KR101020212B1 - 높은 당쇄고정 효율을 가진 당쇄 칩의 표면처리 기술 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 높은 당쇄고정 효율을 가진 당쇄 칩의 표면처리 기술에 관한 것으로, 보다 구체적으로 고체기질 표면에 반응성이 높은 유기분자를 사용하여 자기조립 단분자층을 형성하고 그 위에 링커분자를 연결함으로써 당쇄의 고정화 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의해 제조된 당쇄 고정용 칩은 기존 방법보다 30배 높은 농도의 당쇄용액을 사용하여도 해당 당쇄가 효율적으로 고정되며, 당쇄 칩 제작에 있어서 고가인 당쇄를 적게 사용하므로 비용 측면에서 큰 장점을 가지고, 상기 당쇄칩은 고정된 탄수화물과 특이적으로 결합하는 단백질 및 병원체 검출을 위한 목적에 유용하게 이용될 수 있다.
탄수화물 칩, 당쇄 칩, 표면처리 기술
Description
본 발명은 높은 당쇄고정 효율을 가지는 당쇄 칩의 표면처리 기술에 관한 것이다.
당쇄칩은 고체기질 표면에 다양한 당쇄(수~수십 개의 탄수화물로 이루어진 당복합체)를 고정시킨 칩으로, 당쇄에 특이적인 결합을 하는 렉틴이나 항체 등의 검출에 사용된다. 암세포와 같은 특정한 세포는 표면에 고유한 당쇄를 포함하는 경우가 많아 당쇄가 특정 세포의 마커로 활용되는 경우가 있다. 또한, 세포표면 당쇄는 세포와 세포 상호작용에 매우 중요한 역할을 하며, 경우에 따라서 특정 당쇄의 출현은 질병과 긴밀한 연관관계가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 당쇄와 특이적 상호작용을 하는 단백질을 규명하거나 당쇄에 대한 선택적인 항체를 개발하는 것은 세포의 특성연구나 질병진단의 기회를 제공할 수 있다는 차원에서 매우 중요하다. 당쇄칩은 특정 당쇄에 특이적인 항체나 단백질 발굴을 위한 효율적인 수단을 제공하므로 당체학이나 단백질체학 연구에 있어서 매우 중요한 의미를 가진다.
탄수화물(carbohydrate)과 특이적으로 결합하는 단백질을 렉틴(lectin)이라 하며, 렉틴은 탄수화물과의 상호작용을 통하여 세포-세포 인식, 흡착 및 세포 신호전달, 세포 활성화 등 많은 생물학적 과정에서 중요한 역할을 담당한다. 단백질이나 핵산과는 달리 탄수화물의 분자생물학적 역할에 대해서는 연구가 미진한 상태이며, 최근 들어 탄수화물과 단백질간의 상호작용에 관한 연구가 가속화 되고 있다.
그러나 탄수화물과 단백질 사이의 상호작용을 연구하는데 있어서, 탄수화물의 구조적 복잡성 때문에 합성이 어려워서 대부분의 복잡한 당쇄는 천연으로부터 분리 및 정제를 통해서만 얻을 수 있고 매우 제한된 양만을 얻을 수 있으므로 당쇄연구는 많은 비용을 요구한다.
이러한 어려움 때문에 당쇄 연구의 중요한 수단으로 대두되는 것이 당쇄칩이다. 그러나 당쇄칩 제작을 위하여 기존에 알려진 방법은 30 mM 정도의 고농도의 당쇄를 사용하여야 하므로 보다 효율적인 당쇄고정화 방법의 개발이 요구되어 왔다.
자기 조립 단분자층을 형성하여 고체 기질 표면을 개질하는 경우 각 반응 단계를 진행함에 따라, 첫 단계의 표면 처리 물질의 반응성이 최종 표면 처리 물질의 표면 결합 효율에 영향을 미치는 특성을 가진다. 그러므로 당쇄칩에서는, 첫 단계의 표면 처리 물질이 탄수화물 고정화에 가장 큰 영향을 미친다고도 할 수 있다.
