CA2643042A1 - Presentation de motifs de reconnaissance par une matrice multivalente greffee sur un support solide - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un support solide lié à au moins un châssis moléculaire permettant de lier de manière multivalente au moins un motif de reconnaissance ou présentant au moins un motif de reconnaissance de manière multivalente, un procédé de fabrication d'un support solide et une puce, notamment à sucre, comprenant au moins un support solide.
Description
PRESENTATION DE MOTIFS DE RECONNAISSANCE PAR UNE MATRICE
MULTIVALENTE GREFFÉE SUR UN SUPPORT SOLIDE
La présente invention concerne l'immobilisation de motifs de reconnaissance sur des supports solides. L'immobilisation de molécules sur des supports solides peut notamment permettre la fabrication de puces à biomolécules, notamment de puces à sucres. Celles-ci peuvent notamment être utile dans des méthodes de détection, d'analyses ou de criblage.
Un grand nombre de méthodes d'immobilisation de molécules sur un support solide sont connues. Elles peuvent être classées en deux groupes :
- les méthodes à immobilisation non covalente, qui consistent à adsorber des molécules sur une surface via des interactions non covalentes, notamment de type hydrophobes, liaisons hydrogènes ou liaisons ioniques. La surface utilisée peut notamment être du verre recouvert de nitrocellulose ou une résine polystyrène.
- les méthodes à immobilisation covalente, qui consistent à faire réagir une fonction présente sur le support solide avec une fonction présente sur la molécule pour former une liaison covalente entre la molécule et le support.
Ces méthodes d'immobilisation de molécules sur support solide peuvent être utilisées pour fabriquer des puces à motifs de reconnaissance pouvant permettre l'analyse haut-débit de molécules impliquées dans la reconnaissance de ces motifs de reconnaissance, notamment des sucres. A titre d 'exemple on peut citer des puces à sucres permettant l'analyse haut débit de protéines. Les puces à motifs de reconnaissance obtenues par les méthodes classiques peuvent présenter un niveau de détection insuffisant par rapport à certaines molécules, comme des protéines à faible affinité. On peut par exemple citer le cas de certaines puces à sucres vis-à-vis de
MULTIVALENTE GREFFÉE SUR UN SUPPORT SOLIDE
La présente invention concerne l'immobilisation de motifs de reconnaissance sur des supports solides. L'immobilisation de molécules sur des supports solides peut notamment permettre la fabrication de puces à biomolécules, notamment de puces à sucres. Celles-ci peuvent notamment être utile dans des méthodes de détection, d'analyses ou de criblage.
Un grand nombre de méthodes d'immobilisation de molécules sur un support solide sont connues. Elles peuvent être classées en deux groupes :
- les méthodes à immobilisation non covalente, qui consistent à adsorber des molécules sur une surface via des interactions non covalentes, notamment de type hydrophobes, liaisons hydrogènes ou liaisons ioniques. La surface utilisée peut notamment être du verre recouvert de nitrocellulose ou une résine polystyrène.
- les méthodes à immobilisation covalente, qui consistent à faire réagir une fonction présente sur le support solide avec une fonction présente sur la molécule pour former une liaison covalente entre la molécule et le support.
Ces méthodes d'immobilisation de molécules sur support solide peuvent être utilisées pour fabriquer des puces à motifs de reconnaissance pouvant permettre l'analyse haut-débit de molécules impliquées dans la reconnaissance de ces motifs de reconnaissance, notamment des sucres. A titre d 'exemple on peut citer des puces à sucres permettant l'analyse haut débit de protéines. Les puces à motifs de reconnaissance obtenues par les méthodes classiques peuvent présenter un niveau de détection insuffisant par rapport à certaines molécules, comme des protéines à faible affinité. On peut par exemple citer le cas de certaines puces à sucres vis-à-vis de
2 lectines.
il existe donc un besoin pour des supports solides présentant des motifs de reconnaissance dans lesquels l'affinité de ces motifs de reconnaissance avec des structures les reconnaissant est améliorée.
Les structures reconnaissant les motifs de reconnaissance peuvent être des parties de molécules ou de composés, des molécules ou des composés, ou des superstructures comprenant ces molécules, composés, parties de molécules ou de composés, notamment des molécules ou des composés cibles. Ces superstructures peuvent être par exemple des cellules ou des microorganismes, comme des bactéries ou des virus.
Ainsi les inventeurs ont découvert qu'un support solide sur lequel les motifs de reconnaissance sont fixés via un châssis moléculaire spécifique pouvait permettre d'améliorer le seuil de détection à certaines structures, comme des molécules ou composés cibles.
Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un support solide lié à au moins un châssis moléculaire permettant de lier de manière multivalente au moins un motif de reconnaissance ou présentant au moins un motif de reconnaissance de manière multivalente.
Par châssis moléculaire , on entend au sens de la présente invention une molécule pouvant d'une part être liée à un support solide et d'autre part être liée, notamment de manière covalente, à au moins un motif de reconnaissance.
Par lié de manière multivalente , on entend au sens de la présente invention plusieurs liaisons, chacune reliée à au moins un motif de reconnaissance.
Par le châssis moléculaire est lié de manière multivalente , on entend au sens de la présente invention
il existe donc un besoin pour des supports solides présentant des motifs de reconnaissance dans lesquels l'affinité de ces motifs de reconnaissance avec des structures les reconnaissant est améliorée.
Les structures reconnaissant les motifs de reconnaissance peuvent être des parties de molécules ou de composés, des molécules ou des composés, ou des superstructures comprenant ces molécules, composés, parties de molécules ou de composés, notamment des molécules ou des composés cibles. Ces superstructures peuvent être par exemple des cellules ou des microorganismes, comme des bactéries ou des virus.
Ainsi les inventeurs ont découvert qu'un support solide sur lequel les motifs de reconnaissance sont fixés via un châssis moléculaire spécifique pouvait permettre d'améliorer le seuil de détection à certaines structures, comme des molécules ou composés cibles.
Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un support solide lié à au moins un châssis moléculaire permettant de lier de manière multivalente au moins un motif de reconnaissance ou présentant au moins un motif de reconnaissance de manière multivalente.
Par châssis moléculaire , on entend au sens de la présente invention une molécule pouvant d'une part être liée à un support solide et d'autre part être liée, notamment de manière covalente, à au moins un motif de reconnaissance.
Par lié de manière multivalente , on entend au sens de la présente invention plusieurs liaisons, chacune reliée à au moins un motif de reconnaissance.
Par le châssis moléculaire est lié de manière multivalente , on entend au sens de la présente invention
3 que le châssis moléculaire est lié à plusieurs motifs de reconnaissance, en particulier plusieurs fois au même motif de reconnaissance, en particulier via plusieurs liaisons.
Tout particulièrement chaque motif de reconnaissance est lié par une liaison au châssis moléculaire.
Par motif de reconnaissance , on entend au sens de la présente invention tout type de molécule ou de composé
pouvant être reconnu par, ou former un complexe avec, au moins une autre molécule ou composé, partie de molécule ou composé. Parmi les composés, on peut tout particulièrement citer les récepteurs, protéines, enzymes et molécules présentes sur ou dans des cellules.
En particulier, ce support solide ou puce présente un excellent seuil de détection, en particulier des composés ou entités présentant une affinité avec les motifs de reconnaissance, tout particulièrement par rapport aux composés ou entités qui peuvent ou doivent être détectés par ledit support ou puce.
Ce seuil de détection peut être inférieur ou égal à 1 mM, en particulier inférieur ou égal à 0,5 mM, notamment inférieur ou égal à 0,2 mM, tout particulièrement inférieur ou égal à 0,1 mM, voire inférieur ou égal à 0,08 mM, ou encore inférieur ou égal à 0,05 mM, voire encore plus particulièrement inférieur ou égal à 0,01 mM.
