的术语“降解”是指通过减小分子量或通过将疏水基团转化为亲水基团而变为可溶的。具有酯基的聚合物一般会发生自发水解，例如，聚丙交酯和聚乙交酯。
本发明的颗粒也可包含附加组分。例如，载体可具有掺入或结合到载体的显像剂。目前可商购获得的具有显像剂的载体纳米球的例子为Kodak X-sight纳米球。无机量子限制发光纳米晶体(称为量子点(QD))已成为FRET 应用中的理想供体：当在单紫外线波长下激发时，它们的高量子产率和可调谐的大小依赖性斯托克斯位移允许不同大小发射蓝光到红外光。(Bruchez,et al.,Science,1998,281,2013(Bruchez等人，《科学》，1998年，第281卷，第2013页)；Niemeyer,C.M Angew.Chem.Int.Ed.2003,42,5796(Niemeyer, C.M，《应用化学国际版》，2003年，第42卷，第5796页)；Waggoner,A. Methods Enzymol.1995,246,362(Waggoner,A.，《酶学方法》，1995年，第246卷，第362页)；Brus,L.E.J.Chem.Phys.1993,79,5566(Brus,L.E.，《化学物理杂志》，1993年，第79卷，第5566页))。量子点，诸如基于称为树枝状聚合物的一类聚合物的混合有机/无机量子点，可用于生物标记、成像以及光学生物传感系统。(Lemon,et al.,J.Am.Chem.Soc.2000,122, 12886(Lemon等人，《美国化学会会志》，2000年，第122卷，第12886 页))。与传统无机量子点的合成不同，这些混合量子点纳米颗粒的合成不需要高温或高毒性、不稳定的试剂。(Etienne,et al.,Appl.Phys.Lett.87,181913,2005(Etienne等人，《应用物理学快报》，第87卷，第181913页， 2005年))。
颗粒可以由各种各样的材料形成。颗粒优选由适合于生物用途的材料构成。例如，颗粒可由玻璃、二氧化硅、羟基羧酸的聚酯、二羧酸的聚酸酐、或羟基羧酸和二羧酸的共聚物构成。更一般地说，载体颗粒可以由以下物质构成：直链或支链的、取代或未取代的、饱和或不饱和的、线性或交联的烷基、卤烷基、硫烷基、氨烷基、芳基、芳烷基、烯基、芳烯基、杂芳基、或烷氧基羟基酸的聚酯，或直链或支链的、取代或未取代的、饱和或不饱和的、线性或交联的烷基、卤烷基、硫烷基、氨烷基、芳基、芳烷基、烯基、芳烯基、杂芳基、或烷氧基二羧酸的聚酸酐。另外，载体颗粒可以是量子点、或由量子点如量子点聚苯乙烯颗粒构成(Joumaa etal.(2006)Langmuir 22:1810-6(Joumaa等人，2006年，《朗缪尔》，第22卷，第1810-1816页))。还可以采用包括酯和酸酐键的混合物(例如乙醇酸和癸二酸的共聚物)的载体颗粒。例如，载体颗粒可包含包括以下物质的材料：聚乙醇酸聚合物(PGA)、聚乳酸聚合物(PLA)、聚癸二酸聚合物(PSA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)共聚物 (PLGA或PLG；这些术语可以互换)、聚(乳酸-共-癸二酸)共聚物(PLSA)、聚(乙醇酸-共-癸二酸)共聚物(PGSA)、聚硫化丙烯聚合物、聚(己内酯)、壳聚糖等。可用于本发明的其他生物相容性、可生物降解的聚合物包括己内酯、碳酸盐、酰胺、氨基酸、原酸酯、缩醛、氰基丙烯酸酯、以及可降解聚氨酯的聚合物或共聚物，以及它们与直链或支链的、取代或未取代的烷基、卤烷基、硫烷基、氨烷基、烯基、或芳香族羟基酸或二羧酸的共聚物。另外，具有反应性侧链基团的生物学上重要的氨基酸，例如赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、以及半胱氨酸、或它们的对映异构体，可以被包括在与任何上述材料的共聚物中，以便为与抗原肽和蛋白质或结合部分的结合提供反应性基团。适合于本发明的可生物降解的材料包括金刚石、PLA、PGA、聚硫化丙烯和PLGA聚合物。生物相容但不可生物降解的材料也可以用于本发明的载体颗粒中。例如，可以采用丙烯酸酯、乙烯- 乙酸乙烯酯、酰基取代的乙酸纤维素、不可降解的聚氨酯、苯乙烯、氯乙烯、氟乙烯、乙烯基咪唑、氯磺化烯烃、环氧乙烷、乙烯醇、
Figure BDA0000926265050000251
(特拉华州威明顿的杜邦公司(DuPont,Wilmington,Del.))以及尼龙的不可生物降解聚合物。
本发明的颗粒可通过本领域通常已知的任何方式制造。制造颗粒的示例性方法包括但不限于微乳液聚合、界面聚合、沉淀聚合、乳化蒸发、乳化扩散、溶剂置换和盐析(Astete and Sabliov,J.Biomater.Sci.Polymer Edn., 17:247-289(2006)(Astete和Sabliov，《生物材料科学杂志-聚合物版》，第 17卷，第247-289页，2006年))。PLGA颗粒的制造过程的操纵可控制颗粒性质(例如，大小、大小分布、ζ电势、形态、疏水性/亲水性、多肽截留等)。颗粒的大小受到多种因素影响，包括但不限于PLGA的浓度、用于制造颗粒的溶剂、有机相的性质、用于制造的表面活性剂、连续和不连续相的粘度、所用溶剂的性质、所用水的温度、超声处理、蒸发率、添加剂、剪切应力、灭菌以及任何包封抗原或多肽的性质。
粒度受到聚合物浓度的影响；更大颗粒由更高聚合物浓度形成。例如，当使用溶剂碳酸丙烯酯时，PLGA浓度从1％升高到4％(w/v)可使平均粒度从约205nm增加到约290nm。或者，在乙酸乙酯和5％Pluronic F-127中， PLGA浓度从1％升高到5％(w/v)会使平均粒度从120nm增加到230nm。
连续和不连续相的粘度也是重要的参数，它会影响扩散过程，即形成较小颗粒的关键步骤。颗粒的大小随分散相的粘度增加而增大，而颗粒的大小随更粘的连续相而减小。一般来讲，有机溶剂与水溶剂的相比率越低，粒度越小。
匀浆器速度和搅拌也影响粒度；一般来讲，更高的速度和搅拌会使粒度减小，但存在这样的点，其中进一步增加速度和搅拌时粒度不再减小。与只是高速搅拌相比，在用高压匀浆器对乳液匀浆化时，对大小减小起到有利影响。例如，在5％PVA中20％的相比率下，搅拌情况下的平均粒度为288nm，而匀浆化(300巴的高压)情况下的平均粒度为231nm。
可通过如下方式实现重要的颗粒大小减小：改变所加入的水的温度，以改善溶剂的扩散。平均粒度随水温升高而减小。
包封在颗粒中的多肽的性质也影响粒度。一般来讲，与更亲水的多肽的包封相比，疏水多肽的包封导致形成更小颗粒。在复乳化过程中，通过使用高分子质量PLGA和高分子质量的引起更高内相粘度的第一表面活性剂，来改善对更亲水的多肽的截留。溶剂、聚合物与多肽之间的相互作用影响多肽掺入颗粒中的效率。
PLGA分子质量影响最终平均粒度。一般来讲，分子质量越高，平均粒度越大。例如，当PLGA的组成和分子质量变化(例如，对于50:50 PLGA 而言12至48kDa；对于75:25 PLGA而言12至98kDa)时，平均粒度也变化(分别约102nm-154nm；约132nm到152nm)。即使当颗粒具有相同分子质量时，它们的组成也可影响平均粒度；例如，具有50:50比率的颗粒一般形成的颗粒比具有75:25比率的颗粒更小。聚合物上的端基也影响粒度。例如，用酯端基制备的颗粒形成平均大小为740nm(PI＝0.394)的颗粒，相比之下，对于酸性PLGA端基而言，平均大小为240nm(PI＝0.225)。
所用溶剂也可影响粒度；降低溶液的表面张力的溶剂也减小粒度。
通过真空蒸发移除有机溶剂，以避免聚合物和多肽损坏并促进最终粒度减小。有机溶剂的真空蒸发能更有效地形成更小的颗粒。例如，真空蒸发产生的平均粒度比正常蒸发速率下产生的平均粒度小约30％。
超声处理波长的振幅也影响颗粒特性。波长的振幅应超过20％且超声处理600至800s以形成稳定细乳液，而液滴大小不再变化。然而，超声处理的主要缺点是所形成的乳液不具有单分散性。
可用于产生本发明的颗粒的有机相包括但不限于乙酸乙酯、甲基乙基酮、碳酸丙烯酯和苯甲醇。可使用的连续相包括但不限于表面活性剂泊洛沙姆188。
多种表面活性剂可用于制造本发明的颗粒。表面活性剂可为阴离子、阳离子或非离子的。泊洛沙姆和泊洛沙胺家族中的表面活性剂通常用于颗粒合成。可使用的表面活性剂包括但不限于PEG、吐温-80、明胶、葡聚糖、pluronic L-63、PVA、甲基纤维素、卵磷脂和DMAB。另外，可生物降解且生物相容性的表面活性剂包括但不限于维生素E TPGS(D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)。在某些实施例中，需要两种表面活性剂(例如，在复乳化挥发方法中)。这两种表面活性剂可包括用于第一乳液的疏水表面活性剂以及用于第二乳液的疏水表面活性剂。
可用于产生本发明的颗粒的溶剂包括但不限于丙酮、四氢呋喃(THF)、氯仿以及氯族的成员、氯甲烷。有机溶剂的选择需要两种选择标准：聚合物必须可溶于该溶剂，以及溶剂必须与水相完全混溶。
可用于产生本发明的颗粒的盐包括但不限于氯化镁六水合物、乙酸镁四水合物。
常见盐析剂包括但不限于电解质(例如，氯化钠、乙酸镁、氯化镁)或非电解质(例如，蔗糖)。
可通过加入化合物来改善本发明的颗粒的稳定性和大小，所述化合物包括但不限于脂肪酸或短碳链。较长碳链的月桂酸的加入与颗粒特性的改善相关。此外，疏水添加剂的加入可改善粒度、多肽向颗粒中的掺入以及释放特性。可通过冻干使颗粒的制剂稳定。冷冻保护剂如海藻糖的加入可减少冻干时颗粒的聚集。
目前可商购获得的合适的微珠包括聚苯乙烯微珠，如FluoSpheres(俄勒冈州尤金的分子探针公司(Molecular Probes,Eugene,Oreg.))。
在一些实施例中，本发明提供的系统包括：(a)被构造成向受试者递送化学药剂和/或生物药剂的递送支架；以及(b)用于诱导抗原特异性耐受的抗原偶联聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒。在一些实施例中，所述递送支架的至少一部分为微孔的。在一些实施例中，抗原偶联聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒被包封在所述支架内。在一些实施例中，化学药剂和/或生物药剂选自：蛋白质、肽、小分子、核酸、细胞和颗粒。在一些实施例中，化学药剂和/或生物药剂包括细胞，并且所述细胞包括胰岛细胞。
物理性质还与在具有未成熟淋巴细胞的区域内摄取和保留之后的纳米颗粒的适用性相关。它们包括机械性质，如刚性或弹性。一些实施例是基于弹性核心，例如具有覆盖层例如亲水覆盖层的聚(硫化丙烯)(PPS)核心，如在 PEG中，如在最近开发并且表征用于全身性(但不是靶向或免疫的)递送的 PPS-PEG系统中。弹性核心与大体上刚性的核心相反，如在聚苯乙烯或金属纳米颗粒系统中。术语弹性是指除天然或合成橡胶之外的某些有弹性的材料，而弹性是聚合物领域的技术人员所熟悉的术语。例如，交联PPS可用于形成疏水弹性核心。PPS是一种聚合物，其在氧化条件下降解为聚亚砜并最终形成聚砜，从疏水橡胶转变为亲水的水溶性聚合物。其他硫化物聚合物可能适合使用，其中术语硫化物聚合物是指在基体的主链中具有硫的聚合物。其他可以使用的弹性聚合物是在水合条件下的玻璃化转变温度低于约37℃的聚酯。疏水核心可以有利地与亲水覆盖层一起使用，因为核心和覆盖层会倾向于不混合，因而覆盖层倾向于在空间上从核心扩张开来。核心是指其上具有层的颗粒。层是指覆盖核心的至少一部分的材料。层可以是吸附的或共价结合的。颗粒或核心可以是实心或中空的。弹性疏水核心优于刚性疏水核心，如结晶或玻璃(如在聚苯乙烯的情况下)核心，因为具有弹性疏水核心的颗粒可以携带更高的疏水药物负载量。
另一个物理性质是表面的亲水性。亲水材料当它未交联时可在水中具有至少1克每升的溶解度。具有亲水聚合物的颗粒的空间稳定可通过减少非特异性相互作用而提高从间质的摄取；然而，颗粒增加的隐身性质也可以减少具有不成熟淋巴细胞的区域中吞噬细胞的内在化。然而，已经遇到了平衡这些抵触的特征的挑战，并且本申请记载了用于有效地通过淋巴递送至DC和淋巴结中的其他APC的纳米颗粒的产生。一些实施例包括亲水组分，例如亲水材料层。合适的亲水材料的例子是以下中的一种或多种：聚环氧烷、聚环氧乙烷、多糖、聚丙烯酸和聚醚。可以调整层中的聚合物的分子量以便在体内提供有用的位阻程度，例如约1,000至约100,000或甚至更多；技术人员会立刻认识到在明确说明的范围内的所有范围和数值都是可预期的，例如在10,000和50,000之间。
纳米颗粒可能掺入官能团以用于进一步反应。用于进一步反应的官能团包括亲电试剂或亲核试剂；它们便于与其他分子反应。亲核试剂的例子为伯胺、硫醇和羟基。亲电试剂的例子是琥珀酰亚胺酯、醛、异氰酸酯以及马来酰亚胺。
本领域熟知的多种手段可用于将抗原肽和蛋白质结合到载体。这些方法包括任何标准化学方法，这些方法不破坏或严重限制抗原肽和蛋白质的生物活性，并且允许将充足数量的抗原肽和蛋白质以允许抗原肽或蛋白质与同源 T细胞受体相互作用的取向结合到载体。通常，将抗原肽或蛋白质的C端区域或抗原肽或蛋白质融合蛋白的C端区域结合到载体的方法是优选的。当然，精确的化学方法将取决于载体材料的性质、抗原肽或蛋白质的C端融合的存在与否和/或结合部分的存在与否。
官能团可根据利用率的需要而位于颗粒上。一个位置可以是作为在以下聚合物上的侧基或末端：核心聚合物、作为核心上的层的聚合物或以其他方式拴系到颗粒上的聚合物。例如，本文包括的例子描述了PEG使以下纳米颗粒稳定化，所述纳米颗粒可被轻易官能化以用于靶向特定细胞或递送蛋白质和肽药物。
诸如乙烯碳二亚胺(ECDI)、六亚甲基二异氰酸酯、含有2个环氧残基的聚丙二醇二缩水甘油醚以及表氯醇之类的结合物可用于将肽或蛋白质固定到载体表面。不受理论的约束，ECDI疑似会执行以下两大功能以诱导耐受： (a)ECDI通过催化游离氨基与游离羧基之间的肽键形成而将蛋白质/肽化学偶联到细胞表面；以及(b)ECDI诱导载体模拟凋亡细胞死亡，使得它们被脾中的宿主抗原呈递细胞(可包括内皮细胞)摄取并诱导耐受。正是这种以非免疫性方式呈递至宿主T细胞导致了对自体反应性细胞中无反应性的直接诱导。此外，ECDI充当强效刺激物用于诱导特定调节性T细胞。
在一个系列的实施例中，抗原肽和蛋白质经由共价化学键结合到载体。例如，在抗原C端附近的反应性基团或部分(例如，C端羧基或来自氨基酸侧链的羟基、硫醇或胺基)可通过直接化学反应直接结合到载体表面上的反应性基团或部分(例如，PLA或PGA聚合物的羟基或羧基、树枝状聚合物的末端胺或羧基，或磷脂的羟基、羧基或磷酸酯基团)。或者，可存在既共价结合到抗原肽和蛋白质也共价结合到载体的结合部分，从而将它们连接在一起。
载体表面上的反应性羧基可通过使这些羧基与例如1-乙基-3-[3,9-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)或N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)反应而连接到抗原肽或蛋白质上的游离胺(例如，来自Lys残基)。类似地，可将相同的化学方法用于将载体表面上的游离胺与抗原肽或蛋白质上的游离羧基 (例如，来自C端，或来自Asp或Glu残基)结合。或者，载体表面上的游离胺基可使用磺基-SIAB化学方法共价结合到抗原肽和蛋白质，或抗原肽或蛋白质融合蛋白，大体上如Arano et al.(1991)Chem.2:71-6(Arano等人， 1991年，《化学》，第2卷，第71-76页)所述。
在另一个实施例中，结合到抗原肽或蛋白质的配体与附接到载体的反配体之间的非共价键可将抗原结合到载体。例如，可将生物素连接酶识别序列标签连接到抗原肽或蛋白质的C端，并且此标签可通过生物素连接酶生物素化。然后生物素可充当配体以将抗原肽或蛋白质非共价结合到作为反配体吸附或以其他方式结合到载体表面的亲和素或链霉亲和素。或者，如果抗原肽和蛋白质如上所述被融合到具有Fc区域的免疫球蛋白结构域，则Fc结构域可充当配体，并且共价或非共价结合到载体表面的蛋白质A可充当反配体以将抗原肽或蛋白质非共价结合到载体。可用于将抗原肽和蛋白质非共价结合到载体的其他手段是本领域熟知的，这些手段包括金属离子螯合技术(例如，在抗原肽或蛋白质或者抗原肽或蛋白质融合蛋白的C端使用聚-His标签，以及Ni+涂布的载体)，并且这些方法可替代在这里描述的方法。
将核酸部分结合到平台分子可以许多方式来实现，这些方式通常涉及一种或多种交联剂以及核酸部分与平台分子上的官能团。使用标准合成化学技术将连接基团添加到平台。可使用标准合成技术将连接基团添加到核酸部分。关于本发明的组合中所用的抗原，从业者有许多选择。存在于所述组合中的诱导抗原有助于所诱导的致耐受性反应的特异性。诱导抗原可与靶抗原相同或不同，而靶抗原是存在于或将要置于进行治疗的受试者体内的抗原，它是不期望的免疫反应的靶标，并且需要针对其的耐受。
本发明的诱导抗原可以是多肽、多核苷酸、碳水化合物、糖脂或从生物来源分离的其他分子，或者诱导抗原可以是化学合成的小分子、聚合物或生物材料的衍生物，前提条件是它在与粘膜结合组分组合时具有根据本说明书的诱导耐受的能力。
在一些实施例中，本发明提供一种偶联到一种或多种肽、多肽和/或蛋白质的载体(例如，免疫修饰颗粒)。在一些实施例中，诸如本文所述的那些载体(例如，PLG载体)有效诱导抗原特异性耐受和/或预防免疫相关疾病 (如小鼠模型中的EAE)的发作和/或减轻已存在的免疫相关疾病的严重性。在一些实施例中，本发明的组合物和方法可引起T细胞发生与T细胞活化相关的早期事件，但不允许T细胞获得效应子功能。例如，施用本发明的组合物可产生具有准活化表型的T细胞，如CD69和/或CD44上调，但不展示效应子功能，如由缺乏IFN-γ或IL-17合成所指示的。在一些实施例中，施用本发明的组合物产生具有准活化表型的T细胞，而不使天然抗原特异性T细胞转化成调节性表型，诸如具有CD25+/Foxp3+表型的那些。
在一些实施例中，载体(例如，颗粒)的表面包含允许抗原肽和/或其他功能元件附接(例如共价、非共价)到载体的化学部分和/或官能团。在一些实施例中，载体(例如，颗粒)上的化学部分和/或官能团的数量、取向、间距等根据载体化学、所需的应用等而变化。
在一些实施例中，载体包含一种或多种生物药剂或化学药剂，这些生物药剂或化学药剂粘附到载体、吸附到载体上、包封在载体内和/或包含在整个载体中。在一些实施例中，化学药剂或生物药剂被包封在颗粒中和/或包含在整个颗粒中。本发明不受化学药剂或生物药剂的性质的限制。此类药剂包括但不限于蛋白质、核酸分子、小分子药物、脂质、碳水化合物、细胞、细胞组分等。在一些实施例中，载体上或载体内包含两种或更多种(例如，3种、 4种、5种等)不同的化学药剂或生物药剂。在一些实施例中，药剂被配置成具有特定的释放速率。在一些实施例中，将多种不同的药剂配置成具有不同的释放速率。例如，第一药剂可释放数小时的时间，而第二药剂释放更长的时间(例如，数天、数周、数月等)。在一些实施例中，载体或其一部分被配置成缓慢释放生物药剂或化学药剂。在一些实施例中，缓慢释放使得生物活性量的药剂的释放历时至少30天(例如，40天、50天、60天、70天、 80天、90天、100天、180天等)。在一些实施例中，载体或其一部分被配置成具有足以允许细胞向内生长进入孔中的多孔性。可针对所关注的特定细胞类型和/或所需的向内生长量来选择孔的大小。在一些实施例中，颗粒包含所关注的抗原，而不包含其他非肽活性剂，如药物或免疫调节剂。此外，在一些实施例中，本发明的颗粒除了所关注的抗原外不含免疫刺激性或免疫抑制性肽。此外，在一些实施例中，颗粒不含在其表面上或包封在其中的其他蛋白质或肽(例如，共刺激分子、MHC分子、免疫刺激性肽或免疫抑制性肽)。
已令人惊讶地发现，将抗原、生物药剂和/或化学药剂包封在本发明的颗粒中诱导了免疫耐受并且具有若干优点。第一，包封的颗粒具有更慢的细胞因子反应。第二，当使用多种抗原、生物药剂和/或化学药剂时，包封消除了这些不同分子之间的竞争，如果药剂附接到颗粒的表面则可能发生这种竞争。第三，包封允许更多种抗原、生物药剂和/或化学药剂掺入颗粒中。第四，包封允许更容易地使用复杂的蛋白抗原或器官匀浆(例如，关于1型糖尿病的胰腺匀浆或花生过敏中的花生提取物)。最后，将抗原、生物药剂和/或化学药剂包封在颗粒内而不是结合到颗粒的表面上使颗粒表面上的净负电荷得以维持。将抗原、生物药剂和/或化学药剂包封在本发明的颗粒中可通过本领域已知的任何方法进行。在一个实施例中，通过复乳化法将多肽抗原包封在颗粒中。在另外一个实施例中，多肽抗原为水溶性的。
在另一个实施例中，通过单乳化法将多肽抗原包封在颗粒中。在另外一个实施例中，多肽抗原的疏水性更高。有时，复乳化法导致大颗粒的形成，这可导致亲水性活性组分泄漏并且截留效率低下。聚结和奥斯特瓦尔德成熟 (Ostwald ripening)是可使复乳化液滴失稳的两种机制，而通过亲水性活性组分的有机相的扩散是导致活性组分的截留水平低的主要机制。在一些实施例中，降低纳米颗粒大小可能是有益的。实现这一点的一种策略是施加第二强剪切速率。泄漏效应可通过使用高聚合物浓度和高聚合物摩尔质量而降低，这伴随着内部水相粘度的升高和表面活性剂摩尔质量的增加。