이에 본 발명자들은 유리 기질에 높은 반응성을 가진다고 알려져 있으며, 유리 기질 표면에 개질을 위해 많이 사용하는 실란(silane) 계열의 물질을 일측 말단에 가지며, 아민(amine)에 높은 반응성을 가지는 isocyannate를 타측 말단에 가지는 3-(Triethoxysilyl)propyl Isocyannate를 유리 기질에 처리하여 표면에 개질하였다. 또한 비특이적 결합을 저해하는데 기여하는 물질로 알려져 있는 올리고에틸렌글리콜 및 탄수화물의 환원당 말단과 효과적으로 결합할 수 있는 히드라진(hydrazine)을 차례대로 처리하여 기질 표면에 자기 조립 단분자층(self assembly monolayer)을 형성함으로써 당쇄의 고정을 위한 칩의 제조 방법을 확립하였다. 이렇게 제조된 당쇄 칩은 낮은 농도의 당쇄까지도 효과적으로 고정할 수 있는 능력을 가지며, 기존에 알려진 방법보다 40배 낮은 농도의 당쇄까지 공정할 수 있음을 확인하므로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 기존 당쇄 칩보다 40배 낮은 농도의 당쇄를 고효율적으로 고정할 수 있는 당쇄 칩을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고효율 당쇄 고정용 칩의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법에 의해 탄수화물이 집적된 고효율로 당쇄가 고정된 칩의 제조방법을 제공한다.
또한 상기 방법에 의해 제조된 고효율로 당쇄가 고정된 칩을 제공한다.
아울러, 상기 방법으로 제조된 고효율 당쇄 고정용 칩을 이용한 렉틴의 검출 및 정량 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 고효율 당쇄 고정용 칩은 이소시아네이트 표면을 가진 유리 기판을 제작하여 효율이 높은 반응을 선택하여 표면 처리를 진행함으로써, 기존 당쇄 칩보다 30배 정도 적은 양의 탄수화물을 적용하여도 기존의 칩만큼 민감도를 확보할 수 있을 정도로 당쇄 고정효율이 우수하므로 당쇄칩 제작 비용을 획기적으로 절감할 수 있다.
본 발명은 고효율 당쇄 고정용 칩의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 고효율 당쇄 고정용 칩은 하기와 같은 방법으로 제조될 수 있다:
1) 3-(Triethoxysilyl)propyl isocyanate를 처리하여 슬라이드 글라스 위에 이소시아네이트 표면을 형성하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 슬라이드 글라스에 2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스(에틸아민)을 처리하여 N-Boc-2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스에틸아민 표면을 형성하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 슬라이드 글라스에 삼불화초산(trifluoroacetic acid)과 메틸렌클로라이드(methylene chloride) 혼합액(1:1)을 처리하여 보호기(Boc)을 제거하여 아민이 노출되게 하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 슬라이드 글라스에 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 처리하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 슬라이드 글라스에 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)/NHS(N-hydroxysuccinimide)를 처리하여 하이드라진(hydrazine)을 처리하는 단계.
또한 본 발명의 고효율 당쇄 고정용 칩은 하기와 같은 방법으로 제조될 수 있다:
1) 3-(Triethoxysilyl)propyl isocyanate를 처리하여 슬라이드 글라스 위에 이소시아네이트 표면을 형성하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 슬라이드 글라스에 2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스(에틸아민)을 처리하여 N-Boc-2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스에틸아민 표면을 형성하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 슬라이드 글라스에 삼불화초산(trifluoroacetic acid)과 메틸렌클로라이드(methylene chloride) 혼합액(1:1)을 처리하여 보호기(Boc)을 제거하여 아민이 노출되게 하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 슬라이드 글라스 위에 DSC(disuccinimidyl carbonate)를처리하여 NHS(N-hydroxysuccinimide)가 노출되게 하는 단계;
5) 상기 단계 4)의 슬라이드 글라스 위에 N-Boc-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스에틸아민을 처리하는 단계;
6) 상기 단계 5)의 슬라이드 글라스 위에 삼불화초산(trifluoroacetic acid)과 메틸렌클로라이드(methylene chloride) 혼합액(1:1)을 처리하여 보호기(Boc)을 제거하여 아민이 노출되게 하는 단계;
7) 상기 단계 6)의 슬라이드 글라스에 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 처리하는 단계; 및
8) 상기 단계 7)의 슬라이드 글라스에 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)/NHS(N-hydroxysuccinimide)를 처리하여 하이드라진(hydrazine)을 처리하는 단계.
또한 본 발명은 상기 방법에 의해 탄수화물이 집적된 고효율로 당쇄가 고정된 칩의 제조방법을 제공한다.