Ce seuil de détection peut également être inférieur ou égal à 1000 microg/ml, en particulier inférieur ou égal à 500 microg/ml, notamment inférieur ou égal à 200 microg/ml, tout particulièrement inférieur ou égal à 100 microg/ml, voire inférieur ou égal à 50 microg/ml, ou encore inférieur ou égal à 20 microg/ml, voire encore plus particulièrement inférieur ou égal à 10 microg/ml, en poids de composé ou d'entité à
détecter par rapport au volume de composition, comme une solution ou une suspension, dans lequel il est présent.
Tout particulièrement chaque motif de reconnaissance est lié par une liaison au châssis moléculaire.
Par motif de reconnaissance , on entend au sens de la présente invention tout type de molécule ou de composé
pouvant être reconnu par, ou former un complexe avec, au moins une autre molécule ou composé, partie de molécule ou composé. Parmi les composés, on peut tout particulièrement citer les récepteurs, protéines, enzymes et molécules présentes sur ou dans des cellules.
En particulier, ce support solide ou puce présente un excellent seuil de détection, en particulier des composés ou entités présentant une affinité avec les motifs de reconnaissance, tout particulièrement par rapport aux composés ou entités qui peuvent ou doivent être détectés par ledit support ou puce.
Ce seuil de détection peut être inférieur ou égal à 1 mM, en particulier inférieur ou égal à 0,5 mM, notamment inférieur ou égal à 0,2 mM, tout particulièrement inférieur ou égal à 0,1 mM, voire inférieur ou égal à 0,08 mM, ou encore inférieur ou égal à 0,05 mM, voire encore plus particulièrement inférieur ou égal à 0,01 mM.
Ce seuil de détection peut également être inférieur ou égal à 1000 microg/ml, en particulier inférieur ou égal à 500 microg/ml, notamment inférieur ou égal à 200 microg/ml, tout particulièrement inférieur ou égal à 100 microg/ml, voire inférieur ou égal à 50 microg/ml, ou encore inférieur ou égal à 20 microg/ml, voire encore plus particulièrement inférieur ou égal à 10 microg/ml, en poids de composé ou d'entité à
détecter par rapport au volume de composition, comme une solution ou une suspension, dans lequel il est présent.
4 La figure 1 représente schématiquement la plaque obtenue dans l'exemple 1.
La figure 2 est l'image d'un marquage direct par lectine-FITC spécifique du lactose obtenu dans l'exemple 2.
La figure 3 est l'image d'un marquage direct par lectine-FITC spécifique du N-acétylgalactose.
La figure 4 représente schématiquement la plaque obtenue dans l'exemple 4.
La figure 5 est l'image de la plaque obtenue dans l'exemple 4 après marquage Lectine-FITC spécifique du N-acétylgalactose au scanner.
La figure 6 représente la fonctionnalisation d'une plaque de verre par un châssis moléculaire, l'oxydation, le dépôt de ligands (respectivement N-acétylgalactose et mannose), puis la révélation par marquage.
Le châssis moléculaire peut présenter plusieurs liaisons avec des motifs de reconnaissance, il peut notamment être lié
plusieurs fois avec plusieurs motifs de reconnaissance identiques, ou avec plusieurs motifs de reconnaissance différents.
Un châssis moléculaire lié de manière multivalente à au moins un motif de reconnaissance peut être représenté de la manière suivante CM
MRn où CM représente un châssis moléculaire, et MR1, MR2, MR3, ... , MRn représentent chacun un motif de reconnaissance identique ou différent, n représentant un nombre entier supérieur à 1, notamment supérieur ou égal à 2, en particulier supérieur ou égal à 3, voire supérieur ou égal à
4, et notamment inférieur ou égal à 32, en particulier
La figure 2 est l'image d'un marquage direct par lectine-FITC spécifique du lactose obtenu dans l'exemple 2.
La figure 3 est l'image d'un marquage direct par lectine-FITC spécifique du N-acétylgalactose.
La figure 4 représente schématiquement la plaque obtenue dans l'exemple 4.
La figure 5 est l'image de la plaque obtenue dans l'exemple 4 après marquage Lectine-FITC spécifique du N-acétylgalactose au scanner.
La figure 6 représente la fonctionnalisation d'une plaque de verre par un châssis moléculaire, l'oxydation, le dépôt de ligands (respectivement N-acétylgalactose et mannose), puis la révélation par marquage.
Le châssis moléculaire peut présenter plusieurs liaisons avec des motifs de reconnaissance, il peut notamment être lié
plusieurs fois avec plusieurs motifs de reconnaissance identiques, ou avec plusieurs motifs de reconnaissance différents.
Un châssis moléculaire lié de manière multivalente à au moins un motif de reconnaissance peut être représenté de la manière suivante CM
MRn où CM représente un châssis moléculaire, et MR1, MR2, MR3, ... , MRn représentent chacun un motif de reconnaissance identique ou différent, n représentant un nombre entier supérieur à 1, notamment supérieur ou égal à 2, en particulier supérieur ou égal à 3, voire supérieur ou égal à
4, et notamment inférieur ou égal à 32, en particulier
5 inférieur ou égal à 24, tout particulièrement inférieur ou égal à 16, voire inférieur ou égal à 8.
On peut également définir un greffage multivalent par le ratio nombre de liens ou liaisons entre le châssis moléculaire et des motifs de reconnaissance / nombre de liens ou liaisons entre le châssis moléculaire et le support solide. En l'occurrence celui-ci est supérieur à 1, notamment supérieur ou égal à 2, en particulier supérieur ou égal à 3, voire supérieur ou égal à 4.
Selon un mode de réalisation particulier, le châssis moléculaire présente au moins deux faces, en particulier il présente deux faces. Tout particulièrement, ce châssis moléculaire peut être un cyclopeptide, notamment définissant deux faces, une face supérieure et une face inférieure.
Le châssis moléculaire peut présenter plusieurs motifs de reconnaissance greffés sur sa face supérieure, notamment plusieurs fois le même motif ou différents motifs de reconnaissance greffés chacun une ou plusieurs fois.
Le support solide est lié au châssis moléculaire, notamment par la face inférieure de celui-ci, en particulier par au moins une liaison covalente, tout particulièrement par une liaison oxime.
Parmi les châssis moléculaires susceptibles d'être utilisés dans la présente invention, on peut citer ceux décrits dans la demande WO 2004/026894.
Le châssis moléculaire peut être un cyclopeptide formé de 5, 10 ou 14 résidus d'acides aminés, notamment de 10
On peut également définir un greffage multivalent par le ratio nombre de liens ou liaisons entre le châssis moléculaire et des motifs de reconnaissance / nombre de liens ou liaisons entre le châssis moléculaire et le support solide. En l'occurrence celui-ci est supérieur à 1, notamment supérieur ou égal à 2, en particulier supérieur ou égal à 3, voire supérieur ou égal à 4.
Selon un mode de réalisation particulier, le châssis moléculaire présente au moins deux faces, en particulier il présente deux faces. Tout particulièrement, ce châssis moléculaire peut être un cyclopeptide, notamment définissant deux faces, une face supérieure et une face inférieure.
Le châssis moléculaire peut présenter plusieurs motifs de reconnaissance greffés sur sa face supérieure, notamment plusieurs fois le même motif ou différents motifs de reconnaissance greffés chacun une ou plusieurs fois.
Le support solide est lié au châssis moléculaire, notamment par la face inférieure de celui-ci, en particulier par au moins une liaison covalente, tout particulièrement par une liaison oxime.
Parmi les châssis moléculaires susceptibles d'être utilisés dans la présente invention, on peut citer ceux décrits dans la demande WO 2004/026894.
Le châssis moléculaire peut être un cyclopeptide formé de 5, 10 ou 14 résidus d'acides aminés, notamment de 10
6 acides aminés formant un cyclodécapeptide. Ce cyclopeptide peut présenter au moins un coude, notamment deux coudes notamment pour former l'enchaînement (L)Pro-(D)AA ou (D)Pro-(L)AA. Ce cyclopeptide peut également présenter une symétrie centrale.
Le cyclopeptide peut présenter 10 ou 14 résidus d'acides aminés et former deux coudes, chaque coude étant formé par une combinaison (L)Pro-(D)AA ou (D)Pro-(L)AA, AA
étant un acide aminé et de préférence la glycine, les deux coudes étant séparés par trois et/ou cinq résidus d'acides aminés.