在某些实施例中，本发明提供其上面(或内部)具有细胞或其他生物或化学药剂的载体。在采用细胞的情况下，载体不限于特定类型的细胞。在一些实施例中，载体上面具有胰岛细胞。在一些实施例中，微孔载体上面另外具有ECM蛋白和/或艾塞那肽-4。载体不限于特定类型。在一些实施例中，载体具有不同孔隙率(例如，不同孔径、孔深度和/或孔密度)的区域。在一些实施例中，载体上面(或内部)具有药剂、DNA、RNA、细胞外基质蛋白、艾塞那肽-4等。在某些实施例中，本发明提供用此类载体移植胰岛细胞的方法。在本发明的某些实施例中，诱导抗原是单一分离的或重组产生的分子。为治疗靶抗原散布在宿主中的多个位置的病症，通常需要诱导抗原是与靶抗原相同或与靶抗原免疫相关的。此类抗原的例子是大多数多核苷酸抗原和一些糖抗原(如血型抗原)。
任何合适的抗原均可用于本发明的范围内。在一些实施例中，诱导抗原有助于所诱导的致耐受性反应的特异性。诱导抗原可与靶抗原相同或不同，而靶抗原是存在于或将要被置于接受治疗的受试者体内的抗原，它是不期望的免疫反应的靶标，并且需要针对其的耐受。
在靶抗原优先在特定器官、细胞或组织类型上表达的情况中，从业者再次可选择使用与靶抗原相同或与靶抗原免疫相关的诱导抗原。然而，也存在另外的选择，即，使用对于靶标而言是旁观者(bystander)的抗原。这是一种在免疫学上可能与靶抗原不相关的抗原，但其优先在表达靶抗原的组织中表达。关于旁观者抑制的有效性的工作原理是：抑制是一个活性细胞介导的过程，该过程下调靶细胞处的免疫反应的效应臂(effector arm)。抑制细胞由粘膜表面的诱导抗原特异性地刺激，并回归到旁观者抗原优先表达的组织位点。通过相互作用或细胞因子介导的机制，局部的抑制细胞然后下调附近的效应细胞(或效应细胞的诱导物)，不管它们对什么具有反应性。如果效应细胞对不同于诱导抗原的靶标具有特异性，则结果是旁观者效应。关于对旁观者反应的进一步详细说明和具有此效应的致耐受性肽的列表，读者可参考国际专利公布WO 93/16724。旁观者理论的言下之意是：为实践本发明，普通技术人员不需要鉴定或分离针对其需要获得耐受的特定靶抗原。从业者仅需要能够获得至少一种优先在靶点处表达的分子来用作诱导抗原。
在本发明的某些实施例中，诱导抗原的形式与正在接受治疗的个体中表达的形式不同，而是其片段或衍生物。本发明的诱导抗原包括以具有适当特异性的分子为基础但通过断裂、残基取代、标记、缀合和/或与具有其他功能性质的肽相融合而加以修改的肽。这种修改可出于任何所需目的而进行，包括但不限于消除任何不需要的性质，如毒性或免疫原性；或增强任何所需性质，如粘膜结合、粘膜渗透或对免疫反应的致耐受性臂的刺激。如本文所用的诸如胰岛素肽、胶原肽和髓鞘碱性蛋白肽之类的术语不仅指完整的亚基，而且指异型和合成变体、片段、融合肽、结合物以及其他衍生物，所述衍生物含有与作为衍生物的类似物的相应分子的至少10个并且优选20个连续氨基酸同源(优选在氨基酸水平上70％同一性、更优选80％同一性甚至更优选 90％同一性)的区域，其中衍生物的同源区域与各自的母体分子共有诱导对靶抗原的耐受的能力。
已经认识到，诱导抗原的致耐受性区域经常不同于用于刺激抗体反应的免疫优势表位。致耐受性区域通常是可参与涉及T细胞的特定细胞相互作用的区域。致耐受性区域可参与，并且能够在呈递完整抗原时诱导耐受。一些抗原含有隐蔽的致耐受性区域，因为天然抗原的加工和呈递一般不触发耐受。对隐蔽抗原及其鉴定的详细描述见于国际专利公布WO94/27634中。
在本发明的某些实施例中，使用两种、三种或更多种诱导抗原。当存在多种靶抗原时可能需要实施这些实施例，或者可能需要实施这些实施例来为靶标提供多种旁观者。例如，在治疗糖尿病时，胰岛素与胰高血糖素两者均可与粘膜结合组分混合。可能还需要提供抗原的混合物以覆盖若干可能的替代靶标。例如，组织相容性抗原片段的混合物可用于使预期将来会移植未知表型的同种异体移植物的受试者耐受化。人白细胞抗原的同种异体变体区域是本领域已知的：例如Immunogenetics 29:231,1989(《免疫遗传学》，第 29卷，第231页，1989年)。在另一个例子中，过敏原的混合物可充当用于治疗特应症的诱导抗原。
取决于分子性质，诱导抗原可通过本领域已知的许多技术来制备。多核苷酸、多肽和碳水化合物抗原可从富含其的要进行治疗的物种的细胞中分离。短肽通过氨基酸合成方便地制备。具有已知序列的更长的蛋白质可通过合成编码序列或从天然来源或载体PCR扩增编码序列，然后在合适的细菌或真核生物宿主细胞中表达编码序列来制备。
在本发明的某些实施例中，所述组合包含从细胞或组织获得的抗原的复杂混合物，其中的一种或多种起诱导抗原的作用。抗原可呈全细胞的形式，其为完整的或用固定剂如甲醛、戊二醛或醇进行了处理。抗原可呈细胞裂解液的形式，其通过使细胞或组织经历洗涤剂增溶或机械破碎随后净化而产生。抗原还可以通过亚细胞分级获得，特别是通过诸如差速离心之类的技术进行质膜富集，任选地随后进行洗涤剂增溶和透析。其他分离技术也是合适的，如溶解的膜蛋白的亲和或离子交换层析。
在一个实施例中，抗原肽或蛋白质是自身抗原、同种异体抗原或移植抗原。在另一个特定实施例中，自身抗原选自髓鞘碱性蛋白、胶原或其片段、 DNA、核和核仁蛋白、线粒体蛋白以及胰β-细胞蛋白。
本发明诱导对自身抗原的耐受，以用于通过施用针对其需要获得耐受的抗原来治疗自身免疫性疾病。例如，在患有多发性硬化的患者中观测到针对髓鞘碱性蛋白(MBP)的自身抗体，因此，MBP抗原肽或蛋白质可用于在本发明中使用本发明的组合物进行递送，从而治疗和预防多发性硬化。
另举一个非限制性例子，作为来自异卵双胞胎的移植物的候选者的个体可能经历对植入细胞、组织或器官的排斥，因为植入的抗原对受体而言是外来的。受体个体对目标移植物的在先耐受使后来的排斥消除或减少。通过实践本发明可减少或消除长期的抗排斥治疗。在另一个例子中，许多自身免疫性疾病的特征在于对内源性或自身抗原的细胞免疫反应。免疫系统对内源性抗原的耐受是控制疾病所需要的。
在另一个例子中，个体对工业污染物或诸如可能在工作中遭遇的化学品的致敏带来了免疫反应的危险。个体的免疫系统对化学品(尤其是与个体的内源性蛋白反应的化学品形式)的在先耐受可能是预防免疫反应的后期职业性发生所需要的。
过敏原是也需要获得对其的免疫反应耐受的其他抗原。在一个实施例中，抗原是麦胶蛋白。在另一个实施例中，抗原是A-麦胶蛋白。
值得注意的是，即使在病原性自身抗原未知的疾病中，也可使用存在于解剖位置附近的抗原诱导旁观者抑制。例如，在类风湿性关节炎中观测到胶原的自身抗体，因此，编码胶原的基因可用作表达抗原的基因模块以治疗类风湿性关节炎(参见例如Choy(2000)Curr Opin Investig Drugs 1:58-62 (Choy，2000年，《现代研究药物观点》，第1卷，第58-62页))。此外，对β细胞自身抗原的耐受可用于预防1型糖尿病的发生(参见例如Bach andChatenoud(2001)Ann Rev Immunol 19:131-161(Bach和Chatenoud，2001 年，《免疫学年评》，第19卷，第131-161页))。
作为另一个例子，在自身免疫性脑脊髓炎和许多其他CNS疾病以及多发性硬化中观测到了抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的自身抗体(参见例如Iglesias et al.(2001)Glia 36:22-34(Iglesias等人，2001年，《胶质细胞》，第36卷，第22-34页))。因此，在本发明中使用MOG抗原表达构建体可以治疗多发性硬化以及中枢神经系统的相关自身免疫性疾病。
用于治疗自身免疫性疾病的候选自身抗原的其他例子包括：用于治疗胰岛素依赖型糖尿病的胰β-细胞抗原、胰岛素和GAD；用于治疗类风湿性关 节炎的II型胶原、人软骨gp39(HCgp39)和gp130-RAPS；用于治疗多发性 硬化的髓鞘碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 (MOG，参见上文)；用于治疗硬皮病的纤维蛋白和小核仁蛋白(snoRNP)； 用于治疗格雷夫斯病的甲状腺刺激因子受体(TSH-R)；用于治疗系统性红斑 狼疮的核抗原、组蛋白、糖蛋白gp70和核糖体蛋白；用于治疗原发性胆汁 性肝硬化的丙酮酸脱氢酶脱氢硫辛酰胺乙酰转移酶(PCD-E2)；用于治疗斑秃 的毛囊抗原；以及用于治疗溃疡性结肠炎的人原肌球蛋白亚型5(hTM5)。
在一个实施例中，本发明的颗粒偶联到抗原，所述抗原包含与过敏性反应、自身免疫性疾病和/或炎性疾病或紊乱相关的一个或多个表位。抗原可包含表位的一个或多个拷贝。在一个实施例中，抗原包含与一种疾病或紊乱相关的单个表位。在另外一个实施例中，抗原包含与相同疾病或紊乱相关的不止一个表位。在再一个实施例中，抗原包含与不同疾病或紊乱相关的不止一个表位。在另外一个实施例中，抗原包含与一种或多种过敏性反应相关的一个或多个表位。在另外一个实施例中，抗原包含与多发性硬化、1型糖尿病、乳糜泻和/或炎性肠病(包括克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)相关的一个或多个表位。在一个实施例中，表位来自髓鞘碱性蛋白(例如，SEQ ID NO:4975 和4976)、蛋白脂质蛋白(例如，SEQ IDNO:4977)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(例如，SEQ ID NO:1和4978)、水通道蛋白(例如，SEQID NO:4979)、髓鞘相关糖蛋白(例如，SEQ ID NO:4980)、胰岛素(例如，SEQ ID NO: 4981)、谷氨酸脱羧酶(例如，SEQ ID NO:4982)、麦醇溶蛋白(例如， SEQ ID NO:4983-4985或5136-5140)、IV型胶原α3链(例如，SEQ ID NO: 5017)或它们的片段、同源物或亚型。在另外一个实施例中，表位来自谷蛋白，包括来自麦醇溶蛋白和/或麦谷蛋白。在一个实施例中，表位来自胰岛素同源物，如美国专利No.8,476,228中所述的那些，所述专利据此全文并入以用于所有目的。在一个实施例中，麦胶蛋白表位是美国专利申请No. 20110293644中的SEQ IDNO:13、14、16、320或321，所述专利据此全文并入以用于所有目的。
本发明所设想的与各种自身免疫性疾病和/或炎性疾病或紊乱相关的表位的另外非限制性例子描述于表2和表3中。
表2-代表性线性表位
Figure BDA0000926265050000371
并非所有表位都是线性表位；表位也可为不连续的构象表位。已知多种与自身免疫性疾病或炎性疾病和/或紊乱相关的不连续表位的。不连续表位的非限制性例子描述于表3中。
表3-代表性不连续表位
Figure BDA0000926265050000381
Figure BDA0000926265050000391
通过使用分离的细胞或在动物模型中进行实验可测试抗原和/或表位的组合促进耐受的能力。
在一些实施例中，本发明的耐受诱导组合物包含细胞凋亡信号转导分子 (例如，除抗原肽或其他抗原分子外)。在一些实施例中，细胞凋亡信号转导分子与载体的表面偶联和/或缔合。在一些实施例中，细胞凋亡信号转导分子允许载体被宿主的抗原呈递细胞(如宿主网状内皮系统的细胞)感知为凋亡小体；这允许相关肽表位以耐受诱导方式呈递。不受理论的约束，据推测，这防止了免疫细胞刺激中所涉及到的分子(例如MHC I/II类)和共刺激分子的上调。这些细胞凋亡信号转导分子还可以充当吞噬细胞标记物。例如，适合用于本发明的细胞凋亡信号转导分子已描述于美国专利申请号 20050113297中，该专利申请据此全文以引用方式并入。适合用于本发明的分子包括靶向吞噬细胞的分子，所述吞噬细胞包括巨噬细胞、树突细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞。
在一些实施例中，适合作为细胞凋亡信号转导分子的分子起到增强相关肽的耐受的作用。另外，与细胞凋亡信号转导分子结合的载体可在凋亡细胞识别中被Clq结合(Paidassi et al.,(2008)J.Immunol.180:2329-2338(Paidassi 等人，2008年，《免疫学杂志》，第180卷，第2329-2338页)；全文以引用方式并入本文)。例如，可用作细胞凋亡信号转导分子的分子包括磷脂酰丝氨酸、膜联蛋白-1、膜联蛋白-5、乳脂球-EGF-因子8(MFG-E8)或血小板反应蛋白家族(例如血小板反应蛋白-1(TSP-1))。适合在本发明情况下用作细胞凋亡信号转导分子的各种分子在例如美国专利申请2012/0076831中有所讨论；全文以引用方式并入本文)。
在一些实施例中，细胞凋亡信号转导分子可结合到抗原特异性肽。在一些情况下，细胞凋亡信号转导分子和抗原特异性肽通过形成融合蛋白而结合。例如，融合蛋白可包含至少一种抗原特异性肽(或其片段或变体)，其偶联到细胞凋亡信号转导分子的至少一个分子(或其片段或变体)。关于融合蛋白的形成，术语“融合蛋白”、“融合肽”、“融合多肽”和“嵌合肽”可互换使用。抗原特异性肽的合适片段包括全长肽中维持以下功能的任何片段：能产生本发明所需的抗原特异性耐受功能。融合蛋白可通过本领域中所了解的各种手段(例如基因融合、化学偶联等)来形成。两种蛋白可直接地或经由氨基酸连接基融合。形成融合蛋白的多肽通常使C端连接至N端，不过它们还可以使C端连接至C端、N端连接至N端或N端连接至C端。融合蛋白的多肽可以呈任何顺序。肽连接基序列可用于使第一和第二多肽组分间隔开一定距离，该距离足以确保各多肽折叠成其二级和三级结构。可有效地用作连接基的氨基酸序列包括在以下文献中公开的那些氨基酸序列： Maratea et.al.,Gene 40:39-46(1985)(Maratea等人，《基因》，第40卷，第39-46页)；Murphy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8258-8262(1986) (Murphy等人，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第8258-8262页)；美国专利No.4,935,233和美国专利No.4,751,180；它们全文以引用方式并入本文。连接基序列的长度通常可以是1至约50个氨基酸。在一些实施例中，例如当第一和第二多肽具有可用于分隔功能结构域并且防止空间干扰的非必需N端氨基酸区域时，不需要和/或不利用连接基序列。
致耐受活性的一个代表是完整抗原或片段在靶点处刺激适当细胞因子的生成的能力。由T抑制细胞在靶点处释放的免疫调节性细胞因子被认为是 TGF-β(Miller et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:421,1992(Miller等人，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第421页，1992年))。在耐受期间可以产生的其他因子是细胞因子IL4和IL-10，以及介质PGE。相反，经历主动免疫破坏的组织中的淋巴细胞分泌诸如IL-I、IL-2、IL-6和γ-IFN之类的细胞因子。因此，候选诱导抗原的疗效可通过测量其刺激适当类型的细胞因子的能力来评价。
考虑到这一点，可使用同基因动物作为体外细胞测定的供体，来进行对诱导抗原的致耐受性表位、有效的粘膜结合组分、有效的组合或有效的粘膜施用模式和时间表的快速筛选测试。用测试组合物处理动物的粘膜表面，并且有时通过肠胃外施用完全弗氏佐剂(Freund's adjuvant)中的靶抗原对动物进行攻击。分离脾细胞，并在浓度为约50μg/mL的靶抗原存在下进行体外培养。可用候选蛋白质或亚片段代替靶抗原来标绘致耐受性表位的位置。可以通过标准免疫测定来定量向培养基中的细胞因子分泌。
细胞抑制其他细胞活性的能力可使用从用靶抗原免疫的动物中分离的细胞或通过形成对靶抗原有反应的细胞系来测定(Ben-Nun et al.,Eur.J. Immunol.11:195,1981(Ben-Nun等人，《欧洲免疫学杂志》，第11卷，第 195页，1981年，全文以引用方式并入本文)。在此实验的一个变型中，对抑制细胞群进行轻度照射(约1000至1250拉德)以防止增殖，将抑制细胞与应答细胞一起培养，然后使用氚化胸苷掺入法(或MTT)来定量应答细胞的增殖活性。在另一个变型中，在双腔transwell培养系统(马萨诸塞州剑桥的Costar公司(Costar,Cambridge Mass.))的上层和下层中培养抑制细胞群和应答细胞群，所述培养系统允许细胞群在相互由聚碳酸酯膜隔开1mm内共温育(WO 93/16724)。在这种方法中，照射抑制细胞群是不必要的，因为应答细胞的增殖活性可单独测量。
在靶抗原已经存在于个体中的本发明的实施例中，不需要分离抗原或将其与粘膜结合组分预组合。例如，抗原可因病理状态(如炎性肠病或乳糜泻) 而以某一方式在个体中表达或通过食物过敏原的消化而在个体中表达。通过以一种或多种剂量或制剂给予粘膜结合组分并确定其原位促进针对抗原的耐受化的能力来进行测试。
用于治疗特定疾病的组合物和施用模式的有效性还可以在相应的动物疾病模型中进行阐述。在适合于所采用的模型的疾病的循环生物化学和免疫学标志、受影响的组织的免疫组织学、以及总体临床特征的层面上监测所述治疗减弱或延迟疾病症状的能力。可用于测试的动物模型的非限制性例子包括在以下部分内。
本发明设想了通过调节TH1反应、TH2反应、TH17反应、或这些反应的组合来调节耐受性。调节TH1反应涵盖改变例如干扰素-γ的表达。调节 TH2反应涵盖改变例如IL-4、IL-5、IL-10和IL-13的任何组合的表达。通常 TH2反应的增加(减少)将包括IL-4、IL-5、IL-10或IL-13中至少一个的表达的增加(减少)；更通常TH2反应的增加(减少)将包括IL-4、IL-5、IL-10 或IL-13中至少两个的表达增加，最通常TH2反应的增加(减少)将包括IL-4、 IL-5、IL-10或IL-13中至少三个的增加，而理想地TH2反应的增加(减少) 将包括IL-4、IL-5、IL-10和IL-13全部的表达的增加(减少)。调节TH 17 涵盖改变例如TGF-β、IL-6、IL-21和IL23的表达以及IL-17、IL-21和IL-22 的效应水平。
其他适于评估本发明的组合物和方法的有效性的方法是本领域所了解的，如例如在美国专利申请2012/0076831(全文以引用方式并入本文)中所述。
本发明的某些实施例涉及在未通过治疗性干预事先耐受化的个体中引发免疫耐受。这些实施例通常涉及多次施用抗原与粘膜结合组分的组合。通常，在初免过程中进行至少三次施用、经常地至少四次施用并且有时至少六次施用以实现长期持久的结果，但是受试者可能在治疗过程的早期表现出耐受。最经常的是，以一次性大剂量施用(bolusadministration)的方式给予各剂量，但是能够经粘膜释放的持续制剂也是合适的。在进行多次施用的情况下，各施用之间的时间通常介于1天与3周之间，并且通常介于约3天与2周之间。通常，相同的抗原和粘膜结合组分以相同的浓度存在，并施用给相同的粘膜表面，但是可容许治疗过程中任何这些变量的变化。
本发明的其他实施例涉及加强或延长事先建立的免疫耐受的持久性。这些实施例通常涉及在所建立的耐受衰退或处于衰退风险中时进行一次施用或短期治疗过程。加强通常在初免或事先加强后1个月至1年，并且通常2 至6个月进行。本发明还包括涉及根据每半周、每周、每两周发生一次的施用时间表或根据任何其他定期时间表定期维持耐受的实施例。
本发明的颗粒可以以有效抑制有需要的受试者的炎性免疫反应，或治疗有需要的受试者的细菌或病毒感染的任何剂量给予。在某些实施例中，向个体提供约102至约1020个颗粒。在另外一个实施例中，提供约103至约1015个之间的颗粒。在再一个实施例中，提供约106至约1012个之间的颗粒。在又一个实施例中，提供约108至约1010个之间的颗粒。在一个优选的实施例中，优选的剂量为0.1％固含量/ml。因此，对于0.5μm的微珠，优选的剂量是大约4×109个微珠，对于0.05μm的微珠，优选的剂量是大约4×1012个微珠，对于3μm的微珠，优选的剂量是2×107个微珠。然而，本发明涵盖任何能有效治疗有待治疗的具体病症的剂量。
本发明可用于治疗免疫相关紊乱，如自身免疫性疾病、移植排斥、酶缺乏和过敏反应。以合成的生物相容性颗粒系统作为替代来诱导免疫耐受可导致制造更容易、治疗剂的可用性扩大、样品之间的均一性增加、潜在治疗部位的数量增加以及显著降低对载体细胞的过敏反应的可能性。