상기 고효율로 당쇄가 고정된 칩은 하기와 같은 방법으로 제조될 수 있다:
1) 3-(Triethoxysilyl)propyl isocyanate를 처리하여 슬라이드 글라스 위에 이소시아네이트 표면을 형성하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 슬라이드 글라스에 2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스(에틸아민)을 처리하여 N-Boc-2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스에틸아민 표면을 형성하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 슬라이드 글라스에 삼불화초산(trifluoroacetic acid)과 메틸렌클로라이드(methylene chloride) 혼합액(1:1)을 처리하여 보호기(Boc)을 제거하여 아민이 노출되게 하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 슬라이드 글라스에 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 처리하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 슬라이드 글라스에 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)/NHS(N-hydroxysuccinimide)를 처리하여 하이드라진(hydrazine)을 처리하는 단계; 및
6) 상기 단계 5)의 슬라이드 글라스 위에 탄수화물을 집적하는 단계.
또한, 고효율로 당쇄가 고정된 칩은 하기와 같은 방법으로 제조될 수 있다:
1) 3-(Triethoxysilyl)propyl isocyanate를 처리하여 슬라이드 글라스 위에 이소시아네이트 표면을 형성하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 슬라이드 글라스에 2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스(에틸아민)을 처리하여 N-Boc-2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스에틸아민 표면을 형성하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 슬라이드 글라스에 삼불화초산(trifluoroacetic acid)과 메틸렌클로라이드(methylene chloride) 혼합액(1:1)을 처리하여 보호기(Boc)을 제거하여 아민이 노출되게 하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 슬라이드 글라스 위에 DSC(disuccinimidyl carbonate)를처리하여 NHS(N-hydroxysuccinimide)가 노출되게 하는 단계;
5) 상기 단계 4)의 슬라이드 글라스 위에 N-Boc-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스에틸아민을 처리하는 단계;
6) 상기 단계 5)의 슬라이드 글라스 위에 삼불화초산(trifluoroacetic acid)과 메틸렌클로라이드(methylene chloride) 혼합액(1:1)을 처리하여 보호기(Boc)을 제거하여 아민이 노출되게 하는 단계;
7) 상기 단계 6)의 슬라이드 글라스에 무수물(succinic anhydride)을 처리하는 단계;
8) 상기 단계 7)의 슬라이드 글라스에 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)/NHS(N-hydroxysuccinimide)를 처리하여 하이드라진(hydrazine)을 처리하는 단계; 및
9) 상기 단계 8)의 슬라이드 글라스 위에 탄수화물을 집적하는 단계.
상기 방법에 있어서, 슬라이드 글라스 위에 탄수화물의 집적 농도는 375 μM 내지 6 mM인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 탄수화물은 기존에 알려진 탄수화물 모두를 집적할 수 있으며, 당업자가 연구하고자 하는 목적에 따라 탄수화물을 집적할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 슬라이드 글라스 위에 집적되는 탄수화물은 렉틴, 콘카나발린 A(Concanavalin A), 밀배아 응집소(Wheat Germ Agglutinin), 락토-N-푸코펜토오즈-I(Lacto-N-fucopentaose I), 락토-N-푸코펜토오즈-II(Lacto-N-fucopentaose II), 3-Sulfated Lewis X, Lewis A, 3-Sialyl Lewis A, 혈액군 A 삼당류(Blood group A trisaccharide), 3-Sialyl Lewis X, NA2- Glycan, 혈액군 H 삼당류, 혈액군 B 삼당류로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명자들은 일반적인 방법에 따라, Piranha solution(황산:과산화수소=3:1)으로 슬라이드 글라스를 처리하여 글라스표면의 수산기(hydroxy group)가 활성화된 슬라이드 글라스를 준비하였다. 