Le résidu d'acide aminé du coude représenté ci-dessus par le sigle AA peut être un résidu d'acide aminé autre que la proline et de stéréochimie opposée, il peut s'agir en particulier du résidu glycine.
Les coudes sont séparés par des résidus d'acides aminés, notamment par un nombre impair de résidu d'acides aminés et en particulier par trois et/ou cinq acides aminés pour un cyclodécapeptide et un cyclotétradecapeptide respectivement.
Les trois et/ou cinq résidus d'acides aminés peuvent chacun avoir une fonction chimique protégée orthogonalement par un groupe protecteur. Les groupes protecteurs des chaînes latérales de ces acides aminés se dirigent alternativement de part et d'autre du plan médian dudit châssis et définissent une face dite inférieure et supérieure par rapport à ce plan.
En particulier, le châssis moléculaire est un cyclodécapeptide de formule (I) suivante :
Le cyclopeptide peut présenter 10 ou 14 résidus d'acides aminés et former deux coudes, chaque coude étant formé par une combinaison (L)Pro-(D)AA ou (D)Pro-(L)AA, AA
étant un acide aminé et de préférence la glycine, les deux coudes étant séparés par trois et/ou cinq résidus d'acides aminés.
Le résidu d'acide aminé du coude représenté ci-dessus par le sigle AA peut être un résidu d'acide aminé autre que la proline et de stéréochimie opposée, il peut s'agir en particulier du résidu glycine.
Les coudes sont séparés par des résidus d'acides aminés, notamment par un nombre impair de résidu d'acides aminés et en particulier par trois et/ou cinq acides aminés pour un cyclodécapeptide et un cyclotétradecapeptide respectivement.
Les trois et/ou cinq résidus d'acides aminés peuvent chacun avoir une fonction chimique protégée orthogonalement par un groupe protecteur. Les groupes protecteurs des chaînes latérales de ces acides aminés se dirigent alternativement de part et d'autre du plan médian dudit châssis et définissent une face dite inférieure et supérieure par rapport à ce plan.
En particulier, le châssis moléculaire est un cyclodécapeptide de formule (I) suivante :
7 PCT/FR2007/000307 ~
G Ix x K A
K ~ ~
,o K~
P K
I
Y
Formule (I) dans laquelle Y représente une entité chimique formant une liaison avec un support solide et Xl, X2, X3 et X4 représentent chacun indépendamment les uns des autres une entité chimique, protégée, ou masquée, ou non, permettant de lier, ou liant, au moins un motif de reconnaissance.
On entend par entité chimique protégée une entité
chimique portant un groupement protecteur. Ces groupements sont classiquement connus par l'Homme du Métier et décrits dans des ouvrages de référence, notamment Protective Groups in Organic Synthesis de T. W. Green, P. G. M. Wuts, Wiley-Interscience, New York, 1999.
On entend par entité chimique masquée une entité
chimique portant un groupe ou un résidu permettant de cacher ladite entité chimique. Un tel résidu peut être un résidu acide aminé, par exemple de la sérine.
Plus particulièrement, X1, Xa, X3, X4 et Y peuvent représenter des entités portant au moins une fonction choisie dans le groupe comprenant les fonctions amines, hydroxyles, thiols, hydrazides et en particulier aldéhyde et oxyamine.
Le support solide peut notamment être sous forme de plaque, notamment des plaques à puits, de bille, notamment poreuse, notamment de microbille, de canaux notamment des
G Ix x K A
K ~ ~
,o K~
P K
I
Y
Formule (I) dans laquelle Y représente une entité chimique formant une liaison avec un support solide et Xl, X2, X3 et X4 représentent chacun indépendamment les uns des autres une entité chimique, protégée, ou masquée, ou non, permettant de lier, ou liant, au moins un motif de reconnaissance.
On entend par entité chimique protégée une entité
chimique portant un groupement protecteur. Ces groupements sont classiquement connus par l'Homme du Métier et décrits dans des ouvrages de référence, notamment Protective Groups in Organic Synthesis de T. W. Green, P. G. M. Wuts, Wiley-Interscience, New York, 1999.
On entend par entité chimique masquée une entité
chimique portant un groupe ou un résidu permettant de cacher ladite entité chimique. Un tel résidu peut être un résidu acide aminé, par exemple de la sérine.
Plus particulièrement, X1, Xa, X3, X4 et Y peuvent représenter des entités portant au moins une fonction choisie dans le groupe comprenant les fonctions amines, hydroxyles, thiols, hydrazides et en particulier aldéhyde et oxyamine.
Le support solide peut notamment être sous forme de plaque, notamment des plaques à puits, de bille, notamment poreuse, notamment de microbille, de canaux notamment des
8 capillaires ou chambres, comme des cavités fermées constituant des micro-composants à surfaces micro-structurée, de nanostructures notamment des nanotubes de carbone.
Le support solide peut notamment comprendre, ou être constitué de, au moins un matériau choisi dans le groupe comprenant le verre, le silicium, des oxydes de semi-conducteurs, par exemple l'oxyde de silicium, le plastique, l'or, les oxydes métalliques, notamment tels que oxyde d'indium et d'étain, des sols-gels, des terres rares, ainsi que des assemblages organiques (à base de carbone), comme des nanotubes de carbones.
Le support solide peut être lié directement ou indirectement au châssis moléculaire.
Par lié indirectement on entend qu'un espaceur est lié à chacune des entités citées ou encore que la liaison se fait via au moins un espaceur.
Un espaceur peut être tout type de molécule susceptible de se lier avec les entités auxquelles il doit être attaché.
En particulier il peut s'agir de molécules séparant les deux entités par 1 à 20 atomes, notamment par 2 à 15 atomes, en particulier par 4 à 10 atomes. Tout particulièrement l'espaceur présente un squelette carboné, comprenant éventuellement au moins un hétéroatome, par exemple l'oxygène, le soufre, l'azote, le phosphore.
Le châssis moléculaire est lié au support solide par au moins une liaison, notamment covalente, celle-ci peut être choisie dans le groupe comprenant les liaisons éther, ester, amine, amide, thioéther, oxime, phosphate, alcène, alcyne, hydrazide et disulfure.
Selon un mode de réalisation particulier le support solide est lié au châssis moléculaire via une liaison oxime.
Les motifs de reconnaissance peuvent être de différent
Le support solide peut notamment comprendre, ou être constitué de, au moins un matériau choisi dans le groupe comprenant le verre, le silicium, des oxydes de semi-conducteurs, par exemple l'oxyde de silicium, le plastique, l'or, les oxydes métalliques, notamment tels que oxyde d'indium et d'étain, des sols-gels, des terres rares, ainsi que des assemblages organiques (à base de carbone), comme des nanotubes de carbones.
Le support solide peut être lié directement ou indirectement au châssis moléculaire.
Par lié indirectement on entend qu'un espaceur est lié à chacune des entités citées ou encore que la liaison se fait via au moins un espaceur.
Un espaceur peut être tout type de molécule susceptible de se lier avec les entités auxquelles il doit être attaché.
En particulier il peut s'agir de molécules séparant les deux entités par 1 à 20 atomes, notamment par 2 à 15 atomes, en particulier par 4 à 10 atomes. Tout particulièrement l'espaceur présente un squelette carboné, comprenant éventuellement au moins un hétéroatome, par exemple l'oxygène, le soufre, l'azote, le phosphore.
Le châssis moléculaire est lié au support solide par au moins une liaison, notamment covalente, celle-ci peut être choisie dans le groupe comprenant les liaisons éther, ester, amine, amide, thioéther, oxime, phosphate, alcène, alcyne, hydrazide et disulfure.
Selon un mode de réalisation particulier le support solide est lié au châssis moléculaire via une liaison oxime.
Les motifs de reconnaissance peuvent être de différent
9 type, parmi les motifs de reconnaissance utilisable selon l'invention, on peut citer les molécules d'intérêt, en particulier d'intérêt biologique.