如本文所用，术语“免疫反应”包括T细胞介导和/或B细胞介导的免疫反应。示例性免疫反应包括T细胞反应，例如细胞因子的产生和细胞的细胞毒性。另外，术语免疫反应包括由T细胞活化所间接影响的免疫反应，例如抗体产生(体液反应)和细胞因子应答细胞例如巨噬细胞的活化。参与免疫反应的免疫细胞包括淋巴细胞，如B细胞和T细胞(CD4+、CD8+、Th1 和Th2细胞)；抗原递呈细胞(例如，专职性抗原递呈细胞如树突细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、郎格罕细胞，以及非专职性抗原递呈细胞如角化细胞、内皮细胞、星形细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞)；自然杀伤细胞；骨髓细胞，如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。在一些实施例中，本发明的修饰颗粒有效减少运输到炎症部位的炎性细胞。
如本文所用，术语“无反应”、“耐受”、或“抗原特异性耐受”是指 T细胞对T细胞受体介导的刺激不敏感。这种不敏感通常是抗原特异性的，并且在停止暴露于抗原肽之后仍持续。例如，T细胞无反应的特征为缺乏细胞因子产生，例如IL-2。当T细胞暴露于抗原并在不存在第二信号(协同刺激信号)的情况下接收第一信号(T细胞受体或CD-3介导的信号)时可发生T细胞无反应。在这些条件下，细胞重新暴露于相同的抗原(即使重新暴露是在协同刺激分子存在的情况下发生)导致不能产生细胞因子，并且随后不能增殖。因此，不能产生细胞因子能防止增殖。然而，如果与细胞因子(例如IL-2)一起培养，则无反应的T细胞可以增殖。例如，还可以观察到因T 淋巴细胞的IL-2产生缺乏，T细胞无反应，如通过ELISA或通过使用指示细胞系的增殖测定所测量。或者，可以使用报告基因构建体。例如，无反应 T细胞不能启动由异源启动子在5'IL-2基因增强子的控制下诱导的或者由可见于增强子中的API序列多聚体诱导的DL-2基因转录(Kang et al.1992 Science.257:1134(Kang等人，1992年，《科学》，第257卷，第1134页))。
如本文所用，术语“免疫耐受”是指与未治疗的受试者相比，对一部分接受治疗的受试者执行的方法，其中：a)特异性免疫反应(认为至少部分是由抗原特异性效应T淋巴细胞、B淋巴细胞、抗体、或它们的等同物所介导) 的水平降低；b)特异性免疫反应的发作和发展延迟；或者c)特异性免疫反应发作或发展的风险降低。当与其他抗原相比，优先引发针对某些抗原的免疫耐受时，发生“特异性”免疫耐受。当针对导致炎性免疫反应的抗原无差别地引发免疫耐受时，发生“非特异性”免疫耐受。当针对导致致病性免疫反应的抗原而未对导致保护性免疫反应的其他抗原半区别性地引发免疫耐受时，发生“准特异性”免疫耐受。
对自身抗原和自身免疫性疾病的耐受是通过多种机制来实现的，所述机制包括胸腺中自身反应性T细胞的阴性选择的机制，以及那些逃脱胸腺清除并在外周中发现的自身反应性T细胞的外周耐受的机制。提供外周T细胞耐受的机制的例子包括自身抗原的“忽视”、对自身抗原无反应或不应答、细胞因子免疫偏差以及活化诱导的自身反应性T细胞的细胞死亡。另外，调节性T细胞已经显示参与介导外周耐受。参见例如Walker et al.(2002)Nat.Rev. Immunol.2:11-19(Walker等人，2002年，《自然综述：免疫学》，第2卷，第11-19页)；Shevach et al.(2001)Immunol.Rev.182:58-67(Shevach等人， 2001年，《免疫学综述》，第182卷，第58-67页)。在一些情况下，针对自身抗原的外周耐受失去(或损坏)因而产生自身免疫反应。例如，在EAE 的动物模型中，证实了通过TLR先天性免疫受体使抗原递呈细胞(APC)活化会破坏自身耐受性并导致诱发EAE(Waldner et al.(2004)J.Clin.Invest.113:990-997(Waldner等人，2004年，《临床研究杂志》，第113卷，第 990-997页))。
因此，在一些实施例中，本发明提供用于增加抗原递呈同时抑制或减少 TLR7/8、TLR9和/或TLR 7/8/9依赖性细胞刺激的方法。如本文所述，施用特定的修饰颗粒导致DC或APC的抗原呈递，同时抑制与免疫刺激性多核苷酸相关的TLR 7/8、TLR9和/或TLR7/8/9依赖性细胞反应。这种抑制可包括一种或多种TLR相关性细胞因子的水平降低。
如上文所讨论，本发明提供了具有可用于治疗Mac-1和LFA-1介导的紊乱的生物学性质的新型化合物。
因此，在本发明的另一个方面，提供了药物组合物，该组合物包含免疫修饰颗粒并且任选地包含药学上可接受的载体。在某些实施例中，这些组合物任选地还包含一种或多种另外的治疗剂。或者，本发明的修饰颗粒可与一种或多种其他治疗剂组合施用给有需要的患者。例如，用于联合施用或包含于具有本发明的化合物的药物组合物中的另外的治疗剂可以是已批准的抗炎剂，或者它可以是在食品与药品管理局(Food and DrugAdministration)正在进行批准的多种药剂中的任一种，这些药剂最终获得批准用于治疗任何特征为不受控制的炎性免疫反应或者细菌或病毒感染的紊乱。还应当理解，本发明的某些修饰颗粒可以以游离形式存在以用于治疗，或适当时以其药学上可接受的衍生物形式存在。
本发明的药物组合物另外包含药学上可接受的载体，本文所用的载体包括适于所需的特定剂型的任何及所有溶剂、稀释剂、或其他液体溶媒、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。Remington's PharmaceuticalSciences,Sixteenth Edition,E.W. Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1980)(《雷明顿药物科学》，第十六版，E.W.Martin，宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克出版公司，1980年)公开了用于配制药物组合物的各种载体及其已知的制备技术。除非任何常规载体介质与本发明的化合物不相容，诸如因产生任何不希望的生物效应，或者另外以有害的方式与药物组合物的任何其他组分相互作用，否则预期其使用是在本发明的范围内。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些例子包括但不限于：糖如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂如可可油和栓剂蜡；油如花生油、棉籽油；红花油、芝麻油；橄榄油；玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；酯如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂如氢氧化镁和氢氧化铝；褐藻酸；无热原质水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇、和磷酸盐缓冲溶液、以及其他无毒相容性润滑剂如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、涂布剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以根据配制者的判断而存在于组合物中。
用于口服施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性化合物之外，液体剂型还可包含本领域中常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(具体来说，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油以及芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和失水山梨醇脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包含佐剂，如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、调味剂以及芳香剂。
本发明的颗粒可经口、经鼻、静脉内、肌肉内、经眼、经皮、腹膜内或皮下施用。在一个实施例中，本发明的颗粒经静脉内施用。
本发明用于调节免疫反应的施用的有效量和方法可基于个体、要治疗的病症以及对本领域技术人员显而易见的其他因素而变化。所要考虑的因素包括施用途径和施用的剂量数。此类因素是本领域中已知的，并且本领域技术人员无需过度实验即可很好地作出此类决定。合适的剂量范围是提供所需免疫调节的剂量范围。以所递送的载体的量给出的载体适用剂量范围可以是例如大致以下中的任一种：0.5至10mg/kg、1至9mg/kg、2至8mg/kg、3至 7mg/kg、4至6mg/kg、5mg/kg、1至10mg/kg、5至10mg/kg。或者，剂量可以基于颗粒的数量进行施用。例如，以所递送的载体的量给出的载体适用剂量可以是例如每剂量约106、107、108、109、1010或更大数量的颗粒。给予各患者的绝对量取决于药理学性质，如生物利用率、清除率和施用途径。药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂以及制备药物组合物和制剂的方法的细节在Remmingtons Pharmaceutical Sciences 18th Edition,1990,MackPublishing Co.,Easton,Pa.,USA.(《雷明顿药物科学》，第18版，1990年，宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克出版公司，该文献据此全文以引用方式并入)中提供。
特定载体制剂的有效量和施用方法可基于个体患者、所需的结果和/或疾病类型、疾病阶段以及其他对本领域技术人员显而易见的因素而变化。可用于特定应用的施用途径对本领域技术人员而言是显而易见的。施用途径包括但不限于局部、皮肤、经皮、经粘膜、表皮、肠胃外、胃肠道以及鼻咽和肺部施用，包括经支气管和经肺泡施用。合适的剂量范围是提供足够的含IRP 的组合物以获得约1-50μM的组织浓度的剂量范围，所述组织浓度由血液水平所测量。给予各患者的绝对量取决于药理学性质，如生物利用率、清除率和施用途径。
本发明提供适于局部应用的载体制剂，包括但不限于生理学上可接受的植入物、软膏、乳膏、洗剂和凝胶。示例性皮肤施用途径是侵入性最小的皮肤施用途径，如经皮输送、表皮施用和皮下注射。
经皮施用是通过涂敷能够使载体渗透皮肤并进入血流的乳膏、洗剂、凝胶等来完成的。适于经皮施用的组合物包括但不限于直接涂敷于皮肤或掺入诸如经皮装置(所谓的“贴片”)之类的保护性载体中的药学上可接受的悬浮液、油、乳膏和软膏。合适的乳膏、软膏等的例子可见于例如Physician's Desk Reference(《医生案头手册》)。经皮输送还可以通过离子电渗来完成，例如使用持续几天或更久地连续递送其产物穿过未破损的皮肤的市售贴片。使用此方法允许药物组合物以相对高的浓度进行受控输送，允许组合药物输注并且允许同时使用吸收促进剂。
肠胃外施用途径包括但不限于电(离子电渗)或直接注射，如直接注入中央静脉管、静脉内、肌肉内、腹膜内、皮内或皮下注射。适于肠胃外施用的载体制剂通常在USP水或注射用水中配制，并且还可以包含pH缓冲剂、盐增容剂、防腐剂以及其他药学上可接受的赋形剂。用于肠胃外注射的免疫调节性多核苷酸可被配制成药学上可接受的无菌等渗溶液，如注射用盐水和磷酸盐缓冲盐水。
胃肠施用途径包括但不限于吞服和直肠途径，并且可包括使用例如药学上可接受的供吞服的粉末、药丸或液体以及供直肠施用的栓剂。
鼻咽和肺部施用包括通过吸入来完成，并且包括诸如鼻内、经支气管和经肺泡途径之类的递送途径。本发明包括适于通过吸入而施用的载体制剂，包括但不限于用于形成气溶胶的液体悬浮液以及用于干粉吸入递送系统的粉末形式。适于通过吸入载体制剂而施用的装置包括但不限于雾化器、蒸发器、喷雾器和干粉吸入递送装置。
可注射制剂，例如无菌注射水性或油性悬浮液可根据已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如，在 1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的溶媒和溶剂包括水、林格氏溶液、 U.S.P.以及等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油常用作溶剂或悬浮介质。出于这个目的，可采用任何无刺激性的不挥发性油，包括合成的单甘油酯或双甘油酯。另外，脂肪酸如油酸可用于制备可注射剂。
例如，可通过截留细菌的过滤器过滤，或通过掺入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来对可注射制剂进行灭菌，所述灭菌剂可在使用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中。
为了延长药物的作用，通常需要减慢皮下注射或肌内注射的药物的吸收。这可以通过使用水溶性较差的液体悬浮液或结晶性或无定形材料来实现。药物的吸收速率因此取决于它的溶解速率，而溶解速率又可以取决于结晶大小和结晶形式。或者，肠胃外施用的药物形式的延迟吸收通过将药物溶解或悬浮于油性溶媒中来实现。可注射的长效形式是通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成药物的微囊基质来制备的。根据药物与聚合物的比率和所用具体聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其他可生物降解的聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。长效可注射制剂还可以通过将药物截留于与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。
在一些实施例中，本发明的合成可生物降解颗粒提供了制造的容易性、治疗剂的广泛可用性以及增加的治疗位点。在特定实施例中，使用表面活性剂聚(乙烯-交替-马来酸酐)合成的具有高密度表面羧酸酯基团的表面官能化可生物降解聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒提供了这样一种载体：它提供许多优于其他载体颗粒和/或表面的优点。在本发明的实施例的开发过程中进行的实验证实了肽(例如，PLP139-151肽)与这些颗粒的结合。此类肽偶联颗粒已显示出能有效预防疾病的发展并诱导免疫耐受(例如，在SJL/J PLP139-151/CFA 诱导的R-EAE多发性硬化鼠模型中)。本发明的肽偶联载体提供许多优于其他耐受诱导结构的优点。在一些实施例中，颗粒是可生物降解的，并因此将不会在体内长时间存在。可以控制完全降解的时间。在一些实施例中，将颗粒官能化以促进无细胞活化的内化(例如，载入PLG微球中的磷脂酰丝氨酸)。在一些实施例中，颗粒包含针对特定细胞群的靶向配体。在一些实施例中，将诸如IL-10和TGF-β之类的抗炎性细胞因子包括在颗粒上或颗粒内，以限制正在内化颗粒的细胞类型的活化，并经由能量和/或缺失以及调节性T细胞的活化而促进耐受的诱导。已发现颗粒的组成会影响颗粒存留于体内的时长，并且耐受要求快速的颗粒摄取和清除/降解。由于超过50:50丙交酯：乙交酯的比率会减缓降解速率，本发明的颗粒具有约50:50或更低的丙交酯：乙交酯比率。在一个实施例中，本发明的颗粒具有约50:50的D,L-丙交酯：乙交酯比率。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂以及颗粒剂。在此类固体剂型中，将修饰颗粒与以下材料混合：至少一种惰性的药学上可接受的赋形剂或载体，如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或a)填充剂或增量剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、以及硅酸，b)粘合剂，如羧甲基纤维素、褐藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖以及阿拉伯胶，c)保湿剂，如甘油，d)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐、以及碳酸钠，e)溶解阻滞剂，如石蜡，f)吸收促进剂，如季铵化合物，g)润湿剂，如十六烷醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸附剂，如高岭土和膨润土，以及i)润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠及其混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。
相似类型的固体组合物还可以在使用如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar) 以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂的软或硬填充式明胶胶囊中被用作填充剂。片剂、糖衣丸剂、胶囊剂、丸剂以及颗粒剂的固体剂型可以被制备成具有包衣和外壳，如肠溶包衣和药物配制领域中众所周知的其他包衣。它们可以任选地包含乳浊剂并且还可以具有使它们仅在或优先在肠道的某一部分中任选地以延迟方式释放活性成分的组成。可使用的嵌入组合物的例子包括聚合物质和蜡。相似类型的固体组合物还可以在使用如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂的软或硬填充式明胶胶囊中被用作填充剂。
修饰颗粒还可以呈具有一种或多种上文所述的赋形剂的微囊化形式。片剂、糖衣丸剂、胶囊剂、丸剂以及颗粒剂的固体剂型可以被制备成具有包衣和外壳，如肠溶包衣、释放控制包衣以及药物配制领域中众所周知的其他包衣。在此类固体剂型中，可将活性化合物与至少一种惰性稀释剂(如蔗糖、乳糖和淀粉)混合。此类剂型在正常实践中还可以包含除惰性稀释剂外的另外物质，例如压片润滑剂以及其他压片助剂(如硬脂酸镁和微晶纤维素)。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。它们可以任选地包含乳浊剂并且还可以具有使它们仅在或优先在肠道的某一部分中任选地以延迟方式释放修饰颗粒的组成。可使用的嵌入组合物的例子包括聚合物质和蜡。
本发明涵盖本发明修饰颗粒的药学上可接受的局部制剂。如本文所用的术语“药学上可接受的局部制剂”意指对于通过将制剂涂敷到表皮上来皮内施用本发明的修饰微粒而言是药学上可接受的任何制剂。在本发明的某些实施例中，局部制剂包含载体系统。药学上有效的载体包括但不限于：溶剂(如醇、多元醇、水)、乳膏、洗剂、软膏、油、膏药、脂质体、散剂、乳液、微乳液以及缓冲溶液(如低渗或缓冲盐水)或本领域中已知用于局部施用药物的任何其他载体。业内已知载体的更完整清单由本领域的标准参考著作提供，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,16th Edition,1980 and 17th Edition,1985(《雷明顿药物科学》，第16版，1980年，及第17版，1985 年)，两个版本都是由宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克出版公司(Mack Publishing Company,Easton,Pa.)出版，其公开内容全文以引用方式并入本文。在某些其他实施例中，本发明的局部制剂可包含赋形剂。任何本领域已知的药学上可接受的赋形剂都可用于制备本发明的药学上可接受的局部制剂。可包含在本发明的局部制剂中的赋形剂的例子包括但不限于：防腐剂、抗氧化剂、保湿剂、润肤剂、缓冲剂、增溶剂、其他渗透剂、皮肤保护剂、表面活性剂和推进剂和/或与修饰颗粒组合使用的另外的治疗剂。合适的防腐剂包括但不限于：醇、季胺、有机酸、对羟基苯甲酸酯以及酚。合适的抗氧化剂包括但不限于：抗坏血酸及其酯、亚硫酸氢钠、丁基化羟基甲苯、丁基化羟基茴香醚、生育酚、以及螯合剂，如EDTA和柠檬酸。合适的保湿剂包括但不限于：甘油、山梨糖醇、聚乙二醇、尿素以及丙二醇。用于本发明的合适的缓冲剂包括但不限于：柠檬酸缓冲液、盐酸缓冲液以及乳酸缓冲液。合适的增溶剂包括但不限于：季铵氯化物、环糊精、苯甲酸苄酯、卵磷脂以及聚山梨醇酯。可用于本发明的局部制剂中的合适的皮肤保护剂包括但不限于维生素E油、尿囊素、二甲基硅油、甘油、凡士林以及氧化锌。