이후 3-(Triethoxysilyl)propyl isocyanate와 에탄올의 용액으로, 수산기가 활성화된 슬라이드 글라스를 처리하여 isocyanate(-NCO)기가 노출된 슬라이드 글라스(I)를 제조하였다. 본 발명자들은 2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스에틸아민(NH2CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2)을 다이-터셔리-부틸 다이카보네이트(Di-tert-butyl dicarbonate)로 처리하여 mono Boc으로 보호된 2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스에틸아민을 제조하였다. 이후 상기 슬라이드 글라스(I)에 N-Boc-2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스에틸아민으로 처리하여 슬라이드 글라스(II)를 제조하였고, 삼불화초산(trifluoroacetic acid)으로 보호기(Boc)를 제거함으로써 아민이 노출된 슬라이드 글라스(III)를 제조하였다. 이후 상기 슬라이드 글라스(III)을 Disucccinimidyl carbonate (DSC) DMF용액으로 처리하여 NHS(N-hydroxysuccinimide)가 노출된 슬라이드 글라스(IV)를 제조하였다. 이어서, 1%(w/v) N-Boc-2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스에틸아민 에탄올 용액으로 상온에서 12시간 처리하여 슬라이드 글라스 V를 제조하고 삼불화초산(trifluoroacetic acid)으로 보호기(Boc)를 제거함으로써 아민이 노출된 슬라이드 글라스(VI)를 제조하였다. 이후 아민기가 노출된 슬라이드 글라스 III과 VI을 succinic anhydride로 처리하여 III으로부터 카르복실기 표면 글라스 VIIa를 V로부터 카르복시 표면 글라스를 VIIb를 제작하였다. 또한 카르복실기 표면 글라스 VIIa와 VIIb를 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)/NHS(N-hydroxysuccinimide)로 처리하고 hydrazine을 작용시켜 하이드라진 표면을 가지는 슬라이드 글라스를 제조하였다. 이때 VIIa로부터 제조된 히드라진 표면칩을 당쇄고정용칩 I, VIIb로부터 제조된 히드라진 표면칩을 당쇄고정용칩 II라고 명명하였다.
본 발명자들은 상기와 같이 제조된 본 발명의 당쇄 고정용 칩 I 및 II에 당쇄고정 효율을 실험해 보았다. 다양한 농도(0.187 mM부터 6 mM)의 NA2 Glycan을 당쇄고정용칩 I과 II 위에 점적하고 Bovine serum albumin(BSA)으로 칩 표면을 blocking하여 제조된 칩에 FITC로 표지된 렉틴(Concanavaline A: ConA) 용액을 처리하여 렉틴 검출능력을 확인하였다. 또한, 각 단계별로 칩을 0.01% Tween 20을 포함한 PBS(phosphate buffered saline)로 세척함으로써 비특이적 결합을 제거하였다. Concanavaline A의 결합 정도는 GenPix 4200 형광스캐너(Axon camera)를 이용하여 표지된 FITC의 형광을 측정함으로써 확인하였다.
그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이 본 기술로 제작된 당쇄고정용칩 I과 II는 375 μM의 당쇄를 고정할 경우에도 렉틴을 검출하였으며, 이는 30 mM의 당쇄를 고정하는 기존방법(Org . Lett . Vol. 7, No. 19, 2005)에 비하여 매우 진보된 방법이라 할 수 있다.
또한 상기 방법에 의해 제조된 고효율로 당쇄가 고정된 칩을 제공한다.
아울러, 상기 방법으로 제조된 고효율 당쇄 고정용 칩을 이용한 렉틴의 검출 및 정량 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 렉틴의 검출 및 정량 분석 방법은 하기와 같다:
1) 상기 고효율로 당쇄가 고정된 칩을 시료와 반응시키는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 고효율로 당쇄가 고정된 칩을 분석하는 단계.
본 발명자들은 시판 중인 11종의 당쇄(표1)를 선정하여 5 mM 용액으로 만들고 실시예 2-1에 제시한 방법으로 당쇄고정용칩 II에 점적하여 당쇄칩을 제작하였다. 제작된 당쇄칩에 형광물질인 FITC로 표지된 2종류의 렉틴, Concanavalin A(ConA), Wheat Germ Agglutinin(WGA)을 2 ug/ml의 농도로 희석하여 당쇄칩과 1시간 동안 반응시키고 씻어낸 후 형광을 측정하였다.
그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, Concanavaline A 렉틴은 특이적 결합이 알려진 3-Sialyl Lewis X에 특이적인 결합하였으며, WGA는 NA2-Glycan에 특이적인 결합을 보였다.