Parmi les motifs de reconnaissance, on peut citer les molécules choisies dans le groupe comprenant les sucres, et en particulier les mono- ou oligosaccharides, les acides nucléiques, les peptides, les protéines, ainsi que des molécules mixtes , comme les glycopeptides, glyco-protéines ou les phospholipides, ou des molécules organiques, en particulier celles présentant un intérêt thérapeutique ou de diagnostic, et un mélange de celles-ci.
Parmi les monosaccharides, et en particulier ceux composant ou compris dans des oligosaccharides, on peut citer Glucose, Fructose, Galactose, Mannose, Rhamnose, Fucose, Glucosamine, Galactosamine, Mannosamine, N-acétylglucosamine, N-acétylgalactosamine, N-acétylmannosamine, acide Glucuronique, acide Galacturonique, acide Mannuronique, acide N-acétylneuraminique, acide 3-désoxy-D-manno-2-octulosonique.
Les motifs de reconnaissance peuvent être liés au châssis moléculaire directement ou indirectement.
Les motifs de reconnaissance peuvent être liés au châssis moléculaire par au moins une liaison covalente, celle-ci peut être choisie parmi les liaisons éther, ester, amine, amide, thioéther, oxime, phosphate, alcène, alcyne, hydrazide et disulfure.
Selon un mode de réalisation particulier les motifs de reconnaissance sont liés au châssis moléculaire via une liaison oxime.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a également pour objet un procédé de fabrication de support solide comprenant au moins un châssis moléculaire permettant de présenter ou présentant, au moins un motif de reconnaissance de manière multivalente, comprenant au moins l'étape consistant à greffer sur le support solide au moins un châssis moléculaire permettant de présenter ou présentant 5 des motifs de reconnaissance de manière multivalente sur un support.
Par greffé , on entend au sens de la présente invention qu'une liaison, notamment de type covalente, est formée entre deux entités chimiques.
Selon un premier mode de réalisation, les complexes châssis moléculaire-motifs de reconnaissance sont greffées sur le support solide.
Cette stratégie consiste à synthétiser et à purifier de manière individuelle les complexes châssis moléculaire-motifs de reconnaissance, en particulier châssis moléculaire-sucres, puis à les greffer sur le support solide.
Les motifs de reconnaissance peuvent être greffés sur le châssis moléculaire par une liaison chimique résultant de la condensation d'une fonction portée par le châssis moléculaire et une fonction portée par le motif de reconnaissance. Parmi les liaisons permettant de greffer des motifs de reconnaissance sur les châssis moléculaires, on peut citer les liaisons amide, ester, éther, amine, oxime, phosphate, alcène, alcyne, hydrazide et disulfure.
Selon une variante, le châssis moléculaire comprend au moins une liaison oxyamine ou aldéhyde susceptible de réagir avec au moins une fonction présente sur le support solide, en particulier pour former une liaison oxime.
Les motifs de reconnaissance peuvent être greffés sur le châssis moléculaire, notamment lorsque celui-ci comprend des résidus acides aminés, en utilisant la chimie des oxyamines, en particulier dans le cas où les motifs de reconnaissance sont des sucres. Dans ce cas, le châssis moléculaire peut porter un groupe dérivé carbonylé (aldéhyde ou cétone) et le sucre peut être modifié en position anomérique par une fonction oxyamine (-ONH2), ou vice-versa le sucre peut porter une fonction carbonylée, notamment sur son extrémité réductrice, et le châssis moléculaire peut porter une fonction oxyamine (-ONH2).
Tout particulièrement, au moins une fonction réactive portée par le châssis moléculaire est protégée ou masquée, notamment par un résidu sérine.
Dans le cas où les fonctions réactives, c'est-à-dire destinées à réagir avec les motifs de reconnaissance, sont protégées ou masquées, il y a lieu de procéder à une étape de déprotection ou de régénération pour libérer les fonctions réactives.
Par exemple lorsque la face supérieure du châssis moléculaire porte une ou des sérines, celles-ci peuvent être oxydées, notamment par du périodate de sodium, de manière à
obtenir des fonctions aldéhydes glyoxyliques (-CO-CHO).
A l'issue de l'étape de déprotection, il est alors possible de greffer les motifs de reconnaissance sur les châssis moléculaires.
Les motifs de reconnaissance peuvent en particulier être des sucres portant une fonction oxyamine apte à réagir avec les fonctions aldéhydes des châssis moléculaires pour former des liaisons oximes.
Selon une variante, les motifs de reconnaissance peuvent être greffés sur le châssis moléculaire via un espaceur.
Parmi les types de greffage possible, on peut citer la réaction d'une fonction aldéhyde présente sur le support solide avec une fonction oxyamine présente sur la face inférieure du châssis moléculaire. Cette réaction est, en général, efficace et sélective, elle conduit à la formation d'une liaison oxime. Ainsi, tout particulièrement, le support solide est lié au châssis moléculaire via une liaison oxime.
L'étape de greffage du châssis moléculaire portant les motifs de reconnaissance sur le support solide peut être réalisée par le dépôt de gouttes de solution comprenant les molécules châssis moléculaire-motifs de reconnaissance, soit manuellement, ce qui donne un diamètre de plots d'environ 1 mm, soit par un automate, ce qui permet de réduire la taille du plot, par exemple à 180 m.
Selon un autre mode de réalisation, le châssis moléculaire est greffé sur le support solide, puis les motifs de reconnaissance sont ensuite greffés sur le châssis moléculaire.
Ce procédé de fabrication d'un support solide permettant une présentation multivalente de motifs de reconnaissance peut comprendre au moins les étapes suivantes consistant à
25- greffer le châssis moléculaire sur le support solide, - greffer les motifs de reconnaissance au châssis moléculaire.
Ce procédé peut comprendre en outre au moins une des étapes suivantes consistant à :
- masquer et/ou protéger les fonctions réactives du support solide n'ayant pas réagi avec le châssis moléculaire et pouvant perturber des étapes ultérieures et - déprotéger les fonctions réactives du châssis moléculaire destinées à réagir avec les motifs de reconnaissance.
Ce mode de réalisation est particulièrement intéressant dans la mesure où il peut permettre de réaliser un support présentant une grande variété de motifs de reconnaissance à
partir d'un seul châssis moléculaire.
Dans ce cas, les fonctions destinées à réagir avec les motifs de reconnaissance, par exemple présentes sur la face supérieure du châssis moléculaire, ne réagissent pas avec les fonctions présentes sur le support solide, soit par leur nature même, soit parce qu'elles sont protégées ou masquées.
L'immobilisation du châssis moléculaire sur le support solide peut se faire par la réaction d'une fonction portée par le support solide avec au moins une fonction portée par le châssis moléculaire, en particulier située sur la face inférieure du châssis moléculaire. Tout particulièrement, la fonction portée par le support solide est une fonction aldéhyde, et la fonction portée par le châssis moléculaire est une oxyamine, ce qui conduit à la formation d'une liaison oxime.
Cette étape de greffage peut se faire par le dépôt d'une solution comprenant le châssis moléculaire sur le support solide. Le dépôt pouvant avoir lieu sur toute la surface de ce support ou uniquement à certains endroits.
Cette étape de greffage du châssis moléculaire peut être suivie d'une étape qui permet de masquer les fonctions réactives du support solide n'ayant pas réagi avec le châssis moléculaire, par exemple en mettant en contact le support solide avec une solution d'hydroxylamine pour masquer les fonctions aldéhydes n'ayant pas réagi.
Selon une variante, au moins un motif de reconnaissance est greffé sur le châssis moléculaire par réaction avec au moins une fonction réactive dudit châssis moléculaire Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre une étape de saturation qui peut consister à absorber une protéine ne reconnaissant pas de manière spécifique le motif de reconnaissance, comme par exemple de la sérum albumine bovine (BSA). Cette étape peut notamment permettre d'éviter l'absorption non spécifique de protéines, ou cibles, sur la surface lors de l'étape de reconnaissance du motif de reconnaissance, par exemple par la protéine à détecter. Cette étape de saturation peut permettre de diminuer le bruit de fond.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a encore pour objet une puce comprenant au moins un support solide tel que défini ci-dessus ou obtenu par un procédé tel que défini ci-dessus.