在某些实施例中，本发明的药学上可接受的局部制剂包含至少本发明的修饰颗粒和渗透增强剂。局部制剂的选择将取决于若干因素，包括待治疗的病症、本发明化合物和所用的其他赋形剂的物理化学特征、它们在制剂中的稳定性、可用的制造设备以及成本限制。如本文所用，术语“渗透增强剂”意指能够转运药理学活性化合物穿过角质层并进入表皮或真皮(优选很少或没有全身吸收)的试剂。已经评估了多种化合物在增强药物穿过皮肤的渗透率方面的有效性。参见例如Percutaneous Penetration Enhancers,Maibach H.I. andSmith H.E.(eds.),CRC Press,Inc.,Boca Raton,Fla.(1995)(《经皮渗透增强剂》，Maibach H.I.和Smith H.E.编辑，CRC出版公司，佛罗里达州博卡拉顿，1995年)，其调查了各种皮肤渗透增强剂的使用和测试，以及 Buyuktimkin et al.,Chemical Means ofTransdermal Drug Permeation Enhancement in Transdermal and Topical DrugDelivery Systems,Gosh T.K., Pfister W.R.,Yum S.I.(Eds.),Interpharm PressInc.,Buffalo Grove,Ill.(1997) (Buyuktimkin等人，《透皮及局部药物递送系统中的透皮药物渗透增强的化学方式》，Gosh T.K.、Pfister W.R.、Yum S.I.编辑，国际药物出版公司，伊利诺伊州比弗洛格罗夫，1997年)。在某些示例性实施例中，用于本发明的渗透剂包括但不限于：甘油三酯(例如，大豆油)、芦荟组合物(例如，芦荟凝胶)、乙醇、异丙醇、辛基苯基聚乙二醇、油酸、聚乙二醇400、丙二醇、N-癸基甲基亚砜、脂肪酸酯(例如，豆蔻酸异丙酯、月桂酸甲酯、单油酸甘油酯以及丙二醇单油酸酯)以及N-甲基吡咯烷酮。
在某些实施例中，组合物可以呈软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、散剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴片的形式。在某些示例性实施例中，根据本发明的组合物的制剂是乳膏剂，该乳膏剂可进一步包含饱和或不饱和的脂肪酸，如硬脂酸、棕榈酸、油酸、棕榈油酸、鲸蜡醇或油醇，而硬脂酸是特别优选的。本发明的乳膏剂还可以包含非离子表面活性剂，例如聚氧-40-硬脂酸酯。在某些实施例中，在可能需要时，将活性组分在无菌条件下与药学上可接受的载体和任何所需要的防腐剂或缓冲剂混合。还可以想到眼用制剂、滴耳剂和滴眼剂也包括在本发明的范围内。另外，本发明可设想到使用透皮贴片，所述贴片具有向身体提供受控制的化合物递送的附加优势。此类剂型是通过将化合物溶解或分散于适当的介质中来制备的。如上文所讨论，渗透增强剂还可以用来增加化合物穿过皮肤的流量。可以通过提供速率控制膜或通过将化合物分散于聚合物基质或凝胶中来控制速率。
可通过气雾剂来施用修饰颗粒。这是通过制备包含修饰颗粒的水性气雾剂、脂质体制剂或固体颗粒来实现的。可以使用非水的(例如，碳氟化合物推进剂)悬浮液。
通常，水性气雾剂是通过将药剂的水性溶液或悬浮液与常规药学上可接受的载体和稳定剂配制在一起而制成。载体和稳定剂随具体化合物的要求而改变，但通常包括非离子表面活性剂(吐温、
Figure BDA0000926265050000521
或聚乙二醇)、无毒的蛋白质(如血清白蛋白)、失水山梨醇酯、油酸、卵磷脂、氨基酸(如甘氨酸)、缓冲液、盐、糖或糖醇。气雾剂一般由等渗溶液制备。
还应当理解，可以配制本发明的修饰颗粒和药物组合物并且在组合疗法中使用，即，化合物或药物组合物可以与一种或多种其他所需的治疗剂或医学程序一起配制或与其同时、在其之前或之后施用。用于组合方案中的疗法 (治疗剂或程序)的具体组合将考虑到所需治疗剂和/或程序的相容性及待实现的所需治疗效果。还应当理解，所用疗法对于同样的紊乱可以实现所需的效果(例如，可以同时施用本发明的化合物与另一种抗炎剂)，或者它们可以实现不同的效果(例如，控制任何不良作用)。
在某些实施例中，包含本发明的修饰颗粒的药物组合物还包含一种或多种另外的治疗活性成分(例如，抗炎剂和/或姑息剂)。出于本发明的目的，术语“姑息剂”是指着重于减轻疾病症状和/或治疗方案的副作用但并非治愈的治疗。例如，姑息性治疗涵盖止痛药、防晕药以及止吐药。
本发明提供调节个体(优选为哺乳动物，更优选为人)的免疫反应的方法，所述方法包括给个体施用本文所述的修饰颗粒。由本发明提供的免疫调节方法包括遏制和/抑制先天性免疫反应或适应性免疫反应的方法，所述免疫反应包括但不限于由免疫刺激性多肽或病毒或细菌组分所刺激的免疫反应。
施用足够调节免疫反应的量的修饰颗粒。如本文所述，免疫反应的调节可以是体液的和/或细胞的，并且使用本领域的标准技术并如本文所述的那样进行测量。
在一些实施例中，将本文所描述的组合物与植入物(例如，装置)和/ 或移植物(例如，组织、细胞、器官)一起(例如，与其同时、在其之前或在其之后)施用，以介导、取消、调节和/或降低与其相关的免疫反应。
在某些实施例中，个体罹患与不期望的免疫活化相关的紊乱，如变应性疾病或病症、过敏性反应和哮喘。患有变应性疾病或哮喘的个体是具有现有变应性疾病或哮喘的可识别症状的个体。在这样的个体中，耐受可例如由与引起过敏反应的特定食物(例如，花生蛋白等)、注射的物质(例如，蜂毒蛋白等)或吸入的物质(例如，豚草花粉蛋白、宠物皮屑蛋白等)复合的颗粒诱导。
在某些实施例中，个体罹患与不期望的免疫活化相关的紊乱，如自身免疫性疾病和炎性疾病。患有自身免疫性疾病或炎性疾病的个体是具有现有自身免疫性疾病或炎性疾病的可识别症状的个体。在这样的个体中，耐受可例如由与驱使特定自身免疫性疾病的相关自身抗原复合的颗粒诱导。
在某些实施例中，个体罹患与酶替代疗法相关的紊乱。在这样的个体中，耐受可例如由与基因缺陷患者不能产生的酶复合的颗粒诱导，从而防止患者对为治疗其特定缺陷而施用的重组法产生的酶发生中和抗体反应，例如，在由于在产生因子VIII的能力方面存在基因缺陷而患有血友病的患者中，对人因子VIII的耐受。另一个例子可包括针对诸如以下病症的酶替代：粘多糖贮积症、神经节苷脂沉积症、低碱性磷酸酯酶症、胆固醇酯贮积病、高尿酸血症、生长激素缺乏、肾性贫血或溶酶体贮积症，包括法布里病、高雪氏病、赫尔勒病、亨特氏病、马-拉病、尼曼-匹克病、泰-萨二氏病和庞佩氏病。
在某些实施例中，个体产生针对为治疗而施用的药剂的强烈的或者说是不良的免疫反应，该免疫反应实际上或可能危害患者健康或治疗。另外，本发明提供的新型化合物可提供给未显示出针对药剂的免疫反应但将来可能显示出免疫反应的个体。在某些实施例中，个体正在接受酶替代疗法。在某些实施例中，治疗剂包括但不限于肽或基于蛋白质的药剂、DNA疫苗、 siRNA、剪接位点转换低聚物和基于RNA的纳米颗粒。在一些实施例中，治疗剂包括但不限于重组人凝血因子VIII(Advate)、抗血友病因子、人基因重组抗血友病因子(Kogenate)、重组抗血友病因子(Eloctate)、重组因子VIII Fc 融合蛋白、重组抗血友病因子VIII(Refacto)、Novo VIIa、重组因子VII、依他凝血素α、人基因重组抗血友病(FVIII)因子(Helixate)、Monanine、凝血因子IX、血管性血友病因子和VIII因子浓缩物(Wilate)、西利酶(Ceredase)、阿糖脑苷酶(Alglucerase)、伊米苷酶(Cerezyme)、伊米苷酶(Imiglucerase)、葡糖脑苷脂酶(Elelso)、他利苷酶α(taliglucerase alfa)、法布瑞酶(Fabrazyme)、β- 半乳糖苷酶(Agalsidase beta)、拉罗尼酶(Aldurazyme)、l-艾杜糖醛酸酶、α- 葡萄糖苷酶(Myozyme)、酸性葡萄糖苷酶、艾杜硫酸酯酶(Elaprase)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、加硫酶(Naglazyme)、芳基硫酸酯酶B或N-乙酰氨基半乳糖-4-硫酸酯酶。在一些实施例中，向个体施用用来治疗包括但不限于以下的疾病的治疗剂：血友病、A型血友病、B型血友病、血管性血友病、高雪氏病、法布里病、赫尔勒病、庞佩氏病、亨特氏病、粘多糖贮积症、神经节苷脂沉积症、低碱性磷酸酯酶症、胆固醇酯贮积病、高尿酸血症、生长激素缺乏、肾性贫血和马-拉病。
在某些实施例中，个体罹患罕见性自身免疫病症。此类病症包括但不限于特发性血小板减少性紫癜、膜性肾病、大疱性类天疱疮、寻常天疱疮和重症肌无力。
在某些实施例中，个体罹患与疾病治疗相关的病症。在重组抗体的情况下，例如针对在治疗性情形下用来防止患者针对抗体治疗剂形成中和抗体的人源化抗体而诱导耐受，例如针对用作对自身免疫性疾病的治疗剂的人源化免疫亚组消耗性抗体或抗细胞因子抗体的耐受。
自身免疫性疾病可以分为两大类：器官特异性的和全身性的。自身免疫性疾病包括但不限于：类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、I型糖尿病、II型糖尿病、多发性硬化(MS)、免疫介导的不孕症(如卵巢功能早衰)、硬皮病、舍格伦病、白癜风、脱发(秃头)、多腺体衰竭、格雷夫斯病、甲状腺功能减退、多发性肌炎、寻常天疱疮、落叶型天疱疮、炎性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、自身免疫性肝炎(包括与乙型肝炎病毒(HBV) 和丙型肝炎病毒(HCV)相关的肝炎)、垂体功能减退、移植物抗宿主病 (GvHD)、心肌炎、艾迪生氏病、自身免疫性皮肤病、葡萄膜炎、恶性贫血、乳糜泻、甲状旁腺功能减退、视神经脊髓炎、膜性肾病、大疱性类天疱疮、寻常天疱疮、重症肌无力。
自身免疫性疾病还可以包括但不限于：桥本氏甲状腺炎、I型和II型自身免疫性多腺体综合征、副肿瘤性天疱疮、水疱性类天疱疮、疱疹样皮炎、线状IgA疾病、获得性大疱性表皮松解症、结节红斑、妊娠性类天疱疮、瘢痕性类天疱疮、原发性混合型冷球蛋白血症、小儿慢性大疱性疾病、溶血性贫血、血小板减少性紫癜、古德帕斯彻氏综合征、自身免疫性中性粒细胞减少症、重症肌无力、伊顿-兰伯特肌无力综合征、僵人综合征、急性播散性脑脊髓炎、格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、伴有传导阻滞的多灶性运动神经病、伴有单克隆丙种球蛋白病的慢性神经病变、斜视眼阵挛-肌阵挛综合征、小脑变性、脑脊髓炎、视网膜病、原发性胆道硬化症、硬化性胆管炎、谷蛋白敏感性肠病、强直性脊柱炎、反应性关节炎、多发性肌炎/皮肌炎、混合性结缔组织病、白塞氏综合征、牛皮癣、结节性多动脉炎、变应性血管炎与肉芽肿(Churg-Strauss疾病)、多血管炎重叠综合征、超敏性血管炎、韦格纳氏肉芽肿、颞动脉炎、大动脉炎、川崎病、中枢神经系统孤立性血管炎、血栓闭塞性脉管炎、类肉瘤病、肾小球性肾炎和寒冷病。这些病症在医学领域是众所周知的，并且描述于例如Harrison's Principles of Internal Medicine,14th ed.,Fauci A S et al.,eds.,New York:McGraw-Hill,1998 (《哈里森内科学》，第14版，Fauci A S等人编辑，纽约，麦格劳希尔公司，1998年)。
用于研究自身免疫性疾病的动物模型在本领域中是已知的。例如，其表现与人自身免疫性疾病最相似的动物模型包括自发地对特定疾病产生高发病率的动物品系。此类模型的例子包括但不限于：发生类似1型糖尿病的疾病的非肥胖糖尿病(NOD)小鼠以及易发生狼疮样疾病的动物，如新西兰杂交种、MRL-Faslpr以及BXSB小鼠。已诱导自身免疫性疾病的动物模型包括但不限于：实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，其为多发性硬化的模型；胶原诱导的关节炎(CIA)，其为类风湿性关节炎的模型；桥粒芯糖蛋白3转基因T 细胞小鼠，其可用作寻常天疱疮的实验模型；以及实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)，其为葡萄膜炎的模型。自身免疫性疾病的动物模型还已经通过遗传操纵构建出来，并且包括例如用于炎性肠病的IL-2/IL-10基因敲除小鼠、用于SLE的Fas或Fas配体基因敲除以及用于类风湿性关节炎的IL-I受体拮抗剂基因敲除。
在某些实施例中，个体罹患细菌或病毒感染。患有细菌或病毒感染的个体是具有现有细菌或病毒感染的可识别症状的个体。
可用本发明的修饰颗粒治疗的病毒感染的非限制性列表包括疱疹病毒感染、肝炎病毒感染、西尼罗病毒感染、黄病毒感染、流感病毒感染、鼻病毒感染、乳头瘤病毒感染、副粘病毒感染、副流感病毒感染和逆转录病毒感染。优选的病毒是那些感染受试者的中枢神经系统的病毒。最优选的病毒是导致出血热、脑炎或脑膜炎的那些病毒。
可用本发明的修饰型颗粒治疗的细菌感染的非限制性列表包括葡萄球菌感染、链球菌感染、分枝杆菌感染、芽孢杆菌感染、沙门氏菌感染、弧菌感染、螺旋体感染以及奈瑟氏菌感染。优选的是感染受试者的中枢神经系统的细菌。最优选的是引起脑炎或脑膜炎的细菌。
在一些实施例中，本发明涉及在疾病发作之前使用本发明的组合物。在其他实施例中，本发明涉及使用本发明的组合物来抑制发展中的疾病。在一些实施例中，本发明涉及改善受试者的疾病。所谓改善受试者的疾病意在包括治疗、预防或抑制受试者的疾病。
在一些实施例中，本发明涉及预防疾病的复发。例如，不期望的免疫反应可以发生在肽的一个区域(如抗原决定子)。与不期望的免疫反应相关的疾病的复发可能因在肽的不同区域存在免疫反应攻击而发生。由于本发明的免疫修饰颗粒不含有附接的肽或抗原部分，因此颗粒将针对多个表位有效。在一些包括MS和其他ThI/17介导的自身免疫性疾病在内的免疫反应紊乱中的T细胞反应可以是动态的，并且在复发缓解型和/或慢性进展性疾病的过程中演变。T细胞组库的动态性质暗示其可用于治疗某些疾病，因为靶标可以随着疾病发展而变化。在此之前，需要预先了解反应型态以便预测疾病的发展。本发明提供可以预防动态变化疾病的影响(即“表位扩展”功能)的组合物。作为多发性硬化(MS)的模型，用于复发的已知模型是对蛋白脂蛋白 (PLP)的免疫反应。初始免疫反应可通过对PLP139-15的反应而发生。随后的疾病发作可以通过对PLP[pi]s-iβi的复发免疫反应而发生。
本发明的其他实施例涉及移植。这是指组织样品或移植物从供体个体转移到受体个体，并且经常对需要该组织以便恢复由所述组织提供的生理学功能的人类受体进行。移植的组织包括(但不限于)完整器官如肾、肝、心脏、肺；器官组分如皮肤移植物和眼角膜；以及细胞悬浮液如骨髓细胞和从骨髓或循环血液选择并扩增的细胞培养物，以及全血输血。
任何移植的严重潜在并发症将因宿主受体与移植组织之间的抗原差异而发生。根据差异的性质和程度，可能存在宿主对移植物或移植物对宿主进行免疫攻击的风险，或两者都可能发生。通过追踪受过相似治疗的具有相似表型的受试者的群体中的反应型态，并且根据公认的临床程序将各种可能的贡献因素联系起来以确定风险的程度。免疫攻击可能是预先存在的免疫反应 (如预先形成的抗体)的结果，或者是大致在移植时起始的免疫反应(如产生Th细胞)的结果。抗体、Th细胞或Tc细胞可能参与相互之间及与各种效应分子和细胞的任何组合。然而，参与免疫反应的抗原通常是未知的，因此在设计抗原特异性疗法或诱导抗原特异性耐受方面造成了困难。
本发明的某些实施例涉及减小由于宿主抗移植物疾病而引起的受体对组织移植物的排斥反应的风险。可施行治疗来预防或减少超急性排斥反应、急性排斥反应或慢性排斥反应的影响。优先在移植之前足够长的时间开始治疗，以使得耐受性在安置移植物时即就位；但是当此方案不可行时，可以与移植同时或在移植之后开始治疗。不管开始的时间如何，治疗通常将在移植后以定期间隔持续至少第一个月。如果移植物能充分适应则可能不需要后续剂量，但是如果存在移植物排斥或炎症的任何迹象则可以重新开始。当然，本发明的耐受程序可与其他形式的免疫抑制组合以实现甚至更低水平的风险。
本发明的某些实施例涉及减轻或以其他方式改善作为对手术的反应而诱导的炎性反应。在本发明的一个实施例中，在手术之前施用免疫修饰性颗粒。在本发明的另外一个实施例中，在手术的同时或手术期间施用免疫修饰性颗粒。在本发明的再一个实施例中，在手术之后施用免疫修饰性颗粒。
本发明的颗粒也可用于治疗脓肿或积脓症，以减轻在暴露于感染性病原体如细菌或寄生虫之后受试者中产生的炎性反应。在本发明的一个实施例中，将免疫修饰性颗粒与本领域已知的抗菌和/或抗寄生虫治疗联合施用。
本发明的颗粒也可用于减轻或以其他方式改善作为对物理创伤或损伤的反应而诱导的炎性反应，所述物理创伤或损伤包括但不限于：运动损伤、伤口、脊髓损伤、脑损伤和/或软组织损伤。在本发明的一个实施例中，在受试者经历创伤或损伤之后施用免疫修饰性颗粒。
本发明的颗粒也可用于减轻与癌细胞的发育和/或生长相关的炎性反应。可治疗的癌包括但不限于：中枢神经系统癌、基底细胞癌、癌性脑瘤、伯基特氏淋巴瘤、淋巴瘤、宫颈癌、卵巢癌、睾丸癌、肝癌、非小细胞和小细胞肺癌、黑素瘤、膀胱癌、乳腺癌、结肠和直肠癌、子宫内膜癌、肾(肾细胞) 癌、白血病、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、黑素瘤和甲状腺癌。在一个实施例中，皮下注射本发明的颗粒会防止抑制性中性粒细胞的累积，从而减轻癌症患者的炎症。
本发明的颗粒也可用于受损组织的再生。在一个实施例中，给患者施用颗粒能增强消化道中受损的上皮细胞的再生。在另外一个实施例中，患者罹患结肠炎、克罗恩氏病或炎性肠病。在另一个实施例中，给患者施用本发明的颗粒能增强神经元的髓鞘再生。在另外一个实施例中，患者罹患多发性硬化。
在一些实施例中，本发明的组合物(例如，偶联到抗原分子的PLG载体) 可与一种或多种支架、基质和/或递送系统一起使用(参见例如美国专利申请 2009/0238879、美国专利No.7,846,466、美国专利No.7,427,602、美国专利 No.7,029,697、美国专利No.6,890,556、美国专利No.6,797,738、美国专利 No.6,281,256；它们全文以引用方式并入本文)。在一些实施例中，颗粒(例如，抗原偶联的PLG颗粒)与支架、基质和/或递送系统相关联，吸附到支架、基质和/或递送系统上，嵌入支架、基质和/或递送系统内，结合到支架、基质和/或递送系统，等等(例如，用于将化学/生物材料、细胞、组织和/或器官递送到受试者)。在一些实施例中，支架、基质和/或递送系统(例如，用于将化学/生物材料、细胞、组织和/或器官递送到受试者)包含本文所述的材料和/或由本文所述的材料制成(例如，结合到一种或多种抗原肽的 PLG)。
在一些实施例中，提供了微孔支架(例如，用于将生物材料(例如细胞、组织等)移植到受试者体内)。在一些实施例中，提供了在其上具有药剂(例如，细胞外基质蛋白、艾塞那肽-4)和生物材料(例如，胰岛细胞)的微孔支架。在一些实施例中，支架被用于治疗疾病(例如，1型糖尿病)和相关方法(例如，诊断方法、研究方法、药物筛选)中。在一些实施例中，提供了在其上和/或其中具有本文所述的抗原结合载体的支架。在一些实施例中，支架由抗原结合材料(例如，抗原结合的PLG)制成。
在一些实施例中，支架和/或递送系统包括一层或多层和/或具有一种或多种化学和/或生物实体/药剂(例如，蛋白质、肽偶联颗粒、小分子、细胞、组织等)，参见，例如，美国专利申请2009/0238879；其全文以引用方式并入本文。在一些实施例中，将抗原偶联颗粒与支架递送系统共同施用，以引发对支架和相关材料的免疫耐受的诱导。在一些实施例中，将其上或其中具有本文所述的颗粒的微孔支架施用给受试者。在一些实施例中，抗原偶联颗粒偶联到支架递送系统。在一些实施例中，支架递送系统包含抗原偶联颗粒。
在不脱离本发明的范围和精神的情况下，所述特征的各种修改形式、重构形式和变化形式对本领域的技术人员将是显而易见的。虽然已经描述了具体实施例，但是应当理解的是，不应将所要求保护的本发明不当地限于此类具体实施例。实际上，对相关领域的技术人员显而易见的所述模式和实施例的各种修改形式也意在落在以下权利要求书的范围内。例如，美国专利申请 2012/0076831、2002/0045672、2005/0090008、2006/0002978和2009/0238879 (它们各自全文以引用方式并入本文)以及美国专利No.7,846,466、 7,427,602、7,029,697、6,890,556、6,797,738和6,281,256(它们各自全文以引用方式并入本文)提供了可用于本文所述的各种实施例的细节、修改形式和变化形式。
本申请中提及的和/或下文所列的所有出版物和专利均全文以引用方式并入本文。
实施例
提供以下实例以便进一步说明本发明的优点和特征，但并非旨在限制本公开的范围。
材料与方法
嵌合小鼠的产生
将六至八周龄B6.SJL-PtprcaPep3b/BoyJ(CD45.1)小鼠用一次950拉德的剂量进行照射。12小时后，用107个来自C57BL/6-7.2fms-EGFP供体的骨髓细胞对小鼠进行重建。在照射后，对小鼠给予含磺胺甲噁唑(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))和甲氧苄氨嘧啶(西格玛奥德里奇公司)的饮用水持续10天。在如上所述的照射后六周时，使小鼠感染WNV。使用流式细胞术检查嵌合性，并且如先前所证实的那样，总有96-99％的嵌合性为供体来源的(Getts et al.,J Neurochem.103:1019,2007(Getts等人，《神经化学杂志》，第103卷，第1019页，2007年)。