렉틴의 결합은 형광이외에도 SPR 등을 이용하여 진행될 수 있으며, 특정 당쇄에 결합하는 항체나 렉틴의 검출은 암 발병, 염증, 기타 세균이나 바이러스 등에 의한 감염 여부의 진단에 응용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
당쇄
고정용 칩의 제조
<
1-1> 표면에 수산기를
활성화시킨
슬라이드 글라스 제조
슬라이드 글라스 표면의 수산기(hydroxy group)를 활성화시키기 위해 슬라이드 글라스를 페트리 접시에 넣고 슬라이드 글라스가 충분히 잠길 수 있도록 piranha solution(황산:과산화수소=3:1)을 부어준 후 60℃ 오븐에 넣었다. 20분 후, 슬라이드 글라스를 증류수로 세척하고, 페트리 접시에 넣고 표면이 잠기도록 증류수를 넣고 20분 동안 초음파 처리를 하였다. 다시 증류수로 세척하고 질소 가스를 이용하여 건조시켜 표면에 수산기가 활성화된 슬라이드 글라스를 준비하였다.
<
1-2>
isocyanate
기가 노출된 슬라이드 글라스(I) 제조
3-(Triethoxysilyl)propyl isocyanate를 에탄올에 희석하여 1%(w/v) 용액으로 제조하고, 수산기가 활성화된 슬라이드 글라스에 처리하여 1시간 동안 반응시켰다. 에탄올로 세척하고 3분 동안 초음파 처리를 한 후, 다시 에탄올로 세척하였다. 슬라이드 글라스를 오븐에서 110℃로 1시간 동안 구워 표면에 isocyanate(-NCO)기가 노출된 슬라이드 글라스(I)를 제조하였다. 이를 페트리 접시에 넣고 밀봉하여 데시케이터에 보관하였다.
<1-3> N-
Boc
-2,2'-(에틸렌-1,2-
다이옥시
)
비스에틸아민표면
슬라이드 글라스(
II
) 제조
1 g의 2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스(에틸아민)을 50 ㎖의 메탄올에 녹이고, 0.736 g의 다이-터셔리-부틸 다이카보네이트(Di-tert-butyl dicarbonate, 20)와 0.75 g의 트라이에틸아민을 30 ㎖의 메탄올에 녹인 용액을 0℃에서 천천히 적가한 후 상기 용액을 10시간 동안 상온에서 교반하였다.
용액을 감압유거한 후, 50 ㎖의 클로로포름에 다시 녹이고 탄산수소나트륨 수용액으로 두 번 씻어준 후, 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 다시 용액을 감압농축한 후, 1.03 g의 화합물 N-Boc-2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스에틸아민 표 면을 가진 슬라이드 글라스(II)를 제조하였다.
<
1-4>
아민기가
노출된 슬라이드 글라스(
III
) 제조
Isocyanate(-NCO)기가 노출된 슬라이드 글라스를 1%(w/v) N-Boc-2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스에틸아민 에탄올 용액으로 상온에서 12시간 처리하였다. 에탄올로 세척하고 질소가스로 건조시킨 후, 삼불화초산(trifluoroacetic acid)과 메틸렌클로라이드(methylene chloride) 혼합액(1:1)으로 2시간 처리하여 아민의 반응을 막는 보호기(Boc)를 제거하였다. 슬라이드 글라스를 메틸렌클로라이드, 에탄올의 순서로 세척하고 질소가스로 건조시켜 아민이 노출된 슬라이드 글라스(III)를 제조하였다.
<
1-5>
NHS
(N-
hydroxysuccinimide
)가 노출된 슬라이드 글라스(
IV
) 제조
1.024 g의 disucccinimidyl carbonate(DSC)와 0.69 ㎖의 diisopropylethyl amine을 최종 부피가 40 ㎖이 되도록 DMF에 용해시켜 100 mM DSC 용액을 제조하였다. 아민이 노출된 슬라이드 글라스를 페트리접시에 넣고 DSC 용액을 처리하여 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 후, DMF와 에탄올의 순서로 세척하고 질소가스로 건조시켜 NHS(N-hydroxysuccinimide)가 노출된 슬라이드 글라스(IV)를 제조하였다.
<
1-6>
아민기가
노출된 슬라이드 글라스(
VI
) 제조
NHS(N-hydroxysuccinimide)가 노출된 슬라이드 글라스(IV)를 1%(w/v) N-Boc- 2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스에틸아민 에탄올 용액으로 상온에서 12시간 동안 처리하여 두 개의 아민링커를 가진 슬라이드(V)를 제조하였다. 에탄올로 세척하고 질소가스로 건조시킨 후, 삼불화초산(trifluoroacetic acid)과 메틸렌클로라이드(methylene chloride) 혼합액(1:1)으로 상온에서 2시간 동안 반응시켜 아민의 반응을 막는 보호기(Boc)를 제거하였다. 슬라이드 글라스를 메틸렌클로라이드, 에탄올의 순서로 세척하고 질소가스로 건조시켜 아민이 노출된 슬라이드 글라스(VI)를 제조하였다.