Il peut en particulier s'agir d'une puce à sucres qui présentent un intérêt majeur notamment dans l'analyse haut-débit des protéines impliquées dans la reconnaissance des sucres. Parmi les résidus susceptibles de faire fonction de motif de reconnaissance on peut citer les résidus osidiques impliqués dans de nombreuses pathologies, comme le cancer (présence de marqueurs tumoraux à base de sucres), le SIDA, ou encore issus d'agressions par des agents pathogènes et bactériens, les agents pathogènes ou bactériens pouvant présenter à leurs surfaces des motifs de reconnaissance, comme des récepteurs, à motif saccharidiques.
On peut également envisager la recherche d'antigène, de bactérie et virus dans des fluides biologiques à l'aide de ces puces.
L'invention peut encore être utilisée dans le cadre de la détection d'agents pathogènes dans l'eau ou dans l'air.
L'invention peut être également utilisable dans la découverte de médicaments, par la reconnaissance d'antagonistes ou d'agonistes de récepteurs cellulaires basés sur la reconnaissance de sucres dans le cadre de criblage 5 haut-débit.
L'invention peut également servir pour l'étude de la spécificité et de l'affinité de sucres naturels mais également synthétiques. Le typage des cellules et/ou des protéines impliquées dans la reconnaissance au sein de
Parmi les motifs de reconnaissance, on peut citer les molécules choisies dans le groupe comprenant les sucres, et en particulier les mono- ou oligosaccharides, les acides nucléiques, les peptides, les protéines, ainsi que des molécules mixtes , comme les glycopeptides, glyco-protéines ou les phospholipides, ou des molécules organiques, en particulier celles présentant un intérêt thérapeutique ou de diagnostic, et un mélange de celles-ci.
Parmi les monosaccharides, et en particulier ceux composant ou compris dans des oligosaccharides, on peut citer Glucose, Fructose, Galactose, Mannose, Rhamnose, Fucose, Glucosamine, Galactosamine, Mannosamine, N-acétylglucosamine, N-acétylgalactosamine, N-acétylmannosamine, acide Glucuronique, acide Galacturonique, acide Mannuronique, acide N-acétylneuraminique, acide 3-désoxy-D-manno-2-octulosonique.
Les motifs de reconnaissance peuvent être liés au châssis moléculaire directement ou indirectement.
Les motifs de reconnaissance peuvent être liés au châssis moléculaire par au moins une liaison covalente, celle-ci peut être choisie parmi les liaisons éther, ester, amine, amide, thioéther, oxime, phosphate, alcène, alcyne, hydrazide et disulfure.
Selon un mode de réalisation particulier les motifs de reconnaissance sont liés au châssis moléculaire via une liaison oxime.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a également pour objet un procédé de fabrication de support solide comprenant au moins un châssis moléculaire permettant de présenter ou présentant, au moins un motif de reconnaissance de manière multivalente, comprenant au moins l'étape consistant à greffer sur le support solide au moins un châssis moléculaire permettant de présenter ou présentant 5 des motifs de reconnaissance de manière multivalente sur un support.
Par greffé , on entend au sens de la présente invention qu'une liaison, notamment de type covalente, est formée entre deux entités chimiques.
Selon un premier mode de réalisation, les complexes châssis moléculaire-motifs de reconnaissance sont greffées sur le support solide.
Cette stratégie consiste à synthétiser et à purifier de manière individuelle les complexes châssis moléculaire-motifs de reconnaissance, en particulier châssis moléculaire-sucres, puis à les greffer sur le support solide.
Les motifs de reconnaissance peuvent être greffés sur le châssis moléculaire par une liaison chimique résultant de la condensation d'une fonction portée par le châssis moléculaire et une fonction portée par le motif de reconnaissance. Parmi les liaisons permettant de greffer des motifs de reconnaissance sur les châssis moléculaires, on peut citer les liaisons amide, ester, éther, amine, oxime, phosphate, alcène, alcyne, hydrazide et disulfure.
Selon une variante, le châssis moléculaire comprend au moins une liaison oxyamine ou aldéhyde susceptible de réagir avec au moins une fonction présente sur le support solide, en particulier pour former une liaison oxime.
Les motifs de reconnaissance peuvent être greffés sur le châssis moléculaire, notamment lorsque celui-ci comprend des résidus acides aminés, en utilisant la chimie des oxyamines, en particulier dans le cas où les motifs de reconnaissance sont des sucres. Dans ce cas, le châssis moléculaire peut porter un groupe dérivé carbonylé (aldéhyde ou cétone) et le sucre peut être modifié en position anomérique par une fonction oxyamine (-ONH2), ou vice-versa le sucre peut porter une fonction carbonylée, notamment sur son extrémité réductrice, et le châssis moléculaire peut porter une fonction oxyamine (-ONH2).
Tout particulièrement, au moins une fonction réactive portée par le châssis moléculaire est protégée ou masquée, notamment par un résidu sérine.
Dans le cas où les fonctions réactives, c'est-à-dire destinées à réagir avec les motifs de reconnaissance, sont protégées ou masquées, il y a lieu de procéder à une étape de déprotection ou de régénération pour libérer les fonctions réactives.
Par exemple lorsque la face supérieure du châssis moléculaire porte une ou des sérines, celles-ci peuvent être oxydées, notamment par du périodate de sodium, de manière à
obtenir des fonctions aldéhydes glyoxyliques (-CO-CHO).
A l'issue de l'étape de déprotection, il est alors possible de greffer les motifs de reconnaissance sur les châssis moléculaires.
Les motifs de reconnaissance peuvent en particulier être des sucres portant une fonction oxyamine apte à réagir avec les fonctions aldéhydes des châssis moléculaires pour former des liaisons oximes.
Selon une variante, les motifs de reconnaissance peuvent être greffés sur le châssis moléculaire via un espaceur.
Parmi les types de greffage possible, on peut citer la réaction d'une fonction aldéhyde présente sur le support solide avec une fonction oxyamine présente sur la face inférieure du châssis moléculaire. Cette réaction est, en général, efficace et sélective, elle conduit à la formation d'une liaison oxime. Ainsi, tout particulièrement, le support solide est lié au châssis moléculaire via une liaison oxime.
L'étape de greffage du châssis moléculaire portant les motifs de reconnaissance sur le support solide peut être réalisée par le dépôt de gouttes de solution comprenant les molécules châssis moléculaire-motifs de reconnaissance, soit manuellement, ce qui donne un diamètre de plots d'environ 1 mm, soit par un automate, ce qui permet de réduire la taille du plot, par exemple à 180 m.
Selon un autre mode de réalisation, le châssis moléculaire est greffé sur le support solide, puis les motifs de reconnaissance sont ensuite greffés sur le châssis moléculaire.
Ce procédé de fabrication d'un support solide permettant une présentation multivalente de motifs de reconnaissance peut comprendre au moins les étapes suivantes consistant à
25- greffer le châssis moléculaire sur le support solide, - greffer les motifs de reconnaissance au châssis moléculaire.
Ce procédé peut comprendre en outre au moins une des étapes suivantes consistant à :
- masquer et/ou protéger les fonctions réactives du support solide n'ayant pas réagi avec le châssis moléculaire et pouvant perturber des étapes ultérieures et - déprotéger les fonctions réactives du châssis moléculaire destinées à réagir avec les motifs de reconnaissance.
Ce mode de réalisation est particulièrement intéressant dans la mesure où il peut permettre de réaliser un support présentant une grande variété de motifs de reconnaissance à
partir d'un seul châssis moléculaire.
Dans ce cas, les fonctions destinées à réagir avec les motifs de reconnaissance, par exemple présentes sur la face supérieure du châssis moléculaire, ne réagissent pas avec les fonctions présentes sur le support solide, soit par leur nature même, soit parce qu'elles sont protégées ou masquées.