免疫组织学
将小鼠麻醉并用50mL无菌PBS灌注。除心脏之外(心脏被处理成石蜡块)(Getts etal.,J.Neurochem 103:10919-1030,2007(Getts等人，《神经化学杂志》，第103卷，第10919-11030页，2007年)，将所有器官分离并速冻于最佳切割温度化合物(Optimum CuttingTemperature Compound)(OCT；日本东京的Tissue-Tek公司(Tissue-Tek,Tokyo,Japan))中。在恒冷切片机中切割八微米组织切片、风干过夜，然后保存在-80℃下直到需要时。将冷冻的切片解冻并且进行组织学(标准苏木精伊红染色)或免疫组织化学分析 (Getts etal.,J.Exp Med 205:2319-2337,2008(Getts等人，《实验医学杂志》，第205卷，第2319-2337页，2008年))。如所指示的那样使用针对MARCO、 SIGN-R1和SIGLEC-1(美国明尼苏达州的安迪生物科技公司(R&D Systems, MN,USA))、CD68(美国马萨诸塞州的艾博抗公司(Abcam,MA,USA))及 Ki67(艾博抗公司(Abcam))的抗体。使用DP-70相机和DP manager 2.2.1 软件在Olympus BX-51显微镜(日本东京的奥林巴斯公司(Olympus,Tokyo, Japan))上获取图像。
显微镜和图像获取
使用DP-70相机和DP manager 2.2.1软件(奥林巴斯公司(Olympus))在 OlympusBX-51显微镜(日本奥林巴斯公司(Olympus,Japan))上获取图像。从脑和肝分离白细胞
如先前所描述(Getts et al,J Exp Med.29:2319,2007(Getts等人，《实验医学杂志》，第29卷，第2319页，2007年)，通过将脑在37℃下在PBS 中用脱氧核糖核酸酶(0.005g/ml；西格玛奥德里奇公司)和胶原酶IV (0.05g/ml；西格玛奥德里奇公司)消化60分钟，从PBS灌注小鼠的脑获得白细胞。用10％FCS停止消化，并且使匀浆穿过70μm尼龙细胞滤网(美国新泽西州的贝迪公司(Becton Dickinson,NJ,USA))。将以340xg进行10 分钟离心后获得的沉淀重悬在30％Percoll(挪威阿莫斯罕(Amersham, Norway))中并且在80％Percoll上成层。在室温下以1140xg离心25分钟后从30％/80％界面处收集白细胞。也可使用相同方案从肝获得白细胞，并且在加工之前将组织称重。
从脾、血液和骨髓分离白细胞
对于流式细胞术分析，解剖出右股骨并且使用装有PBS的注射器冲洗出骨髓细胞。对于骨髓前体分离，使用来自至少4只小鼠的股骨和胫骨。将冲洗后所取得的细胞悬浮液通过70μm细胞滤网过滤，并且以340g离心5分钟。将所得沉淀中的红血细胞在基于NH4Cl的红细胞裂解缓冲液(BD Pharm LyseTM；BD Pharmingen公司)中裂解，然后以340xg离心5分钟。就外周血而言，经由心脏穿刺收集血液，并且立即转移到柠檬酸盐缓冲液(mMol，西格玛奥德里奇公司)中。使所得的悬浮液在70％Percoll上成层，并且在室温下在松开制动的情况下以1140×g离心20分钟。收集交界部分，并且将细胞在PBS中洗涤一次，以340×g离心。对于脾白细胞的分离，使脾穿过 7070μm细胞滤网并且以340g离心5分钟。将所得沉淀中的红血细胞在基于 NH4Cl的红细胞裂解缓冲液(BD Pharm LyseTM；BD Pharmingen公司)中裂解，然后以340xg离心5分钟。
流式细胞术
将从脑、肝、血液和骨髓收集(如上所述)的细胞在PBS中洗涤，并且用抗CD16/CD32抗体(Biolegend公司)阻断。使用台盼蓝(trypan blue) 排除法对活细胞进行计数，其通常显示出>95％的细胞活力。
测量细胞表面分子表达，并且在配备有氩离子和HeNe激光器的FACS ARIA(贝迪公司)上进行细胞分选。活细胞群由前向散射和侧向散射来设门，并且随后通过前向设门测定标识的荧光细胞群。使用鉴定所关注细胞群的特定荧光和散射参数进行分选。对于骨髓细胞群，将根据纯度的分选严格程度设为实现>98％的纯度。
使用流式细胞术程序Flow Jo(美国俄勒冈州的Tree Star公司(Tree Star,Inc.OR,USA))对获取的FACS数据文件进行分析。基于分析时的流式细胞仪百分比和来自每个器官的绝对细胞计数，计算所关注的细胞群的定量。
过继转移
在开发本发明的实施例期间进行实验，以研究被称为过继转移的活动性疾病的第二模型。不是用肽免疫动物，而是将来自活动性疾病小鼠的脾的淋巴细胞转移至受体中，所述受体将随后发生疾病。在开发本发明的实施例期间进行实验，以表征PLG纳米颗粒使过继转移的活化效应细胞失活的能力。在第4天，经过对照肽偶联的颗粒或脾细胞处理的小鼠的临床评分开始增加。在第2天经过PLG-PLP139-151颗粒处理的小鼠的平均临床评分在前40天里除两个时间点外的所有时间点均为0，而那两个时间点的平均临床评分为0.25。多重ELISA
根据制造商说明(美国犹他州洛根的Quansys生物科学公司(QuansysBiosciences,Logan,Utah,USA))进行多重平板ELISA。简而言之，将脑、脾和肝组织在PBS中形成匀浆，通过1000×g旋转使其澄清，并且储存于-20 ℃，直到进行测定。还使用了血清样品。将解冻的样品和标准品在所提供的缓冲液中稀释，并在各孔中各自涂铺30μl，每个孔含有16个斑点，各斑点含有针对特定可溶性蛋白的捕获抗体。然后，将平板在轨道式震荡器上在 120r.p.m.下温育1小时。将平板洗涤3次，并添加30μl检测抗体到各孔中，再温育1小时。洗涤3次后，添加链霉亲和素-HRP，再温育15分钟。然后将平板洗涤6次，并添加底物混合物。立即将平板在CCD成像仪(美国纽约州罗彻斯特的柯达公司(Kodak,Rochester NY,USA))上读取。使用Quansys Q-view软件(Quansys生物科学公司(Quansys Biosciences))分析平板图像。实验性自身免疫性脑炎(EAE)的诱导和评估
用含有0.1mg MOG肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(SEQ ID NO:1)；澳大利亚维多利亚帕克维尔的奥世碧公司；>95％经HPLC纯化的) 和含2mg/mL的结核分枝杆菌(西格玛奥德里奇公司)的完全弗氏佐剂的乳液对小鼠进行皮下注射。两天后，向小鼠腹膜内施用500μl百日咳毒素(西格玛奥德里奇公司)。监测小鼠的疾病进展，并按以下量表进行分级：1，尾巴无力和/或一条后肢虚弱；2，超过一条肢体虚弱，步态失常；3，1条肢体瘫痪；4，超过一条肢体瘫痪，失禁；5，濒临死亡。
统计分析
作图并分别在GraphPad Prism和InStat(两款软件均得自美国加利福尼亚州圣迭戈的GraphPad软件公司(GraphPad software,San Diego,CA,USA)) 中进行计算机化统计分析。根据数据，进行非配对双尾Student t检验或单因素ANOVA加上杜克-克莱默事后检验(Tukey-Kramer post test)，其中P<0.05 视为显著的。
对于诸如重量损失、浸润和病毒滴度之类的参数之间的相关分析，使用二阶多项式(Y＝A+B*X+C*X^2)情况下的非线性回归(曲线拟合)。
实施例1
带负电的免疫修饰性颗粒(IMP)的制备
向聚(乙烯-马来酸酐)(PEMA)的D2O溶液(4mL,1％w/v)中逐滴加入聚 (丙交酯-共-乙醇酸)(PLG)的二氯甲烷(DCM)溶液(2mL,20％w/v)。使用VC 30超声波处理器(Ultrasonic Processor)以16瓦特在冰上对混合物超声处理30 秒。然后将所得均质化粗产物倾倒入D2O溶液(200mL，包含0.5％w/v PEMA)中。使用贝尔克玻璃公司(Bellco Glass,Inc.)的Bellstir Multi-stir 9磁力搅拌器(10W持续10s，16W持续10s，16W持续30s)以3.5的速度设置将均质化浆液搅拌过夜。
结果
在搅拌三小时后，在一次性聚苯乙烯比色管中使用动态光散射进行粒度分析。
a.10W，10s–Z-平均＝499.9nm–PdI＝0.23，峰值＝634.5nm
b.16W，10s–Z-平均＝528.9nm–PdI＝0.227，峰值＝657.5nm
c.16W，30s–Z-平均＝471.6nm–PdI＝0.228，峰值＝580.5nm
d.16W,60s–Z-平均＝491.1nm–PdI＝0.275，峰值＝600.8nm
在反应完成后，然后纯化所得的粗悬浮液。
纯化
将新鲜的D2O和10×碳酸氢钠缓冲液过夜冷却到4℃。使用40μm细胞滤网，将36mL的颗粒悬浮液从每个批次过滤到装有4mL冷却的10×碳酸氢钠缓冲液的适当标记的50mL离心管中。每个烧杯制得大约6个此类管。将所有管在4℃下以7000g离心约15分钟，并且吸出上清液。使用上述程序重复悬浮液的制备，尽可能使大部分颗粒沉淀物悬浮在1mL冷却的D2O中。
将悬浮的颗粒转移到含有4mL冷却的10x碳酸氢钠缓冲液的新管中。(步骤1)
重复颗粒的重悬，直到所有颗粒沉淀物成功重悬为止。(步骤2)
然后将6个离心管合并到一个离心管(50mL管)中，并且管中的剩余体积由冷却的D2O填充，直到40mL(洗涤1)。
将管在4℃下以7000g离心20分钟，并且吸出上清液。
将所得颗粒的步骤1和2及洗涤1每次再重复至少两次。最后，将所得的颗粒沉淀物在液氮中进行急冻，并且在歧管中冻干至无水，以获得带负电的IMP。
图1示出了通过动态光散射分析对表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯) 颗粒的表征。在18.2MΩ水中在马尔文激光粒度仪(Malvern Zetasizer Nano ZS)(马萨诸塞州韦斯特伯鲁的马尔文仪器公司(Malvern Instruments, Westborough,MA))上以2.5×105计数/秒的计数率分析表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒。表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的群体具有 567nm的Z-平均直径、670nm的峰值直径和0.209的多分散指数。
表4示出了表面官能化的PLG-PEMA颗粒的测量值。表中的数据是代表性的，因为每个批次略有差异。但表中的数字是基于对若干批次颗粒的合并。复乳化颗粒的测量值与表2中的那些类似。
表4-表面官能化的PLG-PEMA颗粒的测量值
Figure BDA0000926265050000641
实施例2
施用抗原偶联PLGA微珠预防复发性实验性自身免疫性脑炎
用免疫优势蛋白脂质蛋白PLP139-151表位(PLG-PLP139-151)研究PLG纳米颗粒来诱导耐受以预防复发性实验性自身免疫性脑炎(R-EAE)。如上所述产生R-EAE小鼠。
将向动物施用的肽偶联到平均直径为500nm的颗粒。在相对于免疫时间 (第0天)的第-7天用PLP139-151-PLGA(N＝5)、OVA323-339-PLGA(N＝5)或未结合的PLGA(N＝5)处理小鼠。通常在约第12天至第14天观测到疾病高峰期，并对小鼠的临床疾病进行评分。不具有肽或用对照肽OVA323-339修饰的颗粒未能预防疾病的诱导。然而，除了在第20天与第30天之间表现出低于 1的低临床评分外，用PLP139-151修饰的PLGA颗粒产生的临床评分均为0(无疾病)(图2)。使用未修饰的PLG或使用聚苯乙烯颗粒进行的先前研究未产生这种有效的疾病减轻，其中聚苯乙烯结合的颗粒通常触发过敏反应。
此外，由缺乏针对两种免疫PLP139-151表位的迟发型超敏反应(DTH)证实了髓鞘特异性CD4+T细胞的特异性失活。总之，在第-7天用PLG-PLP139-151预防性处理特异性地预防了EAE发生，并表现出颗粒预防疾病能力的提高。使用颗粒产生的评分与使用抗原偶联的脾细胞产生的评分一样好，并且可能更好。
所施用颗粒的类型也对小鼠模型中EAE的发生有影响。在相对于免疫时间(第0天)的第-7天用OVA323-339-PLS(N＝5)、OVA323-339-PLGAPHOSPOREX (N＝5)、OVA323-339-PLGAPEMA(N＝5)、PLP139-151-PLA(N＝5)、 PLP139-151-PLGAPHOSPOREX(N＝5)或PLP139-151-PLGPEMA(N＝5)处理小鼠。通常在约第12天至第14天观测到疾病高峰期，并对小鼠的临床疾病进行评分。用对照肽OVA323-339修饰的任何组成的颗粒未能预防疾病的诱导。然而， PLP139-151偶联的PLG微珠在下调对R-EAE的诱导方面比PLP139-151偶联商业 (Phosphorex)pLG或聚苯乙烯更有效(图3A和图3B)。
实施例3
静脉内输注抗原偶联的PLG颗粒不会在经OVA/明矾预敏化的动物中引起过敏反应诱导的温度降低
由于活动性疾病的存在，对抗原的过敏反应引人担忧，其可能导致立即死亡，并且已在聚苯乙烯结合颗粒的情况下进行了描述。过敏反应与体温显著下降相关。为测试OVA-PLG的静脉内施用在预敏化动物中是否会引起过敏反应诱导的温度下降，在第0天向小鼠经由腹膜内注射用10μg OVA/明矾进行免疫。在第14天，经由腹膜内注射用10μg OVA/明矾将小鼠再次免疫，然后在第21天用静脉内施用的OVA-PLG进行耐受化。然后，在第28天，经由静脉内施用OVA-PLG颗粒或OVA将小鼠耐受化。
如图4中所示，那些在第28天用可溶性OVA处理的小鼠与那些用 OVA-PLG颗粒处理的动物相比表现出温度降低。在递送颗粒1小时内未观测到体温降低。
图5示出了在缓解期间施用PLP-PLG不引起任何与过敏反应相关的死亡。在六至八周龄雌性SJL/J小鼠中通过皮下注射CFA中的PLP139-151诱导 EAE，并监测和记录临床疾病的发生(图5B)。在相对于疾病诱导的第21 天，向小鼠静脉内注射可溶性PLP139-151(空心方形)、可溶性OVA323-339(空心圆形)或偶联到PLG纳米颗粒的相同肽(实心)。在注射之后1小时内，每10分钟监测并记录动物的温度(图5A)。
实施例4
用PLP-PLG颗粒预防性处理诱导长期抗原特异性耐受
通过在疾病诱导之前七天经静脉内施用渐增浓度的PLP139-151-PLG来确定最佳剂量，并监测相较于用OVA323-339-PLG处理的SJL/J小鼠的临床疾病的发生(图6A)。向六至八周龄雌性SJL/J小鼠静脉内注射PLP139-151(方形) 或OVA323-339(圆形)偶联的PLG纳米颗粒。通过在7天(图6B)、25天 (图6C)或50天(图6D)后皮下注射CFA中的PLP139-151来诱导EAE。跟踪图B的动物的临床疾病，持续100天。图6E示出了在相对于疾病诱导的第8天，在图B中所示的小鼠的亚组中进行迟发型超敏反应(DTH)。将来自图B中PLP139-151/CFA初免组(OVA323-339-PLG和PLP139-151-PLG)的所选代表性动物用初免PLP139-151表位和OVA323-339对照肽进行耳部激发。24小时后，测定作为DTH的量度的耳肿胀，并扣除激发之前的反应。图6F示出了向六至八周龄雌性SJL/J小鼠静脉内注射PLP178-191(三角形)、OVA323-339 (圆形)或PLP139-151(方形)偶联的PLG纳米颗粒或单独的未偶联颗粒(空心圆形)。7天后，通过皮下注射CFA中的PLP178-191诱导EAE，并在所示时间点监测疾病。
实施例5
用抗原偶联颗粒治疗复发性实验性自身免疫性脑炎
在开发本发明的实施例期间进行实验以研究PLG-PLP139-151颗粒治疗疾病而非预防疾病的能力，并确定施用途径是否影响疾病发生。在第0天用 PLP139-151和佐剂免疫小鼠。小鼠通常在第12-14天具有最大临床评分。在此模型中，在第10天经由静脉内(iv)施用、腹膜内(ip)施用、皮下(sc)施用或口服将小鼠用PLG-PLP139-151颗粒或用对照PLG-OVA323-339颗粒处理。如图7 中所示，当静脉内或腹膜内施用PLG-PLP139-151颗粒时，预防性耐受最有效。用静脉内施用的PLP139-151-PLG处理的动物未发生疾病并且在大多数时间点平均临床评分为0。这与用PLP139-151聚苯乙烯颗粒处理的动物形成对比，在聚苯乙烯颗粒处理的动物中，观测到的死亡动物>70％是死于过敏反应。
实施例6
对抗原偶联颗粒的耐受在活动性复发性实验性自身免疫性脑炎中抑制抗原特异性Th1和Th17反应的诱导
为确定施用抗原偶联的颗粒是否抑制T辅助细胞的诱导，在第-7天向 BALB/c小鼠静脉内施用MOG35-55-PLG或OVA323-339-PLG颗粒。在第0天，向小鼠皮下施用OVA323-339-PLG颗粒和完全弗氏佐剂(CFA)。在第10天将动物用MOG35-55-PLG或OVA323-339-PLG颗粒再刺激并将引流区淋巴结细胞分离。在第10天测量CPM以及IL-17、GM-CSF、IFN-γ、IL-10和IL-4的水平。如图8中所示，施用OVA323-339-PLG颗粒抑制了所处理动物中的Th1和 Th17反应。
实施例7
由PLP-139-151偶联的PLGA颗粒诱导耐受
通过递送PLP139-151-PLG或OVA323-339PLG至小鼠来实施另一种治疗性耐受策略。组织学分析显示施用PLP139-151-PLG颗粒抑制颈脊髓炎症和脱髓鞘。将小鼠用PLP-PLG或OVA323-339-PLG处理并在第40天取回组织。分离颈脊髓并切片以研究CNS内的免疫反应，其构成R-EAE和多发性硬化的病理基础。图9示出了在用PLP139-151-PLG处理的动物的脊髓内的免疫细胞浸润减少，并且与天然组织的类似性高于OVA323-339-PLG处理的动物的组织。OVA323-339-PLG处理的动物针对CD45、CD4和CD11b具有阳性染色；而 PLP139-151-PLG处理的动物针对这些因子具有最少染色。
施用PLP139-151-PLG颗粒还抑制所处理小鼠的脊髓中的血脑屏障(BBB) 破坏和巨噬细胞活化。将动物用完全弗氏佐剂(CFA)、OVA323-339PLG颗粒或PLP139-151-PLG颗粒处理。测定了EAE的临床评分和发生率百分比(图10B)并经由体内成像观测了脊髓(图10A和图11)。Angiosense测量了 CNS中的血管渗漏并且prosense报告了活化巨噬细胞(组织蛋白酶的活化裂解了报告蛋白，从而展现出荧光信号)。条形图为脑和SC扫描中所示的信号强度给出数值。
也可由其中包封了抗原的颗粒来诱导耐受。图12示出了施用其中包封了PLP139-151的PLG颗粒抑制小鼠中R-EAE的诱导。包封自身抗原的能力允许使用蛋白质的复杂混合物或甚至器官匀浆以实现更高的抗原覆盖度并因此更有效地应对表位扩展。
实施例8
由LP-139-151偶联的PLGA颗粒诱导的耐受部分依赖于调节性T细胞的扩增/ 活化
将SJL/J小鼠在第-9天用抗CD25抗体(调节性T细胞(Treg)的常见标记物)处理，然后在第-7天用OVA323-339PLG颗粒和抗CD25抗体、OVA323-339 PLG颗粒和对照IgG抗体、PLP139-151-PLG颗粒和抗CD25抗体或 PLP139-151-PLG颗粒和对照IgG抗体处理。如图13中所示，用PLP139-151-PLG 颗粒和抗CD25抗体处理的动物有时比那些用PLP139-151-PLG颗粒和对照IgG抗体处理的动物展示出更大的平均临床评分。这证实了Treg或至少表达 CD25的T细胞在引发耐受中发挥作用。
实施例9
在活动性和过继性EAE中由PLP139-151-PLG颗粒诱导治疗性耐受
在活动性和过继性EAE中比较由PLP139-151-PLG颗粒诱导的治疗性耐受。在六至八周龄雌性SJL/J小鼠中通过过继转移2.5×106个PLP139-151活化母细胞来诱导过继性EAE。在疾病诱导之后2天(图14A)、14天(图14C)、 18天(图14E)或21天(图14F)，给小鼠静脉内注射偶联到500nm PLG 纳米颗粒的PLP139-151(方形)或OVA323-339(圆形)肽。将临床疾病评分与用抗原偶联的脾细胞处理之后的那些临床疾病评分进行比较(图14A)。在第 42天从PLP139-151或OVA323-339耐受化的小鼠收集脑和脊髓用于组织学分析。将来自图A的小鼠的切片针对PLP蛋白和CD45进行染色(图14B)。将来自图C的小鼠的脊髓切片用勒克司坚牢蓝染色(图14D)。脱髓鞘和细胞浸润的区域由箭头指示。结果显示在具有过继性EAE的小鼠中由 PLP139-151-PLG颗粒诱导了耐受。
