JP2012511516A - 非自己抗原に対する免疫寛容を誘発する方法およびシステム - Google Patents

非自己抗原に対する免疫寛容を誘発する方法およびシステム Download PDF

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Abstract

非自己抗原に対する免疫寛容の誘発に使用可能な方法およびシステムを開示する。当該方法およびシステムは、キャリアに結合した少なくとも１つの免疫原性非自己抗原を有する寛容源を導入し、当該免疫性抗原は外来性もしくは内在性抗原またはそれらの断片でありうる。非自己抗原は、糖鎖抗原、完全長抗原性タンパク質、および、それらの断片および組み合わせから成る群から選ぶことができ、キャリアはナノ粒子およびステントから選択することができる。また、寛容源組成物が提供され、非自己抗原に対する免疫寛容の誘発に使用することができる。当該方法、システムおよび組成物は、幼児期を過ぎた患者に対して免疫学的不適合臓器移植が安全に行える期間を延長することができるため、特に有利である。
【選択図】図１

Description

本発明は、治療における免疫不適合の分野に関し、特に、非自己抗原に対する免疫寛容を誘発する方法およびシステムに関する。
臓器移植は、多くの場合様々な疾患の救命治療となる。例えば、限定されるものではないが、新生児の心臓移植は移植を行わなければ致命的な先天性心臓奇形および心筋症に対する比較的新しい治療法である。臓器移植により命が救われることは多いものの、この種の治療を必要とする患者の多くに臓器移植をすることは困難であることが多い。様々な臓器移植に対する順番待ちリストは非常に長く、多くの患者は適合するドナー臓器を見つけることができる前に死亡してしまう。
このような治療を提供する上で最も重要な２つの障害は、十分なドナー臓器が不足していること、および、効果の長い免疫抑制剤が必要であることである。免疫抑制剤は多くの望ましくなく、生命を脅かす副作用を引き起こす場合がある。臓器のドナー・プールは不運にも非常に小さく、臓器の種類やレシピエントの年齢層によってはドナーを見つけることは非常に大変である。さらに、ドナー臓器を見つけるためには血液型が適合しなければならない。この要件により、適切なドナーをタイムリーに見つける可能性が大幅に制限されてしまう。
臓器移植では、ドナー／レシピエント間の血液型不適合は一見克服不可能な免疫学的障壁である。ＡＢＨ血液群抗原は、血管内皮等の中胚葉起原の多くの組織で発現している複合多糖構造である(非特許文献１〜３)。Ｈ糖型鎖の単独発現がＯ型の個体を決定し；遺伝的に生産される特定の糖転移酵素が触媒するＡ型末端三糖残基、Ｂ型末端三糖残基、または双方のＨ型糖鎖への付加が、Ａ型、Ｂ型、ＡＢ型の個体をそれぞれ決定する。ＡＢＯ障壁を越えた臓器移植は、通常、「超急性」拒絶反応をもたらす。これは、予め形成された抗体が移植内皮に発現している同族のＡＢＨ抗原に結合することにより開始されるプロセスである（非特許文献４〜５)。これにより、補体活性化、炎症細胞の動員、炎症メディエータの放出というカスケードが開始され、移植血管の迅速で不可逆な血栓形成をもたらす。
ドナー臓器の圧倒的な需要により、ＡＢＯ障壁を越えようとする試みが特に腎臓移植においてなされている（非特許文献６〜１０)。臓器移植の成功には、脾臓摘出、血漿交換およびＢ細胞薬剤投与等、レシピエントから予め形成された抗体の除去をするための積極的な操作が必要とされる。しかしながら多くの場合、抗ドナー抗体はＢ細胞記憶により再生される。
ＡＢＯ不適合同種心臓移植は、心臓が抗体を介した拒絶を受けやすいことと共に、有効な「救済」治療（腎移植失敗の場合の透析等）が無く、不整脈や移植血管症等の症状が必然的に起こるため、意図的には決して行われない。近年のＡＢＯ不適合心臓移植は世界的に８例のみで、すべてドナーの血液型の決定ミスか報告ミスであり、高致死率(８例のうち６例)である（非特許文献１１）。
近年、本発明者らによって、ＡＢＯ式血液型障壁が幼児において安全に突破できることが示され（非特許文献１２）、ドナーのＡ／Ｂ抗原に対して免疫寛容性が自然に形成されることが示された（非特許文献１３）。
正常幼時期にＡＢＯ抗体の産生が遅れることから、順番待ちリスト者の死亡率が高いことも鑑みて、本発明者らは、１９９６年に１０人の幼児患者(平均年齢：２か月)を対象にＡＢＯ不適合心臓移植の臨床試験を開始した（非特許文献１２）。成人心臓移植患者に対しては意図的に実施しなかったものの、遅延抗体発生期間に予め形成された抗体が存在しない場合はＡＢＯ不適合心臓移植片の超急性拒絶は発生しないことが結論付けられた。１０人の幼児患者中８人が生存し、２人がＡＢＯ不適合性と無関係の理由で死亡した。超急性拒否反応の痕跡はなく、血液型不適合に起因する顕著な臨床問題もなかった。かかる臨床試験で観察された生存率は、十分に当時の期待生存率の範囲内であった。実際、カナダ健康情報研究所（Canadian Institute for Health Information）は、１９９６年〜２００１年の間で心臓移植を受けた初めて受けたレシピエントの生存率は７８％であったことを報告している（非特許文献１４)。このアプローチによるドナー・プールの拡大は、本発明者らの施設における幼児の順番待ちリスト死亡率の劇的な減少（５８％から７％)に貢献した。
かかる臨床プロトコルは成功裏に終わったものの、非常に年齢が低い幼児に限定される。新生児免疫寛容は、免疫未成熟期の重要期間（critical window）に意図的に異種抗原を導入することにより発現し、免疫調整操作を更に行わずに免疫応答が永続的に除去される(非特許文献１５〜１８)。免疫応答システムの免疫寛容誘発に対する優れた感受性は、子牛における共有胎盤循環の免疫結果を記述したOwenの研究（非特許文献１６）に基づいて、Burnetにより初めて提案された（非特許文献１９）。「異種抗原に対する獲得免疫寛容」(自己寛容の発現を映す考え)の概念は、その後Medawarらよって２０世紀半ばに定義され拡散した（非特許文献１５、２０〜２１)。
本発明者らがＡＢＯ不適合心臓移植を受けた幼児レシピエントの免疫発達を研究するまで、新生児の免疫寛容の例はげっ歯動物モデルに限定されていた(非特許文献１３)。特異的抗体およびＢ細胞を検出するために一連のin vitroアッセイを用いて患者血液および生検サンプルを検査することにより、本発明者らは、ＡＢＯ不適合臓器移植後にドナー特異的Ｂ細胞寛容が自然発現することを示した。
かかる免疫寛容状態を実証する証拠の組み合わせとしては、ドナーＡ／Ｂ抗原に対する循環抗体が欠乏していること；「第三者」抗原に対する循環抗体が存在していること；免疫グロブリンおよび補体成分の移植片内沈着がないこと；ＥＬＩＳＡおよびＥＬＩＳＰＯＴアッセイによりドナー特異的抗体産生細胞がないこと；ＦＡＣＳ分析により抗原特異的Ｂ細胞がないこと、が挙げられる。これは、新生児免疫寛容が、マウスモデルで実証された細胞・分子メカニズムと同様のメカニズムでヒトにおいて起こることを初めて示した研究である。また重要なことに、ＡＢＯ不適合移植から数年後において幼児レシピエントの移植心臓内でドナーＡ／Ｂ抗原の持続が実証された。
上記臨床手順は成功を収め免疫寛容の誘発が可能であることがわかったものの、新生児の免疫システムが未成熟な短期間に限定されている。しかしながら、一旦免疫系が成熟すると、非自己抗原に対する免疫寛容の誘発は一般に不可能となり、ＡＢＯ不適合移植は生命に危険を及ぼす。適合臓器のみしか使用できないため、ドナー臓器のプールは再び制限されてしまう。
従来より、臓器移植拒絶の発生を防止するために、免疫寛容源（tolerogen）および免疫寛容源組成物が使用されている。それらを使用することにより、ドナー臓器に対する免疫反応が防止・軽減され、かつ、多くの好ましくない、生命を脅かすこともある副作用を有しうる免疫抑制剤への依存が低減されることが望まれている。例えば、David Cohenは、特許文献１において、少なくとも１つのＨＩＶ ＴＡＴ（trans-activator of transcription)分子と結合させた少なくとも１つの免疫抗原を含むＴａＴ系寛容源組成物を教示し、移植拒絶反応の抑制に役立つとされている。しかしながら、本技術には幾つかの大きな制限がある。第一に、寛容源が全てＴａｔベースであり；Ｔａｔの遺伝的組み換え生産および当該組み替えタンパク質への抗原の結合に依存している。組み換えタンパク質の生産は、多くの場合複雑かつ高コストであり、in vivoシステムに制限される。さらに、人間を対象とした薬物治療法として許容されるために、組み換えタンパク質は高精製度かつ均質でなければならない。第二に、Ｔａｔへの依存は使用可能な抗原の種類を制限しうる。これらの制限は、多くの患者を治療する広い医学界における上記組成物の使用を著しく制限しうる。
特許文献２において、Sunil Shaunakらは移植拒絶反応の抑制に有用であるとされるアニオン性グリコデンドリマーを記載している。しかしながら、これらの分子は全てデンドリマーベースである。デンドリマーを使用するという要件は、製造コストを著しく上げ、また、使用可能な抗原の種類を制限しうる。さらに、移植拒絶反応の抑制を維持するために患者に継続投与する必要がある。これらの制限により、多くの患者が治療される広範囲の医療現場における当該グリコデンドリマーの使用が著しく制限されうる。
臓器移植に対する免疫反応を調節するための他の試みとして、産褥由来細胞が注目されている(例えば、特許文献３〜５を参照)。しかし、細胞ベースのアプローチは医療現場で容易に大規模利用できない。臓器ドナー・プールを拡大して移植待ち時間を減らすために、これら現在利用可能な技術がどのようにして簡便に使用できるかを確かめることは困難である。さらに、上述の重大な制限のために、これら寛容源を大規模に使用して、ヒト免疫システムが未成熟であり、かつ、非自己性抗原に対する寛容が獲得できる期間を首尾良く利用することはできない。
したがって、上記問題を解決しつつ、幼児期を過ぎた患者に対して免疫学的不適合臓器移植が安全に行える期間を延長することができる方法およびシステムが必要であった。これにより潜在的なドナー・プールを拡大して、究極的には順番待ちリスト者の死亡率の低減や、稀にしか手に入らないドナー臓器のより効果的な利用が可能となる。
上記背景技術の情報は、出願人が本願発明と関連がありうると考える情報を知らしめること目的としており、前記情報が本願発明に対して従来技術を構成することを必ずしも自認するものでもなく、また、そのように解釈するべきではない。
米国特許出願第２００８／００４４４３５号明細書 米国特許出願第２００５／０２１４２４７号明細書 米国特許出願第２００７／０２６４２６９号明細書 国際公開第２００６／１１６３５７号 欧州特許出願公開第０５７４５２７号明細書
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本発明の広い一態様によれば、非自己抗原に対する免疫寛容の誘発方法が提供される。
本方法は、キャリアに結合された少なくとも１つの非自己抗原を有する寛容源を投与するステップを含む。寛容源は、静脈投与しても外科移植してもよく；新生児や幼児期を過ぎた個体に投与して、免疫学的不適合臓器移植が安全に行える期間を延長することができる。非自己抗原は、糖鎖抗原、完全長抗原性タンパク質、および、それらの断片および組み合わせから成る群から選ぶことができる。
一態様において、互いに異なる複数の非自己抗をキャリアに結合させることができる。糖鎖抗原は、Ａ型抗原、Ｂ型抗原、Ｏ型抗原、Ｇａｌｉｌｉ抗原（Ｇａｌ−α−（１→３）Ｇａｌ）、および、それらの断片および組み合わせから成る群から選ぶことができる。Ａ型抗原、Ｂ型抗原およびＯ型抗原は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、および、ＶＩ型の血液型抗原からなる群から選ばれる。完全長抗原性タンパク質は、ヒト白血球抗原クラスＩ、および、ヒト白血球抗原クラスＩＩから成る群から選ぶことができる。一態様において、抗原はリンカーを介してキャリアと結合される。リンカーは、固定基（anchoring group）を有するアグリコンでありうる。固定基は、モノアルコキシシリル、ジアルコキシシリル、トリアルコキシシリル、モノハロシリル、ジハロシリル、およびトリハロシリルから成る群から選ぶことができる。
一実施形態において、固定基はトリメトキシシリルであり、他の一実施形態ではトリクロロシリルである。他の態様において、キャリアはナノ粒子およびステントから成る群から選ぶことができる。ナノ粒子は、ＳｉＯ２ナノ粒子またはシリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子でありうる。ステントは様々な種類の材料から構成することができ、例えば、シリカ被覆３１６ＬステンレスやＡｌ２Ｏ３被覆ステンレスが挙げられるが、これらに限定されない。
他の態様において、寛容源は、キャリアに結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有分子を更に有することができる。ポリエチレングリコール含有分子は、モノアルキルシリル、ジアルコキシシリル、トリアルコキシシリル、モノハロシリル、ジハロシリル、および、トリハロシリルから成る群から選ばれる表面結合基を有することができる。一実施形態において、表面結合基はトリメトキシシリルであり、他の実施形態ではトリクロロシリルである。
本発明の他の広い一態様によれば、非自己抗原に対する免疫寛容の誘発システムが提供される。本システムは、キャリアに結合された少なくとも１つの非自己抗原を有する寛容源を有する。寛容源は、静脈投与しても外科移植してもよく；新生児や幼児期を過ぎた個体に投与して、免疫学的不適合臓器移植が安全に行える期間を延長することができる。非自己抗原は、糖鎖抗原、完全長抗原性タンパク質、および、それらの断片および組み合わせから成る群から選ぶことができる。
一態様において、複数の異なる非自己抗原をキャリアに結合することができる。糖鎖抗原は、Ａ型抗原、Ｂ型抗原、Ｏ型抗原、Ｇａｌｉｌｉ抗原（Ｇａｌ−α−（１→３）Ｇａｌ）、および、それらの断片および組み合わせから成る群から選ぶことができる。Ａ型抗原、Ｂ型抗原およびＯ型抗原は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、および、ＶＩ型の血液型抗原からなる群から選ばれる。完全長抗原性タンパク質は、ヒト白血球抗原クラスＩおよびヒト白血球抗原クラスＩＩから成る群から選ぶことができる。一態様において、抗原はリンカーを介してキャリアと結合される。リンカーは、固定基（anchoring group）を有するアグリコンでありうる。固定基は、モノアルコキシシリル、ジアルコキシシリル、トリアルコキシシリル、モノハロシリル、ジハロシリル、および、トリハロシリルから成る群から選ぶことができる。一実施形態において、固定基はトリメトキシシリルであり、他の一実施形態ではトリクロロシリルである。他の態様において、キャリアはナノ粒子およびステントから成る群から選ぶことができる。ナノ粒子は、ＳｉＯ２ナノ粒子またはシリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子でありうる。ステントは様々な種類の材料から構成することができ、例えば、シリカ被覆３１６ＬステンレススチールやＡｌ２Ｏ３被覆ステンレススチールが挙げられるが、これらに限定されない。
他の態様において、寛容源は、キャリアに結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有分子を更に有することができる。ポリエチレングリコール含有分子は、モノアルキルシリル、ジアルコキシシリル、トリアルコキシシリル、モノハロシリル、ジハロシリル、および、トリハロシリルから成る群から選ばれる表面結合基を有することができる。一実施形態において、表面結合基はトリメトキシシリルであり、他の実施形態ではトリクロロシリルである。
本発明の他の広い一態様によれば、非自己抗原に対する免疫寛容の誘発に使用可能な寛容源が提供される。寛容源は、キャリアに結合された少なくとも１つの非自己抗原を有する。寛容源は、静脈投与しても外科移植されてもよく；新生児や幼児期を過ぎた個体に投与して、免疫学的不適合臓器移植が安全に行える期間を延長することができる。非自己抗原は、糖鎖抗原、完全長抗原性タンパク質、および、それらの断片および組み合わせから成る群から選ぶことができる。一態様において、互いに異なる複数の非自己抗原をキャリアに結合することができる。
糖鎖抗原は、Ａ型抗原、Ｂ型抗原、Ｏ型抗原、Ｇａｌｉｌｉ抗原（Ｇａｌ−α−（１→３）Ｇａｌ）、および、それらの断片および組み合わせから成る群から選ぶことができる。Ａ型抗原、Ｂ型抗原およびＯ型抗原は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、および、ＶＩ型の血液型抗原からなる群から選ばれる。完全長抗原性タンパク質は、ヒト白血球抗原クラスＩおよびヒト白血球抗原クラスＩＩから成る群から選ぶことができる。
一態様において、抗原はリンカーを介してキャリアと結合される。リンカーは、固定基（anchoring group）を有するアグリコンでありうる。固定基は、モノアルコキシシリル、ジアルコキシシリル、トリアルコキシシリル、モノハロシリル、ジハロシリル、および、トリハロシリルから成る群から選ぶことができる。一実施形態において、固定基はトリメトキシシリルであり、他の一実施形態ではトリクロロシリルである。他の態様において、キャリアはナノ粒子およびステントから成る群から選ぶことができる。ナノ粒子は、ＳｉＯ２ナノ粒子またはシリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子でありうる。ステントは様々な種類の材料から構成することができ、例えば、シリカ被覆３１６ＬステンレスやＡｌ２Ｏ３被覆ステンレスが挙げられるが、これらに限定されない。
他の態様において、寛容源は、キャリアに結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有分子を更に有することができる。ポリエチレングリコール含有分子は、モノアルキルシリル、ジアルコキシシリル、トリアルコキシシリル、モノハロシリル、ジハロシリル、および、トリハロシリルから成る群から選ばれる表面結合基を有することができる。一実施形態において、表面結合基はトリメトキシシリルであり、他の実施形態ではトリクロロシリルである。
本発明の他の広い一態様によれば、本発明の寛容源を投与するステップを含む、臓器移植拒絶反応の抑制方法が提供される。寛容源は、新生児や幼児期を過ぎた患者に投与されうる。寛容源は、静脈投与または外科移植により投与することができる。
本発明の一実施形態に係る寛容源の概略図である。 本発明の一実施形態において使用可能なＡＢＯ型抗原の概略図である。 本発明の一実施形態においてキャリアとして使用可能なＳｉＯ２ナノ粒子の透過型走査電子顕微鏡像である。 本発明の一実施形態においてキャリアとして使用可能なＦｅ３Ｏ４／ＳｉＯ２コア／シェルナノ粒子の明視野透過型電子顕微鏡像である。 本発明の一実施形態においてキャリアとして使用可能なＦｅ３Ｏ４／ＳｉＯ２コア／シェルナノ粒子の広角散乱暗視野走査電子顕微鏡像である。 表面をアミノ基で官能化して抗原の活性エステル誘導体と結合可能とした、本発明の一実施形態に係るシリカまたはアルミナ被覆ステントキャリアの概略図である。 シリカ皮膜またはアルミナ皮膜のヒドロキシ基に抗原を直接付着させて表面官能化した、本発明の一実施形態に係るシリカまたはアルミナ被覆ステントキャリアの概略図である。 シリカのヒドロキシ基に抗原を直接付着させて表面官能化した、本発明の一実施形態に係るシリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子またはＳｉＯ２ナノ粒子の概略代表図である。 表面をアミノ基で官能化して抗原の活性エステル誘導体と結合可能とした、本発明の一実施形態に係るシリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子またはＳｉＯ２ナノ粒子の概略代表図である。 本発明の一実施形態に係る色素／コア蛍光ＳｉＯ２ナノ粒子の走査電子顕微鏡像である。 本発明の一実施形態において使用可能な未処理３１６Ｌステンレススチール製ステントの走査電子顕微鏡像である（黒色十字はオージェ電子分光法を行ったサンプリングポイントを示し、そのスペクトルは図１０Ｂに示す。灰色スケール・バーは２μｍである）。 本発明の一実施形態において使用可能な未処理３１６Ｌステンレススチール製ステントのオージェ電子分光スペクトルを示す図である（“ｓｐｏｔ”は図１０Ａで述べたサンプリングポイントをいう。オージェ電子スペクトルはＦｅ、Ｃｒ、Ｎｉ、Ｃ、Ｏのシグナルを示しているが、シリコンのシグナルはない。シリコンのシグナルは結合エネルギー約１６１５ｅＶに現れることが予測され、観測されない）。 本発明の一実施形態において使用可能なＴＥＯＳディップ法により作製されたＳｉＯ２層被覆３１６Ｌステンレススチール製ステントの走査電子顕微鏡像である（十字および数字はオージェ電子分光法を行った７つのサンプリングポイントを示し、スペクトルは図１１Ｂに示す。スケール・バーは２μｍである）。 本発明の一実施形態において使用可能なＳｉＯ２被覆３１６Ｌステンレススチール製ステントのオージェ電子分光スペクトルを示す図である（“ｓｐｏｔ”は図１１Ａで述べたサンプリングポイントをいう。オージェ電子スペクトルにはＦｅ、Ｃｒ、Ｎｉ、Ｃ、Ｏのシグナル、並びにＳｉのシグナルが示されている。シリコンのシグナルは結合エネルギー約１６１５ｅＶに現れることが予測され、図中、黒色長方形で囲って強調している）。 本発明の一実施形態において使用可能な清浄ステンレススチールのサイクリックボルタモグラムを示す図である。 本発明の一実施形態において使用可能な、原子層堆積法（ＡＬＤ）で形成された５ｎｍ厚アルミナ層で被覆されたステンレススチールのサイクリックボルタモグラムを示す図である。 本発明の一実施形態において使用可能な三種類の原子層堆積（ＡＬＤ）シリカ被覆３１６Ｌステンレススチール製プレートのＦｅ２ｐピークの高解像度Ｘ線光電子分光スペクトルを示す図である（各サンプルは原子層堆積法（ＡＬＤ）により成膜されたシリカ被膜を有している。シリカ層が厚くなるにつれ、シリカ層厚さ〜１０ｎｍのサンプルではＦｅ２ｐ軌道のピークシグナルが小さくなり、表面が均一にＳｉＯ２で覆われ、ＳｉＯ２層が装置からのＸ線の貫通深さと同じ厚さであることが示されている）。 表面官能率それぞれ約０％、１０％、２０％でＡ型Ｉ抗原を共有結合させた、本発明の一実施形態に係るシリカ被覆３１６Ｌステンレススチール製プレート（４ｍｍ×２ｍｍ）のＳｉ２ｐ軌道の高解像度Ｘ線光電子分光スペクトルを示す図である。 表面官能率それぞれ約０％、１０％、２０％でＡ型Ｉ抗原を共有結合させた、本発明の一実施形態に係るシリカ被覆３１６Ｌステンレススチール製プレート（４ｍｍ×２ｍｍ）のＮ１ｓ軌道の高解像度Ｘ線光電子分光スペクトルを示す図である（Ａ型Ｉテトラサッカリドは幾つかのアミド基を有するので、１０％および２０％のサンプルでは窒素が表面に存在している。１００％ＰＥＧシランのサンプルではバックグラウンドを越える窒素を検出されなかった）。 本発明の一実施形態に係る、２０％Ａ型Ｉ抗原／８０％ＰＥＧシラン表面官能化シリカ被覆３１６Ｌステンレススチール製プレート（４ｍｍ×２ｍｍ）のＣ１ｓ軌道のデコンボリューション処理高解像度Ｘ線光電子分光スペクトルを示す図である（デコンボリューション処理したＣ１ｓスペクトルは、サンプル表面上の様々な種類の炭素による影響を明らかにしている。Ｃ＝Ｏ、Ｃ−Ｏ／Ｃ−Ｎ、Ｃ−Ｃ／Ｃ−Ｈに対応するピークが観察される。これらの官能基は抗原／ＰＥＧ表面に存在することが予測される）。 本発明の一実施形態に係る、シリカ被覆ステンレススチールへのＡ−６の結合を確認する改良ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す棒グラフである。 本発明の一実施形態に係る、シリカ被覆ステンレススチールへのＢ−４の結合を確認する改良ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す棒グラフである。 本発明の一実施形態に係る、アルミナ被覆ステンレススチールへのＡ−６の結合を確認する改良ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す棒グラフである。 本発明の一実施形態に係る、シリカ被覆ステンレススチールへのＩ−１４の結合を確認する改良ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す棒グラフである。 本発明の一実施形態に係る、ブタＯ型プール血漿とインキュベートしたシリカ被覆ステンレススチールへのＩ−１４の結合を確認する改良ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す棒グラフである。 本発明の一実施形態に係る、ブタＯ型血漿とインキュベートしたシリカ被覆ステンレススチールへのＩ−１４の結合を確認する改良ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す棒グラフである。 本発明の一実施形態に係る、ブタＡ型血漿とインキュベートしたシリカ被覆ステンレススチールへのＩ−１４の結合を確認する改良ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す棒グラフである。 本発明の一実施形態に係る、様々なＭＰＴＭＳ／ＰＥＧシラン表面官能率を有するシリカナノ粒子のＣ１ｓ軌道の高解像度Ｘ線光電子分光スペクトルを示す図である（Ｘ線光電子分光法は表面に敏感な技術であり、表面から数ナノメートルの光電子をサンプルする。各元素はコア電子に対して特徴的なエネルギーを有し、これは電子がＸ線によって軌道から放出されるときに測定される。この特徴的な結合エネルギーはまた、その電子が由来する原子の酸化状態だけでなく、置換基の酸化状態に対しても敏感である。他の炭素原子に囲まれた炭素原子（Ｃ−Ｃ）や水素原子に囲まれた炭素原子（Ｃ−Ｈ）の結合エネルギーは通常２８５．０ｅＶであり、そのシグナルが標準として使用される。Ｃ−Ｏ結合やＣ−Ｎ結合の結合エネルギーは約２８６．５ｅＶと若干高く、また、Ｃ＝０結合の結合エネルギーは約２８８．５ｅＶと更に若干高い。図中、Ｃ−ＯのピークはＰＥＧシランの表面官能率が減少するにつれて低くなっているのがわかる。Ｃ−Ｈシグナルが一番強い１００％ＭＰＴＭＳとは対照的に、１００％ＰＥＧシラン表面では、Ｃ−Ｏピークが一番強い。これらの結果は、シリカナノ粒子表面への様々なシランの導入を制御することが直接的であることを示している）。 本発明の一実施形態に係る、様々なＭＰＴＭＳ／ＰＥＧシラン表面官能率を有するシリカナノ粒子のＳ２ｐ軌道の高解像度Ｘ線光電子分光スペクトルを示す図である（メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）による表面官能率が大きくなるにつれ、Ｓ２ｐシグナル強度も大きくなる。当該ピークは１００％ＭＰＴＭＳで最も強くなるべきであるが、８０％ＭＰＴＭＳ／２０％ＰＥＧのスペクトルで最も強くなっている。これは、固体基板サンプルではなくパウダーサンプルを扱う場合、サンプル厚さを再現することが困難なことから合理的に説明できる。また、ＰＥＧシランが表面にない場合被膜は薄くなるため、サンプルの多くの部分が有機表面官能基ではなくナノ粒子のシリコン原子および酸素原子から構成される）。 本発明の一実施形態に係る、表面官能基が異なる４種類のシリカナノ粒子サンプルのＮ１ｓ軌道の高解像度Ｘ線光電子分光スペクトルを示す図である（１００％モノサッカリド（ＧｌｃＮＡｃ）官能化サンプルにおいて窒素が大量に検出され、１０％ＧｌｃＮＡｃ／９０％ＰＥＧサンプルにおいて僅かに検出された。窒素はモノサッカリドのアミド基由来であり、１００％ＰＥＧまたは１００％ＭＰＴＭＳ表面官能化シリカナノ粒子サンプルでは検出されない）。 本発明の一実施形態に係る、表面官能基が異なる４種類のシリカナノ粒子サンプルのＳ２ｓ軌道の高解像度Ｘ線光電子分光スペクトルを示す図である（１００％ＭＰＴＭＳサンプルおよび１００％モノサッカリド（ＧｌｃＮＡｃ）サンプルにおいて硫黄が検出された。ＭＰＴＭＳ分子はチオール−エン反応によりトリメトキシシラン部分がモノサッカリドに共有結合されている。極微量の硫黄が１０％ＧｌｃＮＡｃ／９０％ＰＥＧサンプルで検出されたが、その量は１００％ＰＥＧサンプルの場合と比較して有意に多くない）。 発明の一実施形態に係る、シリカナノ粒子へのＡ−６およびＣ−５の結合を確認するマイクロウェル蛍光アッセイの結果を示す棒グラフである。
本発明は、その構成および作用について、下記説明および様々な実施形態を示す添付図面（幾つかの図面にわたって同じ符号が使用されている）を参照することにより最大に理解されうる。
本発明は、非自己抗原に対する免疫寛容を誘発する方法およびシステムの発見に関する。本方法およびシステムは、キャリアに結合した少なくとも１つの免疫原性非自己抗原を有する寛容源を導入し、当該免疫性抗原は外来性もしくは内在性抗原またはそれらの断片でありうる。また、寛容源組成物が提供され、非自己抗原に対する免疫寛容を誘発することができる。当該方法、システムおよび組成物は、幼児期を過ぎた患者へ免疫学的不適合臓器移植が安全に行える期間を延長することができるため、特に有利である。臓器移植を安全に行うことができる期間が延長されることにより、潜在的なドナー・プールが拡大するため、順番待ちリスト者の死亡率の低減や、稀にしか手に入らないドナー臓器のより効果的な利用が可能となる。また、慢性的・系統的な薬理学的免疫抑制の必要性及びそれに付随する多くの副作用を最小限にすることができる。
本発明の一実施形態において（図１）、寛容原１は、キャリア４にリンカー３を介して結合した少なくとも１つの免疫原性非自己抗原２を有する。免疫原性非自己抗原２は、糖鎖抗原、完全長抗原性タンパク質、および、それらの断片および組み合わせから成る群から選ぶことができる。
糖鎖抗原の例には、Ａ型抗原、Ｂ型抗原、Ｏ型抗原、Ｇａｌｉｌｉ抗原（Ｇａｌ−α−（１→３）Ｇａｌ）、および、それらの断片および組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。もちろん、当業者ならば免疫原性でありうる糖鎖抗原が使用可能であることを理解するであろう。
ＡＢＯ式血液型抗原の化学構造を図２に示す。ＡＢＯ式血液型抗原は、それらを多糖類モチーフの残部に連結する連結基の種類によってさらに分類されうる。表１に示すように、６種類のファミリーが同定されており、単糖残基の種類および還元末端のβ−ガラクトシド部の結合位置によりそれぞれＩ型〜ＶＩ型と命名されている。例えば、限定する意図はないが、Ａ型のＩ型抗原はＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基にβ１→３結合したＡ型三糖であり、これは多様な構造の糖鎖を介して体内のタンパク質または脂質に結合している。寛容原１の調製に有用な抗原として全てのタイプが本発明の範囲内で含まれる。