L'immobilisation du châssis moléculaire sur le support solide peut se faire par la réaction d'une fonction portée par le support solide avec au moins une fonction portée par le châssis moléculaire, en particulier située sur la face inférieure du châssis moléculaire. Tout particulièrement, la fonction portée par le support solide est une fonction aldéhyde, et la fonction portée par le châssis moléculaire est une oxyamine, ce qui conduit à la formation d'une liaison oxime.
Cette étape de greffage peut se faire par le dépôt d'une solution comprenant le châssis moléculaire sur le support solide. Le dépôt pouvant avoir lieu sur toute la surface de ce support ou uniquement à certains endroits.
Cette étape de greffage du châssis moléculaire peut être suivie d'une étape qui permet de masquer les fonctions réactives du support solide n'ayant pas réagi avec le châssis moléculaire, par exemple en mettant en contact le support solide avec une solution d'hydroxylamine pour masquer les fonctions aldéhydes n'ayant pas réagi.
Selon une variante, au moins un motif de reconnaissance est greffé sur le châssis moléculaire par réaction avec au moins une fonction réactive dudit châssis moléculaire Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre une étape de saturation qui peut consister à absorber une protéine ne reconnaissant pas de manière spécifique le motif de reconnaissance, comme par exemple de la sérum albumine bovine (BSA). Cette étape peut notamment permettre d'éviter l'absorption non spécifique de protéines, ou cibles, sur la surface lors de l'étape de reconnaissance du motif de reconnaissance, par exemple par la protéine à détecter. Cette étape de saturation peut permettre de diminuer le bruit de fond.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a encore pour objet une puce comprenant au moins un support solide tel que défini ci-dessus ou obtenu par un procédé tel que défini ci-dessus.
Il peut en particulier s'agir d'une puce à sucres qui présentent un intérêt majeur notamment dans l'analyse haut-débit des protéines impliquées dans la reconnaissance des sucres. Parmi les résidus susceptibles de faire fonction de motif de reconnaissance on peut citer les résidus osidiques impliqués dans de nombreuses pathologies, comme le cancer (présence de marqueurs tumoraux à base de sucres), le SIDA, ou encore issus d'agressions par des agents pathogènes et bactériens, les agents pathogènes ou bactériens pouvant présenter à leurs surfaces des motifs de reconnaissance, comme des récepteurs, à motif saccharidiques.
On peut également envisager la recherche d'antigène, de bactérie et virus dans des fluides biologiques à l'aide de ces puces.
L'invention peut encore être utilisée dans le cadre de la détection d'agents pathogènes dans l'eau ou dans l'air.
L'invention peut être également utilisable dans la découverte de médicaments, par la reconnaissance d'antagonistes ou d'agonistes de récepteurs cellulaires basés sur la reconnaissance de sucres dans le cadre de criblage 5 haut-débit.
L'invention peut également servir pour l'étude de la spécificité et de l'affinité de sucres naturels mais également synthétiques. Le typage des cellules et/ou des protéines impliquées dans la reconnaissance au sein de
10 l'organisme et une corrélation avec la structure du sucre peut également être envisagée.
La présente invention concerne encore l'utilisation de châssis moléculaire permettant de lier de manière 15 multivalente au moins un motif de reconnaissance ou présentant au moins un motif de reconnaissance de manière multivalente pour fonctionnaliser une surface, en particulier avec des sucres.
Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et ne peuvent en aucun cas conduire à limiter l'invention.
Exemples Exemple 1 Préparation d'une puce permettant la détection de lectine On prépare :
- une solution aqueuse (A) comprenant 30 ~tM de composé
(A) de formule (II) suivante I
X1 K_ X
G ~ A I~
~
K K noms* K
P
I
z Formule (II) dans laquelle X1, XZ, X3 et X4 représentent chacun -NHCOCH=NOR, R représente un lactose et Z représente -NHCOCHZONH2, - une solution aqueuse (B) comprenant 30 ~tM de R-ONH2, R
représente un lactose, - une solution aqueuse (C) comprenant 30 ~tM d'un composé
(C) de formule ( II ) ci-dessus dans laquelle Xl, X2, X3 et X4 représentent chacun -NHCOCH=NOR, R représente un -N-acétylgalactose, et Z représente -NHCOCH2ONH2, et - une solution aqueuse (D) comprenant 30 M de R-ONH2, R
représente un N-acétylgalactose.
On dépose manuellement ou à l'aide d'un robot (par exemple doté de pipettes piézo-électriques comme le BioChip Arrayer 1 de Packard Instrument), une goutte de chacune de ces compositions sur une partie d'une plaque de verre fonctionnalisé par un aldéhyde, par exemple fabriquées selon un procédé décrit dans le document EN 0016940.
La plaque obtenue est représentée schématiquement en figure 1 :
- la ligne A représente les spots obtenus avec la solution (A), - la ligne B représente les spots obtenus avec la solution (B), - la ligne C représente les spots obtenus avec la solution (C), - la ligne D représente les spots obtenus avec la solution (D).
Exemple 2 détection de lectine-FITC spécifique du lactose par une puce de l'exemple 1 On effectue ensuite un marquage direct d'une puce de l'exemple 1 avec de la lectine-FITC spécifique du lactose. On observe alors une détection spécifique de ladite lectine par la partie de la puce présentant de manière multivalente, en l'occurrence tétravalente, le motif de reconnaissance lactose. Le résultat est montré en figure 2.
On observe sur la figure 2 que seuls les spots obtenus avec les châssis moléculaires portant quatre motifs lactose détectent les lectines-FITC spécifiques du lactose à 30 M.
Exemple 3 : détection de lectine-FITC spécifique du N-acétylgalactose par une puce de l'exemple 1 On effectue un marquage direct d'une puce de l'exemple 1, avec la lectine-FITC spécifique du N-acétylgalactose. On observe alors une détection spécifique de ladite lectine par la partie de la plaque présentant de manière multivalente, en l'occurrence tétravalente, le motif de reconnaissance N-acétylgalactose. Le résultat est montré en figure 3.
On observe sur la figure 3 que seuls les spots obtenus avec les châssis moléculaires portant quatre motifs N-acétylgalactose détectent les lectines-FITC spécifiques du N-acétylgalactose à 30 M.
Exemple 4 : Préparation d'un support solide sur lequel est greffé un châssis moléculaire puis des motifs de reconnaissance On prépare une solution aqueuse (E) comprenant 50 M
d'un châssis moléculaire (E) répondant à la formule (II) dans laquelle X1, Xa, X3 et X4 représentent chacun un résidu sérine, et Z représente -NHCOCH2ONHa.
On fonctionnalise une plaque de verre portant des groupements aldéhydes en la trempant dans la solution de châssis moléculaire (E).
On effectue ensuite une étape dite de saturation consistant à faire réagir les fonctions aldéhydiques de la plaque de verre n'ayant pas réagi avec de l'hydroxylamine, en trempant ladite plaque dans une solution d'hydroxylamine à 10 mM.
On effectue ensuite l'oxydation des sérines en aldéhydes en trempant la plaque dans une solution de périodate de sodium à 10 mM pendant 60 minutes.
On dépose ensuite une goutte d'une solution de N-acétylgalactose portant une fonction -O-NH2 sur le carbone anomérique.
Puis on effectue une étape de saturation avec une solution de Sérum Albumine Bovine (BSA).
La plaque obtenue est représentée schématiquement en figure 4.
Enfin, on effectue une révélation par un marquage lectine-FITC spécifique de la N-acétylgalactose, et passage au scanner. Le résultat est montré en figure 5.
On observe sur la figure 5 que les spots obtenus avec les châssis moléculaires portant quatre motifs N-acétylgalactose obtenus tels que décrits ci-dessus permettent la détection des lectines-FITC spécifiques du N-acétylgalactose à 30 ~tM.
Exemple 5 : Préparation d'un support solide sur lequel est greffé un châssis moléculaire puis des motifs de reconnaissance On prépare une solution aqueuse (E) comprenant 50 M
d'un châssis moléculaire (E) répondant à la formule (II) dans laquelle X1, X2, X3 et X4 représentent chacun un résidu sérine, et Z représente -NHCOCHZONH2.