<
1-7>
카르복시기가
노출된 슬라이드 글라스(
VIIa
와
VIIb
) 제조
10 g의 succinic anhydride를 100 ㎖의 DMF에 녹여 1 M 용액을 제조하였다. 아민기가 노출된 슬라이드 글라스 III과 V에 처리하여 12시간동 안 반응시켰다. DMF, 에탄올, 증류수의 순서로 세척하고 질소 가스를 이용하여 건조시키고 밀봉하여 데시케이터에 보관하였다. 슬라이드 글라스 III으로부터 제조된 카르복실기 표면 글라스를 슬라이드 글라스 VIIa, 슬라이드 글라스 V로부터 제조된 카르복시 표면 글라스를 슬라이드 글라스 VIIb로 명명하였다.
<1-8>
하이드라진
표면 처리된 슬라이드글라스(
VIII
) 제조:
당쇄고정용칩
I과
당쇄고정용칩
II
카르복시기가 노출된 슬라이드 글라스를 200 ㎕의 0.1 M EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride), 0.025 M NHS(N- hydroxysuccinimide) 수용액으로 상온에서 10분 동안 처리하고, 다시 3% hydrazine 수용액으로 0℃에서 1시간 동안 처리하였다. 에탄올로 세척하고 질소가스로 건조시켜 하이드라진 표면을 가지는 슬라이드 글라스를 제조하였다. 이때 슬라이드 글라스 VIIa로부터 제조된 히드라진 표면칩을 당쇄고정용칩 I으로, 슬라이드 글라스 VIIb로부터 제조된 히드라진 표면칩을 당쇄고정용칩 II라고 명명하였다.
<실시예 2> 당쇄 고정화 실험
<
2-1>
당쇄고정용칩
I과
II
의
당쇄고정
효율시험
다양한 농도(0.187 mM부터 6 mM)의 NA2 Glycan을 30% glycerol을 포함한 pH 5.2, 30 mM sodium acetate 완충액에 녹여 각각의 당쇄고정용칩 I과 II위에 점적한 후 마르지 않도록 습도를 조절하면서 50℃에서 12시간 동안 반응하였다(참고문헌: Org. Lett ., Vol. 7, No. 19, 2005). 1% Bovine serum albumin(BSA)으로 칩 표면을 블록킹(blocking)한 다음 당쇄칩을 2 ㎍/㎖의 렉틴(Concanavaline A: ConA) 용액에 1시간 동안 담가서 반응시켰다. 각 단계별로 칩은 0.01% Tween 20을 포함한 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하고 질소기류를 이용하여 건조하였다. 당쇄칩에 결합한 Concanavaline A는 GenPix 4200 형광스캐너(Axon camera)를 이용하여 표지된 FITC의 형광을 측정함으로써 확인하였다. 얻어진 형광이미지는 도 2와 같다.
그 결과, 375 μM인 낮은 농도에서도 형광 신호가 검출되므로 기존의 사용되고 있는 당쇄의 농도보다 낮은 농도에서도 검출이 됨을 알 수 있었다.
<
2-2>
당쇄칩
제작 및 렉틴을 이용한
당쇄
확인
시판 중인 11종의 당쇄(표1)를 선정하여 5 mM 용액으로 만들고 실시예 2-1에 제시한 방법으로 당쇄고정용칩II에 점적하여 당쇄칩을 제작하였다. 제작된 당쇄칩에 형광물질인 FITC로 표지된 2종류의 렉틴, Concanavalin A(ConA), Wheat Germ Agglutinin(WGA)을 2 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 당쇄칩과 1시간 동안 반응시키고 씻어낸 후 형광을 측정하였다(도 3).