本発明の寛容原１の作製を容易にするめに、様々な化学合成プロトコルが糖鎖抗原の作製に利用可能である。例えば、限定する意図はないが、全６タイプのＡＢＯ式血液型抗原は従来技術を用いてグラム〜キログラム単位で作製可能である。現在、上記抗原の合成を教示する手法が幾つか発表されており、Zhangらによる発表が例としてあげられる（Zhang, Y., Yao, Q., Xia, C. et al. Chem. Med. Chem. 2006, 1:1361), Pazynina et al. (Pazynina, G.V., Tyrtysh, T.V., Bovin, N.V. Mendeleev Commun., 2002, 12:143), and Meloncelli et al. (Meloncelli, P. J., Lowary, T. L. Aust. J. Chem., 2009, 62:558）。
一実施形態において、完全長抗原性タンパク質は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を有することができるが、これに限定されない。ＨＬＡ分子には２つの主要クラスがある。クラスＩはＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、および、サブタイプを有する。クラスＩＩはＤＲ、ＤＱ、および、サブタイプを有する。いずれのクラスのＨＬＡも抗原２として使用可能である。もちろん、当業者に理解されるように、本発明においてＨＬＡ分子の断片も抗原２として使用されうる。
ＨＬＡ分子およびその断片は、組み換え技術により容易に作製することができる。当業者ならば、ＨＬＡ分子等の組み換えタンパク質の作製・精製に多く様々な手法が利用可能であることを理解するであろう。例えば、限定する意図はないが、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Sambrook, J. and Russell, D.W., CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York, 3rd Edition, 2001)に記載されている任意の技術を使用して、本発明の目的のために組み換えタンパク質を容易に作製することができる。
リンカー３は、トリアルコキシシリル基、トリハロシリル基等でありうる固定基を有するアグリコンからなる群から選ぶことができる。一実施形態において、リンカー３はトリメトキシシリル固定基を有する。一実施形態において、リンカー３はトリクロロシリル固定基を有する。一実施形態において、固定基は−Ｓｉ（ＯＲ）ｘＲ２ ｙである（式中、Ｒはメチル基、エチル基、プロピル基またはブチル基でありうるアルキル基であり；Ｒ２はメチル基、エチル基、プロピル基またはブチル基でありうるアルキル基、および、Ｉ、ＢｒまたはＣｌでありうるが、これらに限定されないハロゲンから成る群から選ばれる基でありうり；ｘは０、１、２または３であり；ｙは、Ｒ２がアルキル基の場合０、１または２であり、Ｒ２がハロゲンの場合０、１、２または３であり；ｘ＋ｙ＝３でなければならない）。
もちろん、当業者ならば、多くの様々なリンカーが抗原２とキャリア４との結合に使用可能であることを理解するであろう。例えば、限定する意図はないが、リンカーは、−Ｏ（ＣＨ２）８Ｓ（ＣＨ２）３Ｓｉ（ＯＲ）ｘＲ２ ｙ、−Ｏ（ＣＨ２）８ＳＯ２（ＣＨ２）３Ｓｉ（ＯＲ）ｘＲ２ ｙ、−Ｏ（ＣＨ２）７ＣＨ２Ｓｉ（ＯＲ）ｘＲ２ ｙ、−Ｏ（ＣＨ２）８Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）３Ｓｉ（ＯＲ）ｘＲ２ ｙ、および、−Ｏ（ＣＨ２）８Ｓ（ＣＨ２）３Ｓｉ（ＯＲ）ｘＲ２ ｙから成る群から選択される（式中、Ｒはメチル基、エチル基、プロピル基またはブチル基でありうるアルキル基であり；Ｒ２はメチル基、エチル基、プロピル基またはブチル基でありうるアルキル基、および、Ｉ、ＢｒまたはＣｌでありうるが、これらに限定されないハロゲンから成る群から選ばれる基でありうり；ｘは０、１、２または３であり；ｙは、Ｒ２がアルキル基の場合０、１または２であり、Ｒ２がハロゲンの場合０、１、２または３であり；ｘ＋ｙ＝３でなければならない）。
キャリア４は、シリカ被覆ステント、Ａｌ２Ｏ３被覆ステント、ＳｉＯ２ナノ粒子、または、シリカ被覆酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）ナノ粒子から成る群から選択することができる。当業者に理解されるように、ステントにするかナノ粒子にするかは、目的の用途に応じて異なる。
少なくとも１つの抗原２とキャリア４との結合を容易にするために、ステントおよびナノ粒子をシリカまたはアルミナで被覆することができる。シリカ被膜またはアルミナ被膜の他の機能の例としては、材料の不動態化および体内でのキャリア４の半減期の拡張が挙げられるが、これらに限定されない。キャリアのシリカまたはアルミナによる被覆は従来技術に教示されるように行うことができる。例えば、限定する意図はないが、ステンレススチール製ステントのシリカによる被覆は、Meth、Sukenik(Meth, S., Sukenik, C. M. Thin Solid Films, 2003, 425:49)、または、Shapiro et al.(Shapiro, L., Marx, S., Mandler, D. Thin Solid Films, 2007, 515:4624-4628)に教示されるように行うことができる。さらに、原子層堆積法（ＡＬＤ）によりシリカ被膜およびアルミナ被膜の両方をステンレスに形成することができる。また、Stober法によりシリカ被覆ナノ粒子を形成することができる(Stober, W., Fink, A., Bohm, A. J. Colloid Interface Sci., 1968, 26:62-69)。もちろん、当業者に理解されるように、シリカ被膜またはアルミナ被膜の厚さは目的の用途に応じて異なりうる。
ナノ粒子は、シリカ（ＳｉＯ２）ナノ粒子、および、シリカ被覆酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）を含む群から選択することができるが、これらに限定されない。従来教示されている幾つかの技術により、両方の種類のナノ粒子を十分な量で合成することができる。これらの技術の例には、Tal et al.(Tan, W., Wang, K., He, H., et al. Medicinal Research Reviews 2004, 24:621-638)、 Aliev et al. (Aliev, F.G., Correa-Duarte, M.A., Mamedov, A., et al. Adv. Mater. 1999, 11:1006-1010)、Ma et al.(Ma, D., Guan, J., Normandin, F., et al. Chem. Mater. 2006, 18:1920-1927)、及び、 Lee et al. (Lee, J., Lee, Y., Youn, J.K., et al. Small, 2008, 4:143-152)に教示される技術が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、ＳｉＯ２ナノ粒子はキャリア４（図３）として使用することができる。ＳｉＯ２ナノ粒子のサイズは大きく変化しうり；当業者ならば、最適ナノ粒子サイズは目的の用途に応じて変化することを理解するであろう。さらに、用途に応じて、単分散ナノ粒子または多分散ナノ粒子混合物とすることもできる。本発明で使用可能なＳｉＯ２ナノ粒子は従来技術により作製することができ、例えば、Stober法(Stober, W., Fink, A., Bohm, A. J. Colloid Interface Sci., 1968, 26:62-69)が挙げられるが、これに限定されない。
一実施形態において、シリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子は、キャリア４として使用することができる。シリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子のサイズは大きく変化しうり；当業者ならば、最適ナノ粒子サイズは目的の用途に応じて変化することを理解するであろう。さらに、用途に応じて、単分散ナノ粒子または多分散ナノ粒子混合物とすることもできる。本発明で使用可能なシリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子（図４Ａおよび図４Ｂ）は従来技術により調製することができる。例えば、限定する意図はないが、シリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子は Lee et al.(Lee, J., Lee, Y., Youn, J., et al. Small, 2008, 4:143-152)の教示に従って作製することができる。これらナノ粒子は、血中での半減期を長くするために、連続または完全な薄いシリカの鞘（sheath）で被覆することができる。ナノ粒子のコアシェル構造により、ナノ粒子は磁性を有し、また、磁場または電場による部位特異的送達、磁気共鳴撮像における利用などの利点を有しうる。
一実施形態において、キャリア４としてステントが使用されうる。当業者に理解されるように、ステントのサイズは目的の用途に応じて異なる。ステントを挿入する患者のサイズおよびステントの位置が、適切なステントのサイズを決める上で重要な要素となる。さらに、当業者に理解されるように、本発明の目的のために、多くの様々な生体適合性材料をステントの作製に使用することができる。
例えば、限定する意図はないが、３１６Ｌステンレス、チタン、チタン合金、コバルト・クロム合金でステントを作製することができる。一実施形態において、ステントは、低腐食率、良好な生体適合性および低毒性から、３１６Ｌステンレスで作製される。３１６Ｌステンレススチール製ステントは、まず初めに、表面官能化に必要なヒドロキシ基を有するシリカまたはアルミナの薄膜で不動態化することができる。前述のとおり、シリカ被膜またはアルミナ被膜の付与は従来技術により行うことができる。
本発明の寛容源組成物は、当業者に知られる様々な手法で調製することができる。抗原２は、様々な方法によりリンカー３を介してキャリア４に結合することができる。幾つかの技術が現在利用可能であり；例としては、Lemieux et al.が教示するもの(ＵＳＰ４，３６２，７２０、ＵＳＰ４，１３７，４０１、ＵＳＰ４，２３８，４７３)、および、Terunuma et al.が教示するもの(ＷＯ２００７、ＪＰ５３３１８)が含まれる。上述したように、キャリア４のシリカ被膜またはアルミナ被膜は、キャリア４へのリンカー３および抗原２の結合に役立ちうる。
また上述したように、キャリア４を必要な官能基で修飾して抗原２と共有結合させるために、様々な種類のリンカー３を使用することができる。当業者に理解されるように、多くの様々な官能基を使用することができる。
一実施形態において、キャリア４（図５および図８）は、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３Ｓｉ（ＯＭｅ）３をリンカー３としてアミノ基で官能化することができる。理論に拘束されたくないが、アミノ基が存在することにより抗原２の活性化エステルがキャリア４に結合される。もちろん、当業者に理解されるように、目的の用途に応じて、Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）３Ｓｉ（ＯＲ）xＲ２ ｙを使用することもできる（式中、Ｒはメチル基、エチル基、プロピル基またはブチル基でありうるアルキル基であり；Ｒ２はメチル基、エチル基、プロピル基またはブチル基でありうるアルキル基、および、Ｉ、ＢｒまたはＣｌでありうるが、これらに限定されないハロゲンから成る群から選ばれる基でありうり；ｘは０、１、２または３であり；ｙは、Ｒ２がアルキル基の場合０、１または２であり、Ｒ２がハロゲンの場合０、１、２または３であり；ｘ＋ｙ＝３でなければならない）。
他の実施形態において、キャリア４（図６および図７）は、トリメトキシシリル（Ｓｉ（ＯＣＨ３）３）リンカーを有する抗原２で直接官能化することができる。もちろん、当業者に理解されるように、目的の用途に応じて、−Ｓｉ（ＯＲ）xＲ２ ｙで表されるリンカーを使用することもできる（式中、Ｒはメチル基、エチル基、プロピル基またはブチル基でありうるアルキル基であり；Ｒ２はメチル基、エチル基、プロピル基またはブチル基でありうるアルキル基、および、Ｉ、ＢｒまたはＣｌでありうるが、これらに限定されないハロゲンから成る群から選ばれる基でありうり；ｘは０、１、２または３であり；ｙは、Ｒ２がアルキル基の場合０、１または２であり、Ｒ２がハロゲンの場合０、１、２または３であり；ｘ＋ｙ＝３でなければならない）。
理論に拘束されたくないが、糖鎖抗原の保護・脱保護が不要となるため、抗原２の直接官能化はより簡便な合成を可能としうる。さらに、抗原２のキャリア４への結合をより良くコントロールすることが可能となりうる。
キャリア４に結合させる抗原２分子の数および種類は大きく異なりうる。一実施形態において、寛容源１は同じ種類の抗原２分子を複数有する。一実施形態において、寛容源１は互いに異なる種類の抗原２分子を複数有する。例えば、限定する意図はないが、あるＡＢＯ式血液型抗原について６順列全てをキャリア４に結合して寛容源１を作製することで、移植臓器が接触する可能性のある全ての構造を患者に暴露させることができる。一実施形態において、寛容源１はＡＢＯ式血液型抗原およびＨＬＡ抗原の両方を有する。当業者に理解されるように、非自己抗原に対する免疫寛容を誘発するために、抗原を任意に組み合わせたり、または、抗原断片を組み合わせて寛容源１を調製することができる。
キャリア４に結合する抗原２分子の数は、目的の用途に応じて変える必要がありうる。高密度な抗原２の被覆層だけで覆われたナノ粒子は、オプソニン吸着が起こり、その後血流からの迅速に除去されやすいことがわかった。従来、親水性単層またはフレキシブルなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子からなる「雲」のいずれかで被覆されたナノ粒子は、より長い半減期で血流循環することがわかっており、「ステルス粒子」（図７及び図８）といわれる粒子のクラスに属する(Zillies, J.C., Zwiorek, K., Winter, G., et al. Anal. Chem., 2007, 79:4574; Duguet, E., Vasseur, S., Mornet, S., et al. Nanomed, 2006, 1:157; Zahr, A.S., Davis, C.A., Pishko, M.V. Langmuir, 2006, 2:8178; Kirpotin, D.B., Drummond, D.C., Shao, Y., et al. Cancer Res., 2006, 66:6732; Zahr, A.S., de Villiers, M., Pishko, M.V. Langmuir, 2005, 1:403; Peracchia, M.T., Pharma Sciences, 2003, 13:155; Beletsi, A., Panagi, Z., Avgoustakis, K. Int. J. Pharmaceutics, 2005, 298:233)。理論に拘束されたくないが、血漿中での滞在時間が長いステルス粒子は、抗原の循環リンパ球との接触を増大させて、ナノ粒子溶液への再暴露の必要性を低減させる。
一実施形態において、寛容源１の血中半減期を長くするために、ナノ粒子は抗原２と−Ｓｉ（ＯＲ）ｘＲ２ ｙ基等の表面結合基を有しうる適切なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有分子との混合層で被覆される（式中、Ｒはメチル基、エチル基、プロピル基またはブチル基でありうるアルキル基であり；Ｒ２はメチル基、エチル基、プロピル基またはブチル基でありうるアルキル基、および、Ｉ、ＢｒまたはＣｌでありうるが、これらに限定されないハロゲンから成る群から選ばれる基でありうり；ｘは０、１、２または３であり；ｙは、Ｒ２がアルキル基の場合０、１または２であり、Ｒ２がハロゲンの場合０、１、２または３であり；ｘ＋ｙ＝３でなければならない（図８））。
理論に拘束されたくないが、このタイプの層は、抗原２を希釈し、かつ、ナノ粒子をＰＥＧで囲うことが可能であるため、タンパク質の物理吸着を最小限にすることができる。同様の効果はステントでも観察されたが、ステントの場合、生物付着、血漿タンパクの物理吸着および生物膜形成を最小限にするために、ＰＥＧおよび抗原の同時官能化が必要となりうる。もちろん、当業者に理解されるように、他の多くの生物付着ポリマーも使用することができ、本発明の範囲内に含まれる。
幅広い種類のＰＥＧを使用してキャリア４を被覆することができる。当業者に理解されるように、ＰＥＧ鎖の長さを調節して、抗原２へのアクセスを妨げずに最適な保護を提供することができる。一実施形態において、繰り返し単位数６〜９または９〜１２であり、かつ、Ｏ−Ｒ末端基を有するＰＥＧ鎖に、炭素数３の炭素鎖を有するシランが結合している。ここで、Ｒはメチル基、エチル基、プロピル基、および、ブチル基から成る群から選ばれうるアルキル基である。
キャリア４を囲む混合層における抗原２およびＰＥＧの濃度は変化しうる。もちろん、当業者ならば各成分の濃度が目的の用途に応じて異なることを理解するであろう。最低でも、キャリア４は少なくとも１つの抗原２を有さなければならない。
上述したように、本発明で作製される寛容源１は、免疫抑制剤治療に全く頼らないか余り頼らずに抗原特異的免疫反応を抑制するために、患者に投与することができる。患者の年齢および健康状態は大きく変動する。一実施形態において、非自己抗原に対して免疫寛容を誘発する方法およびシステムは、免疫系が成熟する前の新生児に対して適用することができる。他の実施形態において、当該方法およびシステムは、幼児期の年齢を過ぎた患者に対して適用することができる。
本発明の方法およびシステムは、非自己抗原に対する免疫寛容を誘発するために患者に対して寛容源１を投与することを含む。選択した非自己抗原はキャリア４に結合することができ、キャリア４はナノ粒子またはステントとすることができる。
寛容源１の投与法は、寛容源の作製に使用したキャリア４の種類に応じて異なる。一実施形態において、キャリア４がステントの場合、寛容源１の外科移植が必要となる。ステントは、非自己抗原に対する免疫寛容を最大限に誘発するために、体の様々な部位に移植することができる。一実施形態において、ステントは、移植臓器の近傍、または、移植臓器を受容する部位の近傍に移植される。
他の実施形態において、キャリア４がナノ粒子である場合、寛容源１の組成物の静脈投与を採用することができる。本発明の寛容源組成物は、寛容源１を当業者により適宜選ばれる任意の薬学的に許容される賦形剤と配合することにより得られる。静脈投与用組成物に使用する効果的な薬学的賦形剤の要件は当業者によく知られており、多くの出版物に報告されている(Pharmaceutical and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker & Chalmers, Eds., 1982; ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th Ed., 1986)。投与の頻度は目的の用途に応じて変わる。
下記材料および方法を後述の実施例において使用した。これら材料および方法は例示のみを目的としており、本発明の範囲は何らこれらに限定されない。当業者ならば、本発明の要旨を損なわない範囲で改変・置換を行うことが可能であることを理解するであろう。具体的には、下記に記載する具体的な手法および反応条件における改変・置換が含まれる。
（一般的方法）
全ての試薬は商業的供給源から購入したものであり、特に断りのない限り精製せずに使用した。反応溶媒は購入品であり、精製せずに使用した。乾燥溶媒は、窒素下でアルミナカラムおよび銅カラムに連続通過させて精製した。特に断りのない限り、全ての反応はアルゴンの正圧下で室温にて行った。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、アルミシートシリカゲル６０Ｆ２５４（メルク社）を用いて、ｐ−アニスアルデヒド（５％硫酸／エタノール溶液）または１０％モリブデン酸アンモニウム（１０％硫酸溶液）を加熱（＞２００℃）して発色させることで行った。特に断りのない限り、全てのカラムクロマトグラフィーはシリカゲル６０（４０〜６０μＭ）を用いて行った。「イヤトロビーズ（Iatrobeads）」は、Iatron Laboratories（東京）社製のビーズシリカゲル６ＲＳ−８０６０をいう。
Ｃ−１８シリカゲル（３５〜７０μＭ）は、Toronto Research Chemicals社製である。旋光度は２２±２℃の範囲で測定した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、４００ＭＨｚおよび５００ＭＨｚにおいて記録し、化学シフトはＴＭＳ（０．０ｐｐｍ、ＣＤＣｌ３）またはＣＤ３ＯＤ（３．３０ｐｐｍ、ＣＤ３ＯＤ）のピークを基準とした。１３Ｃ ＮＭＲ（ＡＰＴ）スペクトルは、１２５ＭＨｚまたは１００ＭＨｚにおいて記録し、１３Ｃ化学シフトは内部ＣＤＣｌ３（７７．１ｐｐｍ、ＣＤＣｌ３）またはＣＤ３ＯＤ（４９．０、ＣＤ３ＯＤ）のピークを基準とした。特に断りのない限り、全てのスペクトルはＣＤＣｌ３中で記録した。融点測定にはPerkinElmer Thermal Analysisを用いた。電子噴霧イオン化マススペクトルは、ＴＨＦおよびＣＨ３ＯＨの混合液にＮａＣｌを添加した溶液に縣濁したサンプルについて記録した。
フッ化水素酸および硫酸は、J.T.Baker社から購入したものをそのまま使用した。過酸化水素は、Fisher Science社から購入したものをそのまま使用した。酢酸は、EMD社から購入したものをそのまま使用した。エタノール（９５％）は、Fisher Science社から購入したものをそのまま使用した。３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）は、Aldrich社から購入したものをそのまま使用した。２−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］−トリメトキシシランは、Gelest社（モリスビル、ペンシルバニア州、米国）から購入したものをそのまま使用した。１８ＭΩ純水（Barnstead社）は、使用前に用時調製した。バルーン拡張性Palmaz-Schatz PS204Cステンレスステントは、Johnson& Johnson社(マイアミ、フロリダ州)から購入した。
バイオアッセイについて、ＰＢＳＴは、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水溶液（ｐＨ７．４）をいう。リン酸緩衝生理食塩水は、組成：１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４の脱イオン水溶液である。ＯＰＤ指示剤は、Aldrich社から購入し(ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ ＯＰＤ Ｐ９１８７）、メーカーの指示書に従って調製した。吸光度は、SPECTRAmax 340PC UV/Vis 分光光度計（Molecular Devices社）を用いて４５０ｎｍで測定した。蛍光は、SpectraMax M2マイクロプレート・リーダ（Molecular Devices社）で測定した。ペルオキシダーゼ標識レクチン(ＷＧＡ-Ｌ3892およびＰＮＡ-Ｌ7759)は、Aldrich社から購入したものを、改変せずに使用した。また、ＦＩＴＣ標識レクチン(ＷＧＡ-Ｌ４８９５およびＰＮＡ-Ｌ７３８１)は、Aldrich社から購入したものを、改変せずに使用した。抗ＡマウスＩｇＭは、Virogen社から購入した(抗Ａ１、Ａ２、Ａ３ Ｃａｔ＃ １３３−Ａ)。一方、ヤギ抗マウスＩｇＭ ＨＲＰ二次抗体は、Southern Biotech社から購入した(1021-05)。
ステント表面は、走査型オージェ電子顕微鏡法（ＳＡＭ）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、および、ペルオキシダーゼアッセイで解析した。ナノ粒子は、ＸＰＳ、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、および、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）で解析した。ＳＡＭおよびＸＰＳは、高真空条件下（＜１０−８Ｔｏｒｒ）で行った。
ＸＰＳ（Axis-Ultra、Kratos Analytical社）は、Alberta Centre for Surface Engineering and Science(ACSES)で、単色Ａｌ／ＫＲ Ｘ線ソースを使用して光子エネルギー１４８６．６ｅＶで行った。本装置はＣ １ｓピークに基づいてキャリブレーションした。ＳＡＭ（ＪＡＭＰ−９５００Ｆ、ＪＥＯＬ）)は、加速電圧および放出電流をそれぞれ１５ｋＶおよび８ｎＡとして行った。ＳＥＭは、５〜１５ｋＶで動作するＨｉｔａｃｈｉ Ｓ−４８８０ ＦＥ−ＳＥＭを用いて行い；ＴＥＭは、２００ｋＶで動作するＪＥＯＬ−２０１０を用いて行った。ＡＦＭは、市販のカンチレバーを使用したＮａｎｏｓｃｏｐｅ ＩＶ(Digital InstrumentsVeeco社)を使用して行った。
以下、本発明が十分に理解されるように、実施例を記載する。これら実施例は例示のみを目的としており、本発明の範囲を限定するものとして解釈するべきではない。また、これら実施例は本発明の均等物および変形例を排除することは意図しておらず、それらは当業者に自明である。
本発明の様々な実施形態に係るステンレススチール製ステントおよびナノ粒子用の抗原および糖鎖の調製
（実施例１）
７−オクテン−１−イル−２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｉ−４）の合成
トリクロロアセトイミダート（８．６９ｇ、１８．３ｍｍｏｌ）（Rele, S.M., Iyer, S.S., Baskaran, S., et al. J. Org. Chem., 2004, 69:9159-9170）Ｉ−１および７−オクテン−１−オール（２．８２ｇ、２２．０ｍｍｏｌ）を５０ｍｌの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２溶媒に溶解・攪拌した溶液を４Å分子ふるい（３．５ｇ）で処理し、混合液を撹拌した（室温、１時間）。混合液を−３０℃に冷却し、ＴＭＳＯＴｆ（３００μＬ）で処理した後、静置して徐々に加温した（０℃）。混合液をＥｔ３Ｎ（１ｍＬ）で中和した後、ろ過および濃縮を行い、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：３）を行ったところ、次ステップで直ちに使用する分離不可能なα／β混合物Ｉ−２が得られた。
このオイルをＣＨ３ＯＨ（８０ｍＬ）に溶解し、触媒量のＮａＯＣＨ３を含むＣＨ３ＯＨ溶液で処理し、攪拌した（室温、１時間）。その後、アンバーライトＩＲ１２０で中和した後、ろ過および濃縮を行い、次いでフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、２：１）を行ったところ、分離不可能なα／β混合物としてトリオールＩ−３（３．３２ｇ）が得られた。乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解した当該トリオール（３．３２ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）の溶液をベンズアルデヒドジメチルアセタール（２．１３ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）およびＴｓＯＨ（１００ｍｇ）で処理し、攪拌した（５０℃、４時間）。溶液をＥｔ３Ｎ（１ｍＬ）で処理した後、濃縮を行い、次いでフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：３）を行ったところ、β−グリコシドＩ−４の無色オイルが得られた（３．０５ｇ、４１％）。
[α] -38.4 (c = 0.4, CH2Cl2); Rf 0.18 (EtOAc/hexanes, 7:3); 1H NMR (500 MHz): δH 7.52-7.35 (5H, m, Ph), 5.87-5.76 (1H, m, CH=CH2), 5.54 (1H, s, PhCH), 5.04-4.92 (2H, m, CH=CH2), 4.42 (1H, d, J1,2 8.0, H1), 4.34 (1H, dd, J6,6 10.3, J5,65.0, H6), 3.97-3.89 (1H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.79 (1H, dd, J6,6 10.3, J5,6 10.3, H6), 3.69-3.51 (3H, m, H3, H4, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.45-3.35 (2H, m, H2, H5), 2.69 (1H, brs, OH), 2.10-1.99, 1.73-1.56, 1.46-1.25 (10H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O). 13C NMR (125 MHz): δC 139.0 (C*H=CH2), 136.8 (Ph), 129.4 (Ph), 128.4 (Ph), 126.2 (Ph), 114.3 (CH=C*H2), 102.7, 102.0 (PhC*H, C1), 80.6, 72.0, 66.5, 66.2 (C2, C3, C4, C5), 70.7 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 68.5 (C6), 33.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.5 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.81 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.78 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 25.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O). ESI MS: m/z calcd [C21H29N3O5]Na+: 426.2000. Found 426.2002.