图15示出了描绘在用结合到OVA323-339或PLP139-151的SP或PLG颗粒处理之后具有活动性EAE和过继性EAE的小鼠的平均临床评分的图表。在疾病诱导之后10天(图15A)或2天(图15B)，给小鼠静脉内注射PLP139-151-SP、PLP139-151-PLG或OVA323-339-SP或偶联到500nm纳米颗粒的 OVA323-339-PLG肽，并且确定平均临床评分。在两种情况下，施用 PLP139-151-PLG颗粒减轻了疾病，这意味着诱导了耐受。
在PLP-PLG耐受化小鼠中，中枢神经系统免疫细胞的浸润也显著减少。在通过过继转移进行EAE诱导之后2天给SJL/J小鼠静脉内注射与PLP139-151 (方形)或OVA323-339(圆形)偶联的500nm PLG纳米颗粒。在疾病高峰期(第14天)，将脑和脊髓去除并且通过流式细胞术计算淋巴细胞(图16B)、 APC(图16C)、小胶质细胞(图16D)、外周树突细胞(图16E)、髓样树突细胞(图16F)和巨噬细胞(图16G)的数量。这些细胞群的设门策略描绘于(图16A)中。将CNS细胞制备物用PM和离子霉素刺激5小时，然后针对IL-17A和IFN-γ进行细胞内染色(图16H)。
实施例10
用抗PD-1单克隆抗体处理在过继转移EAE中消除通过包封PLP139-151的PLG 纳米颗粒实现的耐受诱导
为测试在具有过继性EAE的小鼠中用抗PD-1抗体处理对PLP139-151诱导的耐受的影响，在第0天，小鼠经由静脉内施用接受了3×106个PLP139-151活化的T细胞母细胞。在第2天，它们经由静脉内施用而连同PBS或抗PD-1 抗体，接受了包封在PLG颗粒中的PLP139-151或OVA323-339。在第4天、第6 天、第8天、第10天和第12天，所有动物均接受了250μg抗PD-1抗体或 PBS。
如图17中所示，当颗粒与PBS一起施用时，施用包封在PLG颗粒中的 PLP139-151肽诱导耐受。然而，施用抗PD-1抗体使此耐受降低。
实施例11
用拮抗性抗CD40单克隆抗体处理在过继转移EAE中以IL-12依赖性方式消除通过包封PLP139-151的PLG纳米颗粒实现的耐受诱导
为测试在具有过继性EAE的小鼠中用拮抗性抗CD40抗体处理对 PLP139-151诱导的耐受的影响，在第0天，小鼠经由静脉内施用接受了3×106个PLP139-151活化的T细胞母细胞。在第2天，小鼠经由静脉内施用接受了包封在PLG颗粒中的PLP139-151或OVA323-339。在第3天，动物接受了对照 IgG2a抗体、抗CD40抗体或抗CD40抗体以及抗Il-12抗体。
如图18中所示，当颗粒与PBS一起施用时，施用包封在PLG颗粒中的 PLP139-151肽诱导耐受。施用拮抗性CD40抗体使此耐受降低，但通过添加抗 IL-12抗体使此耐受降低得以逆转。
实施例12
包封在PLG颗粒中的OVA预防性抑制过敏性气道炎症和体内OVA特异性 Th2反应
为测试包封在PLG颗粒中的OVA对气道炎症的预防作用，在第-7天用 OVA-PLG对小鼠进行静脉内处理。在第0天，小鼠以10μg/小鼠的剂量接受了OVA/明矾腹膜内注射。在第7天，再次用OVA-PLG对小鼠进行静脉内处理，并且在第14天小鼠再次接受10μg/小鼠的OVA/明矾腹膜内注射。在第28天与第30天之间，将小鼠用雾化OVA处理三次。
如图19中所示，预防性施用OVA-PLG使IL-4、IL-5、IL-13和IL-10 的分泌减少，并且使肺中血清OVA IgE和嗜酸性粒细胞的水平降低。
包封在PLG颗粒中的OVA预防性抑制纵隔淋巴结的OVA特异性体外回忆反应。如图20A中所示，在用25μg OVA再刺激之后所观测到的淋巴结增殖在那些用OVA-PLG处理的动物中得以减少。此外，用OVA-PLG处理使在用OVA再刺激之后细胞因子的释放减少。图20B示出了在用OVA-PLG 处理的小鼠中IL-4、IL-5、IL-13和IL-10的水平降低。
实施例13
包封在PLG颗粒中的OVA治疗性抑制过敏性气道炎症和体内OVA特异性 Th2反应
为测试包封在PLG颗粒中的OVA对气道炎症的治疗作用，在第0天和第14天将小鼠用OVA/明矾以10μg/小鼠的剂量进行腹膜内处理。在第28 天和第42天向小鼠静脉内施用OVA-PLG。在第56天至第58天之间，用雾化OVA处理小鼠三次。
如图21中所示，治疗性施用OVA-PLG使IL-4、IL-5、IL-13和IL-10 的分泌减少，并且使肺中血清OVA IgE和嗜酸性粒细胞的水平降低。
图22示出了包封在PLG颗粒中的OVA治疗性下调支气管肺泡灌洗液中的OVA特异性Th2细胞因子优于OVA偶联的PLG颗粒。将动物如上所述进行处理，但在第28天和第42天，用包封在PLG颗粒中的OVA或偶联到PLG颗粒的OVA处理小鼠。令人惊讶的是，包封的OVA对Th2细胞因子的分泌的抑制大于偶联到PLG颗粒的表面的OVA肽。
实施例14
由嗜铬粒蛋白A p31肽-PLG颗粒诱导的耐受抑制1型糖尿病
在3周时通过从小鼠分离脾、腋窝、上臂、腹股沟和胰淋巴结细胞在 BDC2.5小鼠中诱导1型糖尿病。将分离的细胞进行培养，并通过将2×106个细胞/mL与0.5μM p31肽温育96小时进行体外活化。在时间0时经由静脉内施用将5×106个细胞转移至NOD.SCID小鼠(6-8周)。2小时至3天后经由静脉内施用偶联到SP或PLG的p31或MOG35-55使小鼠耐受化。
图23A和图23B示出了处理后的动物的血糖水平。施用p31肽偶联的 PLG产生了与在施用MOG35-55偶联的颗粒后所见的血糖水平相比更低的血糖水平。图23C示出了与经MOG35-55肽-PLG处理的小鼠相比，在经P31-PLG 处理的小鼠中，在动物中观测到的IFNγ分泌细胞的百分比也降低了。
p31-PLG诱导的耐受需要Treg。如上所述在小鼠中诱导1型糖尿病，并在2小时后将活化细胞转移至NOD.SCID小鼠，用p31-PLG或MOG35-55PLG 颗粒使小鼠耐受化。如图24中所示，Treg的耗竭消除了通过施用p31-PLG 颗粒诱导的耐受。
实施例15
由胰岛素偶联的PLG颗粒诱导的耐受抑制NOD小鼠中自发型1型糖尿病的发生
在6周、8周和10周龄时经由静脉内施用将NOD小鼠用BSA(N＝22) 或胰岛素(N＝23)偶联的PLG颗粒进行处理。然后分析小鼠的糖尿病发生，糖尿病发生被定义为血糖>250mg/dL。如图25中所示，施用胰岛素偶联的 PLG颗粒使在300天内未发生糖尿病的小鼠的百分比显著增加(69.6％，相较于22.7％；p＝0.0027)。
实施例16
植入动力学
在第-7天将雌性CD45.2小鼠用OVA-PLG或对照肽Dby-PLG(由雄性 C57BL/6小鼠表达的主要H-Y抗原)耐受化。在第-1天，将小鼠以200拉德进行照射，然后在第0天移植来自雄性CD45.1小鼠的1×106、5×106或1×107个骨髓细胞。然后在第1天将受体小鼠用OVA-PLG、Dby-SP或Dby-PLG 耐受化并且收获血液用于对嵌合性的FACS分析。图26示出了在受体小鼠中观测到的CD45.1供体细胞的百分比。
图27示出了在第1天用OVA-PLG、Dby-SP或Dby-PLG耐受化之后受体小鼠中的供体CD45.1细胞的百分比。一只阳性对照小鼠未展示出显著的植入(约10％)。所有阴性对照小鼠均未植入供体细胞。一只Dby-SP小鼠未展示出显著的植入(约10％)。两只OVA-PLG小鼠植入了供体细胞(约 10％)：其中一只截至第16周被完全排斥。一只Dby-PLG小鼠在第12周开始排斥并且截至第16周为10％。截至第16周，Dby-PLG组在10％-56％的植入范围内。OVA-PLG小鼠展示出：1)自发植入，2)OVA323与Dby之间的序列同源性，或3)颗粒的致耐受性。Dby-PLG允许比Dby-SP和OVA-PLG 更多的植入。
图28示出了定时耐受对受体小鼠中CD45.1细胞的百分比有影响。阳性对照显示出植入(约4％)少于预期(约10％)。一只阴性对照小鼠具有5％的植入。在所有3个OVA-PLG组中，在第-7天、第+1天组中的一只小鼠显示出植入(12％)。在第1天的耐受比在第-7天的耐受更具临床相关性。
实施例17
施用后24小时，香豆素-6PLGA颗粒不可检测
用偶联到抗原或不含抗原的香豆素-6PLGA颗粒处理小鼠。如图29中所示，在施用后3小时颗粒可检测，但在施用后24小时不可检测。将初次接受试验的未注射小鼠(顶部行)与静脉内荧光PLGA/PEMA微粒注射的小鼠脾(左侧列)、肝(中间列)和肺(左侧列)切片(注射后3小时(中间行) 和注射后24小时(底部行)，用DAPI复染)相比较。
实施例18
纳米颗粒在体内与巨噬细胞相关联
施用后6小时和15小时的肝分析显示PLGA颗粒与肝中的F4/80+细胞共定位(图30)。
在静脉输注后24小时，边缘区巨噬细胞主要摄取TAMRA标记的 PLP139-151偶联颗粒。如图31中所示，最高百分比的PLP139-151+细胞是边缘区巨噬细胞。
实施例19
使用核心内含有可溶性PLP139-151的表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒抑制SJL/J小鼠的R-EAE
在相对于在第0天用PLP139-151/CFA初免之前的第-7天和第-1天，给各组SJL/J小鼠静脉内注射2.5mg核心内具有可溶性PLP139-151肽的 500nm-700nm表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒。在第0天将对照小鼠初免但在第-7天或第-1天不接受颗粒处理。观察小鼠的R-EAE临床征象，再持续20天。
描绘于图32中的结果描绘了相对于PLP139-151/CFA初免天数的日平均临床评分。在SJL/J小鼠中通过使用核心内含有可溶性PLP139-151的表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒来诱导免疫耐受抑制了PLP139-151/CFA诱导的R-EAE。
实施例20
通过含有可溶性卵清蛋白的表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒抑制过敏性气道炎症
在小鼠中诱导过敏性气道炎症(AIA)。在第0天和第+14天用卵清蛋白/ 明矾初免之前第-7天和第+7天，给各组Balb/c小鼠静脉内注射2.5mg核心内具有可溶性卵清蛋白或可溶性牛血清白蛋白(对照)的500nm-700nm表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒。在第+28-30天，用雾化卵清蛋白激发小鼠。然后处死小鼠并获得支气管肺泡灌洗液。还对卵清蛋白特异性IgE的血清水平进行了测量。
支气管肺泡灌洗液内的嗜酸性粒细胞计数指示AAI的严重性-更高的计数指示更糟糕的疾病。IgE的血清水平指示AAI的严重性-更高的水平指示更糟糕的疾病。
图33示出了用包封的OVA-PLG处理的小鼠显示出最大的嗜酸性粒细胞累积的降低。图34示出了与未处理或对照处理的动物相比用包封的 OVA-PLG处理的小鼠显示出最大的血清IgE水平的降低。
通过使用核心内含有可溶性卵清蛋白的表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒诱导免疫耐受抑制了Balb/c小鼠中卵清蛋白/明矾诱导的过敏性气道炎症。
实施例21
包封抗原的表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的合成
本实施例详细介绍了可生物降解的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的配制和部分表征，所述可生物降解的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒已用高密度的羧酸酯基团表面官能化并且在其由聚(丙交酯-共-乙交酯)外壳包围的核心内含有可溶性抗原，用于自身免疫性疾病中的耐受诱导并且用于治疗过敏。
通过使用聚(乙烯-交替-马来酸酐(PEMA))(具有并入骨架中的羧酸酯基团的聚合物)作为乳化过程的表面活性剂而实现羧酸酯基团的高密度。
如上所述，核心内含有可溶性PLP139-151并且用高密度羧酸酯基团表面官能化的可生物降解的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒有效诱导SJL/J PLP139-151/CFA诱导的R-EAE多发性硬化小鼠模型中的免疫耐受。此外，核心内含有可溶性卵清蛋白并且用高密度羧酸酯基团表面官能化的可生物降解的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒有效诱导Balb/c卵清蛋白/明矾诱导的AAI 过敏性哮喘小鼠模型中的免疫耐受。
核心内含有可溶性卵清蛋白或牛血清白蛋白并且用高密度羧酸酯基团表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒使用如下的复乳化-溶剂蒸发方法合成：
1.将150μL含200mg/mL卵清蛋白或牛血清白蛋白的不含内毒素的水逐滴加入20mL闪烁小瓶中的2mL含20％w/v聚(丙交酯-共-乙交酯)的二氯甲烷中。
2.将所得的混合物置于冰上并在10瓦下使用探头超声波仪超声处理 30秒。
3.添加10mL含1％w/v聚(乙烯-交替-马来酸酐)的水。
4.将所得的混合物置于冰上并在16瓦下使用探头超声波仪超声处理 30秒。
5.将所得的乳液倒入600mL烧杯中的200mL 0.5％w/v聚(乙烯-交替- 马来酸酐)中并搅拌过夜，以允许颗粒硬化。
6.然后将硬化的颗粒通过离心纯化，并用碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)洗涤 3次。
7.将纯化的颗粒重悬在含4％w/v蔗糖和3％w/v D-甘露糖醇的水中，在液氮中快速冷冻并且冻干至干燥。
图35示出了通过动态光散射分析对核心内含有可溶性PLP139-151的表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的表征。在18.2MΩ水中在马尔文激光粒度仪(MalvernZetasizer Nano ZS)(马萨诸塞州韦斯特伯鲁的马尔文仪器公司 (Malvern Instruments,Westborough,MA))上以1.792×105计数/秒的计数率分析表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒。表面官能化的聚(丙交酯-共- 乙交酯)颗粒的群体具有584nm的Z-平均直径、679nm的峰值直径和0.162 的多分散指数。这些结果代表了遵循上述方案进行的6个批次的合成。
图36示出了通过ζ电势测量对核心内含有可溶性PLP139-151的表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的表征。在18.2MΩ水中在马尔文激光粒度仪 (Malvern ZetasizerNano ZS)(马萨诸塞州韦斯特伯鲁的马尔文仪器公司 (Malvern Instruments,Westborough,MA))上以6.67×104计数/秒的计数率分析表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒。表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的群体具有-48.9mV的峰值ξ电势和5.14mV的ζ偏差。这些结果代表了遵循上述方案进行的6个批次的合成。
图37示出了通过动态光散射分析对核心内含有可溶性卵清蛋白的表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的表征。在18.2MΩ水中在马尔文激光粒度仪(MalvernZetasizer Nano ZS)(马萨诸塞州韦斯特伯鲁的马尔文仪器公司 (Malvern Instruments,Westborough,MA))上以1.822×105计数/秒的计数率分析表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒。表面官能化的聚(丙交酯-共- 乙交酯)颗粒的群体具有569.7nm的Z-平均直径、700.3nm的峰值直径和0.230 的多分散指数。这些结果代表了遵循上述方案进行的3个批次的合成。
图38示出了通过ζ电势测量对核心内含有可溶性卵清蛋白的表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的表征。在18.2MΩ水中在马尔文激光粒度仪 (Malvern ZetasizerNano ZS)(马萨诸塞州韦斯特伯鲁的马尔文仪器公司 (Malvern Instruments,Westborough,MA))上以2.67×104计数/秒的计数率分析表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒。表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的群体具有-52.2mV的峰值ξ电势和5.38mV的ζ偏差。这些结果代表了遵循上述方案进行的3个批次的合成。
实施例22
核心内含有可溶性PLP139-151的表面官能化脂质体在鼠R-EAE多发性硬化模型中诱导免疫耐受
本发明人还已发现，已经过高密度的带负电的基团表面官能化并且核心内含有可溶性抗原的可生物降解的脂质体递送溶媒在鼠R-EAE多发性硬化模型中诱导免疫耐受。
此研究中所用的脂质体由以下摩尔比的以下脂质构成：30:30:40的磷脂酰胆碱：磷脂酰甘油：胆固醇。在相对于在第0天用PLP139-151/CFA初免的第-7天，将各组SJL/J小鼠静脉内注射核心内具有可溶性PLP139-151肽的 200nm表面官能化脂质体(10μmol总脂质/小鼠)。对照小鼠在第0天进行初免并且在第-7天接受核心内具有可溶性OVA323-339肽的500nm-700nm表面官能化脂质体(10μmol总脂质/小鼠)。观察小鼠的R-EAE临床征象，再持续17天。
结果描绘了相对于PLP139-151/CFA初免天数的日平均临床评分。如图39 中所示，与那些经过含有可溶性OVA323-339肽的表面官能化脂质体处理的动物相比，经过核心内具有可溶性PLP139-151肽的表面官能化脂质体处理的动物具有更低的临床评分。
此研究的结果证实，核心内含有可溶性PLP139-151并且经过高密度的带负电的基团表面官能化的可生物降解的脂质体在SJL/J PLP139-151/CFA诱导的 R-EAE鼠多发性硬化模型中有效诱导免疫耐受。
由抗原偶联的或抗原包封的颗粒诱导的耐受具抗原特异性、剂量依赖性和长效性(>150天)。耐受最好是通过静脉内施用直径介于500nm与1μm 之间并且ζ电势≤-5mV的偶联颗粒诱导。耐受的诱导依赖于聚阴离子表面上所见的MARCO清道夫受体对颗粒的摄取(例如，羧化PS/PLG颗粒)。通过无反应性(由抗PD-1和拮抗性CD40抗体部分逆转)与iTreg(由抗CD25抗体部分逆转)的组合来诱导并且维持耐受。本发明的颗粒主要积聚在肝和脾边缘区巨噬细胞(CD11bhi CD11clo MARCO+Sign-R1+Siglec-1-)中。
与使用抗原冲击或抗原定向的未成熟致耐受性树突细胞或工程化抗原特异性Treg相比，使用抗原偶联颗粒治疗自身免疫性疾病存在许多优点。使用GMP可制造的现成通用致耐受性载体进行耐受原制备和诱导快速而简单；不需要对未成熟的树突细胞或Treg进行离体分离和扩增；不需要担心未成熟的树突细胞在离体操纵时活化并变得起刺激作用而非致耐受性或担心Treg在转移后转化成Th1/17；因为宿主未成熟边缘区APC以致耐受性方式加工并呈递抗原，所以宿主APC可从包封完整自身抗原的PLG颗粒或组织提取物选择相关免疫优势自身表位(例如，OVA包封的PLG颗粒预防 OVA/明矾诱导的AAD)；并且所述方案具抗原特异性而没有旁观者抑制，安全，高效，并且可诱导涉及表位扩展的效应T细胞(Th1、Th2、Th17和 CD8)与初次接受试验的T细胞两者中的不反应性。
合成的可生物降解的颗粒和脂质体可实现易制造性、治疗剂的广泛可用性并增加潜在治疗位点的数量。为此，我们已专门使用表面活性剂聚(乙烯- 交替-马来酸酐)以高密度的表面羧酸酯基团工程改造了表面官能化可生物降解的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒。
我们还已经使用30:30:40比率的磷脂酰胆碱：磷脂酰甘油：胆固醇开发了表面官能化的脂质体。
我们已将这些颗粒进一步工程改造成核心内含有可溶性卵清蛋白，从而避开了困扰肽或蛋白质的表面结合的化学污染和纯度问题。这些核心内含有可溶性卵清蛋白的表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒有效防止疾病发生并因此在Balb/c卵清蛋白/明矾诱导的AAI鼠过敏性哮喘模型中诱导免疫耐受。使用EDC结合到羧酸酯官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的肽或蛋白质以不加区别的方式被附接，从而产生难以表征并且纯化成均一群体的抗原聚集体和颗粒-抗原-颗粒聚集体。