On fonctionnalise une plaque de verre portant des groupements aldéhydes en la trempant dans la solution de châssis moléculaire (E) pendant 30 minutes.
On effectue ensuite une étape dite de saturation consistant à faire réagir les fonctions aldéhydiques de la plaque de verre n'ayant pas réagi avec de l'hydroxylamine, en trempant ladite plaque dans une solution d'hydroxylamine à 10 mM.
On effectue ensuite l'oxydation des sérines en aldéhydes en trempant la plaque dans une solution de périodate de sodium à 10 mM pendant 60 minutes.
On dépose ensuite une goutte d'une solution à 50 M de N-acétylgalactose ou de mannose portant une fonction -O-NH2 sur le carbone anomérique. On laisse incuber pendant 30 minutes et on lave à l'eau, puis SDS 0,2% puis de nouveau à l'eau.
Puis on effectue une étape de saturation avec une solution de Sérum Albumine Bovine (BSA).
Enfin, on effectue une révélation par un marquage indirect : On trempe la plaque dans une solution de lectine spécifique de la N-acétylgalactose ou du mannose (concentration 10 Mg/mL) et on révèle avec la streptavidine CY3, et passage au scanner. Le résultat est montré en figure 1.
On observe sur la figure 6 que les spots obtenus avec les châssis moléculaires portant quatre motifs N-acétylgalactose obtenus tels que décrits ci-dessus permettent la détection des lectines correspondantes spécifiques du N-acétylgalactose et que les châssis moléculaires portant quatre motifs mannose obtenus tels que décrits ci-dessus permettent la détection des lectines correspondantes spécifiques du mannose à 50 M.
En outre, nous observons une bonne sélectivité de la reconnaissance : en effet, avec les châssis moléculaires portant quatre motifs N-acétylgalactose obtenus tels que décrits ci-dessus nous n'avons pas de signal avec des 5 lectines correspondantes spécifiques du mannose et que les châssis moléculaires portant quatre motifs mannose obtenus tels que décrits ci-dessus nous n'avons pas de signal avec des lectines correspondantes spécifiques du N-acétylgalactose.
10 Plus précisément, la figure 6 représente - Etape 1 : Fonctionnalisation de la plaque de verre par le châssis moléculaire (E) puis saturation par NH2OH
- Etape 2 Oxydation des résidus sérine en aldéhyde - Etape 3 Dépot de gouttes d'une solution à 50 ~tM de N-15 acétylgalactose (ligne 1) ou de mannose (ligne 2) portant une fonction -O-NHa - Etape 4. Révélation par marquage indirect, Ligne 1 lectine biotinylée spécifique de la N-acétylgalactose puis streptavidine CY3 et ligne 2 lectine biotinylée 20 spécifique du mannose puis streptavidine CY3 (concentration 10 pg/ml).
La présente invention concerne encore l'utilisation de châssis moléculaire permettant de lier de manière 15 multivalente au moins un motif de reconnaissance ou présentant au moins un motif de reconnaissance de manière multivalente pour fonctionnaliser une surface, en particulier avec des sucres.
Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et ne peuvent en aucun cas conduire à limiter l'invention.
Exemples Exemple 1 Préparation d'une puce permettant la détection de lectine On prépare :
- une solution aqueuse (A) comprenant 30 ~tM de composé
(A) de formule (II) suivante I
X1 K_ X
G ~ A I~
~
K K noms* K
P
I
z Formule (II) dans laquelle X1, XZ, X3 et X4 représentent chacun -NHCOCH=NOR, R représente un lactose et Z représente -NHCOCHZONH2, - une solution aqueuse (B) comprenant 30 ~tM de R-ONH2, R
représente un lactose, - une solution aqueuse (C) comprenant 30 ~tM d'un composé
(C) de formule ( II ) ci-dessus dans laquelle Xl, X2, X3 et X4 représentent chacun -NHCOCH=NOR, R représente un -N-acétylgalactose, et Z représente -NHCOCH2ONH2, et - une solution aqueuse (D) comprenant 30 M de R-ONH2, R
représente un N-acétylgalactose.
On dépose manuellement ou à l'aide d'un robot (par exemple doté de pipettes piézo-électriques comme le BioChip Arrayer 1 de Packard Instrument), une goutte de chacune de ces compositions sur une partie d'une plaque de verre fonctionnalisé par un aldéhyde, par exemple fabriquées selon un procédé décrit dans le document EN 0016940.
La plaque obtenue est représentée schématiquement en figure 1 :
- la ligne A représente les spots obtenus avec la solution (A), - la ligne B représente les spots obtenus avec la solution (B), - la ligne C représente les spots obtenus avec la solution (C), - la ligne D représente les spots obtenus avec la solution (D).
Exemple 2 détection de lectine-FITC spécifique du lactose par une puce de l'exemple 1 On effectue ensuite un marquage direct d'une puce de l'exemple 1 avec de la lectine-FITC spécifique du lactose. On observe alors une détection spécifique de ladite lectine par la partie de la puce présentant de manière multivalente, en l'occurrence tétravalente, le motif de reconnaissance lactose. Le résultat est montré en figure 2.
On observe sur la figure 2 que seuls les spots obtenus avec les châssis moléculaires portant quatre motifs lactose détectent les lectines-FITC spécifiques du lactose à 30 M.
Exemple 3 : détection de lectine-FITC spécifique du N-acétylgalactose par une puce de l'exemple 1 On effectue un marquage direct d'une puce de l'exemple 1, avec la lectine-FITC spécifique du N-acétylgalactose. On observe alors une détection spécifique de ladite lectine par la partie de la plaque présentant de manière multivalente, en l'occurrence tétravalente, le motif de reconnaissance N-acétylgalactose. Le résultat est montré en figure 3.
On observe sur la figure 3 que seuls les spots obtenus avec les châssis moléculaires portant quatre motifs N-acétylgalactose détectent les lectines-FITC spécifiques du N-acétylgalactose à 30 M.
Exemple 4 : Préparation d'un support solide sur lequel est greffé un châssis moléculaire puis des motifs de reconnaissance On prépare une solution aqueuse (E) comprenant 50 M
d'un châssis moléculaire (E) répondant à la formule (II) dans laquelle X1, Xa, X3 et X4 représentent chacun un résidu sérine, et Z représente -NHCOCH2ONHa.
On fonctionnalise une plaque de verre portant des groupements aldéhydes en la trempant dans la solution de châssis moléculaire (E).
On effectue ensuite une étape dite de saturation consistant à faire réagir les fonctions aldéhydiques de la plaque de verre n'ayant pas réagi avec de l'hydroxylamine, en trempant ladite plaque dans une solution d'hydroxylamine à 10 mM.
On effectue ensuite l'oxydation des sérines en aldéhydes en trempant la plaque dans une solution de périodate de sodium à 10 mM pendant 60 minutes.
On dépose ensuite une goutte d'une solution de N-acétylgalactose portant une fonction -O-NH2 sur le carbone anomérique.
Puis on effectue une étape de saturation avec une solution de Sérum Albumine Bovine (BSA).
La plaque obtenue est représentée schématiquement en figure 4.
Enfin, on effectue une révélation par un marquage lectine-FITC spécifique de la N-acétylgalactose, et passage au scanner. Le résultat est montré en figure 5.
On observe sur la figure 5 que les spots obtenus avec les châssis moléculaires portant quatre motifs N-acétylgalactose obtenus tels que décrits ci-dessus permettent la détection des lectines-FITC spécifiques du N-acétylgalactose à 30 ~tM.
Exemple 5 : Préparation d'un support solide sur lequel est greffé un châssis moléculaire puis des motifs de reconnaissance On prépare une solution aqueuse (E) comprenant 50 M
d'un châssis moléculaire (E) répondant à la formule (II) dans laquelle X1, X2, X3 et X4 représentent chacun un résidu sérine, et Z représente -NHCOCHZONH2.
On fonctionnalise une plaque de verre portant des groupements aldéhydes en la trempant dans la solution de châssis moléculaire (E) pendant 30 minutes.
On effectue ensuite une étape dite de saturation consistant à faire réagir les fonctions aldéhydiques de la plaque de verre n'ayant pas réagi avec de l'hydroxylamine, en trempant ladite plaque dans une solution d'hydroxylamine à 10 mM.
On effectue ensuite l'oxydation des sérines en aldéhydes en trempant la plaque dans une solution de périodate de sodium à 10 mM pendant 60 minutes.
On dépose ensuite une goutte d'une solution à 50 M de N-acétylgalactose ou de mannose portant une fonction -O-NH2 sur le carbone anomérique. On laisse incuber pendant 30 minutes et on lave à l'eau, puis SDS 0,2% puis de nouveau à l'eau.
Puis on effectue une étape de saturation avec une solution de Sérum Albumine Bovine (BSA).
Enfin, on effectue une révélation par un marquage indirect : On trempe la plaque dans une solution de lectine spécifique de la N-acétylgalactose ou du mannose (concentration 10 Mg/mL) et on révèle avec la streptavidine CY3, et passage au scanner. Le résultat est montré en figure 1.
On observe sur la figure 6 que les spots obtenus avec les châssis moléculaires portant quatre motifs N-acétylgalactose obtenus tels que décrits ci-dessus permettent la détection des lectines correspondantes spécifiques du N-acétylgalactose et que les châssis moléculaires portant quatre motifs mannose obtenus tels que décrits ci-dessus permettent la détection des lectines correspondantes spécifiques du mannose à 50 M.
En outre, nous observons une bonne sélectivité de la reconnaissance : en effet, avec les châssis moléculaires portant quatre motifs N-acétylgalactose obtenus tels que décrits ci-dessus nous n'avons pas de signal avec des 5 lectines correspondantes spécifiques du mannose et que les châssis moléculaires portant quatre motifs mannose obtenus tels que décrits ci-dessus nous n'avons pas de signal avec des lectines correspondantes spécifiques du N-acétylgalactose.
10 Plus précisément, la figure 6 représente - Etape 1 : Fonctionnalisation de la plaque de verre par le châssis moléculaire (E) puis saturation par NH2OH
- Etape 2 Oxydation des résidus sérine en aldéhyde - Etape 3 Dépot de gouttes d'une solution à 50 ~tM de N-15 acétylgalactose (ligne 1) ou de mannose (ligne 2) portant une fonction -O-NHa - Etape 4. Révélation par marquage indirect, Ligne 1 lectine biotinylée spécifique de la N-acétylgalactose puis streptavidine CY3 et ligne 2 lectine biotinylée 20 spécifique du mannose puis streptavidine CY3 (concentration 10 pg/ml).
Claims (25)
1. Support solide lié à au moins un châssis moléculaire permettant de lier de manière multivalente au moins un motif de reconnaissance ou présentant au moins un motif de reconnaissance de manière multivalente.
2. Support solide selon la revendication 1 caractérisé en ce que le châssis moléculaire présente au moins deux faces, et notamment deux faces.
3. Support solide selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le châssis moléculaire est un cyclopeptide, notamment définissant deux faces.
4. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le châssis moléculaire est un cyclopeptide présentant au moins un coude, notamment présentant deux coudes, notamment formés par l'enchaînement (L)Pro-(D)AA ou (D)Pro-(L)AA.
5. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le châssis moléculaire est un cyclopeptide comprenant 10 ou 14 résidus d'acides aminés.
6. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le châssis moléculaire est un cyclopeptide de formule (I) suivante :
dans laquelle Y représente une entité chimique formant une liaison avec un support solide et X1, X2, X3 et X4 représentent chacun indépendamment les uns des autres une entité chimique, protégée, masquée, ou non, permettant de lier, ou liant, au moins un motif de reconnaissance.
dans laquelle Y représente une entité chimique formant une liaison avec un support solide et X1, X2, X3 et X4 représentent chacun indépendamment les uns des autres une entité chimique, protégée, masquée, ou non, permettant de lier, ou liant, au moins un motif de reconnaissance.
7. Support solide selon l'une quelconque des revendications 2 à 6 caractérisé en ce que le châssis moléculaire présente plusieurs motifs de reconnaissance greffés sur sa face supérieure, notamment plusieurs fois le même motif.
8. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que le châssis moléculaire est lié au support solide par au moins une liaison covalente, par exemple du type liaison éther, ester, amine, amide, thioéther, oxime, phosphate, sulfate, alcène, alcyne, hydrazide et disulfure, et en particulier une liaison oxime.
9. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que le châssis moléculaire est lié indirectement au support solide, notamment via au moins un espaceur.
10. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que le support est sous forme de plaque, notamment des plaques à puits, de bille, notamment de microbille, de canaux notamment des capillaires ou chambres, de nanostructures notamment des nanotubes de carbone.
11. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que le support comprend du verre, du silicium, des oxides de semi-conducteurs, par exemple l'oxide de silicium, du plastique, de l'or, des oxydes métalliques, notamment tels que oxyde d'indium et d'étain, des sols-gels, des terres rares, des assemblages organiques tels que des nanotubes de carbone.
12. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 caractérisé en ce que le motif de reconnaissance est une molécule d'intérêt, en particulier d'intérêt biologique, notamment choisi dans le groupe comprenant les sucres, acides nucléiques, peptides, protéines, molécules mixtes , notamment glycopeptides, glycoprotéines, phospholipides, et un mélange de celles-ci.
13. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 caractérisé en ce que le motif de reconnaissance est lié au châssis moléculaire par au moins une liaison covalente, notamment une liaison éther, ester, amine, amide, thioéther, oxime, phosphate, alcène, alcyne, hydrazide, disulfure et en particulier une liaison oxime.
14. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 caractérisé en ce que le motif de reconnaissance est lié indirectement au châssis moléculaire.
15. Procédé de fabrication d'un support solide comprenant au moins un châssis moléculaire permettant de présenter ou présentant au moins un motif de reconnaissance de manière multivalente comprenant au moins l'étape consistant à greffer au moins un châssis moléculaire permettant de présenter ou présentant au moins un motif de reconnaissance de manière multivalente sur un support solide.
16. Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce que le support solide comprend au moins une fonction aldéhyde ou une liaison oxyamine.
17. Procédé selon la revendication 15 ou 16 caractérisé
en ce que le châssis moléculaire comprend au moins une liaison oxyamine ou aldéhyde susceptible de réagir avec au moins une fonction présente sur le support solide.
en ce que le châssis moléculaire comprend au moins une liaison oxyamine ou aldéhyde susceptible de réagir avec au moins une fonction présente sur le support solide.
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 17 caractérisé en ce que le support solide est lié au châssis moléculaire via une liaison oxime.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 18 caractérisé en ce que au moins une fonction réactive portée par le châssis moléculaire est protégée ou masquée, notamment par un résidu sérine.
20. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que au moins une fonction réactive portée par le châssis moléculaire est déprotégée ou régénérée, et en particulier au moins un résidu sérine est oxyde en aldéhyde glyoxylique.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 20 caractérisé en ce que au moins un motif de reconnaissance est greffé sur le châssis moléculaire par réaction avec au moins une fonction réactive dudit châssis moléculaire.
22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 21 caractérisé en ce que le motif de reconnaissance est choisi parmi une molécule d'intérêt, en particulier d'intérêt biologique, notamment un sucre, acide nucléique, peptide, protéine, autre molécule organique ou un mélange de ceux-ci, notamment glycopeptide, glyco-protéine, phospholipide.
23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 22 caractérisé en ce que le motif de reconnaissance porte au moins une fonction aldéhyde ou oxyamine réagissant avec au moins une fonction oxyamine ou aldéhyde, et en particulier avec un groupe aldéhyde glyoxylique, portée par le châssis moléculaire pour former une liaison oxime.
24. Puce, notamment à sucre, comprenant au moins un support solide tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 ou obtenu par un procédé tel que défini selon l'une quelconque des revendications 15 à 23.
25. Utilisation de châssis moléculaire permettant de lier de manière multivalente au moins un motif de reconnaissance ou présentant au moins un motif de reconnaissance de manière multivalente pour fonctionnaliser une surface.
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