７−オクテン−1イル ２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−（４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−ピバロイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｉ−７）の合成
アクセプターＩ−４（１．０２ｇ、２．５３ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）溶液を４Å分子ふるい（３ｇ）と攪拌した（室温、１時間）。溶液を冷却し（−４０℃）、ＴＭＳＯＴｆ（０．１ｍＬ）で処理した後、トリクロロアセトイミダート（Figueroa-Perez, S., Verez-Bencomo, V. Carbohydr. Res. 1999, 317:29-38）Ｉ−５を滴下した（４．４ｇ、８．９ｍｍｏｌ）。その後、混合液を静置して徐々に加温した（０℃）。混合液をＥｔ３Ｎ（１ｍＬ）で中和した後、濃縮を行い、次いでフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：１）を行ったところ、無色のオイルが得られ、すぐに次のステップで使用した。この無色オイルをＣＨ３ＯＨ（１００ｍＬ）に溶解し、ＮａＯＣＨ３のＣＨ３ＯＨ溶液で処理し、攪拌した（室温、３時間）。 アンバーライトＩＲ１２０（Ｈ＋）で中和した後、ろ過を行い、次いでフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、７：３）を行ったところ、多少精製されたジオールＩ−６の無色オイルが得られた（１．２０ｇ、６７％）。このジオール（１．２０ｇ、１．８３ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（２５ｍＬ）に溶解し、トリメチルアセチルクロリド（６００ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）で処理した後、攪拌した（室温、３時間）。濃縮した後、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：３）したところ、アルコールＩ−７の無色オイルが得られた（１．０８ｇ、８０％）。
[α] +5.8 (c = 0.1, CH2Cl2); Rf 0.75 (EtOAc/hexanes, 2:3); 1H NMR (500 MHz): δH 7.52-7.46, 7.38-7.30 (10H, m, Ph), 5.86-5.76 (1H, m, CH2=CH), 5.54, 5.46 (2H, 2×s, PhCH), 5.04-4.92 (2H, m, CH2=CH), 4.78 (1H, dd, J2´,3´ 9.5, J3´,4´ 3.6, H3´), 4.49 (1H, d, J1´,2´ 7.9, H1´), 4.47 (1H, d, J1,2 8.0, H1), 4.37-4.29 (2H, m, H4´, H6), 4.17 (1H, d, J6´,6´ 12.1, H6´), 4.05 (1H, dd, J2´,3´ 9.5, J1´,2´ 8.2, H2´), 3.96-3.88 (2H, m, H6´, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.80 (1H, dd, J6,6 10.1, J5,6 10.1, H6), 3.77-3.72 (2H, m, H3, H4), 3.62-3.49 (2H, m, H2, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.46-3.35 (1H, m, H5), 3.33-3.29 (1H, m, H5´), 3.02-2.96 (1H, brs, OH), 2.11-2.01 (2H, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.72-1.60 (2H, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.46-1.30 (6H, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.22 (9H, s, (CH3)3C). 13C NMR (125 MHz): δC 178.3 (C=O), 139.0 (CH2=C*H), 137.9 (Ph), 137.0 (Ph), 129.1 (Ph), 128.7 (Ph), 128.2 (Ph), 128.0 (Ph), 126.02 (Ph), 125.96 (Ph), 114.3 (C*H2=CH), 104.5 (C1´), 102.7 (C1), 101.4 (PhC*H), 100.5 (PhC*H), 79.9, 79.8 (C3, C4), 73.21, 73.20 (C3´, C4´), 70.8 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 69.1 (C2´), 68.8, 68.5 (C6, C6´), 67.0 (C5´), 66.3 (C5), 65.5 (C2), 39.0 ((CH3)3C*), 33.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.5 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.80 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.77 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 27.1 ((C*H3)3C), 25.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O). ESI MS: m/z calcd [C44H59N3O13]Na+: 760.3416. Found 760.3415.
７−オクテン−１イル ２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−（４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏーピバロイル−２−Ｏ−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−フコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｉ−９）の合成
アクセプターＩ−７（４１５ｍｇ、０．５６３ｍｍｏｌ）の乾燥ＥｔＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２溶液（９０：１０、２０ｍＬ）を４Å分子ふるいと攪拌した（室温、１時間）。混合液を冷却し（−１０℃）、ＴＭＳＯＴｆで処理した後、トリクロロアセトイミダート（Schmidt, R.R., Toepfer, A. J. Carb. Chem. 1993, 12:809-822）Ｉ−８（１．０２ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）の乾燥Ｅｔ２Ｏ溶液（１５ｍＬ）を滴下した。その後、混合液を攪拌した（２０分）。混合液をＥｔ３Ｎ（０．５ｍＬ）で処理した後、ろ過を行い、次いでフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：３）を行ったところ、トリサッカリドＩ−９の無色のオイルが得られた（５１０ｍｇ、８０％）。
[α] -20.7 (c = 0.2, CH2Cl2); Rf 0.59 (EtOAc/hexanes, 3:7); 1H NMR (500 MHz): δH 7.55-7.22 (25H, m, Ph), 5.87-5.77 (1H, m, CH2=CH), 5.41 (1H, d, J1´´,2´´ 1.5, H1´´), 5.48 (1H, s, PhCH), 5.37 (1H, s, PhCH), 5.04-4.92 (4H, m, H3´, PhCH2, CH2=CH), 4.79, 4.74 (2H, AB, J 11.5, PhCH2), 4.76 (1H, d, J1´,2´ 8.1, H1´), 4.69 (1H, A of AB, J 11.7, PhCH2), 4.79, 4.63 (2H, AB, J 11.5, PhCH2), 4.51 (1H, q, J5´´,6´´ 6.3, H5´´), 4.42 (1H, d, J1,2 7.7, H1), 4.34-4.29 (2H, m, H6, H6´), 4.24 (1H, d, J1´,2´ 8.5, J2´,3´ 8.5, H2´), 4.13-4.07 (3H, m, H2´´, H3´´, H4´), 3.97-3.91 (1H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.83-3.70 (5H, m, H3, H4, H4´, H6, H6´), 3.63-3.56 (1H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.43-3.35 (2H, m, H2, H5), 3.04-2.99 (1H, m, H5´), 2.11-2.03 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.73-1.63 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.46-1.31 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.20 (3H, d, J5´´,6´´ 6.3, H6´´), 1.08 (9H, s, (CH3)3C). 13C NMR (125 MHz): δC 177.9 (C=O), 139.01 (Ph), 138.98 (CH2=C*H), 138.6 (Ph), 138.4 (Ph), 137.6 (Ph), 136.8 (Ph), 129.2 (Ph), 128.7 (Ph), 128.5 (Ph), 128.4 (Ph), 128.33 (Ph), 128.28 (Ph), 128.2 (Ph), 128.0 (2C, Ph), 127.6 (Ph), 127.5 (Ph), 127.44 (Ph), 127.38 (Ph), 126.2 (2C, Ph), 114.3 (C*H2=CH), 102.8 (C1), 101.05 (C1´), 101.7 (PhC*H), 100.8 (PhC*H), 96.8 (C1´´), 79.9, 79.7, 78.0, 77.5, 76.55, 76.52 (C3, C3´, C3´´, C4, C4´, C4´´), 75.0 (PhC*H2), 73.5 (PhC*H2), 72.9 (PhC*H2), 72.6, 70.1 (C2´, C2´´), 70.7 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 68.8, 68.6 (C6, C6´), 66.5 (C5´´), 66.4, 65.9, 65.7 (C2, C5, C5´), 38.8 ((CH3)3C*), 27.0 ((C*H3)3C), 33.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.5 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.83 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.78 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 25.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 16.9 (C6´´). ESI MS: m/z calcd [C66H79N3O15]Na+: 1176.5403. Found 1176.5402.
７−オクテン−１イル ２−アジド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−（４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−ピバロイル−２−Ｏ−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−フコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｉ−１０）の合成
ピバロイルエステル（１．４５６ｇ、１．２６ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＯＨ溶液（１５０ｍＬ）を触媒量のＬｉＯＣＨ３（１００ｇ）で処理した後、還流した（７日）。溶液を濃縮後、ＥｔＯＡｃ（４００ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３および塩水で洗浄した。有機抽出物を乾燥・濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、３：７）を行ったところ、アルコールＩ−１０の無色オイルが得られた（１．１０ｇ、８２％）。
[α] -20.7 (c = 0.1, CH2Cl2); Rf 0.26 (EtOAc/hexanes, 3:7); 1H NMR (500 MHz): δH 7.63-7.19 (25H, m, Ph), 5.89-5.79 (1H, m, CH2=CH), 5.57 (1H, s, PhCH), 5.54 (1H, s, PhCH), 5.33 (1H, s, H1´´), 5.06-4.94 (3H, m, PhCH2, CH2=CH), 4.85 (1H, A of AB, J 11.5, PhCH2), 4.84-4.74 (3H, m, PhCH2), 4.68 (1H, d, J1´,2´ 7.1, H1´), 4.66 (1H, A of AB, J 11.1, PhCH2), 4.42 (1H, d, J1,2 8.2, H1), 4.35 (1H, dd, J6,610.5, J5,6 4.8, H6), 4.31 (1H, q, J5´´,6´´ 6.3, H5´´), 4.23 (1H, d, J6´,6´ 12.4, H6´), 4.18 (1H, d, J3´,4´ 3.2, H4´), 4.13-4.06 (2H, m, H2´´, H3´´), 3.98-3.90 (3H, m, H2´, H6, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.86-3.79 (3H, m, H4´´, H6´, OH), 3.78-3.72 (2H, m, H3, H3´), 3.68 (1H, dd, J3,4 9.0, J4,5 9.0, H4), 3.63-3.58 (1H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.44 (1H, dd, J1,2 8.2, J2,3 8.2, H2), 3.41-3.36 (1H, m, H5), 3.26 (1H, s, H5´), 2.12-2.04 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.78-1.56 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.49-1.32 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.24 (d, 3H, J5´´,6´´ 6.3, H6´´). 13C NMR (125 MHz): δC 139.0 (CH2=C*H), 138.8 (Ph), 138.7 (Ph), 137.9 (Ph), 137.8 (Ph), 137.1 (Ph), 129.0 (Ph), 128.7 (Ph), 128.41 (Ph), 128.38 (Ph), 128.36 (Ph), 128.23 (2C, Ph), 128.19 (Ph), 128.1 (Ph), 127.8 (Ph), 127.54 (Ph), 127.46 (Ph), 127.4 (Ph), 126.9 (Ph), 126.1 (Ph), 114.3 (C*H2=CH), 102.9 (C1), 101.7, 101.2, 100.9 (3C, PhC*H, C1´), 99.41 (C1´´), 79.9, 78.8, 78.0, 77.8, 77.1, 76.5, 75.5 (C2´, C2´´, C3, C3´, C3´´, C4, C4´), 75.0 (PhC*H2), 74.0 (PhC*H2), 73.8 (C4´´), 72.7 (PhC*H2), 70.7 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 69.0, 68.5 (C6, C6´), 66.8, 66.74, 66.70, 66.6 (C2, C5, C5´, C5´´), 33.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.5 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.83 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.80 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 25.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 17.04 (C6´´). ESI MS: m/z calcd [C61H71N3O14]Na+: 1092.4828. Found 1092.4823.
７−オクテン−１イル ２−アジド−４，６−ベンジリデン−３−Ｏ−（３−Ｏ−（２−アジド−２−デオキシ−３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−Ｏ−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−フコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｉ−１２）の合成
アクセプターＩ−１０（６２１ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）およびトリクロロアセトイミダート（Gerhard, G., Schmidt, R.R. Liebigs Ann., 1984, 1826-1847）Ｉ−１１（８２３ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）の乾燥Ｅｔ２Ｏ溶液（１５ｍＬ）を４Å分子ふるいで処理した（室温、１時間）。混合液を冷却し（−２０℃）、ＴＭＳＯＴｆ（１０μＬ、０．０５８ｍｍｏｌ）で処理した後、静置して加温した（０℃）。混合液をＥｔ３Ｎ（２００μＬ）で処理した後、ろ過および濃縮を行い、次いでフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２、３：９７）を行ったところ、テトラサッカリドＩ−１２の無色オイルが得られた（７３７ｍｇ、９２％）。
[α] +8.87 (c = 0.1, CH2Cl2); Rf 0.25 (EtOAc/hexanes, 2:3); 1H NMR (500 MHz): δH 7.55-7.20 (25H, m, Ph), 5.87-5.77 (1H, m, CH2=CH), 5.53 (1H, d, J1´´,2´´ 2.5, H1´´), 5.51 (1H, s, PhCH), 5.49 (1H, s, PhCH), 5.28 (1H, d, J1´´´,2´´´ 3.2, H1´´´), 5.20 (1H, dd, J2´´´,3´´´ 11.0, J3´´´,4´´´ 2.9, H3´´´), 5.18-5.12 (2H, m, PhCH2, H4´´´), 5.04-4.93 (3H, m, PhCH2, CH2=CH), 4.90 (1H, A of AB, J 11.9, PhCH2), 4.75 (2H, s, PhCH2), 4.67 (1H, d, J1´,2´ 7.9, H1´), 4.63 (1H, A of AB, J 11.9, PhCH2), 4.52 (1H, q, J5´´,6´´ 6.3, H5´´), 4.46 (1H, d, J1,2 8.0, H1), 4.33 (1H, dd, J6,6 10.5, J5,64.7, H6), 4.28-4.25 (1H, m, H4´), 4.22-4.12 (5H, m, H2´, H2´´, H3´´, H5´´´, H6´), 3.88 (1H, d, J6´,6´ 12.4, H6´), 3.84-3.74 (5H, m, H3´, H4, H4´´, H6, H6´´´), 3.70 (1H, dd, J2,3 9.2, J3,4 9.2, H3), 3.99-3.92 (1H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.65-3.60 (1H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.55 (1H, dd, J2´´´,3´´´ 11.0, J1´´´,2´´´ 3.2, H2´´´), 3.50-3.37 (2H, m, H2, H5), 3.22 (1H, dd, J6´´´,6´´´ 11.5, J5´´´,6´´´ 3.5, H6´´´), 3.10-3.07 (1H, m, H5´), 2.09 (3H, s, CH3C=O), 2.09 (3H, s, CH3C=O), 1.94 (3H, s, CH3C=O), 2.10-2.06 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.77-1.55 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.47-1.35 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.22 (3H, d, J5´´,6´´ 6.3, H6´´). 13C NMR (125 MHz): δC 170.3 (C=O), 169.7 (C=O), 169.4 (C=O), 139.4 (Ph), 139.0 (Ph), 138.81 (Ph), 138.79 (CH2=C*H), 137.6 (Ph), 137.0 (Ph), 129.0 (Ph), 128.7 (Ph), 128.3 (Ph), 128.24 (Ph), 128.16 (Ph), 128.1 (Ph), 128.0 (Ph), 127.45 (Ph), 127.42 (Ph), 127.37 (Ph), 127.3 (Ph), 127.2 (Ph), 126.2 (Ph), 126.1 (Ph), 114.3 (C*H2=CH), 102.9 (C1), 101.4, 101.2, 100.7 (3C, C1´, PhC*H), 97.9 (C1´´), 94.1 (C1´´´), 80.7 (C2´), 79.7 (C3), 74.9 (PhC*H2), 74.0 (PhC*H2), 72.5 (PhC*H2), 77.9, 77.8, 77.3, 76.0, 72.0 (C2´´, C3´, C3´´, C4, C4´´), 72.0 (C4´), 70.8 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 69.1, 68.6 (C6, C6´), 68.8, 68.0 (C3´´´,C4´´´), 67.6 (C5´´´), 66.7, 66.4, 66.11, 66.09 (C2, C5, C5´, C5´´), 62.7 (C6´´´), 57.9 (C2´´´), 33.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.5 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.82 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.80 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 25.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 20.7 (C*H3C=O), 20.62 (C*H3C=O), 20.58 (C*H3C=O), 16.9 (C6´´). ESI MS: m/z calcd [C71H84N5O19]Na+: 1405.5738. Found 1405.5740.
７−オクテン−１イル ２−Ｎ−アセチル−３−Ｏ−（３−Ｏ−（２−Ｎ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−Ｏ−（α−Ｌ−フコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｉ−１３）の合成
テトラサッカリドＩ−１２（３５５ｍｇ、０．２５７ｍｍｏｌ）のピリジン（２ｍＬ）溶液をＡｃＳＨ（４ｍＬ）で処理し、攪拌した（１４日）。混合液をろ過し、濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２、１：１）を行ったところ、無色のオイルとして中間体が得られた（２７０ｍｇ、７４％）。当該中間体（２２５ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＯＨ溶液を触媒量のＮａＯＣＨ３のＣＨ３ＯＨ溶液で処理し、攪拌した（２時間）。アンバーライトＩＲ１２０（Ｈ＋）で中和した後、ろ過を行い、次いで残渣のフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２、１：１）を行ったところ、トリオールの無色オイルが得られた（１９２ｍｇ、９４％）。−７８℃に冷却したフラスコ内に再蒸留液体アンモニア（２０ｍＬ）を投入し、青色が持続するまでナトリウムで処理した。テトラサッカリドトリオール（５８ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４ｍＬ）およびＣＨ３ＯＨ（９．１μＬ、０．２２５ｍｍｏｌ）溶液を滴下して、攪拌した（−７８℃、１時間）。ＣＨ３ＯＨ（４ｍＬ）で反応停止し、次いでアンモニアを蒸発乾燥させた。この溶液をＣＨ３ＯＨ（１００ｍＬ）に溶解し、アンバーライトＩＲ１２０（Ｈ＋）で中和した後、ろ過を行い、次いで残渣のＣ−１８クロマトグラフィー（ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ、１：１）を行ったところ、完全に脱保護されたテトラサッカリドＩ−１３の無色オイルが得られた（３３．５ｍｇ、８８％）。
[α] +27.15 (c = 0.2, H2O); 1H NMR (500 MHz, D2O): δH 5.95-5.86 (1H, m, CH2=CH), 5.23 (1H, d, J1´´,2´´ 4.5, H1´´), 5.16 (1H, d, J1´´´,2´´´ 3.8, H1´´´), 5.08-5.01, 4.98-4.94 (2H, 2×m, CH2=CH), 4.68 (1H, d, J1,2 7.1, H1), 4.38 (1H, d, J1´,2´ 8.6, H1´), 4.34 (1H, q, J5´´,6´´ 6.6, H5´´), 4.31-4.17, 4.01-3.59, 3.56-3.43 (23H, 3×m, H2, H2´, H2´´, H2´´´, H3, H3´, H3´´, H3´´´, H4, H4´, H4´´, H4´´´, H5, H5´, H5´´´, H6, H6´, H6´´´, CH=CH2(CH2)5CH2O), 2.03 (3H, s, CH3C=O), 2.02 (3H, s, CH3C=O), 2.08-2.00 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.56-1.44 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.41-1.26 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.22 (1H, d, J5´´,6´´ 6.6, H6´´). 13C NMR (125 MHz): δC 175.7 (C=O), 174.5 (C=O), 141.2 (CH2=C*H), 114.9 (C*H2=CH), 102.8, 100.8, 100.0 (C1, C1´, C1´´), 92.1 (C1´´´), 78.3, 76.33, 76.27, 75.7, 74.7, 72.7, 71.8, 70.6, 69.7, 69.4, 68.53, 68.50, 67.5, 63.8 (C2´, C2´´´, C3, C3´, C3´´, C3´´´, C4, C4´, C4´´, C4´´´, C5, C5´, C5´´, C5´´´), 71.5 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 62.3, 62.1, 61.6 (C6, C6´, C6´´´), 55.6 (C2), 50.5 (C2´´), 34.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.4 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 25.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 23.2 (C*H3C=O), 22.8 (C*H3C=O), 16.1 (C6´´). ESI MS: m/z calcd [C36H62N2O20]Na+: 865.3788. Found 865.3788.