我们已经产生了核心内含有可溶性卵清蛋白的表面官能化聚(丙交酯-共 -乙交酯)颗粒的均一群体，其不需要抗原的表面结合。
我们已进一步证实，核心内含有可溶性PLP139-151并且用高密度的带负电的基团表面官能化的可生物降解脂质体在SJL/J PLP139-151/CFA诱导的 R-EAE鼠多发性硬化模型中有效诱导免疫耐受。
本发明的脂质体和聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒提供许多优点。这些优点包括：
1)可生物降解的颗粒将不会在体内持续很长时间，并且完全降解的时间可控。
2)颗粒和脂质体可官能化以在无细胞活化的情况下促进内化。为此目标，我们已经将磷脂酰丝氨酸加载到PLG微球中。
3)颗粒和脂质体还可被设计成包含特定细胞群的靶向配体。
4)还可包括诸如IL-10和TGF-β之类的抗炎性细胞因子，以限制使颗粒内化的细胞类型的活化，并促进对经由无反应性和/或缺失以及调节性T细胞的活化引起的耐受的诱导。
从多个角度来看，颗粒或脂质体的这种组合功能均可以耐受诱导为目标，因此相对于聚苯乙烯颗粒而言，设计者的颗粒具有重大进展。此耐受诱导技术的潜在临床应用包括：
(1)T细胞和抗体介导的自身免疫性疾病(如多发性硬化、1型糖尿病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等)-将用与驱动特定自身免疫性疾病的相关自身抗原复合的颗粒来诱导耐受
(2)食物和肺部过敏、皮肤过敏以及哮喘-将用与引起过敏反应的特定食物(例如花生蛋白等)、注射的物质(蜂毒蛋白等)或吸入的物质(例如豚草花粉蛋白质、宠物皮屑蛋白等)复合的颗粒来诱导耐受
(3)移植排斥-将在器官移植之前针对供体器官或细胞上的移植抗原诱导耐受以预防受体排斥
(4)酶替代疗法-将针对具有基因缺陷的患者不能产生的酶诱导耐受，从而防止患者对为治疗其特定缺陷而施用的重组法产生的酶发生中和抗体反应。
实施例23
诱导耐受最有效的颗粒是带负电的并且平均直径为500nm
诱导耐受的关键颗粒参数是组合物的大小和电荷。如图40A和B中所示，颗粒的电荷影响耐受诱导的效率。对经过具有-25mv或-60mv电荷的OVA 缀合颗粒处理的EAE小鼠的比较发现：包含具有-60mv的电荷的颗粒的组合物在诱导耐受方面比具有-25mV电荷的那些更有效。用具有-60mv或 -25mv的电荷的TIMP(致耐受性免疫修饰颗粒)处理小鼠。将小鼠用OVA323-339-TIMP-60mv、OVA323-339-PLGA-25mv、PLP139-151-TIMP-60mv或 PLP139-151-PLGA-25mv(所有抗原均被包封)处理，并对临床疾病评分。图(A) 示出了平均临床评分，而图(B)示出了EAE动物的平均累积评分。
颗粒上的负电荷影响颗粒与MARCO清道夫受体相互作用的能力。图41 示出了免疫修饰颗粒的电荷对于将免疫修饰颗粒靶向抗原呈递细胞具有重要意义。将野生型或MARCO+/-动物用PS-IMP或溶媒处理。结果表明，具有降低的负电荷的颗粒的效率更低，因为其与具有带正电的胶原类结构域的清道夫受体(如MARCO)的相互作用更少。
除了电荷之外，可生物降解的TIMP的大小和组成也影响耐受的诱导。如图42A中所示，诱导EAE模型中的耐受的最有效的颗粒是具有约500nm 平均直径的那些颗粒。将小鼠用500nm OVA323-339-PSB、100nm PLP139-151-PSB、500nm PLP139-151-PSB、1.75μm PLP139-151-PSB或4.5μm PLP139-151-PSB处理，并对临床疾病评分。PLGA载体在1个月内具有缓慢的释放动力学，并且改变聚合物比率可影响颗粒的释放。耐受需要快速的颗粒摄取和清除/降解。由于超过50:50的丙交酯：乙交酯比率会减缓降解速率，本发明的颗粒在一个实施例中为50:50的丙交酯：乙交酯。图42B示出了颗粒被快速破坏。
除了TIMP的电荷和平均直径外，在过敏模型中，包封在颗粒内的抗原优于偶联到抗原的颗粒。在过敏模型中，偶联的纳米颗粒具有导致过敏反应的倾向，因此不是有效的疗法。反之，如图43中所示，具有-60mv的电荷的TIMP在鼠过敏模型中有疗效。将动物暴露于作为过敏原的OVA，然后使用假-PLG或TIMP颗粒、具有OVA的PLG或TIMP颗粒进行治疗或不治疗。图(A)示出了OVA-PLG颗粒未能在过敏中降低TH2反应。图(B)示出了TIMPPEMA-60mv抑制该TH2反应。图(C)示出了TIMPPEMA-60mv抑制回忆反应。
实施例24
包封抗原的表面官能化聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒的单乳化合成
可使用复乳化法(参见实例21)将多肽抗原掺入聚(丙交酯-共-乙交酯) 颗粒中，然而，本发明人发现：当掺入更具疏水性的多肽如麦胶蛋白时，最好是使用溶剂通过单乳化法将抗原掺入颗粒中。
将具有羧酸酯末端基团、50:50D,L-丙交酯:乙交酯比率和在六氟-2-丙醇中的固有粘度为0.18dl/g的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒用于形成包含麦胶蛋白的颗粒。使用如下的单乳化-溶剂蒸发法，合成核心内含有麦胶蛋白并且以高密度羧酸酯基团表面官能化的聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒：
1.将五毫升麦胶蛋白和200mg PLG溶于50μL三氟乙酸(TFA)和 700μL二甲亚砜和1250μL二氯甲烷(DCM)。
2.将所得的混合物逐滴加入4mL 1％w/v PEMA水溶液，以100％的振幅超声处理30秒。
3.将所得的乳液在搅拌下倒入200mL 0.5％w/v PEMA水溶液，搅拌 12小时，以使DCM完全蒸发。
4.然后将颗粒在0.1M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 9.6)中洗涤三次。或者，可使用ddH2O洗涤颗粒。
5.将纯化的颗粒重悬在含4％w/v蔗糖和3％w/v D-甘露糖醇的水中，逐渐冷冻至-80℃并且冻干至干燥。
虽然已经描述和说明了本发明的具体实施例，但这些实施例应该仅仅被认为是说明本发明，而非限制本发明，应当根据随附权利要求书来解释本发明。
本文所引用的所有专利、申请以及其他参考文献均全文以引用方式并入。

Claims (16)

1.一种组合物，所述组合物包含：具有负ζ电势为-80mV至-30mV的载体颗粒，其中所述颗粒为具有400到800nm的直径的聚(乳酸-共-乙醇酸)颗粒或羧化聚(乳酸-共-乙醇酸)颗粒，并且其中所述颗粒包含一个或多个包封的麦醇溶蛋白抗原。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒的ζ电势为-50mV至-40mV。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒具有0.5μm的直径。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒具有600nm的合成后平均大小和-40mV至-60mV的合成后平均电荷。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒为可生物降解的。
6.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的载体。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述抗原含有如SEQ ID NO:1295-1724、1726-1766、4983-4985和4986-5140所述氨基酸序列的一种或多种抗原性麦醇溶蛋白表位。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述一种或多种抗原性麦醇溶蛋白表位为如SEQID NO:4983中所述的氨基酸序列。
9.权利要求1-8中任一项的组合物在制备用于治疗受试者乳糜泻的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述组合物经静脉内施用。
11.根据权利要求9所述的用途，其中所述颗粒具有约400-800纳米的合成后平均大小和约-40至约-70mV的合成后平均电荷。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述颗粒具有约600纳米的合成后平均大小和约-40mV至-60mV的合成后平均电荷。
13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述颗粒为聚(乳酸-共-乙醇酸)颗粒并具有约50:50的聚乳酸：聚乙醇酸共聚物比率。
14.根据权利要求9所述的用途，其中所述颗粒为聚(乳酸-共-乙醇酸)颗粒并具有约50:50的聚乳酸：聚乙醇酸共聚物比率。
15.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物被冻干。
16.根据权利要求9所述的用途，其中将所述颗粒冻干并重构以获得包含所述载体颗粒的重构的药物组合物。
CN201480046047.XA 2013-08-13 2014-08-13 肽缀合颗粒 Active CN105555301B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110339093.0A CN113332422A (zh) 2013-08-13 2014-08-13 肽缀合颗粒

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361865389P 2013-08-13 2013-08-13
US61/865,389 2013-08-13
US201361869279P 2013-08-23 2013-08-23
US61/869,279 2013-08-23
US201361887112P 2013-10-04 2013-10-04
US61/887,112 2013-10-04
PCT/US2014/050962 WO2015023796A2 (en) 2013-08-13 2014-08-13 Peptide conjugated particles

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110339093.0A Division CN113332422A (zh) 2013-08-13 2014-08-13 肽缀合颗粒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105555301A CN105555301A (zh) 2016-05-04
CN105555301B true CN105555301B (zh) 2021-04-16

Family

ID=52468804

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480046047.XA Active CN105555301B (zh) 2013-08-13 2014-08-13 肽缀合颗粒
CN202110339093.0A Pending CN113332422A (zh) 2013-08-13 2014-08-13 肽缀合颗粒

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110339093.0A Pending CN113332422A (zh) 2013-08-13 2014-08-13 肽缀合颗粒

Country Status (24)

Country Link
US (9) US9616113B2 (zh)
EP (2) EP3033102B2 (zh)
JP (4) JP6553033B2 (zh)
KR (5) KR20160042079A (zh)
CN (2) CN105555301B (zh)
AU (4) AU2014306603B2 (zh)
BR (1) BR112016003084A2 (zh)
CA (1) CA2918823A1 (zh)
CY (1) CY1122558T1 (zh)
DK (1) DK3033102T4 (zh)
ES (1) ES2762187T3 (zh)
FI (1) FI3033102T4 (zh)
HR (1) HRP20192270T4 (zh)
HU (1) HUE047329T2 (zh)
IL (3) IL292567A (zh)
LT (1) LT3033102T (zh)
ME (1) ME03590B (zh)
MX (5) MX2016001931A (zh)
PL (1) PL3033102T5 (zh)
PT (1) PT3033102T (zh)
RS (1) RS59801B2 (zh)
RU (1) RU2685186C2 (zh)
SI (1) SI3033102T2 (zh)
WO (1) WO2015023796A2 (zh)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103429232B (zh) 2010-11-12 2016-03-16 盖茨咨询和项目管理公司 修饰的免疫调节粒子
WO2013163176A1 (en) 2012-04-23 2013-10-31 Allertein Therapeutics, Llc Nanoparticles for treatment of allergy
CN104684578B (zh) 2012-06-21 2019-04-19 西北大学 肽缀合粒子
CN116966162A (zh) 2013-03-13 2023-10-31 onCOUR制药股份有限公司 用于治疗炎症的免疫修饰性颗粒
JP2016516754A (ja) 2013-04-03 2016-06-09 アラーテイン・セラピューティクス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＡｌｌｅｒｔｅｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ＬＬＣ 新規のナノ粒子組成物
DK3033102T4 (da) 2013-08-13 2024-02-26 Univ Northwestern Peptidkonjugerede partikler
WO2015200054A2 (en) 2014-06-24 2015-12-30 The Trustees Of Princeton University Process for encapsulating soluble biologics, therapeutics, and imaging agents
GB201508025D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Fabry disease gene therapy
EP3095440B1 (en) * 2015-05-19 2020-01-15 PLS-Design GmbH Antigen-specific immunotherapy using tolerizing liposomes
AU2016332352A1 (en) * 2015-10-02 2018-04-12 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Small molecules blocking histone reader domains
WO2017112828A1 (en) * 2015-12-22 2017-06-29 The Trustees Of Princeton University Process for encapsulating soluble biologics, therapeutics, and imaging agents
CA3008892A1 (en) 2015-12-23 2017-06-29 Cour Pharmaceuticals Development Company Inc. Covalent polymer-antigen conjugated particles
WO2017120222A1 (en) * 2016-01-04 2017-07-13 Cour Pharmaceuticals Development Company Inc. Particles encapsulating fusion proteins containing linked epitopes
JP2019504895A (ja) * 2016-02-09 2019-02-21 クール ファーマシューティカルズ ディベロップメント カンパニー インコーポレイテッド スギ花粉エピトープを封入するｔｉｍｐ（組織性メタロプロテアーゼ阻害因子）
EP4309650A3 (en) * 2016-02-18 2024-03-27 Cour Pharmaceuticals Development Company Inc. Process for the preparation of tolerizing immune-modulating particles
WO2019055539A1 (en) 2017-09-12 2019-03-21 Prudhomme Robert K CELLULOSIC POLYMER NANOPARTICLES AND METHODS OF FORMING THE SAME
JP2021512905A (ja) 2018-02-08 2021-05-20 クール ファーマシューティカルズ ディベロップメント カンパニー インコーポレイテッド 寛容化粒子によるセリアック病の治療
US11731099B2 (en) 2018-07-20 2023-08-22 The Trustees Of Princeton University Method for controlling encapsulation efficiency and burst release of water soluble molecules from nanoparticles and microparticles produced by inverse flash nanoprecipitation
EP3866835B1 (en) 2018-10-19 2024-01-03 The Regents Of The University Of Michigan Method for monitoring autoimmune disease
EP3948215A4 (en) * 2019-04-05 2022-12-28 ASP Health Inc. CONSUMABLE COMPONENTS IN FLUID SAMPLE DELIVERY SYSTEMS AND METHODS
CN110317255B (zh) * 2019-07-19 2020-07-31 北京工商大学 αs1-酪蛋白的抗原表位制备得到的单抗及牛乳过敏原检测方法
US20230086469A1 (en) * 2019-08-30 2023-03-23 Universidad De Chile Autoantigenic peptides (calvicifiv), presented by tolerogenic dentritic cells, useful for the personalized treatment of rheumatoid arthritis
GB201913408D0 (en) * 2019-09-17 2019-10-30 King S College London Proinsulin peptides for type 1 diabetes
JP7471688B2 (ja) * 2019-12-03 2024-04-22 中國醫藥大學 オリゴペプチド、検出キット及び医薬組成物
WO2021155281A1 (en) * 2020-01-31 2021-08-05 Applied Molecular Transport Inc. Compositions and methods for treatment of celiac disease
MX2022011606A (es) * 2020-03-20 2022-12-08 Univ Monash Composiciones y metodos para tratar el lupus.