| 순서 | 명칭 | 조성 |
| 1 | Lacto-N-fucopentaose I | Fuc1(α1-2)Gal1(β1-3)GlcNAc1Gal1Glc1 |
| 2 | Lacto-N-fucopentaose II | Gal1(β1-3)GlcNAc1Gal1(α1-4)Fuc1Glc1 |
| 3 | 3-Sulfated Lewis X | SO3H-Gal1(β1-3)GlcNAc1(α1-4)Fuc1 |
| 4 | Lewis A | Gal1(β1-3)GlcNAc1(α1-4)Fuc1 |
| 5 | 3-Sialyl Lewis A | NeuNAc1Gal1(β1-3)GlcNAc1(α1-4)Fuc1 |
| 6 | Blood group A trisaccharide | GalNAc1Gal1Fuc1 |
| 7 | 3- Sialyl Lewis X | NeuNAc1Gal1(β1-4)GlcNAc1(α1-3)Fuc1 |
| 8 | NA2 - Glycan | (Gal-GlcNAc)2Man3(GlcNAc) |
| 9 | Lewis X | Gal1(β1-4)GlcNAc1(α1-3)Fuc1 |
| 10 | Blood group H trisaccharide | Fuc1Gal1 |
| 11 | Blood group B trisaccharide | Gal2Fuc1 |
| 12 | 30% glycerol Buffer | Control |
도 1은 기질 표면에 고효율로 탄수화물을 고정할 수 있는 당쇄칩의 제작방법을 도식한 것이다
도 2는 당쇄고정용칩의 효율을 보여주는 것으로 칩 I과 II가 모두 375 μM의 당쇄를 인쇄한 경우에도 해당 렉틴을 검출하는 능력을 보였으며, 미세하지만 당쇄고정용칩 II에서 비특이적 상호작용이 감소하는 것을 보여 준다.
도3은 11개의 당쇄를 포함하는 당쇄칩을 이용하여 해당 렉틴을 검출하는 것을 보여주는 그림이다.
Claims (9)
1) 3-(Triethoxysilyl)propyl isocyanate를 처리하여 슬라이드 글라스 위에 이소시아네이트 표면을 형성하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 슬라이드 글라스에 2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스(에틸아민)을 처리하여 N-Boc-2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스에틸아민 표면을 형성하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 슬라이드 글라스에 삼불화초산(trifluoroacetic acid)과 메틸렌클로라이드(methylene chloride) 혼합액(1:1)을 처리하여 보호기(Boc)을 제거하여 아민이 노출되게 하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 슬라이드 글라스에 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 처리하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 슬라이드 글라스에 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)/NHS(N-hydroxysuccinimide)를 처리하여 하이드라진(hydrazine)을 처리하는 단계
를 포함하는 고효율 당쇄 고정용 칩의 제조방법.
1) 3-(Triethoxysilyl)propyl isocyanate를 처리하여 슬라이드 글라스 위에 이소시아네이트 표면을 형성하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 슬라이드 글라스에 2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스(에틸아민)을 처리하여 N-Boc-2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스에틸아민 표면을 형성하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 슬라이드 글라스에 삼불화초산(trifluoroacetic acid)과 메틸렌클로라이드(methylene chloride) 혼합액(1:1)을 처리하여 보호기(Boc)을 제거하여 아민이 노출되게 하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 슬라이드 글라스 위에 DSC(disuccinimidyl carbonate)를처리하여 NHS(N-hydroxysuccinimide)가 노출되게 하는 단계;
5) 상기 단계 4)의 슬라이드 글라스 위에 N-Boc-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스에틸아민을 처리하는 단계;
6) 상기 단계 5)의 슬라이드 글라스 위에 삼불화초산(trifluoroacetic acid)과 메틸렌클로라이드(methylene chloride) 혼합액(1:1)을 처리하여 보호기(Boc)을 제거하여 아민이 노출되게 하는 단계;
7) 상기 단계 6)의 슬라이드 글라스에 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 처리하는 단계; 및
8) 상기 단계 7)의 슬라이드 글라스에 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)/NHS(N-hydroxysuccinimide)를 처리하여 하이드라진(hydrazine)을 처리하는 단계
를 포함하는 고효율 당쇄 고정용 칩의 제조방법.
1) 3-(Triethoxysilyl)propyl isocyanate를 처리하여 슬라이드 글라스 위에 이소시아네이트 표면을 형성하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 슬라이드 글라스에 2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스(에틸아민)을 처리하여 N-Boc-2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스에틸아민 표면을 형성하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 슬라이드 글라스에 삼불화초산(trifluoroacetic acid)과 메틸렌클로라이드(methylene chloride) 혼합액(1:1)을 처리하여 보호기(Boc)을 제거하여 아민이 노출되게 하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 슬라이드 글라스에 숙신산 무수물(succinic anhydride)을 처리하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 슬라이드 글라스에 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)/NHS(N-hydroxysuccinimide)를 처리하여 하이드라진(hydrazine)을 처리하는 단계; 및
6) 상기 단계 5)의 슬라이드 글라스 위에 탄수화물을 집적하는 단계
를 포함하는 고효율로 당쇄가 고정된 칩의 제조방법.
1) 3-(Triethoxysilyl)propyl isocyanate를 처리하여 슬라이드 글라스 위에 이소시아네이트 표면을 형성하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 슬라이드 글라스에 2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스(에틸아민)을 처리하여 N-Boc-2,2'-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스에틸아민 표면을 형성하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 슬라이드 글라스에 삼불화초산(trifluoroacetic acid)과 메틸렌클로라이드(methylene chloride) 혼합액(1:1)을 처리하여 보호기(Boc)을 제거하여 아민이 노출되게 하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 슬라이드 글라스 위에 DSC(disuccinimidyl carbonate)를처리하여 N-hydroxysuccinimide(NHS)가 노출되게 하는 단계;
5) 상기 단계 4)의 슬라이드 글라스 위에 N-Boc-(에틸렌-1,2-다이옥시)비스에틸아민을 처리하는 단계;
6) 상기 단계 5)의 슬라이드 글라스 위에 삼불화초산(trifluoroacetic acid)과 메틸렌클로라이드(methylene chloride) 혼합액(1:1)을 처리하여 보호기(Boc)을 제거하여 아민이 노출되게 하는 단계;
7) 상기 단계 6)의 슬라이드 글라스에 무수물(succinic anhydride)을 처리하는 단계;
8) 상기 단계 7)의 슬라이드 글라스에 EDC(1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)/NHS(N-hydroxysuccinimide)를 처리하여 하이드라진(hydrazine)을 처리하는 단계; 및
9) 상기 단계 8)의 슬라이드 글라스 위에 탄수화물을 집적하는 단계
를 포함하는 고효율로 당쇄가 고정된 칩의 제조방법.
제 3항 또는 제 4항에 있어서, 슬라이드 글라스 위에 집적되는 탄수화물은 렉틴, 콘카나발린 A(Concanavalin A), 밀배아 응집소(Wheat Germ Agglutinin), 락토-N-푸코펜토오즈-I(Lacto-N-fucopentaose I), 락토-N-푸코펜토오즈-II(Lacto-N-fucopentaose II), 3-Sulfated Lewis X, Lewis A, 3-Sialyl Lewis A, 혈액군 A 삼당류(Blood group A trisaccharide), 3-Sialyl Lewis X, NA2- Glycan, 혈액군 H 삼당류, 혈액군 B 삼당류로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 3항 또는 제 4항에 있어서, 슬라이드 글라스 위에 집적되는 탄수화물의 농도는 375 μM 내지 6 mM인 것을 특징으로 하는 고효율 당쇄가 고정된 칩의 제조방법.
제 3항의 제조방법에 의해 제조된 고효율 당쇄가 고정된 칩.
제 4항의 제조방법에 의해 제조된 고효율 당쇄가 고정된 칩.
1) 제 7항 또는 제 8항의 고효율 당쇄가 고정된 칩을 시료와 반응시키는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 고효율 당쇄가 고정된 칩을 분석하는 단계
를 포함하는 렉틴 검출 및 정량 분석 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080065900A KR101020212B1 (ko) | 2008-07-08 | 2008-07-08 | 높은 당쇄고정 효율을 가진 당쇄 칩의 표면처리 기술 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080065900A KR101020212B1 (ko) | 2008-07-08 | 2008-07-08 | 높은 당쇄고정 효율을 가진 당쇄 칩의 표면처리 기술 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20100005839A KR20100005839A (ko) | 2010-01-18 |
| KR101020212B1 true KR101020212B1 (ko) | 2011-03-08 |
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| KR1020080065900A KR101020212B1 (ko) | 2008-07-08 | 2008-07-08 | 높은 당쇄고정 효율을 가진 당쇄 칩의 표면처리 기술 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6855490B2 (en) | 1999-04-14 | 2005-02-15 | Medical Discovery Partners Llc | Method for attaching biological molecules to a glass surface |
-
2008
- 2008-07-08 KR KR1020080065900A patent/KR101020212B1/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| US6855490B2 (en) | 1999-04-14 | 2005-02-15 | Medical Discovery Partners Llc | Method for attaching biological molecules to a glass surface |
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