８−（３−（トリメトキシシリル）プロピルチオ）オクタン−１−イル ２−Ｎ−アセチル−３−Ｏ−（３−Ｏ−（２−Ｎ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−Ｏ−（α−Ｌ−フコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｉ−１４）の合成
乾燥ＭｅＯＨ（０．４ｍＬ）に溶解したアルケン（Ｉ−１３）（１０ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）の脱ガス溶液をＭＰＴＭＳ（７ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）およびＤＡＲＯＣＵＲ１１７３（２μＬ）で処理した後、波長２５４ｎｍにおいて１２００Ｗ（７５Ｗランプ１６個）で３０分照射した。この溶液を乾燥ＭｅＯＨ（２ｍＬ）で希釈し、ヘキサン（２ｍＬ）で三回洗浄した。次いで濃縮することにより、Ｉ−１４の若干不安定な無色オイルが得られた（９．５ｍｇ、８０％）。
（実施例２）
７−オクテン−１−イル ４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｖ−４）の合成
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（４００ｍＬ）に溶解した２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルトリクロロアセトイミダート（Amvam-zollo, P.H., Sinay, P. Carbohydr. Res., 1986, 150:199-212）Ｖ−１ （２０．９ｇ ４２．５ｍｍｏｌ）および７−オクテン−１−オール（６．５３ｇ、５１．０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液を４Å分子ふるい（５ｇ）で処理し、混合した（室温、１時間）。混合液を冷却し（−４０℃）、ＴＭＳＯＴｆ（０．５ｍＬ）で処理した後、静置して加温した（室温、１時間）。
Ｅｔ３Ｎ（２ｍＬ）を添加して反応を停止させた後、ろ過を行い、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、２：３）を行ったところ、無色のオイルが得られた。このオイルをＣＨ３ＯＨ（２００ｍＬ）に溶解し、触媒量のＮａＯＣＨ３を含むＣＨ３ＯＨ溶液で処理し、攪拌した（室温、２時間）。ＮａＯＣＨ３をアンバーライトＩＲ１２０（Ｈ＋）で中和した後、ろ過を行い、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡ／ヘキサン、５：１）したところ、テトロールＶ−３の白色固体が得られ（９．０ｇ、７３％）、次のステップで直ちに使用した。
テトロールＶ−３（９．０ｇ、３１．０ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（１００ｍＬ）溶液をベンズアルデヒドジメチルアセタール（５．９ｍＬ、３８．７ｍｍｏｌ）およびｐ−ＴｓＯＨ（３００ｍｇ）で処理し、攪拌した（４０℃、１８時間）。Ｅｔ３Ｎ（１．５ｍＬ）で中和した後、濃縮を行い、次いでフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：１）したところ、ジオールＶ−４の白色固体が得られた（８．４ｇ、７２％）。
Mp 156-158°C; [α] -26.0 (c = 0.7, CH2Cl2); (Found: C 66.54, H 8.05%. C21H30O6requires C 66.65, H 7.99%); Rf 0.37 (EtOAc/hexanes, 7:10). 1H NMR (500 MHz): δH 7.54-7.48 (2H, m, Ph), 7.40-7.34 (3H, m, Ph), 5.86-5.77 (1H, m, CH=CH2), 5.56 (1H, s, PhCH), 5.03-4.92 (2H, m, CH=CH2), 4.35 (1H, dd, J6,6 12.5, J5,6 1.4, H6), 4.28 (1H, d, J1,2 7.5, H1), 4.22 (1H, d, J3,4 3.8, H4), 4.10 (1H, dd, J6,612.5, J5,6 1.9, H6), 3.97 (1H, ddd, J 9.4, 6.8, 6.8, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.76 (1H, ddd, J2,3 9.4, J1,2 7.5, J 1.7, H2), 3.70 (1H, ddd, J2,3 9.4, J 8.9, J3,4 3.8, H3), 3.54-3.48 (2H, m, H5, CH=CH2(CH2)5CH2O), 2.51 (1H, d, J 8.9, OH), 2.45 (1H, d, J 1.7, OH), 2.10-2.02 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.72-1.63 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.46-1.30 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O). 13C NMR (125.7 MHz): δC 139.3 (C*H=CH2), 137.6 (Ph), 129.2 (Ph), 128.2 (Ph), 126.4 (Ph), 114.3 (CH=C*H2),102.8 (C1), 101.4 (PhC*H), 75.4 (C4), 72.7, 71.7 (C2, C3), 70.0, 69.2 (C6, CH=CH2(CH2)5C*H2O), 66.66 (C5), 33.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.5 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.9 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 25.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O). ESI MS: m/z calcd [C21H30O6]Na+: 401.1935. Found: 401.1937.
７−オクテン−１−イル ４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−［（４−メトキシフェニル）メチル］−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｖ−５）の合成
乾燥トルエン（２００ｍＬ）に溶解したジオールＶ−４（５．８３ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）およびｎ−Ｂｕ２ＳｎＯ（４．２１ｇ、１７．０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液を還流加熱して水を共沸除去した（１時間）。溶液をｎ−Ｂｕ４ＮＩ（７．９５ｇ、２１．６ｍｍｏｌ）およびｐ−メトキシベンジルクロライド（２．９ｇ、２１．６ｍｍｏｌ）で処理し、さらに還流加熱した（４時間）。部分濃縮した後、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）に溶解し、水および塩水で洗浄し、乾燥した。有機抽出物を濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、２：３）を行ったところ、３−Ｏ−ｐ−メトキシ誘導体Ｖ−５の白色固体が得られた（４．７ｇ、６２％）。
Mp 139-141°C; [α] +34.8 (c = 0.6, CH2Cl2); Rf 0.56 (EtOAc/hexanes, 1:1); (Found: C 70.03, H 7.79%. C29H38O7requires C 69.86, H 7.68%). 1H NMR (500 MHz): δH 7.55-7.51 (2H, m, Ph), 7.38-7.30 (5H, m, Ph), 6.89-6.85 (2H, m, Ph), 5.86-5.76 (1H, m, CH=CH2), 5.47 (1H, s, PhCH), 5.03-4.91 (2H, m, CH=CH2), 4.71, 4.69 (2H, AB, J 12.0, PhCH2), 4.33-4.27 (2H, m, H1, H6), 4.11 (1H, d, J3,43.5, H4), 4.06-3.91 (3H, m, H2, H6, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.80 (3H, s, CH3O), 3.54-3.45 (2H, m, H3, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.36-3.33 (1H, m, H5), 2.45 (1H, d, J 1.65, OH), 2.08-2.01 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.70-1.61 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.44-1.30 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O); 13C NMR (125.7 MHz): δC 159.3 (Ph), 139.0 (C*H=CH2), 137.8 (Ph), 130.2 (Ph), 129.5 (Ph), 128.8 (Ph), 128.0 (Ph), 126.4 (Ph), 114.2 (CH=C*H2), 113.8 (Ph), 102.9 (C1), 101.1 (PhCH), 78.8 (C3), 73.2 (C4), 71.1 (PhC*H2), 70.0 (C2), 69.7, 69.3 (C6, CH=CH2(CH2)5C*H2O), 66.7 (C5), 55.2 (CH3O), 33.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.4 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.9 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 25.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O). ESI MS: m/z calcd [C29H38O7]Na+: 521.2518. Found: 521.2510.
７−オクテン−１−イル ２−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−［（４−メトキシフェニル）メチル］-β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｖ−６）の合成
乾燥ＤＭＦ（７５ｍＬ）に溶解したアルコールＶ−５（５．５ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液を冷却し（−２０℃）、ＢｎＢｒ（２．１０ｍＬ、１７．６ｍｍｏｌ）およびＮａＨ（６０％、５７２ｍｇ、１４．３ｍｍｏｌ）で処理し、静置して加温した（室温、１時間）。混合液をＣＨ３ＯＨ（１ｍＬ）で処理し、部分的に濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）に溶解し、水および塩水で洗浄した。有機抽出物を乾燥・濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、２：３）を行ったところ、ベンジルエーテルＶ−６の白色固体が得られた（５．８３ｇ、８９％）。
Mp 99-103 °C; [α] +42.7 (c = 0.5, CH2Cl2); Rf 0.74 (EtOAc/hexanes, 1:1); (Found: C 73.47, H 7.54%. C29H38O7requires C 73.44, H 7.53%); 1H NMR (500 MHz): δH 7.60-7.54 (2H, m, Ph), 7.41-7.26 (10H, m, Ph), 6.88-6.82 (2H, m, Ph), 5.86-5.76 (1H, m, CH=CH2), 5.50 (1H, s, PhCH), 5.02-4.92 (3H, m, PhCH2, CH=CH2), 4.78 (1H, A of AB, J 10.8, PhCH2), 4.73, 4.69 (2H, AB, J 11.9, PhCH2), 4.38 (1H, d, J1,2 7.8, H1), 4.31 (1H, dd, J6,6 12.2, J5,61.3, H6), 4.08 (1H, d, J3,4 3.7, H4), 4.05-3.96 (2H, m, H6, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.85-3.80 (4H, m, H2, CH3O), 3.54 (1H, dd, J2,3 9.7, J3,4 3.7, H3), 3.53-3.48 (1H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.31 (1H, s, H5), 2.09-1.98 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.73-1.60 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.49-1.27 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O); 13C NMR (125.7 MHz): δC 159.2 (Ph), 139.1 (C*H=CH2), 139.0 (Ph), 137.9 (Ph), 130.5 (Ph), 129.3 (Ph), 128.9 (Ph), 128.2 (Ph), 128.1 (Ph), 128.0 (Ph), 127.5 (Ph), 126.5 (Ph), 114.2 (CH=C*H2), 113.7 (Ph), 103.7 (C1), 101.3 (PhC*H), 78.8, 78.5 (C2, C3), 74.1 (C4), 75.2 (PhC*H2), 71.7 (PhC*H2), 69.9, 69.3 (C6, CH=CH2(CH2)5C*H2O), 66.42 (C5), 55.27 (CH3O), 33.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 26.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O). ESI MS: m/z calcd [C36H44O7]Na+: 611.2979. Found: 611.2977.
７−オクテン−１−イル ２−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｖ−７）の合成
ＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ（１９：１、１００ｍＬ）に溶解したＶ−６（５．６０ｇ、９．５２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液を２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−ｐ−ベンゾキノン（２．５９ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）で処理し、攪拌した（２時間）。混合液をＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（３００ｍＬ）で２回洗浄した。乾燥・濃縮後、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：１）を行ったところ、アルコールＶ−７の白色非晶質固体が得られた（４．２２ｇ、９５％）。
[α] +9.0 (c = 0.6, CH2Cl2); Rf 0.48 (EtOAc/hexanes, 1:1); 1H NMR (500 MHz): δH 7.55-7.50 (2H, m, Ph), 7.42-7.26 (8H, m, Ph), 5.86-5.76 (1H, m, CH=CH2), 5.56 (1H, s, PhCH), 5.03-4.92 (3H, m, PhCH2, CH=CH2), 4.73 (1H, A of AB, J 11.3, PhCH2), 4.40 (1H, d, J1,2 7.7, H1), 4.34 (1H, dd, J6,6 12.4, J5,6 1.5, H6), 4.41 (1H, dd, J6,6 12.4, J5,6 1.9, H6), 4.22 (1H, dd, J3,43.8, J4,5 0.9, H4), 4.01 (1H, ddd, J 9.4, 6.5, 6.5, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.74 (1H, ddd, J2,3 9.6, J 7.3, J3,4 3.8, H3), 3.63 (1H, dd, J2,3 9.6, J1,2 7.7, H2), 3.52 (1H, ddd, J 9.4, 6.9, 6.9, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.43-3.44 (1H, m, H5), 2.53 (1H, d, J 7.3, OH), 2.08-2.01 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.61-1.73 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.49-1.30 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O). 13C NMR (125.7 MHz): δC 139.0 (C*H=CH2), 138.6 (Ph), 137.6 (Ph), 129.1 (Ph), 128.3 (Ph), 128.2 (Ph), 127.9 (Ph), 127.6 (Ph), 126.5 (Ph), 114.2 (CH=C*H2), 103.6 (C1), 101.4 (PhC*H), 79.3 (C2), 75.6 (C4), 74.8 (PhC*H2), 72.5 (C3), 70.0, 69.2 (C6, CH=CH2(CH2)5C*H2O), 66.5 (C5), 33.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.9 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 26.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O). ESI MS: m/z calcd [C28H36O6]Na+: 491.2404. Found: 491.2402.
７−オクテン−１−イル ２−Ｏ−ベンジル−３−Ｏ−（４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｖ−１０）の合成
アクセプターＶ−７（３．５９ｇ、７．６７ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２溶液（５０ｍＬ）を４Å分子ふるい（３ｇ）と攪拌した（室温、１時間）。この溶液を冷却し（−４０℃）、ＢＦ３・ＯＥｔ２（０．５ｍＬ）で処理した後、トリクロロアセトイミダート（Figueroa-Perez, S., Verez-Bencomo, V. Carbohydr. Res. 1999, 317:29-38）Ｖ−８（７．７ｇ、１５．３４ｍｍｏｌ）を滴下した。その後、混合液を静置して加温した（０℃）。混合液をＥｔ３Ｎ（２ｍＬ）で中和した後、濃縮を行い、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：１）を行ったところ、無色オイルが得られ、次ステップで直ちに使用した。この無色オイルをＣＨ３ＯＨ（１００ｍＬ）に溶解し、ＮａＯＣＨ３のＣＨ３ＯＨ溶液で処理し、攪拌した（室温、３時間）。アンバーライトＩＲ１２０（Ｈ＋）で中和した後、ろ過を行い、次いでフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、７：３）を行ったところ、ジオールＶ−１０の無色オイルが得られた（３．２４ｇ、５９％）。
[α] +14.0 (c = 0.4, CH2Cl2); Rf 0.44 (EtOAc/hexanes, 7:3); 1H NMR (500 MHz): δH 7.60-7.23 (15H, m, Ph), 5.87-5.76 (1H, m, CH2=CH), 5.56 (1H, s, PhC*H), 5.51 (1H, s, PhC*H), 5.04-4.92 (3H, m, PhCH2, CH2=CH), 4.70 (1H, A of AB, J 10.4, PhCH2), 4.69 (1H, d, J1´,2´ 8.3, H1´), 4.41 (1H, d, J1,27.1, H1), 4.35 (1H, d, J3,4 2.8, H4), 4.31 (1H, dd, J6,612.3, J5,6 1.2, H6), 4.26 (1H, dd, J6´,6´ 12.4, J5´,6´ 1.1, H6´), 4.11 (1H, d, J3´,4´ 3.7, H4´), 4.08-4.00 (3H, m, H6, H6´, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.92-3.85 (2H, m, H2, H3), 3.78 (1H, dd, J2´,3´ 8.5, J1´,2´ 8.3, H2´), 3.63-3.57 (1H, m, H3´), 3.54 (1H, ddd, J 9.4, 6.9, 6.9, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.39 (1H, s, H5), 3.31 (1H, s, H5´), 2.87 (1H, s, OH), 2.59 (1H, d, J 8.3, OH), 2.08-2.01 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.77-1.61 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.50-1.30 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O); 13C NMR (125 MHz): δC 139.0 (CH2=C*H), 138.3 (Ph), 138.0 (Ph), 137.6 (Ph), 129.2 (Ph), 128.9 (Ph), 128.7 (Ph), 128.4 (Ph), 128.3 (Ph), 128.1 (Ph), 127.9 (Ph), 126.7 (Ph), 126.3 (Ph), 114.3 (C*H2=CH), 103.9 (PhC*H), 103.7 (PhC*H), 101.3, 101.2 (C1, C1´), 78.4, 77.4 (C2, C3), 76.4 (C4), 75.1 (PhC*H2), 75.3, 72.5, 71.8 (C2´, C3´, C4´), 70.1 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 69.2, 69.1 (C6, C6´), 66.6, 66.5 (C5, C5´), 33.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.9 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 26.1 (CH=CH2(C*H2)5CH2O). ESI MS: m/z calcd [C41H50O11]Na+: 741.3245. Found: 741.3245.
７−オクテン−１−イル ２−Ｏ−ベンジル−３−Ｏ−（４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−ピバロイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｖ−１１）の合成
ジオールＶ−１０（２．７ｇ、３．７６ｍｍｏｌ）のピリジン溶液（２５ｍＬ）をトリメチルアセタールクロリド（０．６９ｍＬ、５．６４ｍｍｏｌ）で処理した後、攪拌した。反応を完全に終了させるために、トリメチルアセタールクロリド（０．６９ｍＬ、５．６４ｍｍｏｌを更に添加する必要があった。この溶液を濃縮して、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：１）を行ったところ、白色固体のアルコールＶ−１１が得られた（２．５５ｇ、８５％）。
[α] +62.7 (c = 2.2, CH2Cl2); Rf 0.59 (EtOAc/hexanes, 3:2); 1H NMR (500 MHz): δH 7.57-7.28 (15H, m, Ph), 5.85-5.76 (1H, m, CH2=CH), 5.56 (1H, s, PhCH), 5.50 (1H, s, PhCH), 5.03-4.92 (3H, m, CH2=CH, PhCH2), 4.82 (1H, d, J1´,2´ 7.8, H1´), 4.79 (1H, dd, J2´,3´ 10.2, J3´,4´ 3.8, H3´), 4.68 (1H, A of AB, J 10.0, PhCH2), 4.40 (1H, d, J1,27.5, H1), 4.35-4.25 (4H, m, H4, H4´, H6, H6´), 4.07-3.99 (4H, m, H2´, H6, H6´, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.92 (1H, dd, J2,3 9.9, J3,4 3.4, H3), 3.87 (1H, dd, J2,39.9, J1,2 7.5, H2), 3.52 (1H, ddd, J 9.2, 7.0, 7.0, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.40-3.37 (2H, m, H5, H5´), 2.69 (1H, s, OH), 2.08-2.01 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.74-1.62 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.48-1.31 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.24 (9H, s, (CH3)3C); 13C NMR (100 MHz): δC 178.4 (C=O), 139.0 (CH2=C*H), 138.2 (Ph), 137.9 (Ph), 137.8 (Ph), 128.9 (Ph), 128.8 (Ph), 128.7 (Ph), 128.5 (Ph), 128.1 (Ph), 128.0 (Ph), 127.9 (Ph), 126.6 (Ph), 125.9 (Ph), 114.2 (C*H2=CH), 103.9 (PhC*H), 103.6 (PhC*H), 101.2 (C1´), 100.4 (C1), 78.5 (C3), 76.2 (C2), 75.1 (PhC*H2), 73.3, 73.2 (3C, C3´, C4, C4´), 70.1 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 69.09, 69.07 (C6, C6´), 68.9 (C2´), 66.5 (2C, C5, C5´), 39.0 ((CH3)3C*), 33.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 27.1 ((C*H3)3C), 26.1 (CH=CH2(C*H2)5CH2O). ESI MS: m/z calcd [C46H58O12]Na+: 825.3820. Found: 825.3830.
７−オクテン−１−イル ２−Ｏ−ベンジル−３−Ｏ−［４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−Ｏ−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−フコピラノシル）−３−Ｏ−ピバロイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル］−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｖ−１３）の合成
アルコールＶ−１１（１．７４ｇ、２．１６ｍｍｏｌ）の乾燥ＥｔＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（９：１、５０ｍＬ）溶液を４Å分子ふるい（１ｇ）で処理し、混合した（室温、１時間）。混合液を冷却し（−１０℃）、ＴＭＳＯＴｆ（１００μＬ）で処理した後、トリクロロアセトイミダート（Schmidt, R.R., Toepfer, A. J. Carb. Chem. 1993, 12:809-822）Ｖ−１２（３．６５ｇ、６．５０ｍｍｏｌ）の乾燥Ｅｔ２Ｏ溶液（１５ｍＬ）を滴下した。混合液をＥｔ３Ｎ（０．５ｍＬ）で処理した後、ろ過を行い、次いでフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：３）を行ったところ、トリサッカリドＶ−１３の無色オイルが得られた（２．６０ｍｇ、９８％）。
[α] -62.7 (c = 0.3, CH2Cl2); Rf 0.17 (EtOAc/hexanes, 1:1); 1H NMR (500 MHz): δH 7.53-7.44 (6H, m, Ph), 7.39-7.13 (24H, m, Ph), 5.87-5.76 (1H, m, CH2=CH), 5.51 (1H, s, PhCH), 5.44 (1H, s, PhCH), 5.46 (1H, d, J1´´,2´´ 3.5, H1´´), 5.13 (1H, d, J1´,2´ 8.0, H1´), 5.03-4.92 (2H, m, CH2=CH), 4.89 (1H, dd, J2´,3´ 9.8, J3´,4´ 3.8, H3´), 4.82 (1H, A of AB, J 9.6, PhCH2), 4.79 (1H, A of AB, J 12.0, PhCH2), 4.74 (1H, A of AB, J 11.7, PhCH2), 4.63-4.54 (4H, m, PhCH2), 4.43 (1H, d, J1,2 7.7, H1), 4.36-4.24 (7H, m, H2´, H4, H4´, H5´´, H6, H6´, PhCH2), 4.12-3.94 (6H, m, H2´´, H3, H3´´, H6, H6´, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.79 (1H, dd, J2,3 9.9, J1,2 7.7, H2), 3.57 (1H, ddd, J 9.4, 7.0, 7.0, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.38 (1H, s, H5), 3.23 (1H, s, H5´), 3.20 (1H, d, J 1.3, H4´´), 2.11-2.02 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.80-1.69 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.54-1.34 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.13 (9H, s, (CH3)3C), 0.54 (3H, d, J5´´,6´´ 6.4, H6´´); 13C NMR (100 MHz): δC 178.0 (C=O), 139.1 (Ph), 139.0 (CH2=C*H), 138.9 (Ph), 138.5 (Ph), 137.9 (Ph), 137.6 (Ph), 129.3 (Ph), 129.1 (Ph), 128.8 (Ph), 128.6 (Ph), 128.3 (Ph), 128.21 (Ph), 128.16 (Ph), 128.1 (2C, Ph), 128.0 (Ph), 127.9 (Ph), 127.4 (Ph), 127.34 (Ph), 127.30 (Ph), 127.2 (Ph), 127.14 (Ph), 127.08 (Ph), 127.0 (Ph), 125.9 (Ph), 114.3 (C*H2=CH), 103.8 (C1), 101.9, 101.3, 100.4 (3C, C1´, PhC*H), 96.4 (C1´´), 79.9 (C2), 79.3 (C3), 78.6 (C4´´), 76.7, 76.4, 76.1, 74.3, 73.1 (C2´´, C3´, C3´´, C4, C4´), 75.3 (PhC*H2), 75.0 (PhC*H2), 73.0 (PhC*H2), 72.6 (PhC*H2), 70.2 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 69.03, 68.97 (C6, C6´), 68.9 (C5´´), 66.52, 66.5, 66.3 (C2´, C5, C5´), 38.9 ((CH3)3C*), 33.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.9 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 27.1 ((C*H3)3C), 26.3 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 15.89 (C6´´). ESI MS: m/z calcd [C73H86O16]Na+: 1241.5808. Found: 1241.5808.
７−オクテン−１−イル ２−Ｏ−ベンジル−３−Ｏ−［４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−Ｏ−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−フコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル］−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｖ−１４）の合成
ＣＨ３ＯＨ（１５０ｍＬ）に溶解したＶ−１３（３．２１ｇ、２．６２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液を触媒ＬｉＯＣＨ３（２００ｍｇ）で処理し、加熱還流した（５日）。溶液を冷却し、アンバーライトＩＲ１２０（Ｈ＋）で中和した後、ろ過を行った。次いでフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：３）を行ったところ、第１の未反応Ｖ−１３（３５０ｍｇ、１１％）が得られた。さらに溶出（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：２）したところ、アルコールＶ−１４の無色オイルが得られた（１．７２ｇ、５８％）。
[α] -50.3 (c = 0.4, CH2Cl2); Rf 0.77 (EtOAc/hexanes, 1:1); 1H NMR (500 MHz): δH 7.56-7.47 (6H, m, Ph), 7.40-7.18 (24H, m, Ph), 5.88-5.78 (1H, m, CH2=CH), 5.58 (1H, d, J1´´,2´´ 3.55, H1´´), 5.55 (1H, s, PhCH), 5.53 (1H, s, PhCH), 5.05-4.94 (3H, m, H1´, CH2=CH), 4.82, 4.76 (2H, AB, J 11.5, PhCH2), 4.90, 4.64 (2H, AB, J 9.6, PhCH2), 4.61, 4.53 (2H, AB, J 12.0, PhCH2), 4.85, 4.45 (2H, AB, J 11.6, PhCH2), 4.42 (1H, d, J1,27.8, H1), 4.31 (1H, d, J3,4 3.4, H4), 4.34-4.18 (3H, m, H5´´, H6, H6´), 4.11 (1H, d, J3´,4´ 3.8, H4´), 4.10-3.97 (6H, m, H2´´, H3, H3´´, H6, H6´, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.93 (1H, dd, J2´,3´ 8.4, J1´,2´ 8.2, H2´), 3.83 (1H, dd, J2,39.7, J1,2 7.8, H2), 3.78-3.73 (1H, m, H3´), 3.55 (1H, ddd, J 9.1, 6.9, 6.9, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.39 (1H, s, H5), 3.33 (1H, d, J 1.8, H4´´), 3.29 (1H, d, J 7.5, OH), 3.24 (1H, s, H5´), 2.13-2.03 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.80-1.67 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.55-1.32 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 0.70 (3H, d, J5´´,6´´ 6.4, H6´´); 13C NMR (100 MHz): δC 139.03 (CH2=C*H), 138.9 (Ph), 138.5 (Ph), 138.3 (Ph), 137.6 (Ph), 129.1 (Ph), 129.0 (Ph), 128.8 (Ph), 128.4 (Ph), 128.32 (Ph), 128.25 (Ph), 128.22 (Ph), 128.17 (Ph), 128.12 (2C, Ph), 128.09 (Ph), 128.0 (2C, Ph), 127.8 (Ph), 127.41 (Ph), 127.40 (Ph), 127.34 (Ph), 127.29 (Ph), 126.9 (Ph), 126.4 (Ph), 114.3 (C*H2=CH), 103.9 (C1), 101.5, 101.4, 101.2 (3C, C1´, PhC*H), 97.8 (C1´´), 79.8, 79.5 (C2, C3), 78.3 (C4´´), 76.7, 76.2, 75.9, 75.2, 74.8, 74.4 (C2´, C2´´, C3´, C3´´, C4, C4´), 75.0 (PhC*H2), 74.8 (PhC*H2), 73.0 (PhC*H2), 72.8 (PhC*H2), 70.1 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 69.1, 69.0 (C6, C6´), 66.8, 66.64, 66.61 (C5, C5´, C5´´), 33.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.9 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 26.2 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 16.14 (C6´´). ESI MS: m/z calcd [C68H78O15]Na+: 1157.5233. Found: 1157.5237.
７−オクテン−１−イル ３−Ｏ−［３−Ｏ−（２−Ｎ−アセチル−２−デオキシ−３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−Ｏ−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−フコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル］−２−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｖ−１６）の合成
アクセプターＶ−１４（３５９ｍｇ、０．２９２ｍｍｏｌ）の乾燥Ｅｔ２Ｏ溶液（１５ｍＬ）を４Å分子ふるい（３００ｍｇ）で処理し、攪拌した（室温、１時間）。混合液を冷却し（−１０℃）、ＴＭＳＯＴｆ（１０μＬ、０．０５８ｍｍｏｌ）で処理した後、トリクロロアセトイミダート（Gerhard, G., Schmidt, R.R. Liebigs Ann., 1984, 1826-1847）Ｖ−１５（４５７ｍｇ、０．９６５ｍｍｏｌ）の乾燥Ｅｔ２Ｏ溶液（１５ｍＬ）を滴下した。その後、混合液を静置した（２０分）。混合液をＥｔ３Ｎ（０．５ｍＬ）で中和した後、ろ過および濃縮を行い、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：３）を行ったところ、部分的に精製されたテトラサッカリドの無色オイルが得られた（２７０ｍｇ、６５％）。残渣をピリジン（４ｍＬ）に溶解し、ＡｃＳＨ（２ｍＬ）で処理した後、攪拌した（３日）。濃縮後フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、２０：１）したところ、Ｖ−１６の無色オイルが得られた（２０５ｍｇ、７８％）。
[α] +11.7 (c = 0.6, CH2Cl2); Rf 0.38 (EtOAc/hexanes, 3:1); 1H NMR (500 MHz): δH 7.59-7.11 (30H, m, Ph), 5.89-5.77 (1H, m, CH2=CH), 5.57 (1H, d, JNH 10.8 NH), 5.51 (1H, d, J1´´,2´´ 3.7, H1´´), 5.55 (1H, s, PhCH), 5.44 (1H, s, PhCH), 5.13-5.08 (2H, m, H1´´´, PhCH2), 5.07-5.02 (3H, m, H1´, H4´´´, CH=CH2), 4.92-5.01 (3H, m, H3´´´, PhCH2, CH=CH2), 4.90, 4.89 (2H, AB, J 10.0, PhCH2), 4.79 (1H, A of AB, J 11.4, PhCH2), 4.78 (1H, A of AB, J 12.2, PhCH2), 4.64 (1H, ddd, JNH 10.8, J2´´´,3´´´ 10.6, J1´´´,2´´´ 3.6, H2´´´), 4.52 (1H, A of AB, J 11.8, PhCH2), 4.45 (1H, d, J1,2 7.8, H1), 4.44-4.39 (2H, m, H5´´, PhCH2), 4.35-4.22 (5H, m, H3´, H4, H4´, H6, H6´), 4.18 (1H, dd, J2´´,3´´ 10.2, J1´´,2´´ 3.7, H2´´), 4.13-4.01 (6H, m, H3, H3´´, H5´´´, H6, H6´, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.87-3.81 (2H, m, H2, H2´), 3.71 (1H, dd, J6´´´,6´´´ 11.5, J5´´´,6´´´ 7.8, H6´´´), 3.57 (1H, ddd, J 9.1, 7.0, 7.0, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.32 (1H, s, H4´´), 3.40, 3.27 (2H, 2 × s, H5, H5´), 3.10 (1H, dd, J6´´´,6´´´ 11.5, J5´´´,6´´´ 2.6, H6´´´), 2.09, 1.97, 1.78, 1.57 (12H, 4 × s, CH3C=O), 2.12-2.04 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.80-1.67 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.53-1.35 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 0.56 (3H, d, J5´´,6´´ 6.2, H6´´); 13C NMR (100 MHz): δC 170.7 (C=O), 170.3 (C=O), 170.1 (C=O), 170.0 (C=O), 139.3 (Ph), 139.0 (CH2=C*H), 138.9 (Ph), 138.41 (2C, Ph), 138.39 (Ph), 137.4 (Ph), 129.4 (Ph), 129.2 (Ph), 128.72 (Ph), 128.71 (Ph), 128.33 (Ph), 128.30 (Ph), 128.26 (Ph), 128.23 (Ph), 128.17 (2C, Ph), 128.0 (Ph), 127.9 (Ph), 127.44 (Ph), 127.38 (Ph), 127.2 (Ph), 127.1 (Ph), 126.9 (Ph), 126.0 (Ph), 114.3 (C*H2=CH), 103.8 (C1), 102.0, 101.6, 100.7 (C1´, PhC*H), 98.1 (C1´´), 92.1 (C1´´´), 80.2, 79.8 (C2, C3), 78.2 (C4´´), 75.3 (PhC*H2), 75.0 (PhC*H2), 74.1 (PhC*H2), 72.2 (PhC*H2), 76.3, 76.1, 76.0, 75.0, 70.7, 69.9 (C2´, C2´´, C3´, C3´´, C4, C4´), 70.3 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 69.2, 69.0 (C6, C6´), 68.9 (C3´´´), 67.6 (C4´´´), 67.3 (C5´´), 66.9 (C5´´´), 66.5, 66.2 (C5, C5´), 62.5 (C6´´´), 46.4 (C2´´´), 33.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.9 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 26.2 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 22.8 (C*H3C=O), 20.74 (C*H3C=O), 20.71 (C*H3C=O), 20.66 (C*H3C=O), 15.91 (C6´´). ESI MS: m/z calcd [C82H97NO23]Na+: 1486.6344. Found: 1486.6348.
７−オクテン−１−イル ３−Ｏ−［３−Ｏ−（２−Ｎ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−Ｏ−（α−Ｌ−フコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル］−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｖ−１７）の合成
ＣＨ３ＯＨ（２５ｍＬ）に溶解したＶ−１３（１８６ｍｇ、０．１５４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液を触媒量のＮａＯＣＨ３を含むＣＨ３ＯＨ溶液で処理し、攪拌した（２時間）。溶液をアンバーライトＩＲ１２０（Ｈ＋）で中和した後、ろ過を行った。次いで残渣をフラッシュクロマトグラフィー（イヤトロビーズ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、９：１）を行ったところ、トリオールの無色オイルが得られた（３５０ｍｇ、１１％）。−７８℃に冷却したフラスコ内に再蒸留液体アンモニア（２０ｍＬ）を投入し、青色が持続するまでナトリウムで処理した。
テトラサッカリドトリオール（１６０ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４ｍＬ）およびＣＨ３ＯＨ（２９μＬ、０．１２０ｍｍｏｌ）溶液を滴下して、攪拌した（−７８℃、１時間）。ＣＨ３ＯＨ（４ｍＬ）を添加して反応停止し、次いでアンモニアを蒸発乾燥させた。この溶液をＣＨ３ＯＨ（１００ｍＬ）に溶解し、アンバーライトＩＲ１２０（Ｈ＋）で中和した後、ろ過を行い、次いで残渣のＣ−１８クロマトグラフィー（ＣＨ３ＯＨ／Ｈ２Ｏ、１：１）を行ったところ、完全に脱保護されたテトラサッカリドＶ−１７の無色オイルが得られた（８５ｍｇ、９０％）。
[α] +24.4 (c = 0.3, CH3OH); 1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 5.85-5.75 (1H, m, CH2=CH), 5.30 (1H, d, J1´´,2´´ 3.8, H1´´), 5.16 (1H, d, J1´´´,2´´´ 3.7, H1´´´), 5.01-4.93 (1H, m, CH=CH2), 4.93-4.88 (1H, m, CH=CH2), 4.67 (1H, d, J1´,2´ 7.7, H1´), 4.65 (1H, q, J5´´,6´´6.5, H5´´), 4.22 (1H, d, J1,2 6.9, H1), 4.01 (1H, dd, J2´,3´ 9,7, J1´,2´ 7.7, H2´), 4.34-4.30, 4.20-4.09, 3.95-3.80, 3.63-3.47 (22H, 4 × m, H2, H2´´, H2´´´, H3, H3´, H3´´, H3´´´, H4, H4´, H4´´, H4´´´, H5, H5´, H5´´´, H6, H6´, H6´´´, CH=CH2(CH2)5CH2O), 2.01 (3H, s, CH3C=O), 2.09-2.00 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.69-1.58 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.45-1.26 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.22 (3H, d, J5´´,6´´ 6.5, H6´´); 13C NMR (125 MHz , CD3OD): δC 174.4 (C=O), 140.1 (CH2=C*H), 114.8 (C*H2=CH), 105.02, 104.96 (C1, C1´), 100.2 (C1´´), 93.7 (C1´´´), 84.2, 77.8, 76.3, 76.2, 74.0, 73..8, 72.8, 71.7, 71.6, 70.5, 70.33, 70.25, 70.0, 68.1, 64.8 (C2, C2´, C2´´, C3, C3´, C3´´, C3´´´, C4, C4´, C4´´, C4´´´, C5, C5´, C5´´, C5´´´), 70.8 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 63.4, 62.54, 62.51 (C6, C6´, C6´´´), 51.30 (C2´´´), 34.9 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 30.8 (2C, CH=CH2(C*H2)5CH2O), 30.1 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 27.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 22.9 (C*H3C=O), 16.8 (C6´´). ESI MS: m/z calcd [C34H59NO20]Na+: 824.3523. Found: 824.3513.
（実施例３）
７−オクテン−１−イル ２−Ｏ−ベンジル−３−Ｏ−［４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−Ｏ−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−フコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル］−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｖ−１９）の合成
アクセプターＶ−１４（３１０ｍｇ、０．２７３ｍｍｏｌ）の乾燥Ｅｔ２Ｏ溶液（５ｍＬ）を４Å分子ふるいで処理し、攪拌した（室温、１時間）。混合液を冷却し（−１０℃）、ＴＭＳＯＴｆ（１０μＬ、０．０５８ｍｍｏｌ）で処理した後、トリクロロアセトイミダート（Wegmann, B., Schmidt, R.R. J. Carbohydr. Chem., 1987, 6:357-375）Ｖ−１８（７００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）の乾燥Ｅｔ２Ｏ溶液（１０ｍＬ）を滴下した。その後、混合液を静置した（２０分）。混合液をＥｔ３Ｎ（０．５ｍＬ）で中和した後、濃縮を行い、次いでフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）を行ったところ、部分的に精製されたテトラサッカリドＶ−１９の無色オイルが得られた（２７０ｍｇ、６０％）。
７−オクテン−１−イル ３−Ｏ−［２−Ｏ−（α−Ｌ−フコピラノシル）−３−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル］−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｖ−２０）の合成
−７８℃に冷却したフラスコ内に再蒸留液体アンモニア（２０ｍＬ）を投入し、青色が持続するまでナトリウムで処理した。テトラサッカリドＶ−１９（２６０ｍｇ、０．１５７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４ｍＬ）およびＣＨ３ＯＨ（６３μＬ、１．５７ｍｍｏｌ）溶液を滴下して、攪拌した（−７８℃、１時間）。ＣＨ３ＯＨ（４ｍＬ）を添加して反応停止し、次いでアンモニアを蒸発乾燥させた。この溶液をＣＨ３ＯＨ（１００ｍＬ）に溶解し、アンバーライトＩＲ１２０（Ｈ＋）で中和した後、ろ過を行い、次いでクロマトグラフィー（イヤトロビーズ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、１：１）を行ったところ、第１の未反応Ｖ−１９が得られた（１０４ｍｇ、４０％）。さらに溶出（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、１：２）したところ、完全に脱保護された化合物Ｖ−２０が得られた（６０ｍｇ、５０％）。
[α] +7.2 (c = 0.2, CH3OH);
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 5.85-5.75 (1H, m, CH2=CH), 5.29 (1H, d, J1´´,2´´ 3.8, H1´´), 5.16 (1H, d, J1´´´,2´´´ 3.6, H1´´´), 5.01-4.94 (1H, m, CH=CH2), 4.93-4.88 (1H, m, CH=CH2), 4.67 (1H, d, J1´,2´ 7.5, H1´), 4.61 (1H, q, J5´´,6´´ 6.3, H5´´), 4.23 (1H, d, J1,2 7.0, H1), 4.01 (1H, dd, J2´,3´ 8.1, J1´,2´ 7.5, H2´), 4.19-4.09, 3.97-3.65, 3.64-3.49 (22H, 3 × m, H2, H2´´, H2´´´, H3, H3´, H3´´, H3´´´, H4, H4´, H4´´, H4´´´, H5, H5´, H5´´´, H6, H6´, H6´´´, CH=CH2(CH2)5CH2O), 2.08-2.00 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.66-1.57 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.45-1.27 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 0.56 (3H, d, J5´´,6´´ 6.3, H6´´); 13C NMR (125 MHz, CD3OD): δC 140.1 (CH2=C*H), 114.8 (C*H2=CH), 105.04, 104.98 (C1, C1´), 100.3 (C1´´), 96.1 (C1´´´), 84.3, 79.4, 76.3, 76.0, 74.4, 73.8, 73.1, 71.64, 71.61, 71.4, 71.2, 70.32, 70.30, 70.0, 68.0, 66.6 (C2, C2´, C2´´, C2´´´, C3, C3´, C3´´, C3´´´, C4, C4´, C4´´, C4´´´, C5, C5´, C5´´, C5´´´), 70.8 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 63.3, 62.56, 62.54 (C6, C6´, C6´´´), 34.9 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 30.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 30.10 (2C, CH=CH2(C*H2)5CH2O), 27.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 16.7 (C6´´). ESI MS: m/z calcd [C32H56O20]Na+: 783.3257. Found: 783.3258.
（実施例４）
７−オクテン−１−イル ４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＶＩ−４）の合成
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシルトリクロロアセトイミダート（Schmidt, R.R., Josef, M. Angew. Chem., 1980, 92:763）ＶＩ−１（３３．９ｇ、６９ｍｍｏｌ）および７−オクテン−１−オール（１１．０ｇ、８６ｍｍｏｌ）の攪拌溶液を４Å分子ふるい（５ｇ）で処理した（室温、１時間）。混合液を冷却し（−４０℃）、ＴＭＳＯＴｆ（０．５ｍＬ）で処理した後、静置して加温した（室温、１時間）。Ｅｔ３Ｎ（２ｍＬ）を添加して反応を停止させた後、ろ過を行い、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、２：３）を行ったところ、無色のオイルが得られた。このオイルをＣＨ３ＯＨ（２００ｍＬ）に溶解し、触媒量のＮａＯＣＨ３を含むＣＨ３ＯＨ溶液で処理し、攪拌した（室温、２時間）。ＮａＯＣＨ３はアンバーライトＩＲ１２０（Ｈ＋）で中和した後、ろ過を行い、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡ／ヘキサン、５：１）したところ、テトロールＶＩ−３の白色固体が得られ（１１．３ｇ、５７％）、次のステップで直ちに使用した。テトロールＶＩ−３（１１．３ｇ、３８．９ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ溶液（２００ｍＬ）をベンズアルデヒドジメチルアセタール（７．２ｍＬ、４８ｍｍｏｌ）およびｐ−ＴｓＯＨ（３００ｍｇ）で処理し、攪拌した（４０℃、１８時間）。Ｅｔ３Ｎ（１．５ｍＬ）で中和した後、濃縮を行い、次いでフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：１）したところ、ジオールＶＩ−４の白色固体（１４．０ｇ、９５％）が得られた。
Mp 149-151°C; [α] -46.8 (c = 0.3, CH2Cl2); Rf 0.82 (EtOAc/hexanes, 7:10); 1H NMR (500 MHz): δH 7.52-7.48 (2H, m, Ph), 7.41-7.35 (3H, m, Ph), 5.86-5.77 (1H, m, CH=CH2), 5.55 (1H, s, PhCH), 5.03-4.92 (2H, m, CH=CH2), 4.41 (1H, d, J1,2 8.0, H1), 4.35 (1H, dd, J6,6 10.5, J5,64.9, H6), 3.93-3.77 (3H, m, H3, H6, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.61-3.43 (4H, m, H2, H4, H5, CH=CH2(CH2)5CH2O), 2.71 (1H, d, J 2.2, OH), 2.51 (1H, d, J 2.4, OH), 2.10-2.01 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.71-1.59 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.47-1.28 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O); 13C NMR (125 MHz): δC 139.0 (C*H=CH2), 136.9 (Ph), 129.3 (Ph), 128.3 (Ph), 126.3 (Ph), 114.3 (CH=C*H2), 103.1 (C1), 101.9 (PhC*H), 80.6 (C4), 73.2, 70.5, 64.6 (C2, C3, C5), 68.7 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 66.4 (C6), 33.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.5 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.83 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.77 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 25.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O). ESI MS: m/z calcd [C21H30O6]Na+: 401.1935. Found: 401.1934.
７−オクテン−１−イル ４，６−Ｏ−ベンジリデン−２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＶＩ−５）の合成
ＤＭＦ（２００ｍＬ、−２０℃）に溶解したジオールＶＩ−４（１３．０ｇ、３４．４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液をＢｎＢｒ（１２．２ｍＬ、０．１０３ｍｍｏｌ）およびＮａＨ（６０％、３．４４ｇ、８６ｍｍｏｌ）で処理し、攪拌した（室温、６時間）。混合液を冷却し（−２０℃）、ＣＨ３ＯＨ（１０ｍＬ）で処理し、静置した（室温、１０分）。この溶液を濃縮し、ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶解し、水（４００ｍＬ）および塩水（４００ｍＬ）で洗浄した。有機抽出物を乾燥・濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：９）を行ったところ、ジベンジルエーテルＶＩ−５の白色固体が得られた（１８．８ｇ、９８％）。
Mp 49-51°C; [α] -27.8 (c = 1.2, CH2Cl2); Rf 0.56 (EtOAc/hexanes, 1:5); 1H NMR (500 MHz): δH 7.52-7.49 (2H, m, Ph), 7.43-7.26 (13H, m, Ph), 5.86-5.76 (1H, m, CH=CH2), 5.59 (1H, s, PhCH), 5.04-4.91 (4H, m, PhCH2, CH=CH2), 4.83 (1H, A of AB, J 10.9, PhCH2), 4.79 (1H, A of AB, J 11.0, PhCH2), 4.57 (1H, d, J1,2 7.9, H1), 4.37 (1H, dd, J6,6 10.3, J5,65.1, H6), 3.93 (1H, ddd, J 9.4, 6.5, 6.5, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.81 (1H, dd, J6,6 10.3, J5,6 5.1, H6), 3.77 (1H, dd, J2,38.6, J3,4 9.1, H3), 3.71 (1H, dd, J4,5 9.2, J3,4 9.1, H4), 3.58 (1H, ddd, 1H, J 9.4, 6.9, 9.4, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.48 (1H, dd, J2,3 8.6, J1,2 7.9, H2), 3.43 (1H, ddd, J5,69.9, J4,5 9.4, J5,6 5.1, H5), 2.09-2.02 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.72-1.62 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.47-1.31 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O); 13C NMR (125 MHz): δC 139.0 (C*H=CH2), 138.6 (Ph), 138.4 (Ph), 137.4 (Ph), 128.9 (Ph), 128.4 (Ph), 128.32 (Ph), 128.27 (Ph), 128.2 (Ph), 128.0 (Ph), 127.7 (Ph), 127.6 (Ph), 126.0 (Ph), 114.3 (CH=C*H2), 104.2 (C1), 101.1 (PhC*H), 82.2, 81.5, 90.9 (C2, C3, C4), 75.3 (PhC*H2), 75.1 (PhC*H2), 70.6 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 68.8 (C6), 66.0 (C5), 33.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.9 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 26.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O). ESI MS: m/z calcd [C35H42O6]Na+: 581.2874. Found: 581.2876.
７−オクテン−１−イル ２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＶＩ−６）の合成
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）に溶解したアルケンＶＩ−５（７．４７ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液を４Å分子ふるい（５ｇ）で処理し、攪拌した（室温、１時間）。次いで、混合液を冷却し（０℃）、トリエチルシラン（１０．７ｍＬ、６６．９ｍｍｏｌ）およびＢＦ３・ＯＥｔ２（３．３ｍＬ、２６．６ｍｍｏｌ）で処理した後、攪拌した（室温、５時間）。混合液をＥｔ３Ｎ（５ｍＬ）で中和し、ＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）で希釈した後、飽和ＮａＨＣＯ３、水、次いで塩水で洗浄した。有機抽出物を濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）を行ったところ、アルコールＶＩ−６の無色オイルが得られた（４．７ｇ ６４％）。
[α] -18.0 (c = 0.3, CH2Cl2); Rf 0.73 (EtOAc/hexanes, 3:7); 1H NMR (500 MHz): δH 7.40-7.26 (15H, m, Ph), 5.87-5.76 (1H, m, CH=CH2), 5.03-4.93 (4H, m, PhCH2, CH=CH2), 4.75 (1H, A of AB, J 11.4, PhCH2), 4.73 (1H, A of AB, J 10.7, PhCH2), 4.62, 4.58 (2H, AB, J 12.3, PhCH2), 4.43 (1H, d, J1,2 7.2, H1), 3.99-3.93 (1H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.79 (1H, dd, J6,6 10.4, J5,6 3.9, H6), 3.72 (1H, dd, J6,610.4, J5,6 5.4, H6), 3.63-3.52 (2H, m, H4, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.50-3.40 (3H, m, H2, H3, H5), 2.54 (1H, d, J 2.1, OH), 2.09-2.01 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.72-1.62 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.47-1.30 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O); 13C NMR (125 MHz): δC 139.0 (C*H=CH2), 138.7 (Ph), 138.5 (Ph), 138.0 (Ph), 128.5 (Ph), 128.40 (Ph), 128.36 (Ph), 128.1 (Ph), 128.0 (Ph), 127.8 (Ph), 127.71 (Ph), 127.69 (2C, Ph), 114.2 (CH=C*H2), 103.7 (C1), 84.1, 81.7 (C2, C3), 75.3 (PhC*H2), 74.7 (PhC*H2), 74.0 (C4), 73.7 (PhC*H2), 71.7 (C5), 70.4, 70.2 (C6, CH=CH2(CH2)5C*H2O), 33.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.9 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 26.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O). ESI MS: m/z calcd [C35H44O6]Na+: 583.3030. Found: 583.3031.
７−オクテン−１−イル ４−Ｏ−（４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＶＩ−８）の合成
アクセプターＶＩ−６（４．０２ｇ、７．１９ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）溶液を４Å分子ふるいと攪拌した（室温、１時間）。この溶液を冷却し（−４０℃）、ＢＦ３・ＯＥｔ２（０．５ｍＬ）で処理した後、トリクロロアセトイミダート（Figueroa-Perez, S., Verez-Bencomo, V. Carbohydr. Res., 1999, 317:29-38）ＶＩ−７（８．９０ｇ、１８．０ｍｍｏｌ）を滴下し、静置して加温した（０℃）。この混合液をＥｔ３Ｎ（２ｍＬ）で中和し、濃縮し、次いでフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：１）を行ったところ、無色のオイルが得られ、次ステップで直ちに使用した。この無色オイルをＣＨ３ＯＨ（８０ｍＬ）に溶解し、ＮａＯＣＨ３のＣＨ３ＯＨ溶液で処理し、攪拌した（室温、３時間）。アンバーライトＩＲ１２０（Ｈ＋）で中和した後、ろ過を行い、次いでフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、７：３）を行ったところ、ジオールＶＩ−８の無色オイルが得られた（５．３ｇ、９１％）。
[α] -3.1 (c = 1.4, CH2Cl2); Rf 0.68 (EtOAc/hexanes, 7:3); 1H NMR (500 MHz): δH 7.50-7.21 (20H, m, Ph), 5.86-5.77 (1H, m, CH2=CH), 5.46 (1H, s, PhCH), 5.03-4.91 (5H, m, PhCH2, CH2=CH), 4.73 (1H, A of AB, J 10.1, PhCH2), 4.74, 4.62 (2H, AB, J 12.3, PhCH2), 4.58 (1H, d, J1´,2´ 8.5, H1´), 4.40 (1H, d, J1,2 8.1, H1), 4.06-3.99 (4H, m, H4, H4´, H6, H6´), 3.95 (1H, ddd, J 9.5, 6.4, 6.4, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.80 (1H, dd, J6,6 11.6, J5,6 1.9, H6), 3.75 (1H, dd, J6´,6´ 12.5, J5´,6´ 1.5, H6´), 3.73-3.68 (2H, m, H3, H5), 3.64 (1H, dd, J2´,3´ 9.0, J1´,2´ 8.5, H2´), 3.54 (1H, ddd, J 9.5, 6.8, 6.8, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.51-3.44 (3H, m, H2, H3´, OH), 2.87 (1H, s, H5´), 2.49 (1H, d, J 7.3, OH), 2.10-2.01 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.74-1.61 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.49-1.29 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O); 13C NMR (125 MHz): δC 139.2 (CH2=C*H), 139.0 (Ph),138.4 (Ph), 137.69 (Ph), 137.67 (Ph), 129.1 (Ph), 128.4 (Ph), 128.3 (Ph), 128.2 (Ph), 128.1 (2C, Ph), 128.0 (Ph), 127.8 (Ph), 127.6 (Ph), 127.2 (2C, Ph), 126.4 (Ph), 114.3 (C*H2=CH), 103.9, 103.5 (C1, C1´), 101.3 (PhC*H), 83.7 (C3), 82.1 (C2), 77.6 (C4), 75.2 (PhC*H2), 75.1, 74.2 (C4´, C5), 74.9 (PhC*H2), 73.5 (PhC*H2), 72.7, 72.5 (C2´, C3´), 70.10 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 68.9, 68.5 (C6, C6´), 66.7 (C5´), 33.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.9 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 26.1 (CH=CH2(C*H2)5CH2O). ESI MS: m/z calcd [C48H58O11]Na+: 833.3871. Found: 833.3872.
７−オクテン−１−イル ４−Ｏ−（４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−ピバロイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＶＩ−９）の合成
ピリジン（２ｍＬ）に溶解したジオールＶＩ−８（５．９３ｇ、３．７２ｍｏｌ）の攪拌溶液をトリメチルアセタールクロリド（１．１６ｍＬ、９．５２ｍｍｏｌ）で処理し、攪拌した。濃縮し、次いでフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：１）を行ったところ、アルコールＶＩ−９の白色固体が得られた（６．２２ｇ、９５％）。
[α] +42.4 (c = 0.5, CH2Cl2); Rf 0.55 (EtOAc/hexanes, 3:2); 1H NMR (500 MHz): δH 7.52-7.18 (20H, m, Ph), 5.86-5.77 (1H, m, CH2=CH), 5.40 (1H, s, PhCH), 5.05-4.90 (5H, m, CH2=CH, PhCH2), 4.73 (1H, A of AB, J 11.9, PhCH2), 4.72 (1H, A of AB, J 10.9, PhCH2), 4.67-4.63 (2H, m, H1´, H3´), 4.59 (1H, A of AB, J 12.4, PhCH2), 4.39 (1H, d, J1,2 7.8, H1), 4.17 (1H, d, J3´,4´ 3.7, H4´), 4.04-3.90 (4H, m, H4, H6, H6´, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.87 (1H, dd, J2´,3´ 9.7, J1´,2´ 7.9, H2´), 3.78 (1H, dd, J6,611.6, J5,6 2.0, H6), 3.73-3.65 (2H, m, H3, H6´), 3.49-3.42, 3.60-3.50 (4H, 2 × m, H2, H5, OH, CH=CH2(CH2)5CH2O), 2.81 (1H, s, H5´), 2.09-2.01 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.72-1.61 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.47-1.31 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.22 (9H, s, (CH3)3C); 13C NMR (125 MHz): δC 178.3 (C=O), 139.2 (Ph), 139.0 (CH2=C*H), 138.4 (Ph), 137.9 (Ph), 137.5 (Ph), 128.6 (Ph), 128.4 (Ph), 128.3 (Ph), 128.2 (Ph), 128.14 (Ph), 128.12 (Ph), 127.92 (Ph), 127.86 (Ph), 127.6 (Ph), 127.1 (Ph), 126.9 (Ph), 126.0 (Ph), 114.3 (C*H2=CH), 103.9 (2C, C1, C1´), 100.4 (PhC*H), 83.9 (C3), 82.2 (C2), 77.7 (C4), 75.1 (PhC*H2), 74.8 (PhC*H2), 74.0, 73.4, 73.1 (C3´, C4´, C5), 73.7 (PhC*H2), 70.1 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 69.5 (C2´), 68.8 (2C, C6, C6´), 66.5 (C5´), 38.7 ((CH3)3C*), 33.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.9 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 27.1 ((C*H3)3C), 26.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O). ESI MS: m/z calcd [C53H66O12]Na+: 917.4446. Found: 917.4449.
７−オクテン−１−イル ４−Ｏ−［４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−Ｏ−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−フコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル］−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＶＩ−１２）の合成
アルコールＶＩ−９（２．９０ｇ、３．２４ｍｍｏｌ）の乾燥Ｅｔ２Ｏ／ＣＨ２Ｃｌ２（９：１、５０ｍＬ）溶液を４Å分子ふるい（２ｇ）で処理し、攪拌した（室温、１時間）。混合液を冷却し（−１０℃）、ＴＭＳＯＴｆ（１００μＬ）で処理した後、トリクロロアセトイミダート（Schmidt, R.R., Toepfer, A. J. Carb. Chem., 1993, 12:809-822）ＶＩ−１０（５．２０ｇ、９．２５ｍｍｏｌ）の乾燥エーテル溶液（１５ｍＬ）を滴下した。混合液をＥｔ３Ｎ（０．５ｍＬ）で処理した後、ろ過を行い、次いでフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：３）を行ったところ、トリサッカリドＶＩ−１１の無色のオイルが得られた（３．３４ｇ、７８％）。このオイルをＣＨ３ＯＨ（１００ｍＬ）に溶解し、触媒ＬｉＯＣＨ３（１５０ｍｇ）で処理し、加熱還流した（５日）。静置して冷却した後、アンバーライトＩＲ１２０（Ｈ＋）で中和した。ろ過した後、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：３）を行ったところ、第１の未反応出発物質が得られた（４８０ｍｇ、１６％）。さらに溶出（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：２）したところ、アルコールＶＩ−１２の無色オイルが得られた（１．９６ｇ、６８％）。
[α] -40.8 (c = 0.4, CH2Cl2); Rf 0.44 (EtOAc/hexanes, 3:2); 1H NMR (500 MHz): δH 7.58-7.09 (35 H, m, Ph), 5.87-5.76 (1H, m, CH2=CH), 5.58 (1H, s, PhC*H), 5.16 (1H, A of AB, J 10.4, PhCH2), 5.05 (1H, d, J1´´,2´´ 3.4, H1´´), 5.03-5.01, 4.97-4.93 (3H, m, PhCH2, CH2=CH), 4.82 (1H, A of AB, J 11.6, PhCH2), 4.81 (1H, A of AB, J 12.1, PhCH2), 4.76-4.70 (4H, m, PhCH2), 4.89, 4.64 (2H, AB, J 10.9, PhCH2), 4.67, 4.43 (2H, AB, J 12.4, PhCH2), 4.42 (1H, d, J1´,2´ 7.9, H1´), 4.35 (1H, d, J6´,6´ 12.4, H6´), 4.34 (1H, d, J1,27.9, H1), 4.14 (1H, d, J3´,4´ 3.6, H4´), 4.07 (1H, dd, J2´´,3´´ 6.8, J1´´,2´´ 3.4, H2´´), 4.09-4.00 (2H, m, H4, H4´´), 3.98 (1H, dd, J6´,6´ 12.4, J5´,6´ 1.5, H6´), 3.97-3.87 (4H, m, H3´´, H5´´, H6, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.81 (1H, dd, J2´,3´ 9.7, J1´,2´ 7.9, H2´), 3.69-3.57 (3H, m, H3´, H6, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.54-3.46 (2H, m, H3, OH), 3.41 (1H, dd, J2,39.1, J1,2 8.0, H2), 3.31-3.26 (1H, m, H5), 3.13 (1H, s, H5´), 2.06-2.01 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.72-1.59 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.47-1.29 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.08 (3H, d, J5´´,6´´ 6.5, H6´´); 13C NMR (125 MHz): δC 139.0 (CH2=C*H), 138.8 (Ph), 138.74 (Ph), 138.69 (Ph), 138.6 (Ph), 138.3 (Ph), 138.1 (Ph), 137.5 (Ph), 129.0 (Ph),128.9 (Ph), 128.6 (Ph), 128.43 (Ph), 128.42 (Ph), 128.32 (2C, Ph), 128.27 (Ph), 128.24 (Ph), 128.19 (Ph), 128.10 (Ph), 128.06 (Ph), 128.0 (Ph), 127.7 (Ph), 127.64 (Ph), 127.60 (Ph), 127.57 (Ph), 127.54 (Ph), 127.43 (Ph), 127.38 (Ph), 126.6 (Ph), 114.2 (C*H2=CH), 103.7 (C1), 101.4, 101.2 (C1´, PhC*H), 99.2 (C1´´), 82.9, 81.7 (C2, C3), 79.0, 78.1, 77.6, 77.3, 76.3 (C2´, C2´´, C3´´, C4, C4´´), 75.8 (C4´), 76.0 (PhC*H2), 75.11 (PhC*H2), 75.07 (C5), 74.8 (PhC*H2), 74.1 (PhC*H2), 73.4 (PhC*H2), 73.0 (PhC*H2), 72.9 (C3´), 70.0 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 69.0, 68.1 (C6, C6´), 67.3, 66.5 (C5´, C5´´), 33.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 26.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 16.8 (C6´´). ESI MS: m/z calcd [C75H86O15]Na+: 1249.5859. Found: 1249.5855.
７−オクテン−１−イル ４−Ｏ−［３−Ｏ−（２−Ｎ−アセチル−２−デオキシ−３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−Ｏ−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−フコピラノシル)−β−Ｄ−ガラクトピラノシル］−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＶＩ−１５）の合成
アクセプターＶＩ−１２（３６５ｍｇ、０．３２１ｍｍｏｌ）の乾燥Ｅｔ２Ｏ溶液（１５ｍＬ）を４Å分子ふるい（２５０ｍｇ）で処理し、攪拌した（室温、１時間）。混合液を冷却し（−１０℃）、ＴＭＳＯＴｆ（１０μＬ、０．０５８ｍｍｏｌ）で処理した後、トリクロロアセトイミダート（Gerhard, G., Schmidt, R.R. Liebigs Ann., 1984, 1826-1847）ＶＩ−１３（４５７ｍｇ、０．９６５ｍｍｏｌ）の乾燥Ｅｔ２Ｏ（１５ｍＬ）溶液を滴下した。その後、混合液を静置した（２０分）。Ｅｔ３Ｎ（１．５ｍＬ）で中和した後、ろ過・濃縮を行った。フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：３）したところ、部分的に精製されたテトラサッカリドＶＩ−１４の無色オイル（３３０ｍｇ、６７％）が得られた。残渣をピリジン（４ｍＬ）に溶解し、ＡｃＳＨ（２ｍＬ）で処理した後、攪拌した（３日）。濃縮後フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、２０：１）したところ、ＶＩ−１５の無色オイルが得られた（２３０ｍｇ、７０％）。
[α] -3.4 (c = 0.3, CH3OH); 1H NMR (500 MHz): δH 7.55-7.12 (35H, m, Ph), 5.87-5.75 (1H, m, CH2=CH), 5.47 (1H, d, J1´´,2´´ 3.9, H1´´), 5.43 (1H, s, PhCH), 5.42 (1H, d, J 9.7, NH), 5.23-5.17 (2H, m, PhCH2), 5.10 (1H, d, J1´´´,2´´´ 3.7, H1´´´), 5.03-4.93 (6H, m, H3´´´, H4´´´, PhCH2, CH=CH2), 4.89 (1H, A of AB, J 10.6, PhCH2), 4.74 (1H, A of AB, J 10.5, PhCH2), 4.74 (1H, A of AB, J 11.8, PhCH2), 4.70-4.57 (7H, m, H1´, H2´´´, PhCH2), 4.40-4.34 (2H, m, H5´´, H6´), 4.35 (1H, d, J1,2 8.0, H1), 4.29 (1H, d, J3´,4´ 3.8, H4´), 4.25 (1H, dd, J2´´,3´´ 10.1, J1´´,2´´ 3.9, H2´´), 4.21 (1H, dd, J2´,3´ 9.6, J1´,2´ 8.1, H2´), 4.12 (1H, dd, J3,4 9.1, J4,5 9.1, H4), 4.14-4.07 (1H, m, H5´´´), 4.02-3.94 (2H, m, H6´, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.90 (1H, dd, J6,6 11.5, J5,6 3.7, H6), 3.86 (1H, dd, J2´´,3´´ 10.1, J3´´,4´´ 2.6, H3´´), 3.84 (1H, dd, J2´,3´ 9.4, J3´,4´ 3.8, H3´), 3.71-3.64 (3H, m, H4´´, H6, H6´´´), 3.59 (1H, ddd, J 9.5, J 6.8, J 6.8, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.50 (1H, dd, J2,3 9.0, J3,4 9.1, H3), 3.49 (1H, dd, J2,39.0, J1,2 8.0, H2), 3.20-3.14 (2H, m, H5, H5´), 3.04 (1H, dd, J6´´´,6´´´ 11.5, J5´´´,6´´´ 3.6, H6´´´), 2.09, 1.97, 1.81, 1.46 (12H, 4 × s, CH3C=O), 2.10-2.01 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.74-1.66 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.48-1.38 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.16 (3H, d, J5´´,6´´ 6.6, H6´´); 13C NMR (125 MHz): δC 170.4 (C=O), 170.3 (C=O), 170.1 (C=O), 170.0 (C=O), 139.4 (Ph), 139.0 (CH2=C*H), 138.6 (Ph), 138.52 (Ph), 138.50 (Ph), 138.4 (Ph), 138.3 (Ph), 137.7 (Ph), 129.1 (Ph), 129.0 (Ph), 128.42 (Ph), 128.36 (Ph), 128.32 (3C, Ph), 128.29 (Ph), 128.25 (Ph), 128.20 (Ph), 128.19 (Ph), 127.8 (Ph), 127.7 (Ph), 127.55 (Ph), 127.53 (Ph), 127.40 (2C, Ph), 127.36 (Ph), 127.3 (Ph), 126.4 (Ph), 126.3 (Ph), 114.3 (C*H2=CH), 103.8 (C1), 101.3, 100.8 (C1´, PhC*H), 98.3 (C1´´), 92.1 (C1´´´), 83.0, 71.7 (C2, C3), 79.9, 77.2, 76.5, 75.8, 75.5, 75.5, 71.3, 70.6 (C2´, C2´´, C3´, C3´´, C4, C4´, C4´´, C5), 76.2 (PhC*H2), 75.3 (PhC*H2), 74.7 (PhC*H2), 7.36 (PhC*H2), 73.4 (PhC*H2), 72.1 (PhC*H2), 70.1 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 69.0, 67.9 (C6, C6´), 68.8, 67.7, 67.4 (C3´´´, C4´´´, C5´´´), 66.7, 66.4 ( C5´, C5´´), 63.0 (C6´´´), 46.5 (C2´´´), 33.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.9 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 26.1 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 22.6 (C*H3C=O), 20.69, (C*H3C=O), 20.66 (C*H3C=O), 20.6 (C*H3C=O), 16.7 (C6´´). ESI MS: m/z calcd [C89H105NO23]Na+: 1578.6970. Found: 1578.6986.
７−オクテン−１−イル ４−Ｏ−［３−Ｏ−（２−Ｎ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−Ｏ−（α−Ｌ−フコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル］−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＶＩ−１６）の合成
テトラサッカリドＶＩ−１５（２４０ｍｇ、０．１５４ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＯＨ溶液（２５ｍＬ）を触媒量のＮａＯＣＨ３を含むＣＨ３ＯＨ溶液で処理し、攪拌した（２時間）。アンバーライトＩＲ１２０（Ｈ＋）で中和した後、ろ過を行い、次いで残渣のフラッシュクロマトグラフィー（イヤトロビーズ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、９：１）を行ったところ、トリオールの無色オイルが得られた（２１０ｍｇ、９５％）。−７８℃に冷却したフラスコ内に再蒸留液体アンモニア（２０ｍＬ）を投入し、青色が持続するまでナトリウムで処理した。 テトラサッカリド（９０ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４ｍＬ）およびＣＨ３ＯＨ（１８μＬ、０．４４ｍｍｏｌ）溶液を滴下して、攪拌した（−７８℃、１時間）。ＣＨ３ＯＨ（４ｍＬ）を添加して反応停止し、次いでアンモニアを蒸発乾燥させた。 この溶液をＣＨ３ＯＨ（１００ｍＬ）に溶解し、アンバーライトＩＲ１２０（Ｈ＋）で中和した後、ろ過を行い、次いで残渣のＣ−１８クロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ、１：１）を行ったところ、完全に脱保護されたテトラサッカリドＶＩ−１６の無色オイルが得られた（４５．０ｍｇ、９０％）。
[α] +17.1 (c = 0.3, CH3OH); 1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 5.87-5.73 (1H, m, CH2=CH), 5.34 (1H, d, J1´´,2´´ 3.9, H1´´), 5.16 (1H, d, J1´´´,2´´´ 3.9, H1´´´), 5.01-4.95 (1H, m, CH=CH2), 4.94-4.89 (1H, m, CH=CH2), 4.52 (1H, d, J1´,2´ 7.8, H1´), 4.35-4.28 (2H, m, H2´´´, H5´´), 4.26 (1H, d, J1,2 7.8, H1), 4.00 (1H, dd, J2´,3´ 9.7, J1´,2´ 7.8, H2´), 4.20-4.15, 4.13-4.09, 3.94-3.61, 3.57-3.50, 3.32-3.23 (21H, 5 × m, H2, H2´´, H3´, H3´´, H3´´´, H4, H4´, H4´´, H4´´´, H5, H5´, H5´´´, H6, H6´, H6´´´, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.46 (1H, d, J2,3 9.1, J3,4 9.1, H3), 2.01 (3H, s, CH3C=O), 2.09-1.98 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.65-1.58 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.44-1.30 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.22 (3H, d, J5´´,6´´ 6.5, H6´´); 13C NMR (125 MHz , CD3OD): δC 174.5 (C=O), 140.1 (CH2=C*H), 114.8 (C*H2=CH), 104.3 (C1), 102.2 (C1´), 100.2 (C1´´), 93.6 (C1´´´), 78.2, 78.0, 77.0, 76.8, 76.5, 74.9, 73.6, 73.5, 72.7, 71.9, 70.6, 70.0, 67.7, 64.9 (C2, C2´, C2´´, C3, C3´, C3´´, C3´´´, C4, C4´, C4´´, C4´´´, C5, C5´, C5´´´), 71.0 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 69.9 (C5´´), 63.4, 62.5, 61.7 (C6, C6´, C6´´´), 51.3 (C2´´´), 34.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 30.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 30.08 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 30.07 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 27.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 22.8 (C*H3C=O), 16.6 (C6´´). ESI MS: m/z calcd [C34H59NO20]Na+: 824.3523. Found: 824.3526.
（実施例５）
７−オクテン−１−イル ４−Ｏ−［４，６−Ｏ−ベンジリデン−３−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−Ｏ−（２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−フコピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル］−２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＶＩ−１８）の合成
アクセプターＶＩ−１２（３２０ｍｇ、０．２６１ｍｍｏｌ）の乾燥Ｅｔ２Ｏ（５ｍＬ）溶液を４Å分子ふるいで処理し、攪拌した（室温、１時間）。混合液を冷却し（−１０℃）、ＴＭＳＯＴｆ（１０μＬ、０．０５８ｍｍｏｌ）で処理した後、トリクロロアセトイミダート（Wegmann, B., Schmidt, R.R. J. Carbohydr. Chem., 1987, 6:357-375）ＶＩ−１７（７００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）の乾燥Ｅｔ２Ｏ（１０ｍＬ）溶液を滴下した。その後、混合液を静置した（２０分）。Ｅｔ３Ｎ（０．５ｍＬ）で中和した後、ろ過・濃縮を行った。フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）したところ、部分的に精製されたテトラサッカリドＶＩ−１８の無色オイル（２７０ｍｇ、６０％）が得られた。
７−オクテン−１−イル ４−Ｏ−［２−Ｏ−（α−Ｌ−フコピラノシル）−３−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル］−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＶＩ−１９）の合成
−７８℃に冷却したフラスコ内に再蒸留液体アンモニア（１０ｍＬ）を投入し、青色が持続するまでナトリウムで処理した。テトラサッカリドＶＩ−１８（１６０ｍｇ、０．０９１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４ｍＬ）およびＣＨ３ＯＨ（４１μＬ、１．０１ｍｍｏｌ）溶液を滴下して、攪拌した（−７８℃、１時間）。ＣＨ３ＯＨ（４ｍＬ）を添加して反応停止し、次いでアンモニアを蒸発乾燥させた。この溶液をＣＨ３ＯＨ（１００ｍＬ）に溶解し、アンバーライトＩＲ１２０（Ｈ＋）で中和した後、ろ過を行い、次いで残渣のＣ−１８クロマトグラフィー（イヤトロビーズ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、１：１）を行ったところ、完全に脱保護された化合物ＶＩ−１９が得られた（５０ｍｇ、７２％）。
[α] -3.0 (c = 1.0, CH3OH); 1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 5.86-5.76 (1H, m, CH2=CH), 5.33 (1H, d, J1´´,2´´ 3.8, H1´´), 5.17 (1H, d, J1´´´,2´´´ 3.7, H1´´´), 5.00-4.95 (1H, m, CH=CH2), 4.93-4.89 (1H, m, CH=CH2), 4.53 (1H, d, J1´,2´ 7.6, H1´), 4.29 (1H, q, J5´´,6´´ 6.6, H5´´), 4.28 (1H, d, J1,2 8.2, H1), 3.47 (1H, dd, J2,39,1, J3,4 9,1, H3), 4.19-4.10, 4.03-3.50, 3.31-3.24 (22H, 3 × m, H2, H2´, H2´´, H2´´´, H3´, H3´´, H3´´´, H4, H4´, H4´´, H4´´´, H5, H5´, H5´´´, H6, H6´, H6´´´, CH=CH2(CH2)5CH2O), 2.09-2.00 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.66-1.57 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.44-1.25 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.20 (3H, d, J5´´,6´´ 6.6, H6´´); 13C NMR (125 MHz, CD3OD): δC 140.1 (CH2=C*H), 114.8 (C*H2=CH), 104.3 (C1´), 102.2 (C1), 100.3 (C1´´), 96.1 (C1´´´), 79.8, 78.3, 77.0, 76.5, 76.4, 74.8, 73.7, 73.6, 73.1, 71.8, 71.4, 71.3, 71.0, 69.9, 67.7, 65.8 (C2, C2´, C2´´, C2´´´, C3, C3´, C3´´, C3´´´, C4, C4´, C4´´, C4´´´, C5, C5´, C5´´, C5´´´), 71.0 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 63.3, 62.5, 61.7 (C6, C6´, C6´´´), 34.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 30.8 (2C, CH=CH2(C*H2)5CH2O), 30.1 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 27.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 16.6 (C6´´). ESI MS: m/z calcd [C32H56O20]Na+: 783.3257. Found: 783.3258.
（実施例６）
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フタリミド−β−Ｄ−グルコピラノシルトリクロロアセトイミダート（Ａ−１）の合成
Schmidtらの方法を用いて合成した。１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲのスペクトルは、Schmidtらのものとよく一致していた(Grundler, G., Schmidt, R.R. Carbohydr. Res., 1985, 135:203-218)。
７−オクテン−１−イル ３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フタリミド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ａ−２）の合成
トリクロロアセトイミダート（Ａ−１）（８．１０ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）および７−オクテン−１−オール（２．２４ｇ、１７．５ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２溶液（４０ｍＬ）を４Å分子ふるいと共に攪拌した（２．５ｇ、３０分）。この混合液を冷却し（−１５℃）、ＢＦ３・ＯＥｔ２（０．５ｍＬ）で処理した後、静置してゆっくり０℃まで加温した。Ｅｔ３Ｎ（１ｍＬ）で処理した後、ろ過・濃縮を行い、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ペトロール、１：１）を行ったところ、オクテニルグリコシドＡ−２の無色オイルが得られた（６．５６ｇ、８５％）。
[α] +17.7 (c = 1.5, CH2Cl2); Rf 0.48 (EtOAc/petrol, 7:3); 1H NMR (500 MHz): δH 7.87-7.81 (2H, m, Ar), 7.75-7.69 (2H, m, Ar), 5.79 (1H, dd, J2,3 10.8, J3,4 9.1, H3), 5.73-5.55 (1H, m, CH=CH2), 5.34 (1H, d, J1,2 8.5, H1), 5.16 (1H, dd, J4,5 10.1, J3,4 9.1, H4), 4.94-4.84 (2H, m, CH=CH2), 4.39-4.26 (2H, m, H2, H6), 4.23-4.01 (1H, m, H6), 3.95-3.79 (2H, m, H5, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.51-3.32 (1H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 2.12 (3H, s, CH3C=O), 2.03 (3H, s, CH3C=O), 1.88 (3H, s, CH3C=O), 1.91-1.76 (m, 2H, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.51-1.25 (m, 2H, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.17-0.93 (m, 6H, CH=CH2(CH2)5CH2O); 13C NMR (125 MHz): δC 170.7 (C=O), 170.2 (C=O), 169.5 (C=O), 138.9 (C*H=CH2), 134.3 (Ph), 131.4 (Ph), 123.6 (Ph), 114.1 (CH=C*H2), 98.2 (C1), 70.8 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 71.8, 70.1, 69.1 (C3, C4, C5), 62.1 (C6), 54.7 (C2), 33.5 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.1 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.61 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.58 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 25.6 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 20.8 (C*H3CO), 20.6 (C*H3CO), 20.5 (C*H3CO). ESI MS: m/z calcd [C28H35NO10]Na+: 568.2153. Found 568.2155.
７−オクテン−１−イル ２−デオキシ−２−フタリミド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ａ−３）の合成
トリアセテートＡ−２（６．３６ｇ、１１．７ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ溶液（８０ｍＬ）を触媒量のＮａＯＭｅを含むＭｅＯＨ溶液で処理し、攪拌した（３０分）。その後、ＮａＯＭｅをアンバーライトＩＲ１２０で中和した後、ろ過した。濃縮後、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ペトロール、９：１）を行ったところ、トリオールＡ−３の白色固体が得られた（３．８９ｇ、８０％）。分析用に少量を再結晶した（ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）。
Mp 127-129°C [α] -15.3 (c = 1.0, CH2Cl2); Rf 0.13 (EtOAc/petrol, 7:3); 1H NMR (500 MHz): δH 7.82-7.76 (2H, m, Ar), 7.72-7.65 (2H, m, Ar), 5.71-5.61 (1H, m, CH=CH2), 5.16 (1H, d, J1,28.5, H1), 4.92-4.83 (2H, m, CH=CH2), 4.57 (1H, d, J 4.65, OH), 4.32-4.23 (1H, m, H3), 4.21 (1H, d, J 6.3, OH), 4.06 (1H, dd, J2,3 10.8, J1,28.5, H2), 3.93-3.83 (2H, m, H6), 3.80-3.64 (2H, m, H4, CH=CH2(CH2)5CH2O), 3.50-3.33 (3H, m, H5, CH=CH2(CH2)5CH2O, OH), 1.87-1.73 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.42-1.24 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.08-0.91 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O); 13C NMR (125 MHz): δC 168.4 (C=O), 139.0 (C*H=CH2), 134.0 (Ph), 131.7 (Ph), 123.4 (Ph), 114.1 (CH=C*H2), 98.4 (C1), 75.5 (C5), 71.6 (C3), 71.3 (C4), 69.9 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 61.7 (C6), 56.8 (C2), 33.5 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.2 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.6 (2C, CH=CH2(C*H2)5CH2O), 25.6 (CH=CH2(C*H2)5CH2O). ESI MS: m/z calcd [C22H29NO7]Na+: 442.1836. Found 442.1838.
７−オクテン−１−イル ３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−Ｎ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ａ−４）の合成
トリオールＡ−３（１２９ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ溶液（０．５ｍＬ）をヒドラジン水和物（１００ｍｇ、２ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ溶液（２ｍＬ）で処理し、還流した（４時間）。濃縮後、残渣をピリジン（２ｍＬ）、Ａｃ２Ｏ（１ｍＬ）およびＤＭＡＰ（５ｍｇ）で処理した。１時間後、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）で処理し、濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃに溶解した。次いで１Ｍ ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、飽和ＮａＨＣＯ３および塩水で洗浄した。有機抽出物を乾燥・濃縮した後、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ペトロール、３：１）を行ったところ、Ａ−４の無色オイルが得られた（１２２ｍｇ、８６％）。
[α] -17.6 (c = 0.4, CH2Cl2); Rf 0.45 (EtOAc/petrol, 3:1); 1H NMR (500 MHz): δH 5.84-5.74 (1H, m, CH=CH2), 5.57 (1H, d, J 8.7, NH), 5.30 (1H, dd, J2,310.6, J3,4 9.6, H3), 5.05 (1H, dd, J3,4 9.6, J4,59.6, H4), 5.00-4.95 (1H, m, CH=CH2), 4.94-4.90 (1H, m, CH=CH2), 4.68 (1H, d, J1,2 8.3, H1), 4.34-4.20 (1H, m, H6), 4.18-4.04 (1H, m, H6), 3.94-3.75 (2H, m, H2, CH=CH2(CH2)5CH2O,), 3.72-3.66 (1H, m, H5), 3.50-3.41 (1H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O,), 2.07 (3H, s, CH3CO), 2.02 (3H, s, CH3CO), 2.01 (3H, s, CH3CO), 1.93 (3H, s, CH3CO), 2.02-1.97 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.63-1.48 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.40-1.20 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O). 13C NMR (125 MHz): δC 170.8 (C=O), 170.7 (C=O), 170.1 (C=O), 169.4 (C=O), 139.0 (C*H=CH2), 114.3 (CH=C*H2), 100.7 (C1), 72.4, 71.8 (C3, C5), 69.9 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 68.8 (C4), 62.2 (C6), 54.9 (C2), 33.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 29.4 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.83 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 28.77 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 25.70 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 23.3 (C*H3CO), 20.73 (C*H3CO), 20.69 (C*H3CO), 20.6 (C*H3CO). ESI MS: m/z calcd [C22H35NO9]Na+: 480.2204. Found 480.2208.
７−オクテン−１−イル ２−Ｎ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ａ−５）の合成
Ａ−４（１０５ｍｇ、２３．０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ溶液（１ｍＬ）を触媒量のＮａＯＭｅを含むＭｅＯＨ溶液で処理し、静置した（１時間）。その後、アンバーライトＩＲ１２０（Ｈ＋）で中和した後、ろ過した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、４：１）を行ったところ、トリオールＡ−５の無色オイルが得られた（７２ｍｇ、９９％）。
[α] -23.7 (c = 0.6, MeOH); Rf 0.12 (CH2Cl2/MeOH, 9:1); 1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 5.87-5.74 (1H, m, CH=CH2), 5.01-4.86 (2H, m, CH=CH2), 4.38 (1H, d, J1,2 8.4, H1), 3.90-3.83 (2H, m, H6, CH=CH2(CH2)5CH2O,), 3.67 (1H, dd, J6,6 11.9, J5,6 5.7, H6), 3.62 (dd, J2,310.3, J1,2 8.4, H2), 3.48-3.41 (2H, m, H3, CH=CH2(CH2)5CH2O,), 3.37-3.27 (1H, m, H4) 3.27-3.21 (1H, m, H5), 1.96 (3H, s, CH3CO), 1.96 (3H, s, CH3CO), 2.07-2.00 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.63-1.44 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.46-1.22 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O). 13C NMR (125 MHz): δC 173.6 (C=O), 140.1 (C*H=CH2), 114.8 (CH=C*H2), 102.8 (C1), 78.0 (C5), 76.1 (C3), 72.2 (C4), 70.6 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 62.8 (C6), 57.5 (C2), 34.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 30.6 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 30.1 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 30.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 27.0 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 23.1 (C*H3CO). ESI MS: m/z calcd [C16H29NO6]Na+: 354.1887. Found 354.1888.
８−（３−（トリメトキシシリル）プロピルチオ）オクタン−１−イル ２−Ｎ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ａ−６）の合成
乾燥ＭｅＯＨ（０．４ｍＬ）に溶解したアルケンＡ−５（３２．０ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）の脱ガス溶液をＭＰＴＭＳ（５６．８ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）、ＤＡＲＯＣＵＲ１１７３（５μＬ）で処理し、波長２５４ｎｍにおいて１２００Ｗ（７５Ｗランプ１６個）で３０分照射した。この溶液を乾燥ＭｅＯＨ（２ｍＬ）で希釈し、ヘキサン（２ｍＬ）で三回洗浄した。次いで濃縮することにより、Ａ−６の若干不安定な無色オイルが得られた（４０ｍｇ、８０％）。
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 4.38 (1H, d, J1,2 8.5, H1), 3.90-3.82 (2H, m, H6, (CH2)7CH2O,), 3.67 (1H, dd, J6,6 11.8, J5,6 5.7, H6), 3.61 (1H, dd, J1,28.5, J2,3 8.5, H2), 3.55 (6H, s, (CH3O)3Si), 3.48-3.41 (2H, m, H3, (CH2)7CH2O,), 3.34-3.28 (1H, m, H4), 3.27-3.22 (1H, m, H5), 2.54-2.46 (4H, m, CH2SCH2(CH2)6CH2O), 1.97 (3H, s, CH3CO), 1.81-1.63 (2H, m, CH2SCH2(CH2)6CH2O), 1.61-1.50 (4H, m, CH2SCH2(CH2)6CH2O, (CH3O)3SiCH2CH2CH2SCH2(CH2)6CH2O), 1.42-1.26 (8H, m, CH2SCH2(CH2)6CH2O), 0.78-0.71 (2H, m, (CH3O)3SiCH2CH2CH2SCH2(CH2)6CH2O) 13C NMR (125 MHz, CD3OD): δC 170.9 (C=O), 100.0 (C1), 75.2, 73.4 (C3, C4), 69.5 (C5), 67.8 (CH2)7C*H2O), 60.1 (C6), 64.7 (C2), 46.1 ((C*H3O)3Si), 33.0 (CH2) 30.0 (CH2), 28.1 (CH2), 28.0 (CH2), 27.9 (CH2), 27.70 (CH2), 27.66 (CH2), 27.1 (CH2), 24.4 (CH2), 20.3 (C*H3CO), 6.5 ((CH3O)3SiC*H2). ESI MS: m/z calcd [C22H45NO9SiS]Na+: 550.2476. Found 550.2473.
（実施例７）
７−オクテン−１−イル ４−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトミラノース)−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｂ−３）の合成
トリクロロアセトイミデート（Amvam-Zollo, P.H., Sinay, P. Carbohydr. Res., 1986, 150:199-212）Ｂ−１（１１．０ｇ、１４．１ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２溶液（２００ｍＬ）を７−オクテン−１−オール（２．５３ｍＬ、１６．９ｍｍｏｌ）および４Å分子ふるい（４．０ｇ）で処理し、攪拌した（室温、１時間）。混合液を冷却し（−４０℃）、ＴＭＳＯＴｆ（２００μＬ）で処理した後、静置した（３０分）。混合液をＥｔ３Ｎ（３ｍＬ）で中和した後、ろ過および濃縮を行い、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ペトロール、１：１）を行ったところ、多少精製されたグリコシド（Ｂ−２）の無色オイルが得られた（５．５ｇ、５２％）。残渣をＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）に溶解し、触媒量のＮａＯＭｅを含むＭｅＯＨ溶液で処理した（室温、１時間）。その後、アンバーライトＩＲ１２０で中和した後、ろ過および濃縮を行い、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、４：１）したところ、オクテニルグリコシド（Ｂ−３）の無色オイルが得られた（２．１ｇ、６４％）。
[α] -9.0 (c = 0.5, MeOH); Rf 0.15 (CH2Cl2/MeOH, 6:1); 1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 5.85-5.75 (1H, m, CH=CH2), 5.00-4.94 (1H, m, CH=CH2), 4.92-4.88 (1H, m, CH=CH2), 4.35 (1H, d, J1´,2´ 7.6, H1´), 4.27 (1H, d, J1,2 7.6, H1), 3.91-3.74, 3.71-3.67, 3.59-3.46, 3.41-3.36 (13H, 4×m, H2´, H3, H3´, H4, H4´, H5, H5´, H6, H6´, CH=CH2(CH2)5CH2O,), 3.23 (1H, dd, J2,3 9.0, J1,2 7.6, H2), 2.08-2.01 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.65-1.57 (2H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O), 1.43-1.29 (6H, m, CH=CH2(CH2)5CH2O). 13C NMR (125 MHz, CD3OD): δC 140.1 (C*H=CH2), 114.7 (CH=C*H2), 105.1, 104.2 (C1, C1´) 80.7, 77.1, 76.5, 76.4, 74.9, 74.8, 72.6, 70.3 (C2, C2´, C3, C3´, C4, C4´, C5, C5´), 70.9 (CH=CH2(CH2)5C*H2O), 62.5, 62.0 (C6, C6´), 34.8 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 30.7 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 30.08 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 30.06 (CH=CH2(C*H2)5CH2O), 26.9 (CH=CH2(C*H2)5CH2O). ESI MS: m/z calcd [C20H36O11]Na+: 475.2150. Found 475.2142.
８−（３−（トリメトキシシリル）プロピルチオ）オクタン−１−イル ４−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトミラノース)−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｂ−４）の合成
乾燥ＭｅＯＨ（０．４ｍＬ）に溶解したアルケン（Ｂ−３）（１９ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ）の脱ガス溶液をＭＰＴＭＳ（２４ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）およびＤＡＲＯＣＵＲ１１７３（５μＬ）で処理した後、波長２５４ｎｍにおいて１２００Ｗ（７５Ｗランプ１６個）で３０分照射した。この溶液を乾燥ＭｅＯＨ（２ｍＬ）で希釈し、ヘキサン（２ｍＬ）で三回洗浄した。次いで濃縮することにより、Ｂ−４の若干不安定な無色オイルが得られた（２３ｍｇ、８５％）。
1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH 4.35 (1H, d, J1´,2´ 7.6, H1´), 4.27 (1H, d, J1,2 7.8, H1), 3.91-3.67, 3.61-3.45, 3.41-3.28 (22H, 3×m, H2´, H3, H3´, H4, H4´, H5, H5´, H6, H6´, (CH2)7CH2O, (CH3O)3Si), 3.23 (1H, dd, J2,3 8.4, J1,2 7.8, H2), 2.55-2.45 (4H, m, CH2SCH2(CH2)6CH2O), 1.73-1.51 (6H, m, CH2SCH2(CH2)6CH2O, (CH3O)3SiCH2CH2CH2SCH2(CH2)6CH2O), 1.44-1.29 (8H, m, CH2SCH2(CH2)6CH2O), 0.80-0.68 (2H, m, (CH3O)3SiCH2CH2CH2SCH2(CH2)6CH2O) 13C NMR (125 MHz, CD3OD): δC 105.1, 104.2 (C1, C1´), 80.7, 77.1, 76.5, 76.4, 74.85, 74.78, 72.6, 70.3 (C2, C2´, C3, C3´, C4, C4´, C5, C5´), 70.9 ((CH2)7C*H2O), 62.5, 62.0 (C6, C6´), 50.9 ((C*H3O)3Si), 35.8 (CH2), 32.7 (CH2), 30.85 (CH2), 30.77 (CH2), 30.5 (CH2), 30.3 (CH2), 29.9 (CH2), 27.1 (CH2), 24.1 (CH2), 9.2 ((CH3O)3SiC*H2).
（実施例８）
８−（２−（ｔｅｒｔ-ブチルカルバマート）エチルチオ）オクタン−１イル ３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−Ｎ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｃ−２）の合成
アルケンＣ−１（１．１１ｇ、２．４３ｍｍｏｌ）およびシテアミン塩酸塩（１．３７ｇ、１２．１ｍｍｏｌ）の脱ガスＭｅＯＨ溶液（３ｍＬ）を２５４ｎｍで照射した（１時間）。濃縮後、（ＣＨ３）２ＣＯ／Ｈ２０（７／３、７０ｍＬ）に溶解し、ＮａＨＣＯ３（１２．２ｇ、０．１４５ｍｏｌ）およびＢｏｃ２Ｏ（９．５０ｇ、４３．６ｍｍｏｌ）で処理し、混合した（室温、１２時間）。混合液のろ過後、ある程度濃縮した。次いでＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）と飽和ＮａＣｌ溶液（２００ｍｌ）とに相分離した。有機相を乾燥・濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡ／ペトロール、３：１）したところ、カルバマート（Ｃ−２）の無色オイルが得られた（１．５０ｇ、９７％）。
[α] -8.5 (c = 0.9, CH2Cl2); Rf 0.28 (EtOAc/petrol, 7:3); 1H NMR (500 MHz): 5.90-5.78 (1H, m, NH), 5.28 (1H, dd, J2,3 10.3, J3,4 9.6, H3), 5.02 (1H, dd, J3,4 9.6, J4,5 9.6, H4), 4.67 (1H, d, J1,2 8.3, H1), 4.23 (1H, dd, J6,6 12.2, J5,64.8, H6), 4.10 (1H, dd, J6,6 12.2, J5,6 2.3, H6), 3.85-3.75 (2H, m, H2, CH2O,), 3.68 (1H, ddd, J4,5 9.6, J5,64.8, 2.3, H5), 3.49-3.40 (m, 1H, CH2O,), 3.30-3.23 (2H, m, CH2N), 2.62-2.57 (2H, m, CH2S), 2.50-2.45 (2H, m, CH2S), 2.05 (3H, s, CH3C=O), 2.00 (3H, s, CH3C=O), 1.99 (3H, s, CH3C=O), 1.91 (3H, s, CH3C=O), 1.59-1.18 (21H, m, (CH2)6CH2O, (CH3)3C)). 13C NMR (125 MHz): δC 170.8 (C=O), 170.7 (C=O), 170.1 (C=O), 169.4 (C=O), 155.8 (C=O), 100.7 (C1), 72.4 (C3), 71.7 (C5), 69.8 (CH2O), 68.8 (C4), 62.2 (C6), 54.8 (C2), 39.7 (CH2N), 32.2 (CH2S), 31.8 (CH2S), 29.6 ((C*H2)6CH2O), 29.4 ((C*H2)6CH2O), 29.2 ((C*H2)6CH2O), 29.12 ((C*H2)6CH2O), 29.06 ((C*H2)6CH2O), 28.7 ((C*H2)6CH2O), 28.4 ((C*H3)3C), 25.7 ((CH3)3C*), 23.3 (C*H3C=O), 20.73 (C*H3C=O), 20.68 (C*H3C=O), 20.6 (C*H3C=O). ESI MS: m/z calcd [C29H50N2O11S]Na+: 657.3027. Found 657.3021.
８−（２−（ｔｅｒｔ-ブチルカルバマート）エチルチオ）オクタン−１イル ２−Ｎ−アセチル−２−デオキシ-β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｃ−３）の合成
カルバマートＣ−２（１．４４ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１ｍＬ）溶液を触媒量のＮａＯＣＨ３を含むＣＨ３ＯＨ溶液で処理し、攪拌した（室温、１時間）。その後、アンバーライトＩＲ１２０（Ｈ＋）で中和した後、ろ過を行い、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、４：１）を行ったところ、トリオールＣ−３の無色オイルが得られた（９１７ｍｇ、８０％）。
[α] -13.8 (c = 0.3, MeOH); Rf 0.12 (CH2Cl2/MeOH, 9:1); 1H NMR (500 MHz, CD3OD): 4.38 (1H, d, J1,28.4, H1), 3.90-3.84 (2H, m, H6, CH2O), 3.67 (1H, dd, J6,610.3, J5,6 5.7, H6), 3.61 (1H, dd, J2,3 10.3, J1,28.4, H2), 3.48-3.41 (2H, m, H3, CH2O), 3.36-3.15 (4H, m, H4, H5, CH2N), 2.60-2.47 (4H, m, CH2S), 1.96 (3H, s, CH3C=O), 1.62-1.25 (21H, m, (CH2)6CH2O, (CH3)3C). 13C NMR (125 MHz): δC 170.6 (C=O), 155.9 (C=O), 102.1 (C1), 77.4 (C5), 75.5 (C3), 71.6 (C4), 70.0 (CH2O), 62.3 (C6), 56.9 (C2), 32.2 (CH2S), 32.1 (CH2S), 30.3 ((C*H2)6CH2O), 30.1 ((C*H2)6CH2O), 29.9 ((C*H2)6CH2O), 29.80 ((C*H2)6CH2O), 29.77 ((C*H2)6CH2O), 29.3 ((C*H2)6CH2O), 28.2 ((C*H3)3C), 26.5 ((CH3)3C*), 22.5 (C*H3C=O). ESI MS: m/z calcd [C23H44N2O8S]Na+: 531.2711. Found 531.271
ハ−フエステル（Ｃ−５）の合成
カルバマートＣ−３（１７０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１ｍＬ）溶液をＨＣｌ（１Ｍ、１ｍＬ）で処理し、攪拌した（室温、６０分）。この溶液を濃縮し白色個体を得た後、これをＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解し、ｐ−ニトロフェニルエステルリンカー（Wu, X., Ling, C.C., Bundle, D.R. Org. Lett., 2004, 6:4407-4410）Ｃ−６（５８０ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）で処理し、攪拌した（室温、１２時間）。濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、４：１）を行ったところ、多少不安定なエステルＣ−５の淡黄色個体が得られた（１４５ｍｇ、６５％）。
Rf0.85 (CH2Cl2/MeOH, 9:1); 1H NMR (500 MHz, CD3OD): δH8.31-8.24 (2H, m, Ph), 7.38-7.34 (2H, m, Ph), 4.40 (1H, d, J1,2 8.4, H1), 3.90-3.83 (2H, m, H6, CH2O), 3.71-3.59 (2H, m, H2, H6), 3.48-3.40 (m, 2H, H3, CH2O), 3.38-3.22 (4H, m, CH2N, H4, H5), 2.69-2.59, 2.55-2.50, 2.31-2.22 (8H, 3×m, CH2S, CH2C=O), 1.97 (3H, s, CH3C=O), 1.80-1.23 (16H, m, CH2). 13C NMR (125 MHz): δC 176.6 (C=O), 174.5 (C=O), 173.5 (C=O), 158.0 (Ph), 147.6 (Ph), 127.0 (Ph), 124.9 (Ph), 103.6 (C1), 78.8, 77.0, 73.1 (C3, C4, C5), 71.5 (CH2O), 63.7 (C6), 53.3 (C2), 41.1 (CH2), 37.5 (CH2), 35.5 (CH2), 33.6 (CH2), 33.1 (CH2), 31.6 (CH2), 31.5 (CH2), 31.3 (CH2), 31.2 (CH2), 30.7 (CH2), 28.0 (CH2), 27.1 (CH2), 26.2 (CH2), 24.0 (C*H3C=O). ESI MS: m/z calcd [C23H47N3O11S]Na+: 680.2823. Found 680.2825.
（実施例９）
シリカおよびアルミナ被覆ステンレススチール表面の調製
ＴＥＯＳディップによるシリカ被覆ステンレススチール表面の調製
ステンレススチール製ステント表面の調製
ＳｉＯ２被覆ステンレススチール製ステントを従来手法の変形例に従って作製した。ステンレススチール製ステントを下記４種類の溶媒中各々で１０分超音波処理した（１８ＭΩ Ｈ２Ｏ、ＣＨ２Ｃｌ２、（ＣＨ３）２ＣＯ、ＥｔＯＨ）。次いで、ステンレススチール製ステントを９０分間エアープラズマ処理した（〜８００ｍＴｏｒｒ）。プラズマ・クリーナーから取り出した後、直ちにテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）原液に浸漬した。１５〜３０秒後、ステントを取り出し、１８ＭΩ Ｈ２Ｏ中に２分間浸漬した。ＴＥＯＳ原液または様々なｐＨのＴＥＯＳエタノール溶液に再浸漬する前に、ステントを窒素流下で乾燥した。硬化ステップ（１５分、１１０℃）をディップ・サイクル間に時々行った。このサイクルを５〜１０回繰り返した。ディップ・サイクルの完了後、ステンレススチール箔を１８ＭΩ Ｈ２Ｏ内に１時間静置した。水から取り出した後、ＳｉＯ２被覆ステントは直ちに官能化された。ステンレススチール表面の電気活性面が得られた。結果を表２に示す。また、ステンレススチール表面の赤外伸縮振動数を算出した。結果を表３に示す。ステンレススチール表面を更にＳＥＭおよびＡＥＳで解析した。結果を図１０Ａ、図１０Ｂ、図１１Ａ、図１１Ｂに示す。
サイクリックボルタンメトリーにより得られた平均電気活性面積（ＥａＡ）およびシリカ被覆ステンレススチールのＸＰＳ分析により得られたステンレススチール由来の金属組成（Ｆｅ、Ｃｒ、Ｎｉ、Ｍｏ）
シリカ被覆ステンレススチール３１６Ｌの赤外伸縮振動数
ＡＬＤによるシリカ被覆ステンレススチール表面の調製
用時清浄したステンレススチールをＦｌｅｘＡＬ（Oxford Industries社）に入れ、原子層堆積（ＡＬＤ）を行った。まず、チャンバーを５ｘ１０−６Ｔｏｒｒ未満に減圧した。次いで、チャンバーにビス（ｔ−ブチルアミノ）シラン内で発泡させたアルゴンガスを０．６秒間投入した後、チャンバーを５．５秒間パージした。次いで、３００Ｗのプラズマパルスを５秒間供給した後、更に２秒間パージした。この間、圧力は１５ｍＴｏｒｒに維持した。このシリカ前駆体添加／プラズマパルス供給のサイクルを繰り返した。この間、酸素ガスを６０ｓｃｃｍで継続的に流した。このサイクルを、平坦なサンプルおよびステントの両面について同じ回数行った。サイクル毎に厚さ約１．２５Åの層が形成された。次いで、サンプルをＸＰＳ分析した。結果を図１３に示す。
ＡＬＤによるアルミナ被覆ステンレススチール表面の調製
用時清浄したステンレススチールをＦｌｅｘＡＬ（Oxford Industries社）に入れ、原子層堆積（ＡＬＤ）を行った。まず、チャンバーを５ｘ１０−６Ｔｏｒｒ未満に減圧した。次いで、チャンバーにトリメチルアルミニウムを３０ミリ秒間投入した後、チャンバーを４秒間パージした。次いで、３００Ｗのプラズマパルスを３秒間供給した後、更に８００ミリ秒間パージした。この間、圧力は１５ｍＴｏｒｒに維持した。このシリカ前駆体添加／プラズマパルス供給のサイクルを繰り返した。この間、酸素ガスを６０ｓｃｃｍで継続的に流した。このサイクルを、平坦なサンプルおよびステントの両面について同じ回数行った。サイクル毎に厚さ約１．０５Åの層が形成された。次いで、サンプルをサイクリックボルタンメトリーで解析した。結果を図１２Ａおよび図１２Ｂに示す。
（実施例１０）
シリカまたはアルミナ被覆ステンレススチール表面の糖鎖標識
シリカまたはアルミナ被覆ステンレススチールの２０％糖鎖・８０％ＰＥＧ表面官能化
典型的な実験により、糖鎖Ｉ−１４（４．８２ｘ１０−６ｍｏｌ）を１％ＡｃＯＨ含有９５％ＥｔＯＨ溶媒０．２５ｍＬに溶解した。２−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］−トリメトキシシラン（１０ｍｇ、平均分子量＝５５２ｇ／ｍｏｌ、１．９３ｘ１０−５ｍｏｌ）９．４μＬおよび１％ＡｃＯＨ含有９５％ＥｔＯＨからなる溶液０．４７ｍＬを加えた。このシラン溶液を使用前に５分間静置して、トリメトキシシラン基を加水分解させてシラノール基とした。１００％ＥｔＯＨでディップリンスし、かつ、１１０℃に加熱したオーブンで１５分間硬化処理する前に、サンプルをトリメトキシシラン溶液内で２分間攪拌した。同様の手法を糖鎖Ａ−６およびＢ−４に使用することができる。次いで、表面をＸＰＳ分析した。結果を図１４、図１５、図１６に示す。
シリカまたはアルミナ被覆ステンレススチールの１０％糖鎖／９０％ＰＥＧ表面官能化
典型的な実験により、糖鎖Ｉ−１４（４．８２ｘ１０−６ｍｏｌ）を１％ＡｃＯＨ含有９５％ＥｔＯＨ溶媒０．２５ｍＬに溶解した。２−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］−トリメトキシシラン（２３ｍｇ、平均分子量＝５５２ｇ／ｍｏｌ、４．３４ｘ１０−５ｍｏｌ）２１μＬおよび１％ＡｃＯＨ含有９５％ＥｔＯＨからなる溶液１．０６ｍＬを加えた。このシラン溶液を使用前に５分間静置して、トリメトキシシラン基を加水分解させてシラノール基とした。１００％ＥｔＯＨでディップリンスし、かつ、１１０℃に加熱したオーブンで１５分間硬化処理する前に、サンプルをトリメトキシシラン溶液内で２分間攪拌した。同様の手法を糖鎖Ａ−６およびＢ−４に使用することができる。次いで、表面をＸＰＳ分析した。結果を図１４、図１５に示す。
シリカまたはアルミナ被覆ステンレススチールの１００％ＰＥＧ表面官能化
典型的な実験により、２−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］−トリメトキシシラン（２４ｍｇ、４．３３ｘ１０−５ｍｏｌ）２２μＬを１％ＡｃＯＨ含有９５％ＥｔＯＨ溶媒１．０ｍＬに溶解した。このシラン溶液を使用前に５分間静置して、トリメトキシシラン基を加水分解させてシラノール基とした。１００％ＥｔＯＨでディップリンスし、かつ、１１０℃に加熱したオーブンで１５分間硬化処理する前に、サンプルをトリメトキシシラン溶液内で２分間攪拌した。
（実施例１１）
改良ＥＬＩＳＡアッセイによる、シリカまたはアルミナ被覆ステンレススチールへの糖鎖の結合の確認
シリカ被覆ステンレススチールへのＡ−６およびＢ−４の結合確認
各シリカ被覆ステンレススチール表面を２％ＢＳＡのＰＢＳＴ溶液（１００μＬ）で処理し、振盪した（１４時間、５℃）。シリカ被覆ステンレススチールを取り出し、ペルオキシダーゼ標識レクチン（ＷＧＡまたはＰＮＡ）（０．１ｍｇ／ｍｌ、１００μＬ）の２％ＢＳＡ ＰＢＳＴ溶液内で振盪しながら室温で２時間インキュベートした。表面をＰＢＳＴでよく洗浄して未結合レクチンを除去した後、ＳｉｇｍａＦａｓｔ ＯＰＤ溶液で処理した（４００μＬ、１時間）。溶液の一部（１００μＬ）を取って、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１７、図１８の棒グラフに示す。
アルミナ被覆ステンレススチールへのＡ−６の結合確認
各アルミナ被覆ステンレススチール表面を２％ＢＳＡのＰＢＳＴ溶液（１００μＬ）で処理し、振盪した（１４時間、５℃）。アルミナ被覆ステンレススチールを取り出し、ペルオキシダーゼ標識ＷＧＡ（０．０１ｍｇ／ｍｌ、１００μＬ）の２％ＢＳＡ ＰＢＳＴ溶液内で振盪しながら室温で２時間インキュベートした。表面をＰＢＳＴでよく洗浄して未結合レクチンを除去した後、ＳｉｇｍａＦａｓｔ ＯＰＤ溶液で処理した（４００μＬ、１時間）。溶液の一部（１００μＬ）を取って、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図１９の棒グラフに示す。
シリカ被覆ステンレススチール製ステントへのＩ−１４の結合確認
各シリカ被覆ステンレススチール製ステント表面を２％ＢＳＡのＰＢＳＴ溶液（２００μＬ）で処理し、振盪した（１４時間、５℃）。各シリカ被覆ステンレススチール製ステントを取り出し、マウス抗Ａ−ＩｇＭ抗体と共にインキュベートした（５℃、１４時間、０．０２３ｍｇ／ｍｌ、５０μＬ）。各シリカ被覆ステンレススチール製ステントを取り出し、ＰＢＳＴでよく洗浄した後、二次抗体であるＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体で処理した（２１℃、３時間、０．０１３ｍｇ／ｍｌ、５０μＬ）。表面をＰＢＳＴでよく洗浄して未結合抗体を除去した後、ＳｉｇｍａＦａｓｔ ＯＰＤ溶液で処理した（２００μＬ、１時間）。溶液の一部（１００μＬ）を取って、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図２０の棒グラフに示す。
Ａ型Ｉ抗原官能化ステンレススチール表面の血漿中安定性評価
前述した一般方法に従って、Ａ型Ｉ抗原担持シリカ被覆ステンレススチールサンプルを数個作製した。各サンプルを３種類のブタ血漿（Ｏ型、Ａ型、市販のＯ型プール血漿）に入れた。サンプルをシェイカーテーブルで１２日間攪拌した。１２日経過後、サンプルをブタ血漿から取りだし、エタノールに入れた。各シリカ被覆ステンレススチール製ステント表面を２％ＢＳＡのＰＢＳＴ溶液（２００μＬ）で処理し、振盪した（１４時間、５℃）。各シリカ被覆ステンレススチール製ステントを取り出し、マウス抗Ａ−ＩｇＭ抗体と共にインキュベートした（５℃、１４時間、０．０２３ｍｇ／ｍｌ、５０μＬ）。各シリカ被覆ステンレススチール製ステントを取り出し、ＰＢＳＴでよく洗浄した後、二次抗体であるＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＭ抗体で処理した（２１℃、３時間、０．０１３ｍｇ／ｍｌ、５０μＬ）。表面をＰＢＳＴでよく洗浄して未結合抗体を除去した後、ＳｉｇｍａＦａｓｔ ＯＰＤ溶液で処理した（２００μＬ、１時間）。溶液の一部（１００μＬ）を取って、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を図２１、図２２、図２３の一連の棒グラフに示す。
（実施例１２）
シリカナノ粒子の作製
シリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子の作製
典型的な実験により、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを界面活性剤として用いたキシレン／水の逆ミセル溶液中でＦｅ（ＩＩ）およびＦｅ（ＩＩＩ）の塩を塩基触媒で共結晶化することによりＦｅ３Ｏ４ナノ粒子を作製した。Ｆｅ３Ｏ４溶液は、ナノ粒子が形成されるように、高温で数時間熟成した。温度を下げる際、少量のＴＥＯＳを反応溶液に添加してナノ粒子上へのＳｉＯ２外壁シェルの形成を開始させた。ＴＥＯＳの添加量は形成されるＳｉＯ２外壁シェルの厚さに直接影響するが、ナノ粒子のサイズは大型粒子の作製中に大きくばらついた。このコア／シェルナノ粒子を単離し、遠心／分散のサイクルを３回繰り返すことにより清浄した。清浄後、得られたシリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子をエタノールに縣濁させておいた。Stober法によるＳｉＯ２ナノ粒子作製において、一定量の既知濃度のナノ粒子縣濁液をシードとして用いることによりＳｉＯ２シェルをより制御した方法で大きくした。ＳｉＯ２シェルを所望の直径（３０〜２０００ｎｍ）にする際、反応溶液に適切なシランを添加することによりナノ粒子表面を官能化した。ＰＥＧ、糖および蛍光色素を結合したシランの添加により、最初のシラン比率を反映した表面官能化ナノ粒子が同様に得られた。ある作製例において、ＰＥＧ結合シランおよびＭＰＴＭＳ（メルカプトプロピルメトキシシランのみを４：１の比率で使用した。次いで、糖および蛍光色素の分子をナノ粒子表面の２０％を占めるチオール基に結合させた。得られた官能化シリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子を遠心／分散のサイクルを三回行って清浄・単離した後、最後にＰＢＳ水溶液等の適切な溶媒に分散させた。ナノ粒子溶液は使用するまで４℃で保存した。ナノ粒子をＦＴＩＲ分光、ＸＰＳ、ＥＡ、糖特異的アッセイにより分析した。
蛍光（色素導入）シリカナノ粒子の作製
典型的な実験により、適切な反応性アミン置換基を有する選択した有機色素をグローブボックス内でバイアルに秤量した。通常、必要な粒子サイズに応じて１〜５ｍｇ使用する。有機色素を無水エタノール１〜５ｍＬに溶解した。アミノプロピルメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）２〜５０当量、すなわち２〜２０μＬを、色素溶液を激しく攪拌しながらバイアルに添加した。バイアルをアルミニウム箔に包み、暗所で１２〜１６時間室温で攪拌する。次いで、ＡＰＴＭＳ結合有機色素溶液は、適量の水、アンモニアおよびテトラエトキシオルトシリケート（ＴＥＯＳ）を含むエタノール溶液に添加することができる。反応溶液における水、アンモニアおよびＴＥＯＳの濃度を変化させることで、ナノ粒子のサイズを制御することができる。ナノ粒子中の有機色素の分布は、試薬、すなわちＴＥＯＳの添加順序により制御することができる。ある反応において、ＴＥＯＳを数アリコート添加してナノ粒子を大型化した。ナノ粒子生成反応終了後、確立されたシランカップリング反応により同一反応容器内でナノ粒子表面が官能化されうる。官能化後、得られたナノ粒子を遠心／分散のサイクルを３回繰り返すことにより清浄・単離し、最後に適切な溶媒に分散させた。ナノ粒子をＳＥＭ（図９）、ＤＬＳ、ＵＶ／Ｖｉｓ分光により分析した。
シリカナノ粒子の作製
典型的な実験において、１００％エタノール１００ｍＬを２８％アンモニア６．２ｍＬおよびミリポア水０．４２ｍＬと共に３０分間攪拌した。次いで、ＴＥＯＳ３．５６ｍＬを添加し、反応液を一晩攪拌した。前述した条件により、得られたナノ粒子の直径は約１００ｎｎであった。多くの場合、用途に応じて様々なシラン類を使用したシランカップリング反応により、ナノ粒子を同一反応容器内で官能化した。またある場合は、ナノ粒子を遠心し、新鮮なエタノールに再分散するサイクルを３回繰り返して、清浄した。ナノ粒子はＳＥＭおよびＤＬＳにより分析した。
（実施例１３）
アルコキシシラン・リンカーを用いた炭水化物官能ナノ粒子の作製
１００％ＰＥＧナノ粒子の作製
上述の一連のシリカナノ粒子を作製した。ＴＥＯＳ前駆体からナノ粒子を生成する縮合反応が完了した時点で、前記塩基性エタノール溶液を使用して更なるシランカップリング反応を触媒することができる。典型的な実験において、ＰＥＧ−シラン４〜５μＬを粒径１００ｎｍのシリカナノ粒子反応溶液３５ｍＬに添加した。ＰＥＧ官能ナノ粒子を遠心により単離する前に、反応溶液を室温で６〜１２時間攪拌した。ナノ粒子を遠心／再分散のサイクルを５回繰り返して清浄した。２番目と最後は水に分散させた。ナノ粒子はＳＥＭ（図２４、図２５）、ＤＬＳ、ＦＴＩＲ分光により分析した。
９０％ＰＥＧ／１０％ＧｌｃＮＡｃナノ粒子の作製
典型的な実験において、ＭＳ０．２８ｍｇおよびＰＥＧ−シラン３．７μＬをエタノール１ｍＬに溶解した。この溶液を粒径１００ｎｍのシリカナノ粒子反応溶液３５ｍＬに添加した。９０％ＰＥＧ／１０％ＧｌｃＮＡｃ官能シリカナノ粒子を遠心により単離する前に、反応溶液を室温で１２時間攪拌した。ナノ粒子の遠心／再分散サイクルを５回繰り返して清浄した。２番目と最後は水に分散させた。ナノ粒子はＳＥＭ（図２６、図２７）、ＤＬＳ、下記蛍光バイオアッセイにより分析した。
（実施例１４）
活性化エステル（ＰＮＰ）リンカーを用いた糖鎖官能ナノ粒子の作製
アミノ化ナノ粒子の作製
典型的な実験において、アミノプロピルメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）１．５μＬを粒径１００ｎｍのシリカナノ粒子反応溶液３５ｍＬに添加した。アミン官能ナノ粒子を遠心により単離する前に、反応溶液を室温で６〜１２時間攪拌した。ナノ粒子の遠心／再分散のサイクルを５回繰り返して清浄した。最終遠心ステップからのナノ粒子ペレットを丸底フラスコ内に入れた。ナノ粒子を１００℃のオイルバスで加熱しながら一晩減圧下（〜０．２Ｔｏｒｒ）に置いた。次いで、ナノ粒子を乾燥ＤＭＦに再分散した。ナノ粒子はＳＥＭ、ＤＬＳ、ＦＴＩＲ分光により分析した。
９０％ＰＥＧ／１０％アミンナノ粒子の作製
典型的な実験において、アミノプロピルメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）０．４μＬおよびＰＥＧ３．４μＬを粒径１００ｎｍのシリカナノ粒子反応溶液１００ｍＬに添加した。
９０％ＰＥＧ／１０％アミン官能ナノ粒子を遠心により単離する前に、反応溶液を室温で６〜１２時間攪拌した。ナノ粒子の遠心／再分散のサイクルを３回繰り返して清浄した。
最終遠心ステップからのナノ粒子ペレットを丸底フラスコ内に入れた。ナノ粒子を１００℃のオイルバスで加熱しながら一晩減圧下（〜０．２Ｔｏｒｒ）に置いた。次いで、炭水化物エステルを添加する前に、ナノ粒子を乾燥ＤＭＦに再分散した。ナノ粒子はＳＥＭ、ＤＬＳ、ＦＴＩＲ分光により分析した。
９０％ＰＥＧ／１０％ＧｌｃＮＡｃナノ粒子（ＰＮＰ）の作製
アミノ化ナノ粒子（１００ｍｇ、９０％ＰＥＧ、１０％アミン）の乾燥ＤＭＦ溶液（０．５ｍＬ）をハーフエステルＣ−５（５ｍｇ）と処理し、攪拌した（室温、オーバーナイト）。遠心／１００％エタノールへの再分散のサイクルを３回繰り返して、ナノ粒子を精製した。ナノ粒子をバイオアッセイ、ＳＥＭ、ＤＬＳで分析する前に、遠心／ミリポア水またはＰＢＳへの再分散のサイクルを更に２回繰り返した。
（実施例１５）
シリカナノ粒子への糖鎖結合の確認
各ナノ粒子（１００％ＰＥＧ、９０％ＰＥＧ／１０％ＧｌｃＮＡｃ ＡＳ、９０％ＰＥＧ／１０％ＧｌｃＮＡｃ ＰＮＰ）をＰＢＳＴ（１００ｍｇ／ｍＬ）に溶解した。各溶液の一部（９０μＬ）を２％ＢＳＡのＰＢＳＴ溶液（２００μＬ）で処理し、混合液を穏やかに揺すって攪拌した（１４時間、５℃）。次いで、混合液を遠心し、ＦＩＴＣ結合レクチン（ＷＧＡまたはＰＮＡ、１ｍｇ／ｍＬ）で処理し、混合液を穏やかに揺すって攪拌した（２時間、２１℃）。混合液を遠心し、上清を捨てた後、ペレットをＰＢＳ（１００μＬ）に縣濁した。この手順を２回繰り返し、未結合レクチンを全て除去した。得られたペレットをマイクロウェル蛍光プレートリーダーに入れ、蛍光強度を測定した（励起波長：４４４ｎｍ、測定波長：５３８ｎｍ、図２８）。
本明細書で記載した全ての出版物、特許および特許出願は、本発明が属する分野の当業者の知識水準を示すためのものであり、それぞれが具体的かつ単独で本明細書に援用されているかのように本明細書に参照により援用される。
本出願は、２００８年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／１２１，７８４号の利益および優先権を主張し、明示的に本明細書に記載されているものとしてその全体を援用する。

Claims (81)

  1. キャリアに結合された少なくとも１つの非自己抗原を有する寛容源を投与するステップを含む、非自己抗原に対する免疫寛容の誘発方法。
  2. 前記非自己抗原は、糖鎖抗原、完全長抗原性タンパク質、および、それらの断片および組み合わせから成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記糖鎖抗原は、Ａ型抗原、Ｂ型抗原、Ｏ型抗原、Ｇａｌｉｌｉ抗原（Ｇａｌ−α−（１→３）Ｇａｌ）、および、それらの断片および組み合わせから成る群から選ばれる、請求項２に記載の方法。
  4. 前記Ａ型抗原、前記Ｂ型抗原、および、前記Ｏ型抗原は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、および、ＶＩ型の血液型抗原からなる群から選ばれる、請求項３に記載の方法。
  5. 前記完全長抗原性タンパク質は、ヒト白血球抗原クラスＩ、および、ヒト白血球抗原クラスＩＩから成る群から選ばれる、請求項２に記載の方法。
  6. 複数の異なる非自己抗原が前記キャリアに結合される、請求項１に記載の方法。
  7. 前記抗原はリンカーを介して前記キャリアに結合される、請求項１に記載の方法。
  8. 前記リンカーは固定基を有するアグリコンである、請求項７に記載の方法。
  9. 前記固定基は、モノアルコキシシリル、ジアルコキシシリル、トリアルコキシシリル、モノハロシリル、ジハロシリル、および、トリハロシリルから成る群から選ばれる、請求項８に記載の方法。
  10. 前記固定基はトリメトキシシリルである、請求項９に記載の方法。
  11. 前記固定基はトリクロロシリルである、請求項９に記載の方法。
  12. 前記キャリアはナノ粒子およびステントから成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
  13. 前記ナノ粒子はＳｉＯ２ナノ粒子である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ナノ粒子はシリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子である、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記ステントはシリカ被覆３１６Ｌステンレススチール製である、請求項１２に記載の方法。
  16. 前記ステントはＡｌ２Ｏ３被覆３１６Ｌステンレススチール製である、請求項１２に記載の方法。
  17. 前記寛容源は、前記キャリアに結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有分子を更に有する、請求項１に記載の方法。
  18. 前記ポリエチレングリコール含有分子は、モノアルキルシリル、ジアルコキシシリル、トリアルコキシシリル、モノハロシリル、ジハロシリル、および、トリハロシリルから成る群から選ばれる表面結合基を有する、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記表面結合基はトリメトキシシリルである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記表面結合基はトリクロロシリルである、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記寛容源は静脈投与される、請求項１に記載の方法。
  22. 前記寛容源は外科移植により投与される、請求項１に記載の方法。
  23. 前記寛容源は新生児に投与される、請求項１に記載の方法。
  24. 前記寛容源は幼児期を過ぎた患者に投与される、請求項１に記載の方法。
  25. 前記寛容源は免疫学的不適合臓器移植が安全に行える期間を延長するために投与される、請求項１に記載の方法。
  26. キャリアに結合された少なくとも１つの非自己抗原を有する寛容源を有する、非自己抗原に対する免疫寛容の誘発システム。
  27. 前記非自己抗原は、糖鎖抗原、完全長抗原性タンパク質、および、それらの断片および組み合わせから成る群から選ばれる、請求項２６に記載のシステム。
  28. 前記糖鎖抗原は、Ａ型抗原、Ｂ型抗原、Ｏ型抗原、Ｇａｌｉｌｉ抗原（Ｇａｌ−α−（１→３）Ｇａｌ）、および、それらの断片および組み合わせから成る群から選ばれる、請求項２７に記載のシステム。
  29. 前記Ａ型抗原、前記Ｂ型抗原、および、前記Ｏ型抗原は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、および、ＶＩ型の血液型抗原からなる群から選ばれる、請求項２８に記載のシステム。
  30. 前記完全長抗原性タンパク質は、ヒト白血球抗原クラスＩ、および、ヒト白血球抗原クラスＩＩから成る群から選ばれる、請求項２７に記載のシステム。
  31. 複数の異なる非自己抗原が前記キャリアに結合される、請求項２６に記載のシステム。
  32. 前記抗原はリンカーを介して前記キャリアに結合される、請求項２６に記載のシステム。
  33. 前記リンカーは固定基を有するアグリコンである、請求項３２に記載のシステム。
  34. 前記固定基は、モノアルコキシシリル、ジアルコキシシリル、トリアルコキシシリル、モノハロシリル、ジハロシリル、および、トリハロシリルから成る群から選ばれる、請求項３３に記載のシステム。
  35. 前記固定基はトリメトキシシリルである、請求項３４に記載のシステム。
  36. 前記固定基はトリクロロシリルである、請求項３４に記載のシステム。
  37. 前記キャリアはナノ粒子およびステントから成る群から選ばれる、請求項２６に記載のシステム。
  38. 前記ナノ粒子はＳｉＯ２ナノ粒子である、請求項３７に記載のシステム。
  39. 前記ナノ粒子はシリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子である、請求項３７に記載のシステム。
  40. 前記ステントはシリカ被覆３１６Ｌステンレススチール製である、請求項３７に記載のシステム。
  41. 前記ステントはＡｌ２Ｏ３被覆３１６Ｌステンレススチール製である、請求項３７に記載のシステム。
  42. 前記寛容源は、前記キャリアに結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有分子を更に有する、請求項２６に記載のシステム。
  43. 前記ポリエチレングリコール含有分子は、モノアルキルシリル、ジアルコキシシリル、トリアルコキシシリル、モノハロシリル、ジハロシリル、および、トリハロシリルから成る群から選ばれる表面結合基を有する、請求項３４に記載のシステム。
  44. 前記表面結合基はトリメトキシシリルである、請求項４３に記載のシステム。
  45. 前記表面結合基はトリクロロシリルである、請求項４３に記載のシステム。
  46. 前記寛容源は静脈投与される、請求項２６に記載のシステム。
  47. 前記寛容源は外科移植により投与される、請求項２６に記載のシステム。
  48. 前記寛容源は新生児に投与される、請求項２６に記載のシステム。
  49. 前記寛容源は幼児期を過ぎた患者に投与される、請求項２６に記載のシステム。
  50. 前記寛容源は免疫学的不適合臓器移植が安全に行える期間を延長するために投与される、請求項２６に記載のシステム。
  51. キャリアに結合された少なくとも１つの非自己抗原を有する、非自己抗原に対する免疫寛容を誘発するための寛容源。
  52. 前記非自己抗原は、糖鎖抗原、完全長抗原性タンパク質、および、それらの断片および組み合わせから成る群から選ばれる、請求項５１に記載の寛容源。
  53. 前記糖鎖抗原は、Ａ型抗原、Ｂ型抗原、Ｏ型抗原、Ｇａｌｉｌｉ抗原（Ｇａｌ−α−（１→３）Ｇａｌ）、および、それらの断片および組み合わせから成る群から選ばれる、請求項５２に記載の寛容源。
  54. 前記Ａ型抗原、前記Ｂ型抗原、および、前記Ｏ型抗原は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、および、ＶＩ型の血液型抗原からなる群から選ばれる、請求項５３に記載の寛容源。
  55. 前記完全長抗原性タンパク質は、ヒト白血球抗原クラスＩ、および、ヒト白血球抗原クラスＩＩから成る群から選ばれる、請求項５２に記載の寛容源。
  56. 複数の異なる非自己抗原が前記キャリアに結合される、請求項５１に記載の寛容源。
  57. 前記抗原はリンカーを介して前記キャリアに結合される、請求項５１に記載の寛容源。
  58. 前記リンカーは固定基を有するアグリコンである、請求項５７に記載の寛容源。
  59. 前記固定基は、モノアルコキシシリル、ジアルコキシシリル、トリアルコキシシリル、モノハロシリル、ジハロシリル、および、トリハロシリルから成る群から選ばれる、請求項５８に記載の寛容源。
  60. 前記固定基はトリメトキシシリルである、請求項５９に記載の寛容源。
  61. 前記固定基はトリクロロシリルである、請求項５９に記載の寛容源。
  62. 前記キャリアはナノ粒子およびステントから成る群から選ばれる、請求項５１に記載の寛容源。
  63. 前記ナノ粒子はＳｉＯ２ナノ粒子である、請求項６２に記載の寛容源。
  64. 前記ナノ粒子はシリカ被覆Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子である、請求項６２に記載の寛容源。
  65. 前記ステントはシリカ被覆３１６Ｌステンレススチール製である、請求項６２に記載の寛容源。
  66. 前記ステントはＡｌ２Ｏ３被覆３１６Ｌステンレススチール製である、請求項６２に記載の寛容源。
  67. 前記キャリアに結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有分子を更に有する、請求項５１に記載の寛容源。
  68. 前記ポリエチレングリコール含有分子は、モノアルキルシリル、ジアルコキシシリル、トリアルコキシシリル、モノハロシリル、ジハロシリル、および、トリハロシリルから成る群から選ばれる表面結合基を有する、請求項６７に記載の寛容源。
  69. 前記表面結合基はトリメトキシシリルである、請求項６８に記載の寛容源。
  70. 前記表面結合基はトリクロロシリルである、請求項６８に記載の寛容源。
  71. 静脈投与される、請求項５１に記載の寛容源。
  72. 外科移植により投与される、請求項５１に記載の寛容源。
  73. 新生児に投与される、請求項５１に記載の寛容源。
  74. 幼児期を過ぎた患者に投与される、請求項５１に記載の寛容源。
  75. 請求項５１〜７０のいずれか一項に記載された寛容源を投与するステップを含む、臓器移植拒絶反応の抑制方法。
  76. 前記寛容源は新生児に投与される、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記寛容源は幼児期を過ぎた患者に投与される、請求項７５に記載の方法。
  78. 前記寛容源は静脈投与される、請求項７５に記載の方法。
  79. 前記寛容源は外科移植により投与される、請求項７５に記載の方法。
  80. 非自己抗原に対する免疫寛容を誘発するための、請求項５１〜７０のいずれか一項に記載の寛容源の使用。
  81. 幼児期を過ぎた患者に対して免疫不適合臓器移植が安全に行える期間を延長するための、請求項５１〜７０のいずれか一項に記載の寛容源の使用。

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