AU2021370647A1 (en) * 2020-10-27 2023-06-08 Elucida Oncology, Inc. Folate receptor targeted nanoparticle drug conjugates and uses thereof
AU2022256497A1 (en) * 2021-04-16 2023-11-30 Cour Pharmaceuticals Development Company Inc. Treatment of peanut allergy with tolerizing nanoparticles
EP4323768A1 (en) 2021-04-16 2024-02-21 Cour Pharmaceuticals Development Company Inc. Method of tracking maintenance of immunological tolerance
CA3235813A1 (en) 2021-10-21 2023-04-27 John J. Puisis Treatment of primary biliary cholangitis (pbc) with tolerizing nanoparticles
CN113908256B (zh) * 2021-11-26 2023-05-26 中国农业科学院兰州兽医研究所 Lancl1蛋白在制备抗病毒药物中的应用
CN114773434B (zh) * 2022-03-17 2024-04-05 南京市妇幼保健院 一种用于激活原始卵泡从而治疗或辅助治疗卵巢早衰的多肽pfap1及其应用
TW202400801A (zh) 2022-04-29 2024-01-01 美商庫爾製藥發展公司股份有限公司 用於克服治療性載體及蛋白質之免疫原性之耐受性免疫修飾奈米粒子
GB202211696D0 (en) * 2022-08-10 2022-09-21 Univ London Queen Mary Peptides and method
WO2024072751A1 (en) * 2022-09-26 2024-04-04 The Methodist Hospital Microparticle formulations for intravenous therapy and methods for their manufacture and use
WO2024086706A1 (en) 2022-10-19 2024-04-25 Cour Pharmaceuticals Development Company Inc. Treatment of peanut allergy with tolerizing nanoparticles
WO2024094562A1 (en) * 2022-11-01 2024-05-10 Universität Zürich Novel mbp peptides and their use in the treatment of multiple sclerosis

Family Cites Families (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3512940A (en) 1968-12-30 1970-05-19 Justin J Shapiro Test tube filter device
GB8311730D0 (en) 1983-04-29 1983-06-02 Bagshawe K D Handling of reaction mixtures
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US4990253A (en) 1988-01-25 1991-02-05 Abbott Laboratories Fluid sample filtration device
US5358690A (en) 1989-01-10 1994-10-25 Lamina, Ltd. Environmental sample collection and membrane testing device
DE9013914U1 (zh) 1990-10-05 1991-02-14 Walter Sarstedt Geraete Und Verbrauchsmaterial Fuer Medizin Und Wissenschaft, 5223 Nuembrecht, De
JP3712260B2 (ja) 1992-02-28 2005-11-02 オートイミューン インク 自己免疫疾患のバイスタンダー抑制
US6004763A (en) 1992-09-11 1999-12-21 Institut Pasteur Antigen-carrying microparticles and their use in the induction of humoral or cellular responses
FR2695563B1 (fr) 1992-09-11 1994-12-02 Pasteur Institut Microparticules portant des antigènes et leur utilisation pour l'induction de réponses humorales ou cellulaires.
JPH06157592A (ja) 1992-11-24 1994-06-03 Hitachi Chem Co Ltd ペプチドもしくはその誘導体、それらとタンパク質との結合体、及びこれらを免疫源とする抗エンドセリン−１抗体の製造方法
AU674584B2 (en) 1993-06-02 1997-01-02 Tvw Telethon Institute For Child Health Research Cryptic peptides for use in inducing immunologic tolerance
US5833860A (en) 1995-08-28 1998-11-10 Millipore Investment Holdings Limited Centrifugal adsorptive sample preparation device and method
US5804201A (en) 1996-03-11 1998-09-08 The Rockefeller University Immunomodulatory peptides of vespid antigen 5
CA2285329A1 (en) 1997-03-31 1998-10-08 The Regents Of The University Of Michigan Open pore biodegradable matrices and process for making them
US7427602B1 (en) 1998-05-13 2008-09-23 The Regents Of The University Of Michigan Sustained DNA delivery from structural matrices
AU5307899A (en) 1999-08-18 2001-03-13 Catholic Educational Foundation Immunological tolerance-induction agent
WO2001039800A2 (en) * 1999-12-06 2001-06-07 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Controlled delivery of antigens
CA2410510A1 (en) 2000-06-02 2001-12-13 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Artificial antigen presenting cells and methods of use thereof
US7332168B2 (en) 2000-08-22 2008-02-19 Micromet Ag Composition for the elimination of autoreactive B-cells
US7029697B2 (en) 2001-02-14 2006-04-18 Northwestern University Controlled surface-associated delivery of genes and oligonucleotides
US6890556B1 (en) 2001-02-14 2005-05-10 Northwestern University Controlled surface-associated delivery of genes and oligonucleotides
US20020187147A1 (en) * 2001-02-15 2002-12-12 City Of Hope Antigen specific recombinant MHC class II molecules and methods of use
AU2002364701B8 (en) 2001-11-20 2006-06-22 Alkermes, Inc. Compositions for sustained action product delivery
WO2003080114A2 (en) 2002-03-19 2003-10-02 Powdermed Limited Imidazoquinoline adjuvants for vaccines
CA2483917C (en) 2002-05-02 2013-07-30 President And Fellows Of Harvard College Formulations limiting spread of pulmonary infections
US20040115216A1 (en) 2002-07-12 2004-06-17 The Johns Hopkins University Reagents and methods for engaging unique clonotypic lymphocyte receptors
US7465463B2 (en) 2002-09-04 2008-12-16 Polyheal, Ltd. Compositions comprising microspheres with anti-inflammatory properties for healing of ocular tissues
US20060189554A1 (en) * 2002-09-24 2006-08-24 Russell Mumper Nanoparticle-Based vaccine delivery system containing adjuvant
WO2005000272A1 (en) * 2003-06-04 2005-01-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Long-circulating liposomal compositions
US20060051407A1 (en) 2003-06-27 2006-03-09 Yoram Richter Method of treating ischemia-reperfusion injury
US8592197B2 (en) 2003-07-11 2013-11-26 Novavax, Inc. Functional influenza virus-like particles (VLPs)
WO2005015160A2 (en) 2003-08-07 2005-02-17 The Children's Hospital Of Philadelphia Functionalized polymeric colloids
US8198020B2 (en) 2003-08-22 2012-06-12 Potentia Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing phagocytosis or phagocyte activity
WO2005020933A2 (en) 2003-09-02 2005-03-10 University Of South Florida Nanoparticles for drug-delivery
WO2005046722A2 (en) 2003-11-05 2005-05-26 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Carbohydrate antigen-nanoparticle conjugates and uses thereof as antimetastatic agents in treating cancer
WO2007024323A2 (en) 2005-06-17 2007-03-01 The University Of North Carolina At Chapel Hill Nanoparticle fabrication methods, systems, and materials
DE602005015831D1 (de) 2004-04-02 2009-09-17 Research In Motion Ltd Einsatz und provisionierung drahtloser in der hand gehaltener einrichtungen
US7846466B2 (en) 2004-06-10 2010-12-07 Northwestern University Biodegradable scaffolds and uses thereof
AU2005326322B2 (en) 2004-07-01 2009-02-05 Yale University Targeted and high density drug loaded polymeric materials
JP4933455B2 (ja) 2005-02-02 2012-05-16 ノヴォ ノルディスク アー／エス 新規のインスリン誘導体
JP2006248978A (ja) 2005-03-10 2006-09-21 Mebiopharm Co Ltd 新規なリポソーム製剤
WO2007003327A1 (en) * 2005-07-01 2007-01-11 Roche Diagnostics Gmbh Carboxylated latex particles
US20070014752A1 (en) 2005-07-08 2007-01-18 Krishnendu Roy Surface functionalization of polymeric materials
GB0514262D0 (en) * 2005-07-12 2005-08-17 Renovo Ltd Promotion of epithelial regeneration
US20070041934A1 (en) 2005-08-12 2007-02-22 Regents Of The University Of Michigan Dendrimer based compositions and methods of using the same
BRPI0619938A2 (pt) * 2005-12-16 2011-10-25 Univ Kansas nano agrupamentos para envio de terapêuticos
US20100028450A1 (en) 2006-01-25 2010-02-04 The Board Of Trustees Of The University Of Illinoi S Tolerogenic biodegradable artificial antigen presenting system
WO2007094003A2 (en) * 2006-02-15 2007-08-23 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Viral display vehicles for treating multiple sclerosis
BRPI0708503A2 (pt) 2006-03-02 2011-05-31 Cbio Ltd regulação das respostas imune por modulação da função do antìgeno presente em células
JP2009533453A (ja) * 2006-04-11 2009-09-17 オードウェイ リサーチ インスティテュート 甲状腺ホルモン類似体、アンタゴニストおよびそれらの製剤のためのナノ粒子およびポリマー製剤
EP2061446A2 (en) * 2006-07-28 2009-05-27 University Court of the University of Edinburgh Use of cdk inhibitors for the treatment of granulocyte mediated disorders
WO2008043157A1 (en) * 2006-10-12 2008-04-17 The University Of Queensland Compositions and methods for modulating immune responses
US20090214474A1 (en) 2006-11-01 2009-08-27 Barbara Brooke Jennings Compounds, methods, and treatments for abnormal signaling pathways for prenatal and postnatal development
RU2481125C2 (ru) 2006-12-18 2013-05-10 Колороббия Италия С.П.А. Магнитные наночастицы для применения при гипертермии, их приготовление и применение в магнитных системах для фармакологического использования
JP5650406B2 (ja) 2007-03-07 2015-01-07 ユーティーアイ リミテッド パートナーシップ 自己免疫状態の予防および治療のための組成物および方法
US20080311140A1 (en) 2007-05-29 2008-12-18 Baylor College Of Medicine Antigen specific immunosuppression by dendritic cell therapy
MX2010003642A (es) 2007-10-12 2010-08-09 Massachusetts Inst Technology Nanotecnologia de vacuna.
WO2009049365A1 (en) 2007-10-15 2009-04-23 Cooperative Research Centre For Asthma A method of prophylaxis and agents for use therein
WO2009052561A1 (en) 2007-10-22 2009-04-30 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Compositions and methods for manipulating an immune response
EP2057998A1 (en) 2007-10-31 2009-05-13 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Use of modified cells for the treatment of multiple sclerosis
US20090123509A1 (en) * 2007-11-08 2009-05-14 Cory Berkland Biodegradable Colloidal Gels as Moldable Tissue Engineering Scaffolds
US20090238879A1 (en) 2008-01-24 2009-09-24 Northwestern University Delivery scaffolds and related methods of use
JP2009203174A (ja) 2008-02-26 2009-09-10 Hokkaido Univ タンパク質−リポソーム複合体を含有するイオントフォレーシス用組成物
EP2300022A2 (en) 2008-04-25 2011-03-30 Duke University Regulatory b cells and their uses
US9233110B2 (en) * 2008-05-09 2016-01-12 Omathanu P. Perumal Protein nanocarriers for topical delivery
US20110206773A1 (en) 2008-05-20 2011-08-25 Yale University Sustained delivery of drugs from biodegradable polymeric microparticles
EP2123261A1 (en) 2008-05-20 2009-11-25 Stallergenes S.A. Mucoadhesive particulate formulation for inducing antigen-specific immune tolerance
US8323696B2 (en) 2008-08-29 2012-12-04 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne Nanoparticles for immunotherapy
CA2738855A1 (en) * 2008-09-29 2010-04-01 The Corporation Of Mercer University Nanospheres encapsulating bioactive material and method for formulation of nanospheres
CN102227244A (zh) 2008-10-02 2011-10-26 匹兹堡大学-属高等教育联邦体系 用于治疗全身性炎症的吸附剂聚合物的施用
US8277812B2 (en) 2008-10-12 2012-10-02 Massachusetts Institute Of Technology Immunonanotherapeutics that provide IgG humoral response without T-cell antigen
PT2367561E (pt) * 2008-11-30 2015-10-23 Immusant Inc Composições e métodos para o tratamento da doença celíaca
JP2012511516A (ja) 2008-12-11 2012-05-24 ザ・ガバナーズ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・アルバータ 非自己抗原に対する免疫寛容を誘発する方法およびシステム
SG193843A1 (en) * 2009-01-20 2013-10-30 Univ Northwestern Compositions and methods for induction of antigen-specific tolerance
EP2255831A1 (en) * 2009-05-25 2010-12-01 Institut Pasteur Liposome based diepitope constructs
EA022699B1 (ru) 2009-05-27 2016-02-29 Селекта Байосайенсиз, Инк. НАЦЕЛЕННЫЕ СИНТЕТИЧЕСКИЕ НАНОНОСИТЕЛИ С pH-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ СРЕДСТВ
WO2011031441A1 (en) 2009-08-28 2011-03-17 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Therapy with a chimeric molecule and a pro-apoptotic agent
JP5486750B2 (ja) 2009-09-18 2014-05-07 国立大学法人九州大学 金微粒子被覆体とその製造方法、およびその用途
RU2448685C2 (ru) * 2009-11-30 2012-04-27 Российская Федерация в лице Министерства промышленности и торговли Российской Федерации Липосомы, содержащие олигопептиды - фрагменты основного белка миелина, фармацевтическая композиция и способ лечения рассеянного склероза
US20110135744A1 (en) 2009-12-03 2011-06-09 The Regents Of The University Of California Nanoparticle Based Therapy for Dispersing Mucin
WO2011103588A1 (en) * 2010-02-22 2011-08-25 Liquidia Technologies, Inc. Polysaccharide particle vaccines
US8207290B2 (en) 2010-03-26 2012-06-26 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for generating nanoparticles
US9168225B2 (en) * 2010-04-23 2015-10-27 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nano-hybrid delivery system for sequential utilization of passive and active targeting
AU2011261203B2 (en) 2010-06-04 2014-11-20 Flow Pharma Inc. Peptide particle formulation
JP5703372B2 (ja) 2010-06-04 2015-04-15 トンジ ユニバーシティＴｏｎｇｊｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ピレンおよびピロールのコポリマーならびに該コポリマーの生成方法
US20130209463A1 (en) 2010-06-30 2013-08-15 Compugen Ltd. Polypeptides and uses thereof as a drug for treatment of multiple sclerosis, rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders
WO2012006395A1 (en) * 2010-07-07 2012-01-12 Artificial Cell Technologies, Inc. Respiratory syncytial virus antigenic compositions and methods
US9522183B2 (en) 2010-07-31 2016-12-20 The Scripps Research Institute Compositions and methods for inducing immune tolerance
EP2600878A4 (en) 2010-08-04 2014-06-11 Univ Duke REGULATORY B-CELLS AND ITS USES
CN103429232B (zh) 2010-11-12 2016-03-16 盖茨咨询和项目管理公司 修饰的免疫调节粒子
WO2012071014A1 (en) 2010-11-24 2012-05-31 Nanyang Technological University Method for coating particles with calcium phosphate and particles, microparticles and nanoparticles formed thereof
US10064406B2 (en) 2011-01-06 2018-09-04 Cytosorbents Corporation Polymeric sorbent for removal of impurities from whole blood and blood products
US20130266625A1 (en) * 2011-01-24 2013-10-10 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Nanoparticles based on poly (lactic glycolic) acid for cosmetic applications
WO2012149259A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Selecta Biosciences, Inc. Tolerogenic synthetic nanocarriers to reduce antibody responses
AU2012290306B2 (en) 2011-07-29 2017-08-17 Selecta Biosciences, Inc. Synthetic nanocarriers that generate humoral and cytotoxic T lymphocyte (CTL) immune responses
WO2013036296A1 (en) 2011-09-06 2013-03-14 Selecta Biosciences, Inc. Compositions and methods for producing antigen-specific induced tolerogenic dendritic cells with synthetic nanocarriers
US20130202659A1 (en) * 2012-01-31 2013-08-08 Cerulean Pharma Inc. Polymer-agent conjugates, particles, compositions, and related methods of use
WO2013113326A1 (en) * 2012-01-31 2013-08-08 Curevac Gmbh Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and at least one protein or peptide antigen
CN104684578B (zh) 2012-06-21 2019-04-19 西北大学 肽缀合粒子
CN116966162A (zh) * 2013-03-13 2023-10-31 onCOUR制药股份有限公司 用于治疗炎症的免疫修饰性颗粒
DK3033102T4 (da) 2013-08-13 2024-02-26 Univ Northwestern Peptidkonjugerede partikler
US20160243221A1 (en) * 2013-10-18 2016-08-25 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods for tolerizing cellular systems

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Effect of zeta potential on properties of nanodrug delivery systems-A review(part2);Soheyla Honary et al.;《Tropical Journal of Pharmaceutical Research》;20130509;第12卷(第2期);第270页右栏第3段-271页右栏最后1段 *
Suppression of collagen-induced arthritis by single administration of poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles entrapping type Ⅱ collagen：a novel treatments strategy for induction of oral tolerance;Wan-Uk kim et al.;《ARTHRITIS & RHEUMATISM》;20020430;第46卷(第4期);说明书摘要部分、第1110页左栏第2段、 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2020203824B2 (en) 2023-06-22
WO2015023796A3 (en) 2015-06-18
JP2021193086A (ja) 2021-12-23
EP3650047A1 (en) 2020-05-13
EP3033102B2 (en) 2023-12-20
KR20160042079A (ko) 2016-04-18
MX2023000194A (es) 2023-02-09
IL243632B (en) 2020-04-30
US9616113B2 (en) 2017-04-11
AU2020203824A1 (en) 2020-07-02
CA2918823A1 (en) 2015-02-19
MX2023000192A (es) 2023-02-09
AU2023219813A1 (en) 2023-09-07
US10188711B2 (en) 2019-01-29
KR20240015725A (ko) 2024-02-05
US20210000932A1 (en) 2021-01-07
AU2020203822A1 (en) 2020-07-02
MX2020004799A (es) 2020-10-19
WO2015023796A2 (en) 2015-02-19
KR20220084202A (ko) 2022-06-21
PT3033102T (pt) 2019-12-19
PL3033102T3 (pl) 2020-09-07
US20180271962A1 (en) 2018-09-27
CN105555301A (zh) 2016-05-04
RU2685186C2 (ru) 2019-04-16
EP3033102A2 (en) 2016-06-22
JP6553033B2 (ja) 2019-07-31
ME03590B (me) 2020-07-20
JP2024037982A (ja) 2024-03-19
RU2019110510A (ru) 2019-10-21
IL273615B (en) 2022-06-01
US20220008523A1 (en) 2022-01-13
US20170312349A1 (en) 2017-11-02
US20200316181A1 (en) 2020-10-08
US11389517B2 (en) 2022-07-19
US20170258880A1 (en) 2017-09-14
JP7007335B2 (ja) 2022-02-10
IL273615A (en) 2020-05-31
AU2014306603A1 (en) 2016-02-18
SI3033102T2 (sl) 2024-03-29
EP3033102B1 (en) 2019-10-23
KR20210099186A (ko) 2021-08-11
US9522180B2 (en) 2016-12-20
PL3033102T5 (pl) 2024-04-08
KR20230008909A (ko) 2023-01-16
LT3033102T (lt) 2020-03-10
HRP20192270T4 (hr) 2024-03-01
BR112016003084A2 (pt) 2017-09-12
RU2016107998A (ru) 2017-09-18
MX2016001931A (es) 2016-09-07
RS59801B2 (sr) 2024-03-29
SI3033102T1 (sl) 2020-03-31
FI3033102T4 (fi) 2024-03-01
IL243632A0 (en) 2016-03-31
CY1122558T1 (el) 2021-01-27
JP2016528254A (ja) 2016-09-15
AU2014306603B2 (en) 2020-03-12
HRP20192270T1 (hr) 2020-06-12
IL292567A (en) 2022-06-01
HUE047329T2 (hu) 2020-04-28
CN113332422A (zh) 2021-09-03
DK3033102T4 (da) 2024-02-26
JP7408604B2 (ja) 2024-01-05
US20150190485A1 (en) 2015-07-09
ES2762187T3 (es) 2020-05-22
US20150283218A1 (en) 2015-10-08
EP3033102A4 (en) 2017-03-22
US11160851B2 (en) 2021-11-02
US10617747B2 (en) 2020-04-14
DK3033102T3 (da) 2019-12-16
JP2019196369A (ja) 2019-11-14
KR102485789B1 (ko) 2023-01-05
US11129881B2 (en) 2021-09-28
AU2020203822B2 (en) 2023-05-25
US20220000994A1 (en) 2022-01-06
MX2020007079A (es) 2020-09-09
RS59801B1 (sr) 2020-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7408604B2 (ja) ペプチドコンジュゲート粒子
JP7491869B2 (ja) ペプチドコンジュゲート粒子
RU2813163C2 (ru) Частицы, конъюгированные с пептидом

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant