JP4800771B2 - 糖鎖リガンド複合体、およびそのリガンド複合体を用いたタンパク質の分析方法 - Google Patents

Description

【技術分野】
本発明は、リンカー化合物に還元末端を有する糖鎖が導入された新規リガンド複合体、および、このリガンド複合体を金や銀、銅などの金属で表面をコートしたチップ上に集合化させ固定化したリガンド担持体に関するものである。さらに、本発明は上記リガンド複合体を用いたタンパク質の分析方法に関するものである。
【背景技術】
生体内に存在する種々の糖は、生物の活動や生命を維持するためのメカニズムの中で重要な役割を果たしている。このような糖の機能を精密に解明するためには、糖の複雑な構造に基づいてそれらの機能を解析する必要がある。糖の機能解析には、構造が解明されている糖鎖を用いて、糖の構造を一部ずつ再現し、これによって糖全体の構造と機能との関係を明らかにする手法が用いられる。
上記糖の機能解析の手法としては、例えば、表面プラズモン共鳴（以下、ＳＰＲと記載する）が知られている。すなわち、糖の一部を模擬したオリゴ糖を含んでなるリガンド複合体をセンサチップ表面上に導入し、このリガンド複合体が導入されてなるセンサチップを用いて、オリゴ糖と特異的に相互作用するタンパク質等の物質を特定する。これにより、オリゴ糖の構造に基づく生物活性の正しい評価を行うことができる。
ところが、オリゴ糖は、１分子だけでは活性がそれほど高くないため、オリゴ糖の生物活性を評価する場合には、オリゴ糖をセンサチップ上に集合化させることが必要となる。つまり、集合化したオリゴ糖を用いて、タンパク質との相互作用を解析することにより、オリゴ糖の生物活性の評価を行うことが可能になる。
そこで、本発明者らは、これまでに、センサチップ表面に固定可能な部位及びオリゴ糖を導入可能な部位を分子内に有するリンカー化合物を得、このリンカー化合物に１単位又は２単位のオリゴ糖を導入してなるリガンド複合体を得ている。そして、このリガンド複合体を用いることによって、センサチップ上に、オリゴ糖を集合化して導入することができることを見出している（例えば、特許文献１、非特許文献１等を参照）。
［特許文献１］特開２００３−８３９６９号公報（２００３年３月１９日公開）
［非特許文献１］「日本化学会第７９回春季年会−講演予稿集ＩＩ」、社団法人日本化学会、２００１年３月１５日、ｐ．１０４２
しかしながら、上記の各文献に記載されたリガンド複合体においては、導入される糖鎖（オリゴ糖鎖）は、発明者らによって合成された硫酸化糖に限られており、市販の還元末端を有するマルトース、ラクトースなどのオリゴ糖を導入しチップ化できるかどうかについては明らかにされていない。また、上記の文献に記載のリガンド複合体を固定化して得られたセンサチップをＳＰＲを用いた測定に使用した後に、チップ上の糖鎖と結合したタンパク質の同定に使用するという利用方法は、従来から提唱されてはいたが、データ的に満足できるものは存在しなかった。
本発明は上述の問題点に鑑みてなされたものであって、市販の還元末端を有する糖を導入してなる新規リガンド複合体、および、タンパク質の同定に使用することのできるリガンド担持体を提供することを目的とするものである。
【発明の開示】
本願発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、先出願（出願番号：特願２００３−１９０５６８、公開番号：特開２００４−１５７１０８（公開日：２００４年６月３日）、本願の優先日（２００４年２月１８日）の時点で未公開）に記載のリンカー化合物（何れも本願発明者らによって見出されたもの）に市販のマルトースまたはラクトースを反応させ、それぞれ末端にαグルコピラノースまたはβガラクトピラノースを有するリガンド複合体を合成した。さらに、本願発明者はこれらのリガンド複合体を金コーティングチップに固定化させたシュガーチップ（リガンド担持体）を作製した。そして、これらのシュガーチップを用いてタンパク質との相互作用を検討するために、ＳＰＲ測定で相互作用を確認後、当該シュガーチップをそのままＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳに供したところ、各シュガーチップに結合するタンパク質を同定することができること見出し本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明のリガンド複合体は、一般式（１）

（式中、ｐ，ｑはそれぞれ独立して０以上６以下の整数）にて表される構造を備え、上記Ｘとして、末端に芳香族アミノ基を有するとともに、主鎖に炭素−窒素結合を有していてもよい炭化水素誘導鎖を、１鎖又は２鎖又は３鎖含んでなる構造を備え、上記Ｙとして、硫黄原子又は硫黄原子を含む炭化水素構造を備え、上記Ｚとして、炭素−炭素結合又は炭素−酸素結合を持つ直鎖構造を備えているリンカー化合物と、還元末端を有する糖とが、上記芳香族アミノ基を介して結合している構造を有していることを特徴としている。
上記炭化水素誘導鎖とは、炭素及び水素からなる炭化水素鎖にて、一部の炭素や水素が他の原子や置換基に置き換わっていてもよいものを指すものとする。すなわち、上記炭化水素誘導鎖とは、末端に芳香族アミノ基を有し、炭化水素鎖の主鎖構造である炭素−炭素結合（Ｃ−Ｃ結合）の一部が、炭素−窒素結合（Ｃ−Ｎ結合）、炭素−酸素結合（Ｃ−Ｏ結合）、アミド結合（ＣＯ−ＮＨ結合）に置き換わっていてもよいものを指す。
また、上記硫黄原子を含む炭化水素構造とは、炭素及び水素からなる炭化水素構造にて、一部の炭素が硫黄に置き換わっているものを意味する。また、この硫黄原子を含む炭化水素構造は、鎖状（直鎖、枝分かれ鎖の両方を含む）であっても、環状であってもよく、また、鎖状構造および環状構造の両方の構造を含んでいてもよいものとする。
本発明のリガンド複合体において、上記リンカー化合物は、上記Ｙとして、Ｓ−Ｓ結合またはＳＨ基を含む炭化水素構造を備えているものであってもよい。つまり、上記硫黄原子を含む炭化水素構造中に、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）またはチオール基（ＳＨ基）が含まれていてもよい。
本発明のリガンド複合体において、上記Ｘは、一般式（２）

（式中、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３はそれぞれ独立して０以上６以下の整数。Ｒ’は水素（Ｈ）またはＲ。）にて表される構造を備え、上記Ｒは糖鎖由来化合物であるものであってもよい。
本発明のリガンド複合体において、上記Ｘは、一般式（３）

（式中、ｍ^４，ｍ^５はそれぞれ独立して０以上６以下の整数。Ｒ’は水素（Ｈ）またはＲ。）にて表される構造を備え、上記Ｒは糖鎖由来化合物であるものであってもよい。
本発明のリガンド複合体において、上記Ｘは、一般式（４）

（式中、Ｒ’は水素（Ｈ）またはＲ）にて表される構造を備え、上記Ｒは糖鎖由来化合物であるものであってもよい。
本発明のリガンド複合体において、上記Ｚは、式（５）または式（６）

（式中、ｎ^１，ｎ^２はそれぞれ１以上６以下の整数）にて表される構造を備えているものであってもよい。
また、本発明にかかるリガンド複合体の製造方法は、一般式（７）

（式中、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３はそれぞれ独立して０以上６以下の整数、ｎ^１は１以上６以下の整数）にて表される構造を備えているリンカー化合物、または、一般式（８）

（式中、ｍ^４，ｍ^５はそれぞれ独立して０以上６以下の整数、ｎ^１は０以上６以下の整数）にて表される構造を備えているリンカー化合物、または、一般式（９）

（式中、ｎ^１，ｑはそれぞれ独立して０以上６以下の整数）にて表される構造を備えているリンカー化合物、または、一般式（１０）

（式中、ｎ^２は１以上６以下の整数）にて表される構造を備えているリンカー化合物、または、一般式（１１）

（式中、ｎ^１は１以上６以下の整数）にて表される構造を備えているリンカー化合物と、還元末端を有する糖とを用いて還元アミノ化反応を行うことを特徴としている。
また、本発明にかかるリガンド担持体は、上記の何れかのリガンド複合体を、表面に金属を有する支持体上に固定化させてなることを特徴とするものである。そして、上記リガンド担持体は、タンパク質の分析に使用してもよい。
また、本発明にかかるタンパク質の分析方法は、上記の何れかのリガンド複合体を、支持体と接触させることによって、当該リガンド複合体を支持体上に固定化させたリガンド担持体を作成する工程と、上記リガンド担持体を、タンパク質溶液と接触させた後、分子間相互作用の測定を行う工程と、上記分子間相互作用の測定の後に質量分析を行って、上記リガンド担持体に結合しているタンパク質を同定する工程と、からなることを特徴としている。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のリガンド複合体を用いたタンパク質分析方法の手順を示す模式図である。
図２（ａ）は、α−グルコピラノースを２分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用いてＣｏｎＡの結合挙動を測定した結果を示すグラフである。
図２（ｂ）は、α−グルコピラノースを２分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用いてＰＳＡの結合挙動を測定した結果を示すグラフである。
図２（ｃ）は、α−グルコピラノースを２分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用いてＬＣＡの結合挙動を測定した結果を示すグラフである。
図３（ａ）は、α−グルコピラノースを３分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用いてＣｏｎＡの結合挙動を測定した結果を示すグラフである。
図３（ｂ）は、α−グルコピラノースを３分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用いてＰＳＡの結合挙動を測定した結果を示すグラフである。
図３（ｃ）は、α−グルコピラノースを３分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用いてＬＣＡの結合挙動を測定した結果を示すグラフである。
図４（ａ）は、β−ガラクトピラノースを２分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用いてＲＣＡの結合挙動を測定した結果を示すグラフである。
図４（ｂ）は、β−ガラクトピラノースを２分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用いてＰＮＡの結合挙動を測定した結果を示すグラフである。
図５（ａ）は、β−ガラクトピラノースを３分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用いてＲＣＡの結合挙動を測定した結果を示すグラフである。
図５（ｂ）は、β−ガラクトピラノースを３分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用いてＰＮＡの結合挙動を測定した結果を示すグラフである。
図６（ａ）は、センサチップに結合したＣｏｎＡを質量分析した結果を示すチャートである。
図６（ｂ）は、センサチップに結合したＰＮＡを質量分析した結果を示すチャートである。
図７は、リガンド複合体（化合物３０）の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定チャートである。
図８は、リガンド複合体（式（３６））の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定チャートである。
図９は、リガンド複合体（式（３７））の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定チャートである。
図１０は、リガンド複合体（式（３８））の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定チャートである。
図１１は、リガンド複合体（式（３９））の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定チャートである。
図１２は、リガンド複合体（式（４０））の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定チャートである。
図１３は、リガンド複合体（式（４１））の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定チャートである。
図１４は、リガンド複合体（式（４２））の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定チャートである。
図１５は、リガンド複合体（式（４３））の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定チャートである。
図１６は、リガンド複合体（式（４４））の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定チャートである。
図１７は、リガンド複合体（式（４５））の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定チャートである。
図１８は、リガンド複合体（式（４６））の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定チャートである。
図１９は、リガンド複合体（式（４７））の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定チャートである。
図２０は、リガンド複合体（式（４８））の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定チャートである。
図２１は、リガンド複合体（式（４９））の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定チャートである。
図２２は、リガンド複合体（式（５０））の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定チャートである。
図２３は、リガンド複合体（式（５１））の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル測定チャートである。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明のリガンド複合体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサチップやアフィニティクロマトグラフィーの担持体等のタンパク質分析用の支持体に固定化されて用いられるものであり、支持体表面と結合することのできるリンカー化合物と、分析対象となるタンパク質などと特異的に相互作用することのできる糖鎖とから構成されている。上記ＳＰＲやアフィニティクロマトグラフィーでは、糖分子と特異的に相互作用するタンパク質などの物質を特定することや分離することを目的としている。そのため、上記リガンド複合体は、タンパク質等の物質と非特異的に相互作用を起こさないものであることが必要とされる。
そこで、本発明のリガンド複合体は、上記一般式（１）で表される構造を備えたリンカー部分（リンカー化合物）を有している。この構造中のＹで示す構造中には、硫黄原子（Ｓ）が含まれており、この硫黄原子（Ｓ）は、例えば、タンパク質分析用の支持体表面にコートされた金属（例えばＡｕ）と、金属−硫黄結合（例えばＡｕ−Ｓ結合）を形成し、支持体に強固に結合することができる。
また、上記リンカー化合物は、上記一般式（１）のＸとして、末端に芳香族アミノ基を有するとともに主鎖に炭素−窒素結合を有していてもよい炭化水素誘導鎖を、１鎖又は２鎖又は３鎖含んでなる構造を備えている。これによって、上記リンカー化合物は、タンパク質分析用の支持体表面に糖分子を集合化して配列することができるとともに、末端に芳香族アミノ基を有していることによって、糖分子を簡便に導入することができる。
また、上記リンカー化合物は、上記一般式（１）のＺとして、炭素−炭素結合又は炭素−酸素結合を持つ直鎖構造を備えている。より具体的には、化合物の製造が容易であることから、Ｚは、上記式（５）または式（６）にて表される構造を有することが好ましい。なお、上記一般式（１）において、ｐ，ｑはそれぞれ独立して０以上６以下の整数であれば限定されない。また、上記式（５）のｎ^１および式（６）のｎ^２はそれぞれ１以上６以下の整数であれば限定されない。
さらに、上記リンカー化合物として、上記一般式（１）において、ｐが４であり、ｑが１であり、Ｙとして、Ｓ−Ｓ結合を有する環状炭化水素構造を備えており、Ｚが上記式（５）である構造を有しているものを挙げることができる。上記リンカー化合物としては、例えば一般式（１２）

にて表される構造を備えるものであってもよい。このリンカー化合物は、チオクト酸を原料として合成することが可能である。
また、上記リンカー化合物として、上記一般式（１）において、ｐが４であり、ｑが１であり、Ｙとして、Ｓ−Ｓ結合を有する環状炭化水素構造を備えており、Ｚが上記式（６）である構造を有しているものを挙げることができる。上記リンカー化合物としては、例えば一般式（１３）

にて表される構造を備えるものであってもよい。このリンカー化合物は、チオクト酸を原料として合成することが可能である。
また、上記リンカー化合物として、上記一般式（１）において、ｐが０であり、ｑが０であり、Ｙとして、硫黄原子（Ｓ）を有しており、Ｚが上記式（５）または上記式（６）である構造が２量体を形成しているものを挙げることができる。上記リンカー化合物としては、例えば一般式（１４）

にて表される構造を備えるものであってもよい。
上記一般式（１２）、一般式（１３）および一般式（１４）にて表されるリンカー化合物は、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）が含まれており、このＳ−Ｓ結合中の硫黄（Ｓ）は、例えば、タンパク質分析用の支持体表面にコートされた金属（例えばＡｕ）と、金属−硫黄結合（例えばＡｕ−Ｓ結合）を形成し、支持体に強固に結合することができる。なお、上記Ｙとしては、一般式（１２）、一般式（１３）または一般式（１４）で示されるものに限定されることはないが、金属−硫黄結合（Ａｕ−Ｓ結合）を容易に形成することができるという点で、Ｓ−Ｓ結合またはＳＨ基が含まれている炭化水素構造であることが好ましい。
そして、本発明のリガンド複合体は、上記リンカー化合物の芳香族アミノ基に、還元末端を有する糖鎖が導入され調製される。言い換えれば、本発明のリガンド複合体は、上記リンカー化合物と、還元末端を有する糖とが、芳香族アミノ基を介して結合している構造を有している。この糖の導入は、例えば、上記リンカー化合物の芳香族アミノ基のアミノ基（−ＮＨ_２基）と糖との還元アミノ化反応によって行うことができる。つまり、糖中の平衡によって生じるアルデヒド基（−ＣＨＯ基）またはケトン基（−ＣＲＯ基、Ｒは炭化水素基）と、上記リンカー化合物が有するアミノ基とが反応する。そして、この反応によって形成されたシッフ塩基を引き続き還元することによって、芳香族アミノ基に容易に糖を導入することができる。
本発明では、特に上記還元末端を有する糖として、上記先出願に記載のような発明者らによって合成された硫酸化糖ではなく、市販のもの、あるいは、市販の多糖を分解して調製したものを用いる。なお、上記「還元末端を有する糖」とは、アノマー炭素原子が置換を受けていない単糖またはオリゴ糖である。つまり、上記還元末端を有する糖とは、還元糖である。
上記還元末端を有する糖としてより具体的には、マルトース、ラクトース、パノース、セロビオース、メリビオース、マンノオリゴ糖、キトオリゴ糖、ラミナリオリゴ糖などが挙げられるが、これに限定されることはない。このように、マルトースやラクトースなどのオリゴ糖を有するリガンド複合体は、従来の硫酸化糖を有するリガンド複合体と比較して、タンパク質測定に関して応用範囲が広いと言う利点を有している。
本発明のリガンド複合体として具体的には、一般式（７）

（式中、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３はそれぞれ独立して０以上６以下の整数、ｎ^１は１以上６以下の整数）にて表される構造を有するリンカー化合物、または、一般式（８）

（式中、ｍ^４，ｍ^５はそれぞれ独立して０以上６以下の整数、ｎ^１は１以上６以下の整数）にて表される構造を有するリンカー化合物、または、一般式（９）

（式中、ｎ^１，ｑはそれぞれ独立して０以上６以下の整数）にて表される構造を有するリンカー化合物、または、一般式（１０）

（式中、ｎ^２は１以上６以下の整数）にて表される構造を有するリンカー化合物、または、一般式（１１）

（式中、ｎ^１は１以上６以下の整数）にて表される構造を有するリンカー化合物の芳香族アミノ基に、還元末端を有する糖が導入された構造を有するものが挙げられる。
上記のリガンド複合体は、例えば、一般式（７）〜（１１）にて表される構造を有するリンカー化合物と、還元末端を有する糖とを用いて還元アミノ化反応を行うことによって製造することができる。
上記一般式（７）にて表される構造を有するリンカー化合物とは、つまり、炭化水素誘導鎖を３鎖有するものであり、末端に芳香族アミノ基を有する３鎖の炭化水素誘導鎖が、１つの炭素（Ｃ）に結合することによって分岐構造を形成している。なお、上記一般式（７）において、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３は、０以上６以下の整数であれば限定されず、ｎ^１は１以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。このうち、上記ｍ^１〜ｍ^３は、製造時の簡便さの点から互いに同じ整数であることが好ましく、特に２であることが好ましい。
上記一般式（８）にて表される構造を有するリンカー化合物とは、つまり、炭化水素誘導鎖を２鎖有するものであり、末端に芳香族アミノ基を有する２鎖の炭化水素誘導鎖が、１つの窒素（Ｎ）に結合することによって分岐構造を形成している。なお、上記一般式（８）において、ｍ^４，ｍ^５は、０以上６以下の整数であれば限定されず、ｎ^１は１以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。このうち、上記ｍ^４，ｍ^５は、製造時の簡便さの点から互いに同じ整数であることが好ましく、特に２であることが好ましい。
上記一般式（９）にて表される構造を有するリンカー化合物は、炭化水素誘導鎖を１鎖有するものである。なお、上記一般式（９）において、ｎ^１，ｑは、０以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、同じ整数であってもよい。
上記一般式（１０）にて表される構造を有するリンカー化合物は、炭化水素誘導鎖を１鎖有するものである。なお、上記一般式（１０）において、ｎ^２は、１以上６以下の整数であれば限定されない。
上記一般式（１１）にて表される構造を有するリンカー化合物は、炭化水素誘導鎖を１鎖有するものが２量体を形成したものである。なお、上記一般式（１１）において、ｎ^１は、１以上６以下の整数であれば限定されない。
上記一般式（７）または一般式（８）のように、上記Ｘは、炭素や窒素等の原子にて、上記炭化水素誘導鎖を複数結合して分岐構造を形成している多分岐型部位である構造を備えているものでもよい。なお、上記Ｘに複数の炭化水素誘導鎖が含まれる場合は、すべて同じであることが好ましいが、末端に芳香族アミノ基を有していれば、互いに異なる構造であってもよい。
以上のように、本発明のリガンド複合体に含まれるリンカー化合物は、タンパク質分析用の支持体に結合可能な硫黄原子と、オリゴ糖鎖等の糖分子に結合可能なアミノ基とを有している。従って、例えばＡｕ−Ｓ結合などの金属−硫黄結合により上記リンカー化合物が、タンパク質分析用の支持体上に固定されるので、上記リンカー化合物を介して、上記支持体上に糖分子を強固にかつ簡単に結合させることができる。
また、上記リンカー化合物は、多分岐型部位を有していてもよく、この場合該多分岐型部位の各末端に芳香族アミノ基を有している。そのため、上記リンカー化合物に還元末端を有する糖が導入された本発明のリガンド複合体を用いることにより、上記支持体表面により効率よく糖分子を集合化させることができる。
さらに、上記リンカー化合物は、タンパク質との非特異的な相互作用の影響をほぼ無視することができる。それゆえ、上記リンカー化合物を有する本発明のリガンド複合体を用いることによって、上記糖とタンパク質との相互作用を再現性よく評価することが可能になる。
上記リンカー化合物は、例えば以下に示す製造方法によって製造される。つまり、上記一般式（７）、（８）、（９）または（１０）にて表されるリンカー化合物は、チオクト酸と、芳香族アミノ基末端が保護基によって保護されたアミン化合物との縮合反応を行い、上記芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護することによって製造される。また、上記一般式（１１）にて表されるリンカー化合物は、γ−メルカプト酪酸の２量体と、２分子の芳香族アミノ基末端が保護基によって保護されたアミン化合物との縮合反応を行い、上記芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護することによって製造される。
上記チオクト酸は、下記一般式（１５）

にて表される構造を備えている。
また、上記アミン化合物は、保護基によって保護された芳香族アミノ基末端を有するものであれば特に限定されるものではない。
上記保護基とは、芳香族アミノ基のアミノ基が上記縮合反応によって反応しないように導入される置換基である。このような保護基は、特に限定されるものではないが、例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基（−ＣＯＯＣ（ＣＨ_３）_３基；Ｂｏｃ基と記載する）、ベンジル基、アリルカルバメート基（−ＣＯＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２、Ａｌｌｏｃ基）等を挙げることができる。
上記アミン化合物としては、例えば、下記一般式（１６）

にて表される構造を備えている第１級アミン化合物を挙げることができる。なお、上記一般式（１６）中のｍ^１〜ｍ^３は、それぞれ独立して、０以上６以下の整数であり、ｎ^１は１以上６以下の整数である。この一般式（１６）にて表されるアミン化合物と、チオクト酸との縮合反応、および、その後に行われる芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護によって得られるリンカー化合物は、上記一般式（７）にて表されるリンカー化合物である。
また、上記アミン化合物の他の例としては、例えば、下記一般式（１７）

にて表される構造を備えている第２級アミン化合物を挙げることができる。なお、上記一般式（ｌ７）中のｍ^４，ｍ^５は、それぞれ独立して、０以上６以下の整数であり、ｎ^１は１以上６以下の整数である。この一般式（１７）にて表されるアミン化合物と、チオクト酸との縮合反応、および、その後に行われる芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護によって得られるリンカー化合物は、上記一般式（８）にて表されるリンカー化合物である。これらのアミン化合物の合成方法については、後の実施例にて詳述する。
上記チオクト酸またはγ−メルカプト酪酸とアミン化合物との縮合反応により、チオクト酸またはγ−メルカプト酪酸のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ基）と、アミン化合物のアミノ基（−ＮＨ_２基）とが縮合して、アミド結合が形成される。その後、芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護して、保護基を取り外し、芳香族アミノ基にすることによって、上記したリンカー化合物を得ることができる。
本発明のリガンド複合体は、上述のようにして作製されたリンカー化合物に、還元末端を有するマルトースやラクトースなどのオリゴ糖が導入されたものである。本発明のリガンド複合体として具体的には、以下に示すものを挙げることができる。
１番目のリガンド複合体は、上記一般式（１２）にて表される構造において、上記Ｘとして上記一般式（２）にて表される構造を備え、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒに下記式（１８）

にて表される構造を有するマルトースを導入してなるものである。
２番目のリガンド複合体は、上記一般式（１２）にて表される構造において、上記Ｘとして上記一般式（２）にて表される構造を備え、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒに下記式（１９）

にて表される構造を有するラクトースを導入してなるものである。
この１，２番目のリガンド複合体は、３鎖の炭化水素誘導鎖を有しているリンカー化合物にオリゴ糖がそれぞれ１個導入されているので、末端に３単位のオリゴ糖を有している。言い方を換えれば、上記１番目のリガンド複合体は、末端に３単位のα−グルコピラノースを有しており、上記２番目のリガンド複合体は、末端に３単位のβ−ガラクトピラノースを有している。なお、上記一般式（２）において、ｍ^１〜ｍ^３は、０以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。また、上記一般式（１２）において、ｎ^１は１以上６以下の整数であれば特に限定されない。
また、３番目のリガンド複合体は、上記一般式（１２）にて表される構造において、上記Ｘとして上記一般式（３）にて表される構造を備え、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒに上記式（１８）にて表される構造を有するマルトースを導入してなるものである。
４番目のリガンド複合体は、上記一般式（１２）にて表される構造において、上記Ｘとして上記一般式（３）にて表される構造を備え、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒに上記式（１９）にて表される構造を有するラクトースを導入してなるものである。
この３，４番目のリガンド複合体は、２鎖の炭化水素誘導鎖を有しているリンカー化合物にオリゴ糖がそれぞれ１個導入されているので、末端に２単位のオリゴ糖を有している。言い方を換えれば、上記３番目のリガンド複合体は、末端に２単位のα−グルコピラノースを有しており、上記４番目のリガンド複合体は、末端に２単位のβ−ガラクトピラノースを有している。なお、上記一般式（３）において、ｍ^４，ｍ^５は、０以上６以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。また、上記一般式（１２）において、ｎ^１は１以上６以下の整数であれば特に限定されない。
５番目のリガンド複合体は、上記一般式（１３）にて表される構造において、上記Ｘとして上記一般式（４）にて表される構造を備え、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒにグルコースを導入してなるものである。なお、上記一般式（１３）において、ｎ^２は１以上６以下の整数であれば特に限定されない。
６番目のリガンド複合体は、上記一般式（１３）にて表される構造において、上記Ｘとして上記一般式（４）にて表される構造を備え、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒにマルトースを導入してなるものである。なお、上記一般式（１３）において、ｎ^２は１以上６以下の整数であれば特に限定されない。
７番目のリガンド複合体は、上記一般式（１４）にて表される構造において、上記Ｘとして上記一般式（４）にて表される構造を備え、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒにグルコースを導入してなるものである。なお、上記一般式（１４）において、ｎ^１は１以上６以下の整数であれば特に限定されない。
８番目のリガンド複合体は、上記一般式（１４）にて表される構造において、上記Ｘとして上記一般式（４）にて表される構造を備え、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒにマルトースを導入してなるものである。なお、上記一般式（１４）において、ｎ^１は１以上６以下の整数であれば特に限定されない。
さらに、上記一般式（９）にて表される構造を備えているリンカー化合物に、下記群（２０）

に示される１７種類の糖鎖をそれぞれ導入した１７種類のリガンド複合体が、本発明のリガンド複合体の具体例に挙げられる。
上記のリガンド複合体は、いずれもリンカー化合物と糖分子とを含んでなっているので、リンカー化合物内のＳ−Ｓ結合にて、タンパク質分析用の支持体表面の金属と、金属−硫黄（Ｓ）結合、例えば金−硫黄（Ａｕ−Ｓ）結合により結合することができる。これにより、このＡｕ−Ｓ結合を介して、上記支持体表面に糖分子を集合化して固定化されてなるリガンド担持体を提供することができる。上記支持体表面の金属としては、上記Ａｕの他、Ｃｕ、Ａｇ、Ｐｔ等の金属を用いることができるが、特にＡｕを用いることが好ましい。
また、上記各リガンド複合体は、後述の実施例に示されるように、タンパク質と異なる相互作用を示すことが確認された。それゆえ、未知タンパク質の同定に有効に利用することができると考えられる。
なお、本発明のリガンド複合体に導入されている上記オリゴ糖は、同一の単糖分子からなる単一オリゴ糖であってもよいし、種々の単糖分子やその誘導体からなる複合糖質であってもよい。また、上記オリゴ糖は、いずれも、自然界から単離・精製して得られる種々の天然の糖であってもよく、人工的に合成された糖であってもよい。また、上記オリゴ糖は、多糖を分解して得られたものであってもよい。
また、上述のような本発明のリガンド複合体を、表面に金属を有する支持体に金属−硫黄結合を介して固定化させてなるリガンド担持体も本発明に含まれる。このリガンド担持体はタンパク質分析の用途に限定されず、糖分子との相互作用を調べるために、タンパク質以外の物質の分析用として用いることもできる。
上記リガンド担持体は、該リガンド複合体を含むリガンド複合体溶液と表面に金属膜を有する支持体とを接触させることにより、リガンド複合体のＳ−Ｓ結合の各Ｓ原子が、支持体表面の金属と金属−硫黄結合によって結合して、支持体表面に上記リガンド複合体が導入される。具体的には、上記リガンド複合体溶液に、タンパク質分析用の支持体を所定時間浸漬する、あるいは、上記支持体にリガンド複合体溶液を注入する（支持体表面にリガンド複合体溶液を流す）ことによって、上記リガンド複合体（リガンド複合体に含まれるリンカー化合物）のＳ−Ｓ結合を、上記支持体表面の金等とのＡｕ−Ｓ結合に変換して、支持体表面に上記リガンド複合体を固定することができる。
リガンド複合体溶液に用いる溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、メタノール、水、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）や、これらの混合溶媒等を挙げることができる。また、浸漬時間は、０．５時間〜１２時間程度であればよく、注入濃度は、１μＭ〜１ｍＭ程度であればよい。
このように、本発明のリガンド複合体は、Ｓ−Ｓ結合を有しているので、タンパク質分析用の支持体表面に簡単に固定化することができ、上記支持体上に糖分子を簡単に導入することができる。
本発明のリガンド担持体は、糖分子と、例えばタンパク質等の他の物質との相互作用の分析に、利用可能である。具体的には、上記リガンド担持体は、ＳＰＲ測定、アフィニティクロマトグラフィー等に適用することができる。
例えば、タンパク質分析として、ＳＰＲ測定を行うには、以下のようにすればよい。すなわち、金薄膜等の金属薄膜を蒸着した支持体に、本発明のリガンド複合体を固定化してなるリガンド担持体を用い、該リガンド担持体とタンパク質とを接触させ、常法に従って、表面プラズモン共鳴装置を用いて共鳴角度を測定すれば、該リガンド担持体とタンパク質との結合挙動を観測することができる。なお、ＳＰＲ測定に用いる上記支持体（センサチップ）としては、例えば、ガラス、プラスチック等を用いることができ、特にガラスが好適に用いられる。また、リガンド担持体とタンパク質の接触は、例えば、タンパク質をランニングバッファーに溶解した溶液を、該リガンド担持体の表面に流入することにより行えばよい。このランニングバッファーとしては、例えば、リン酸緩衝溶液等を挙げることができる。
また、本発明のリガンド担持体は、後述の実施例に示されるように、各々のタンパク質と異なる相互作用を示すことが確認されているため、タンパク質の同定に利用することができる。つまり、本発明のリガンド担持体を用いて未知タンパク質の分析を行うことによって、そのタンパク質が糖結合性タンパク質であるか否か、また、そのタンパク質がどの種のタンパク質であるかを容易に判定することができる。なお、上記のリガンド複合体をそれぞれ固定化したリガンド担持体のうち、少なくとも２種類を一組のセットとして含むチップセットを作製すれば、より簡便にタンパク質（特に、糖鎖結合性のタンパク質）の同定を行うことができるため有用である。
ここで、本発明のリガンド担持体の利用方法について説明する。本発明のリガンド担持体は、分子間相互作用の測定（例えば、以下のようなＳＰＲ測定）にセンサチップとして使用することができる。すなわち、第１のリガンド複合体が支持体表面に固定化されてなる第１のセンサチップと、上記第１のリガンド複合体とは種類の異なる第２のリガンド複合体が支持体表面に固定化されてなる第２のセンサチップとを用いて、第１のセンサチップを用いて得られたＳＰＲ測定の検出結果と、第２のセンサチップを用いて得られたＳＰＲ測定の検出結果との差を検出し、糖分子の相互作用を観測することができる。
これらのセンサチップには、固定化される糖分子が異なっているリガンド複合体、あるいは、固定化されている糖分子は同じであるがリンカー化合物の部分が異なっているリガンド複合体を用いればよい。この種類の異なるリガンド複合体としては、例えば上述の各リガンド複合体を挙げることができる。そして、上記のリガンド複合体のうちから、リンカー化合物部分は同じ構造を有しているが、オリゴ糖の部分が異なる構造を有するもの（例えば、上記１番目のリガンド複合体と２番目のリガンド複合体のセット、あるいは、上記３番目のリガンド複合体と４番目のリガンド複合体とのセット）を選択することが好ましい。
上記ＳＰＲ測定では、第１のセンサチップの糖分子に特異的に作用するタンパク質等を用いて、測定条件を一定にして、上記２つのセンサチップに作用させ、両者の共鳴角度を観測する。この両者の共鳴角度の差を検出することで、糖分子とタンパク質等との特異的な相互作用として測定することができる。
また、糖分子との相互作用を観測する物質は、タンパク質に限定はされない。
上記では、２つの種類のセンサチップを同時に測定したが、これに限定されることはなく、２種類以上のセンサチップを測定してもかまわないし、同時に測定しなくてもかまわない。また、少なくとも１つのセンサチップに糖分子を導入していないものを用いてもよい。例えば、リンカー化合物のみを固定化したものを用いてもよい。
上記のようなＳＰＲ測定を行うと、糖分子以外は同じ構造のリガンド複合体を有する少なくとも２つのセンサチップを用いて、測定をすることができるため、少なくとも２つのセンサチップ相互作用の差は、糖分子に起因したものとして観測される。従って、上記測定方法を用いれば、糖分子以外の部分と、他の物質との非特異的な相互作用を低減させ、糖分子と他の物質との特異的な相互作用を観測することができる。
また、糖分子は同じであって、リンカー化合物部分の構造が異なるリガンド複合体が固定化された２種類のセンサチップを用いて上記のようなＳＰＲ測定を行ってもよい。この場合は、センサチップ上の糖分子の集合化度の違いによるタンパク質の結合挙動を測定することができる。このようなセンサチップのセットの例としては、上記１番目のリガンド複合体と３番目のリガンド複合体とのセットを挙げることができる。
さらに、上述のＳＰＲ測定によって糖分子と他の物質との特異的な相互作用を確認した後に、ＳＰＲ測定に使用したタンパク質の結合したリガンド担持体をそのまま質量分析にかければ、センサチップと結合したタンパク質を同定することができる。上記質量分析は、マトリックス支援型レーザ脱離／飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）などの従来公知の質量分析計を使用し、従来公知の方法に従って実施すればよい。
上述したような手順を用いれば、本発明のリガンド複合体を用いてタンパク質の分析を行うことができる。つまり、本発明のタンパク質の分析方法は、上記の本発明のリガンド複合体を、表面に金属を有する支持体と接触させることによって、当該リガンド複合体を支持体上に固定化させたリガンド担持体を作成する工程と、上記リガンド担持体を分析対象となるタンパク質を含む溶液と接触させて相互作用させた後、例えばＳＰＲのような分子間相互作用の測定を行う工程と、上記分子間相互作用測定の後に質量分析を行って、上記リガンド担持体に結合しているタンパク質を同定する工程とからなるものである。
このタンパク質の分析方法においては、上述したように、種類の異なるリガンド複合体が固定化された２種類以上のリガンド担持体を用いてそれぞれタンパク質の分析を行って、それぞれの結果を比較検討し各タンパク質の特性を解析することができる。
【実施例】
以下、本発明のリガンド複合体の合成についてより詳細に説明する。また、本実施例では、合成したリガンド複合体を用いてＳＰＲ測定と質量分析を行い、タンパク質の分析を行った。それについても併せて説明する。
［実施例１：リガンド複合体（化合物１〜４）の合成］
本実施例では、実施の形態において説明した１〜４番目のリガンド複合体にそれぞれ分類される４個のリガンド複合体を合成した。
（１）１番目のリガンド複合体（化合物１）の合成
上記１番目のリガンド複合体の一つである、上記一般式（１２）にて表される構造において、ｎ^１が１であり、Ｘが一般式（２）にて表される構造を備え、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒに上記式（１８）で表されるマルトースが導入され、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３が２である構造を有するリガンド複合体（化合物１）を以下の手順で合成した。
上記リガンド複合体（化合物１）の合成の前段階として、まず、芳香族アミノ基末端が保護基によって保護された分岐鎖を３鎖有するリンカー化合物Ａの合成を行った。
先ず、下記式（２１）に示すように、６５℃−７０℃のジメトキシエタン中、水酸化ベンジルトリメチルアンモニウムの存在下にて、ニトロメタン（化合物５）に対し、３単位のｔ−ブチルアクリレート（化合物６）をマイケル付加させ、９１％の収率にて化合物７を得た。次いで、水素雰囲気下（６ｋｇ／ｃｍ^２）、５０℃のエタノール中にて、ラネーニッケル（Ｒａｎｅｙ Ｎｉ）を用いて、上記化合物７のニトロ基を還元して、９８％の収率にて化合物８を得た。
その後、ＣＨ_２Ｃｌ_２中、１．１当量の１−ヒドロキシ−７−アザペンゾトリアゾール（式中、ＨＯＡｔ）、１．１当量の水溶性カルボジイミド塩酸塩（式中、ＥＤＣ・ＨＣｌ）の存在下にて、上記化合物８に１．１当量のＺ−グリシンを縮合させ、８５％の収率にてＺ−グリシン体（化合物９）を得た。

より具体的に説明すれば、上記化合物８は、文献（Ｇ．Ｒ．Ｎｅｗｋｏｍｅら、ＯＰＰＩ ＢＲＩＥＦＳ，２８巻，ｐ．４９５，１９９６）の方法に従って、まず、ニトロメタン（１２．２ｇ，２００ｍｍｏｌ）を１，２−ジメトキシエタン５０ｍＬに溶解して、６５−７０℃に加熱し、４０％水酸化ベンジルトリメチルアンモニウム−メタノール溶液（２ｍＬ）を加えて、ニトロメタン溶液とした。次いで、このニトロメタン溶液の温度を７５℃まで上昇させ、ｔ−ブチルアクリレート（９０．８ｍＬ，６２０ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した後、溶液温度を７０−７５℃に保ちながら、４０％水酸化ベンジルトリメチルアンモニウム−メタノール溶液を１ｍＬずつ４回に分けて加えて２．５時間攪拌し、ニトロメタン／ｔ−ブチルアクリレート反応溶液を得た。このニトロメタン／ｔ−ブチルアクリレート反応溶液中の不溶物をデカンテーションにより取り除いて濃縮し、得られた残渣をジエチルエーテルに溶かして、氷冷した１０％塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、及び水で２回ずつ洗浄して残渣溶液を得た。その後、乾燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて、該残渣溶液を乾燥させ、セライトを用いて該乾燥剤を除去して、減圧濃縮した後、濃縮残渣をエタノールに溶解して再結晶を行い、化合物７（８１．８ｇ，９１％）を白色針状結晶として得た。
続いて、化合物７の結晶（１０ｇ，２２．４ｍｍｏｌ）とＴ−１ラネーニッケル（６．０ｇ）とを無水エタノール５０ｍＬに加え、６ｋｇ／ｃｍ^２の水素雰囲気下、５０℃で２３時間攪拌した後、セライトを用いてＴ−１ラネーニッケルを濾去することによって得られた化合物７反応溶液を減圧濃縮した。この化合物７反応溶液の減圧濃縮によって得られた濃縮残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（溶媒：クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製し、化合物８（収量９．２ｇ、収率９８％）を白色固体として得た。
より具体的には、Ｚ−グリシン（１．２６ｇ，６．６２ｍｏｌ）と、ＨＯＡｔ（０．９０ｇ，６．６２ｍｍｏｌ）と、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１．２７ｇ，６．６２ｍｍｏｌ）とを無水ジクロロメタン（２８ｍＬ）に溶かしたＺ−グリシン溶液に、０℃の温度条件下、化合物８（２．５０ｇ，６．０２ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（２ｍＬ）に溶かした化合物８溶液を加えて、アルゴン雰囲気下、室温で３６時間攪拌して、Ｚ−グリシン／化合物８反応溶液を得た。このＺ−グリシン／化合物８反応溶液に、ジクロロメタンと１０％クエン酸水溶液とを加えてジクロロメタンで抽出し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、および水で１回ずつ洗浄し、乾燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた後、該乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。この減圧濃縮によって得られた濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶媒：クロロホルム）で精製し、化合物９（収量３．０９ｇ、収率８５％）を白色固体として得た。
得られた上記化合物９のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定（飛行時間型質量分析計測定）を行ったところ、ｍ／ｚ（質量／電荷比）６２９．４［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。また、核磁気共鳴（^１Ｈ−ＮＭＲ、４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、

であった。これにより、化合物９の構造を確認することができた。なお、化合物９の分子質量は６０６．３５である。
次に、下記式（２２）にて示すように、ＣＨ_２Ｃｌ_２／Ｈ_２Ｏ＝１０／１の混合溶媒中にて、トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと記載する）を用いて、上記化合物９のｔ−ブトキシカルボニル基（−ＣＯＯＣ（ＣＨ_３）_３基；式（２２）中、ｔＢｕ）を脱保護して、収率９５％にて化合物１０を得た。
その後、４．５当量のペンタフルオロフェニルジフェニルホスフェート（式中、ＦＤＰＰ）、１１当量のジイソプロピルエチルアミン（式中、ＤＩＰＥＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の存在下にて、上記化合物１０とＢｏｃ基によってアミノ基が保護されたｍ−フェニレンジアミン誘導体（化合物１１、１０当量）とを縮合させ、収率９９％にてＮ−Ｂｏｃアミン誘導体（化合物１２）を得た。続いて、メタノール（式中、ＭｅＯＨ）中、Ｐｄ／Ｃ（活性炭担持パラジウム）の存在下にて接触水素還元を行い、化合物１２に縮合した上記Ｚ−グリシンのベンジルオキシカルボニル基（式中、Ｚ基）を脱保護して、収率７９％にて化合物１３を得た。

上記化合物１．０〜１３を得るために、具体的には、以下の操作を行った。
すなわち、化合物１０を得るために、化合物９（２．９８ｇ，４．９０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶かし、−１０℃でＴＦＡ（１５ｍＬ）と水（１．５ｍＬ）とを加えた後、室温で１．５時間攪拌して化合物９反応溶液を得た。該化合物９反応溶液を減圧濃縮した後、氷浴中で濃縮残渣にｐＨが５になるまで１０％水酸化ナトリウム水溶液を加え、さらにｐＨが２になるまで濃塩酸を加えて、白色固体を析出させた。得られた白色固体を水で洗浄し、化合物１０（収量２．０４ｇ、収率９５％）を白色固体として得た。
得られた上記化合物１０のＥＳＩ−ＭＳ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ４３７．１［（Ｍ−Ｈ）⁻］であった。また、核磁気共鳴（^１Ｈ−ＮＭＲ、４００ＭＨｚ，ｄ_６−ＤＭＳＯ）測定を行ったところ、

であった。これらにより、化合物１０の構造を確認することができた。なお、化合物１０の分子質量は４３８．１６である。
また、化合物１１を得るために、ｍ−フェニレンジアミン（０．５０ｇ，４．６２ｍｍｏｌ）をメタノール（３５ｍＬ）に溶かし、０℃で（Ｂｏｃ）_２Ｏ（１．０６ｍＬ，４．６２ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．６５ｍＬ，４．６５ｍｍｏｌ）とを加えた後、室温で２４時間攪拌して、減圧濃縮を行った。該減圧濃縮によって得られた濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶媒：クロロホルム／アセトン＝１０／１）で精製し、化合物１１（収量６６５ｍｇ、収率６８％）を白色固体として得た。
上記化合物１１の、ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ２３１．２［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。また、^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、

であった。これらにより、化合物１１の構造を確認することができた。なお、化合物１１の分子質量は２０８．１２である。
また、化合物１２を得るために、上記化合物１０（１００ｍｇ，２２８μｍｏｌ）、上記化合物１１（４７５ｍｇ，２．２８ｍｍｏｌ）、ＦＤＰＰ（３９４ｍｇ，１．０３ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（４４７μＬ，２．５７ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶かし、アルゴン雰囲気下で、室温で２９時間攪拌した後、酢酸エチル及び水を加えて酢酸エチルで抽出し、有機層を０．５Ｎ塩酸、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、及び飽和食塩水で１回ずつ洗浄して、乾燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させて、乾燥反応溶液を得た。得られた乾燥反応溶液から、乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶媒：クロロホルム／アセトン＝３／１）で精製し、化合物１２（収量２２８ｍｇ、収率９９％）を白色固体として得た。
上記化合物１２のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところｍ／ｚ１００９．５［（Ｍ＋Ｈ）^＋］であった。また、^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、

であった。これらにより、化合物１２の構造を確認することができた。なお、化合物１２の分子質量は１００８．５０である。
また、化合物１３は、具体的には次のようにして得た。すなわち、化合物１２（２００ｍｇ，１９８μｍｏｌ）をメタノール（３ｍＬ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（６２．３ｍｇ）を加え、水素雰囲気下、室温で１５時間攪拌した後、上記Ｐｄ／Ｃを濾去して、減圧濃縮を行った。該減圧濃縮によって得られた濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶媒：クロロホルム／メタノール＝８／１）で精製して、化合物１３（収量１３６ｍｇ、収率７８％）を白色固体として得た。
上記化合物１３のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ８７５．５［（Ｍ＋Ｈ）^＋］であった。また、^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、

であった。これらにより、化合物１３の構造を確認することができた。なお、化合物１３の分子質量は８７４．４６である。
さらに、下記式（２３）にて示すように、１．０当量のＥＤＣ・ＨＣｌ、１．０当量の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（式（２３）中、ＨＯＢｔ）、ＣＨ_２Ｃｌ_２中、上記化合物１３を、１．０当量のチオクト酸（化合物１４）と縮合させ、収率７５％にてチオクト酸誘導体（化合物１５）を得た。
上記にて得られた化合物１５を、ＣＨ_２Ｃｌ_２中、トリメチルシリルクロリド（式中、ＴＭＳＣｌ）、フェノール（ＰｈＯＨ）の存在する酸性条件下にて、上記Ｂｏｃ基を脱保護し、芳香族アミノ基を有する炭化水素誘導鎖を３鎖含んでなるリンカー化合物として、化合物Ａを得た（収率３２％）。

具体的に、化合物１５および化合物Ａを得るために以下の操作を行った。
すなわち、化合物１５を得るために、化合物１４（２３．６ｍｇ，１１４ｍｏｌ）とＨＯＢｔ（１５．４ｍｇ，１１４ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（２．３ｍＬ）に溶解し、０℃の温度条件下、化合物１３（２．５０ｍｇ，６．０２ｍｍｏｌ）を加えて、アルゴン雰囲気下で、遮光して室温で３６時間攪拌した後、１０％クエン酸水溶液とを加えてからクロロホルムで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた。その後、該乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶媒：クロロホルム／メタノール＝４０／１）で精製して、化合物１５（収量９１．０ｍｇ、収率７５％）を白色固体として得た。
上記化合物１５のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ１０８５．５［（Ｍ＋Ｈ）^＋］であった。また、^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ_３Ｃｌ）測定を行ったところ、

であった。これらにより、化合物１５の構造を確認することができた。なお、化合物１５の分子質量は１０６２．４９である。
また、化合物Ａを得るために、トリメチルシリルクロリド（０．２５ｍＬ，２．６４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（０．４９ｍＬ）に溶解し、フェノール（５４９ｍｇ，５．８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１．４６ｍＬ）に溶解したフェノール溶液を加えて攪拌した後、さらに、化合物１５（３４．７ｍｇ，３２．６μｍｏｌ）を加え、室温で、遮光下１．５時間攪拌して、化合物１５反応溶液を得た。続いて、該化合物１５反応溶液にクロロホルムを加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄して、黄色固体を析出させた。析出した黄色固体を酢酸に溶解して４℃まで冷却し、凝集した固体を濾別して、化合物Ａ（収量７．９ｍｇ、収率３２％）を白色固体として得た。
上記化合物ＡのＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ７６３．６［（Ｍ＋Ｈ）^＋］であった。また、^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、

であった。これらにより、化合物Ａの構造を確認することができた。なお、化合物Ａの分子質量は７６２．３３である。
続いて、このように得られたリンカー化合物Ａを用いて、上記一般式（１２）にて表される構造において、ｎ^１が１であり、Ｘが一般式（２）にて表され、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３が２である構造を有するリガンド複合体（化合物１）を下記式（２４）の手順にて合成した。

式（２４）に示すように、得られたリンカー化合物Ａと、上記式（１８）にて表されるオリゴ糖である市販のマルトース水和物（４．５当量）とを、Ｈ_２Ｏ／ジメチルアセトアミド（式中、ＤＭＡｃ）／酢酸（ＡｃＯＨ）＝１／１／０．１の混合溶媒に溶解し、ｐＨ４〜４．５、３７℃にて、シッフ塩基を形成させた後、溶媒にＡｃＯＨを加え、１０当量の９５％ＮａＢＨ_３ＣＮを加えて、ｐＨ３〜４．５、３７℃にて、還元アミノ化反応を行った。その後、得られた化合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（アマーシャムバイオシステムズ社製）を用いて、ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、さらに脱塩処理を行って、末端にα−グルコピラノースを３単位含んでなるリガンド複合体として化合物１を得た。上記化合物１の同定は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳおよびＮＭＲによって行った。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの結果は、ｍ／ｚ；１７６４．４１［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。また^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）測定を行ったところ、

であった。これらの結果から化合物１の構造を確認することができた。なお、この化合物１の分子質量は１７４０．７０である。
（２）２番目のリガンド複合体（化合物２）の合成
上記２番目のリガンド複合体の一つである、上記一般式（１２）にて表される構造において、ｎ^１が１であり、Ｘが一般式（２）にて表される構造を備え、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒに上記式（１９）で表されるラクトースが導入され、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３が２である構造を有するリガンド複合体（化合物２）を以下の手順で合成した。
上記リガンド複合体（化合物２）の合成においては、まず、リンカー化合物Ａを、上述の１番目のリガンド複合体の合成における手順と同じ手順で合成した。
続いて、得られたリンカー化合物Ａを用いて、上記一般式（１２）にて表される構造において、ｎ^１が１であり、Ｘが一般式（２）にて表される構造を備え、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒに上記式（１９）で表されるラクトースが導入され、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３が２である構造を有するリガンド複合体（化合物２）を下記式（２５）の手順にて合成した。

式（２５）に示すように、上記の方法で得られたリンカー化合物Ａと、上記式（１９）にて表されるオリゴ糖である市販のラクトース水和物（４．５当量）とを、Ｈ_２Ｏ／ジメチルアセトアミド（式中、ＤＭＡｃ）／酢酸（ＡｃＯＨ）＝１／１／０．１の混合溶媒に溶解し、ｐＨ４〜４．５、３７℃にて、シッフ塩基を形成させた後、溶媒にＡｃＯＨを加え、１０当量の９５％ＮａＢＨ_３ＣＮを加えて、ｐＨ３〜４．５、３７℃にて、還元アミノ化反応を行った。その後、得られた化合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（アマーシャムバイオシステムズ社製）を用いて、ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、さらに脱塩処理を行って、末端にβ−ガラクトピラノースを３単位含んでなるリガンド複合体として化合物２を得た。上記化合物２の同定は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳおよびＮＭＲによって行った。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの結果は、ｍ／ｚ１７６６．９２［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。また^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）測定を行ったところ、

であった。これらの結果から化合物２の構造を確認することができた。なお、この化合物２の分子質量は１７４０．７０である。
（３）３番目のリガンド複合体（化合物３）の合成
上記３番目のリガンド複合体の一つである、上記一般式（１２）にて表される構造において、ｎ^１が１であり、Ｘが一般式（３）にて表される構造を備え、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒに上記式（１８）で表されるマルトースが導入され、ｍ^４，ｍ^５が２である構造を有するリガンド複合体（化合物３）を以下の手順で合成した。
上記リガンド複合体（化合物３）の合成の前段階として、まず、芳香族アミノ基末端が保護基によって保護された分岐鎖を２鎖有するリンカー化合物Ｂの合成を行った。
下記式（２６）にて示すように、アミノ安息香酸（Ｂ−１）のアミノ基をＢｏｃ基で保護したアミノ安息香酸誘導体（Ｂ−２）とジエチレントリアミン（Ｂ−３）をＨＯＢｔとＥＤＣ−ＨＣｌを用いて縮合し、ジアミド体（Ｂ−４）を７９％の収率で得た。ＤＭＦ中、縮合剤としてＦＤＰＰを用いて、ジアミド体（Ｂ−４）とアミノ基をＺ基で保護したグリシン（Ｚ−Ｇｌｙ）とを反応させ、（Ｂ−５）を７５％の収率で得た。Ｚ基を接触水素還元により除去して（Ｂ−６）とした後、チオクト酸（Ｂ−７）と縮合させ、（Ｂ−８）を９７％の収率で得た。最後に、ＴＦＡによってＢｏｃ基を除去し、芳香族アミノ基を２単位有するリンカー化合物Ｂを９５％の収率で得た。

より具体的に説明すれば、上記化合物Ｂ−２は、４−アミノ安息香酸（Ｂ−１）（２．００ｇ，１４．６ｍｍｏｌ）をメタノール１４０ｍＬに溶解させ、（Ｂｏｃ）_２Ｏ（６．７ｍＬ，２９．１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（３．０６ｍＬ、２１．９ｍｍｏｌ）を加えて室温で１６時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮し、残渣にヘキサンと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加え、水層を抽出した。この水層に１０％クエン酸ナトリウム水溶液をｐＨ＝４になるまで加え、白色の固体を析出させた。得られた固体を酢酸エチルに溶解させ、水で洗浄した後、減圧濃縮した。残査を酢酸エチル−ヘキサンで再結晶して化合物Ｂ−２（３．２５ｇ，収率：９１．３％）を無色結晶として得た。
得られた上記化合物Ｂ−２の^１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）測定を行ったところ、

であった。また、上記化合物Ｂ−２のＥＳＩ−ＭＳ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ２３６．２０［（Ｍ−Ｈ）⁻］であった。これによって化合物Ｂ−２の構造を確認することができた。なお、この化合物Ｂ−２の分子質量は２３７．２５である。
続いて、上記化合物Ｂ−２（１．３０ｇ、５．４６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．７３８ｇ、５．４６ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ・ＨＣｌ（１．０５ｇ，５．４６ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（３０ｍＬ）に溶解させ、アルゴン雰囲気下に０℃で５０分間攪拌した。この溶液にジエチレントリアミン（Ｂ−３）（０．２８３ｍＬ，２．６０ｍｍｏｌ）を加え、遮光下に室温で終夜攪拌し、白色結晶を得た。この白色結晶を濾取した後、メタノールから再結晶して、化合物Ｂ−４（１．２３ｇ，収率：８７．４％）を白色結晶として得た。
得られた上記化合物Ｂ−４の^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ）測定を行ったところ、

であった。また、上記化合物Ｂ−４のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ５４２．６４［（Ｍ＋Ｈ）^＋］であった。これによって化合物Ｂ−４の構造を確認することができた。なお、この化合物Ｂ−４の分子質量は５４１．６０である。
続いて、上記化合物Ｂ−４（１．０３ｇ，１．８５ｍｍｏｌ）、Ｚ−グリシン（０．４３０ｇ，２．０４ｍｍｏｌ）およびＦＤＰＰ（１．０７ｍｇ，２．７８ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（８ｍＬ）に溶解した後、ジイソプロピルエチルアミン（０．３６ｍＬ，２．７８ｍｍｏｌ）を加え、アルゴン雰囲気下に室温で２０時間攪拌した。この反応溶液を減圧濃縮して得られた残渣をクロロホルムに溶解し、有機層を１０％クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で順に洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（５０ｇ，クロロホルム：アセトン＝１：２）で精製して、化合物Ｂ−５（１．０２ｇ，収率：７５．０％）を白色固体として得た。
得られた上記化合物Ｂ−５の^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、

であった。また、上記化合物Ｂ−５のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ７５５．３６［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。これによって化合物Ｂ−５の構造を確認することができた。なお、この化合物Ｂ−５の分子質量は７３２．３２である。
続いて、上記化合物Ｂ−５（０．１９３ｇ，０．２６４ｍｍｏｌ）をメタノール（３ｍＬ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（１２０ｍｇ）を加え、水素雰囲気下、室温で３時間攪拌した後、Ｐｄ／Ｃを濾去して減圧濃縮し、化合物Ｂ−６（０．２３０ｇ，収率：９４．４％）を白色固体として得た。
得られた上記化合物Ｂ−６の^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ_６−ＤＭＳＯ）測定を行ったところ、

であった。また、上記化合物Ｂ−６のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ５９９．３３［（Ｍ＋Ｈ）^＋］であった。これによって化合物Ｂ−６の構造を確認することができた。なお、この化合物Ｂ−６の分子質量は５９８．３９である。
続いて、チオクト酸（Ｂ−７）（４１．０ｍｇ，０．２００ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３５．０ｍｇ，０．２００ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ・ＨＣｌ（４２．１ｇ，０．２００ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（３ｍＬ）に溶解し、窒素雰囲気下に遮光して０℃で１．５時間攪拌した。次いで、上記化合物Ｂ−６（０．１ｇ，０．１６７ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解して、上記のジメチルホルムアミド溶液に滴下した後、室温で１９時間攪拌した。反応溶液にクロロホルムを加え、有機層を抽出し、この有機層を１０％クエン酸水溶液と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液とで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（５０ｇ，クロロホルム：メタノール＝７：１）で精製して、化合物Ｂ−８（０．１２８ｇ，収率：９７．０％）を白色固体として得た。
得られた上記化合物Ｂ−８の^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、

であった。また、上記化合物Ｂ−８のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ８０９．３３［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。これによって化合物Ｂ−８の構造を確認することができた。なお、この化合物Ｂ−８の分子質量は７８７．３０である。
上記化合物Ｂ−８（０．１２８ｇ，０．１６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１ｍＬ）に溶解し、ＴＦＡ（２ｍＬ）を加えて、遮光下０℃で１．５時間攪拌した後、減圧濃縮を行い、得られた残渣をメタノールに溶解して、Ｄｏｗｅｘ Ｍａｒａｔｈｏｎ Ａ（ＯＨ⁻ ｆｏｒｍ）のカラムに通して中和し、減圧濃縮し、化合物Ｂ（８９．３ｍｇ，収率：９５．２％）を黄色固体として得た。
得られた上記化合物Ｂの^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ_６−ＤＭＳＯ）測定を行ったところ、

であった。また、上記化合物ＢのＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ５８７．２４［（Ｍ＋Ｈ）^＋］であった。これによって化合物Ｂの構造を確認することができた。なお、この化合物Ｂの分子質量は５８６．２４である。
続いて、得られたリンカー化合物Ｂを用いて、上記一般式（１２）にて表される構造において、ｎ^１が１であり、Ｘが一般式（３）にて表される構造を備え、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒに上記式（１８）で表されるマルトースが導入され、ｍ^４，ｍ^５が２である構造を有するリガンド複合体（化合物３）を下記式（２７）の手順にて合成した。

式（２７）に示すように、上記の方法で得られたリンカー化合物Ｂと、上記式（１８）にて表されるオリゴ糖である市販のマルトース水和物（４．５当量）とを、Ｈ_２Ｏ／ジメチルアセトアミド（式中、ＤＭＡｃ）／酢酸（ＡｃＯＨ）＝１／１／０．１の混合溶媒に溶解し、ｐＨ４〜４．５、３７℃にて、シッフ塩基を形成させた後、溶媒にＡｃＯＨを加え、１０当量の９５％ＮａＢＨ_３ＣＮを加えて、ｐＨ３〜４．５、３７℃にて、還元アミノ化反応を行った。その後、得られた化合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（アマーシャムバイオシステムズ社製）を用いて、ゲル濾過クロマトグラフィーにより精製し、さらに脱塩処理を行って、末端にα−グルコピラノースを２単位含んでなるリガンド複合体として化合物３を得た。上記化合物３の同定は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳおよびＮＭＲによって行った。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの結果は、ｍ／ｚ１２３９．３６［（Ｍ＋Ｈ）^＋］であった。また^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）測定を行ったところ、

であった。これらから結果から化合物３の構造を確認することができた。なお、この化合物３の分子質量は１２３８．４８である。
（４）４番目のリガンド複合体（化合物４）の合成
上記４番目のリガンド複合体の一つである、上記一般式（１２）にて表される構造において、ｎ^１が１であり、Ｘが一般式（３）にて表される構造を備え、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒに上記式（１９）で表されるラクトースが導入され、ｍ^４，ｍ^５が２である構造を有するリガンド複合体（化合物４）を以下の手順で合成した。
上記リガンド複合体（化合物４）の合成の前段階として、まず、芳香族アミノ基末端が保護基によって保護された分岐鎖を２鎖有するリンカー化合物Ｂの合成を上記のように行った。続いて、得られたリンカー化合物Ｂを用いて、上記一般式（１２）にて表される構造において、ｎ^１が１であり、Ｘが一般式（３）にて表される構造を備え、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒに上記式（１９）で表されるラクトースが導入され、ｍ^４，ｍ^５が２である構造を有するリガンド複合体（化合物４）を下記式（２８）手順にて合成した。

式（２８）に示すように、上記の方法で得られたリンカー化合物Ｂと、上記式（１９）にて表されるオリゴ糖である市販のラクトース水和物（４．５当量）とを、Ｈ_２Ｏ／ジメチルアセトアミド（式中、ＤＭＡｃ）／酢酸（ＡｃＯＨ）＝１／１／０．１の混合溶媒に溶解し、ｐＨ４〜４．５、３７℃にて、シッフ塩基を形成させた後、溶媒にＡｃＯＨを加え、１０当量の９５％ＮａＢＨ_３ＣＮを加えて、ｐＨ３〜４．５、３７℃にて、還元アミノ化反応を行った。その後、得られた化合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（アマーシャムバイオシステムズ社製）を用いて、ゲル濾過クロマトグララィーにより精製し、さらに脱塩処理を行って、末端にβ−ガラクトピラノースを２単位含んでなるリガンド複合体として化合物４を得た。上記化合物４の同定は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳおよびＮＭＲによって行った。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳの結果は、ｍ／ｚ１２６１．１５［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。また^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）測定を行ったところ、

であった。これらの結果から化合物４の構造を確認することができた。なお、この化合物４の分子質量は１２３８．４８である。
［実施例２：ＳＰＲ測定と質量分析によるタンパク質の分析］
実施例２では、実施例１にて作製した各リガンド複合体（化合物１〜４）を用いて、タンパク質の糖鎖との結合特性について、ＳＰＲ測定および質量分析によって解析した。その手順について以下に説明する。
図１には、本実施例におけるタンパク質の分析の手順を工程１〜工程１２として示す。図１において、工程１〜工程７は、各リガンド複合体（化合物１〜４）を、金（Ａｕ）でコーティングされた支持体表面に固定化させてリガンド担持体（センサチップ）を作製する工程である。そして、上記リガンド担持体を、分析対象となるタンパク質を含む溶液と接触させる工程８の後に実施される工程が、ＳＰＲ測定を行う工程である。さらに、支持体表面を水で洗う工程１０の後に実施される工程が、質量分析（ＭＳ）によってタンパク質を同定する工程である。
本実施例において、ＳＰＲ測定は日本レーザ電子社製のＳＰＲ−８Ｂを用いて行った。また、質量分析はアプライドバイオ社製のマトリックス支援型レーザ脱離／飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）であるＶｏｙａｇｅｒ ＲＰ−ＤＥを用いて行った。
分析に用いたタンパク質は、グルコピラノース結合性のレクチンタンパク質としてＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ（ＣｏｎＡと略記する）、ＰＳＡ、ＬＣＡ、および、ガラクトピラノース結合性のレクチンタンパク質としてＲＣＡ、ＰＮＡの５種類であった。そして、ネガティブコントロールとしてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。
まず、図１に示す工程１〜工程７に基づいて、上記化合物１〜４をそれぞれ固定化した４種類のリガンド担持体を作製した。続いて、上記の５種のレクチンタンパク質およびＢＳＡを、それぞれＰＢＳバッファーに溶解してタンパク質溶液を調製した。その後、図１に示す工程８を行い、各リガンド担持体と各タンパク質溶液とをそれぞれ接触させて相互作用させた。続いて、ＳＰＲ測定を行い、リガンド担持体とタンパク質との結合測定を行った。
α−グルコピラノースを固定化したリガンド担持体（センサチップ）を用いたレクチンタンパク質の結合挙動の結果を図２、図３および表１に示した。図２には化合物３（Ｄｉ−ｖａｌｅｎｔ ｔｙｐｅ）のリガンド複合体を固定化したセンサチップの結果を示し、図３には化合物１（Ｔｒｉ−ｖａｌｅｎｔ ｔｙｐｅ）のリガンド複合体を固定化したセンサチップの結果を示した。図２および図３とも、（ａ）はＣｏｎＡの結合挙動結果、（ｂ）はＰＳＡの結合挙動結果、（ｃ）はＬＣＡの結合挙動結果を示している。

図２および図３から明らかなように、ＣｏｎＡおよびＰＳＡについては、リガンド複合体のリンカー部分の構造の違いによらず同様の結合挙動を示した。しかし、ＬＣＡについては、３単位の糖分子を有するリガンド複合体である化合物１とは結合することが示されたが、２単位の糖分子を有するリガンド複合体化合物３とは結合しないことが示された。図には示していないが、ネガティブコントロールであるＢＳＡは化合物１または３を固定化したチップには結合しないことが分った。
また、表１には、それぞれのタンパク質の結合挙動をまとめた。αグルコース結合性のレクチンタンパク質に、特異的結合が観測され、結合定数の算出も可能であった。Ｄｉ−ｖａｌｅｎｔリガンド結合体を用いた場合よりも、Ｔｒｉ−ｖａｌｅｎｔリガンド結合体を用いた場合の方が解離定数（Ｋ_Ｄ）が同等または小さく算出されており、１つのリガンド複合体当たりの糖鎖の数が増えることによって、結合活性が上昇していることが明らかとなった。
β−ガラクトピラノースを固定化したリガンド担持体（センサチップ）を用いたレクチンタンパク質の結合挙動の結果を図４、図５および表２に示した。図４には化合物４（Ｄｉ−ｖａｌｅｎｔ ｔｙｐｅ）のリガンド複合体を固定化したセンサチップの結果を示し、図５には化合物２（Ｔｒｉ−ｖａｌｅｎｔ ｔｙｐｅ）のリガンド複合体を固定化したセンサチップの結果を示した。図４および図５とも、（ａ）はＲＣＡの結合挙動結果、（ｂ）はＰＮＡの結合挙動結果を示している。

図４および図５から明らかなように、ＲＣＡおよびＰＮＡはリガンド複合体のリンカー部分の構造の違いによらず同様の結合挙動を示した。図には示していないが、ネガティブコントロールであるＢＳＡは化合物２または４を固定化したチップには結合しないことが分った。
また、表２には、それぞれのタンパク質の結合挙動をまとめた。βガラクトース結合性のレクチンタンパク質に、特異的結合が観測され、結合定数の算出も可能であった。なお、ＣｏｎＡについては化合物３を用いて作成したチップにおいて、タンパク質の濃度に依存しない非特異的な結合挙動が観測された。Ｄｉ−ｖａｌｅｎｔリガンド結合体を用いた場合よりも、Ｔｒｉ−ｖａｌｅｎｔリガンド結合体を用いた場合の方が解離定数（Ｋ_Ｄ）が同等または小さく算出されており、１つのリガンド複合体当たりの糖鎖の数が増えることによって、結合活性が上昇していることが明らかとなった。
以上の結果から、糖鎖の集合化度によってタンパク質の糖鎖に対する結合活性が異なる場合があることが明らかとなり、レクチンタンパク質の糖鎖結合特性もこの系によって測定することが出来ることが示された。
さらに、このＳＰＲ測定に供したリガンド担持体のうち、タンパク質との結合が確認されたものについては、工程９および工程１０を行った後、質量分析計に供することで、リガンド担持体に結合しているタンパク質の同定を行った。なお、質量分析を行う際には、結合測定を行った部分にマトリックス溶液（飽和αＣＨＣＡまたはシナピン酸）を乗せ、乾燥させてから質量分析計に供し、分子質量の測定を行った。
上記の一連の工程で、リガンド担持体とタンパク質との結合挙動を確認した後、工程１１においてリガンド担持体とタンパク質との結合を解離させた後、工程１２においてＰＢＳバッファーで洗浄を行った。その後、別のタンパク質溶液を用いて、再度工程８〜工程１０までを繰り返し、ＳＰＲ測定および質量分析を行った。この作業を各リガンド担持体および各タンパク質について繰り返し実施した。
質量分析の結果を図６および表３に示した。図６（ａ）にはＣｏｎＡの分析結果を示し、図６（ｂ）にはＰＮＡの分析結果を示した。

図６（ａ）および図６（ｂ）から明らかなように、それぞれのタンパク質を構成するサブユニットの分子質量に相当する１価と２価のイオンピークが観測された。
また、表３には他のレクチンタンパク質の結果も合わせてまとめた。各々のレクチンタンパク質のサブユニットの１価または２価の分子質量に近いイオンピークが観測された。ただし、ＲＣＡについてはサブユニットの分子質量が３万ダルトン以上と大きいために、用いた質量分析計ではそのイオンピークを検出することは出来なかった。より高性能なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ機器を用いれば検出は可能であろう。
この質量分析の結果、ＲＣＡを除いて、結合した各々のレクチンタンパク質に相当する分子量が観測され、レクチンタンパク質の同定に成功した。
以上のように、本実施例の結果から、本発明にかかるリガンド複合体を用いてＳＰＲ測定および質量分析を行ってタンパク質の分析を行えば、タンパク質を正確に同定することができることが確認された。また、本実施例の結果から、末端に同じ糖鎖を有しているリガンド担持体であっても、糖鎖の集合化度の差によってタンパク質との結合活性が異なることが確認された。つまり、本発明のタンパク質の分析方法は、糖鎖の集合化度とタンパク質の結合活性との関係の解析にも利用することができると考えられる。このような糖鎖の集合化度とタンパク質の結合活性との関係の解析は、既存の方法では判別不可能であるため、本発明の有用性をより高めるものと言える。
［実施例３：リガンド複合体（化合物２１、２２）の合成］
本実施例では、実施の形態において説明した５番目および６番目のリガンド複合体に分類されるリガンド複合体を合成した。すなわち、５番目のリガンド複合体である上記一般式（１３）にて表される構造においてｎ^２が４であり、上記Ｘが一般式（４）にて表される構造を備え、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒにグルコースが導入された構造を有するリガンド複合体（化合物２１）、および、６番目のリガンド複合体である上記一般式（１３）にて表される構造においてｎ^２が４であり、上記Ｘが一般式（４）にて表される構造を備え、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒにマルトースが導入された構造を有するリガンド複合体（化合物２２）を以下の手順で合成した。
〔測定方法、試薬等〕
^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定には、ＪＥＯＬ−Ｄｅｌｔａ６００ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いた。化学シフトは、ＣＤＣｌ_３の場合はテトラメチルシラン（０．００ｐｐｍ）を基準物質にしてδ値で表した。Ｄ_２Ｏの場合はＤＨＯ（４．６５ｐｐｍ）を基準物質にしてδ値で表した。質量分析はＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｍａｒｉｎｅｒ^ＴＭ Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて測定した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ、０．０４０−０．０６３ｍｍ）を用いて行った。薄層クロマトグラフィーはＰｒｅｃｏａｔｅｄ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０ Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ、０．５ｍｍ）を使用した。全ての試薬、脱水溶媒は関東化学株式会社製のものを購入して使用した。
（１）化合物１６の合成
以下、式（２９）にしたがって説明する。

まず、式（２９）の化合物１６を以下の手順で合成した。
ビス［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル］エーテル（１４．５７ｍｌ，８０ｍｍｏｌ）とＢＦ_３・Ｅｔ_２Ｏ（２５２ｍｌ，２ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン５０ｍｌに溶解し、０℃でジアゾ酢酸エチル（１．８ｍｌ，１７．３５ｍｍｏｌ）を滴下した後、室温で７０分間攪拌した。反応溶液に飽和塩化アンモニウム水溶液２０ｍｌを加え、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、濃縮残渣をクロマトグラフィー（６００ｇ、ヘキサン：酢酸エチル＝１：３）で精製してエチル化体化合物（２．２６ｇ，収率：４７％）を無色液体として得た。
上記のエチル体化合物（２．１５ｇ，７．６６ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（４１．７ｍｇ，３３７ｍｍｏｌ）を無水ピリジン８ｍｌに溶解した。この溶液に０℃でｐ−トルエンスルホン酸クロリド（１．７５ｇ，９．１９ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン８ｍｌに溶解した溶液を滴下し、室温で３時間攪拌した。反応溶液にジクロロメタンと氷水を加えてジクロロメタンに抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で１回ずつ洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、濃縮残渣をクロマトグラフィー（１００ｇ、クロロホルム：アセトン＝４：１）で精製してトシル体化合物（２．５９ｇ，収率：７８％）を黄色液体として得た。
上記のトシル体化合物（１．０１ｇ，２．３１ｍｍｏｌ）とアジ化ナトリウム（１．５３ｇ，２．３１ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド５０ｍｌに溶解し、遮光して１２０℃で窒素雰囲気下１０時間攪拌した。反応溶液をクロロホルムで抽出し、水、飽和食塩水で有機層を１回ずつ洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、濃縮残渣をクロマトグラフィー（１０ｇ、クロロホルム：アセトン＝２：１）で精製してアジド体化合物（６３８ｍｇ，収率：９０％）を黄色液体として得た。
上記のアジド体化合物（６１４ｍｇ，２．０１ｍｍｏｌ）をメタノール２４ｍｌに溶解し、遮光下０℃で１Ｎ ＮａＯＨ ４．３ｍｌを加えた後、室温で２１時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、濃縮残渣にクロロホルムを加えた後、１Ｎ ＨＣｌをｐＨ＝２になるまで加え、クロロホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で１回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、化合物１６（５４９ｍｇ，収率：９０％）を無色液体として得た。
この化合物１６について^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、δ６．１９（１Ｈ，ｂｓ，ＣＯ_２ Ｈ），４．１６（２Ｈ，ｓ，ＯＣＨ _２ＣＯ_２Ｈ），３．７５−３．６４（１２Ｈ，ｍ，ＯＣＨ _２ＣＨ _２Ｏ），３．６８（２Ｈ，ｍ，Ｎ_３ＣＨ_２ＣＨ _２），３．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，Ｎ_３ＣＨ _２）であった。また、上記化合物１６のＥＳＩ−ＭＳ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ３２８．１４［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。これによって化合物１６の構造を確認することができた。なお、この化合物１６の分子質量は２７７．１３である。
（２）化合物１７の合成
化合物１６（２２８ｍｇ，０．８２３ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（４ｍｌ）に溶解し、室温、ＨＯＢｔ（１３５ｍｇ，０．９８７ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１９２ｍｇ，０．９８７ｍｍｏｌ）、化合物１１（２０５ｍｇ，０．９８７ｍｍｏｌ）を０°Ｃで順に加え、遮光下２０時間攪拌した。この反応溶液を減圧濃縮して得られた濃縮残渣をクロロホルムで抽出し、有機層を１０％クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で１回ずつ洗浄して、乾燥剤として無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。減圧濃縮によって得られた濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（８０ｇ，クロロホルム：メタノール＝１０：１）で精製して、化合物１７（３６７ｍｇ，収率：９５％）を黄色オイル状物質として得た。この化合物１７のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ４９０．２４［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。これによって化合物１７の構造を確認することができた。なお、この化合物１７の分子質量は４６７．２４である。
（３）化合物１８の合成
化合物１７（２９ｍｇ，０．０６２ｍｍｏｌ）をメタノール（３ｍｌ）に溶解し、１０％Ｐｄ／Ｃ（５．０ｍｇ）を加え、水素雰囲気下、室温で９時間攪拌した。上記Ｐｄ／Ｃを濾去して濾液を減圧濃縮した。得られた濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（１．５ｇ，クロロホルム：メタノール＝７：１）で精製して、化合物１８（２２ｍｇ，収率：８２％）を黄色オイル状物質として得た。この化合物１８のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ４４２．２７［（Ｍ＋Ｈ）^＋］であった。これによって化合物１８の構造を確認することができた。なお、この化合物１８の分子質量はＣ_２１Ｈ_３５Ｎ_３Ｏ_７：４４１．２５である。
（４）化合物１９の合成
チオクト酸（１２．６ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）に溶解し、アルゴン雰囲気下、ＨＯＢｔ（８．３ｍｇ，０．０６１ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１１．８ｍｇ，０．０６１ｍｍｏｌ）を順に加え、遮光下室温に戻して２時間攪拌した。化合物１８（２２．４ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）を無水ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）に溶解して加え、室温で遮光下１日撹拌した。反応液にトルエンを加えて、濃縮し、有機層を１０％クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。得られた濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３ｇ、クロロホルム：メタノール＝１０：１）で精製し、化合物１９を黄色の油状物として得た。収量は２７ｍｇ（８４％）であった。この化合物１９のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ６５２．２８［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。これによって化合物１９の構造を確認することができた。なお、この化合物１９の分子質量は６２９．２８である。
（５）化合物２０の合成
化合物１９（３１ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２ｍｌ）に溶解し、０℃でＴＦＡ（１４７μｌ）を加え、同温で３時間攪拌した。反応溶液を濃縮後、トルエンで共沸した。得られた濃縮残渣をジクロロメタンに溶解し、トリエチルアミン水溶液を加えて、水相のｐＨを８とした後、有機相を無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。得られた濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｇ、クロロホルム：メタノール＝５：１）で精製し、化合物２０を黄色の油状物として得た。収量は２６．１ｍｇ（５９％）であった。この化合物２０について^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、

であった。また、化合物２０のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ５５２．３１［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。以上から化合物２０の構造を確認することができた。なお、この化合物２０の分子質量は５２９．２３である。
（６）リガンド複合体（化合物２１）の合成
以下、式（３０）にしたがって説明する。

化合物２０（１５．５ｍｇ，２９．３μｍｏｌ）とグルコース（５．８ｍｇ，３２．２μｍｏｌ）をＤＭＡｃ／水（１：１，１ｍｌ）に溶解し、酢酸（２００μｌ）を加え、３７℃で２日放置した。反応液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（５．５ｍｇ，８７．９μｍｏｌ）を加え、３７℃でさらに６日間放置した。反応液を濃縮した。得られた残渣は、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ，３０ｇ，メタノール／水＝５０／５０）によって精製した。化合物２１は白色の固体として得られた。収量は４．５４ｍｇ（２２％）であった。
この化合物２１について^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）測定を行ったところ、

であった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定を行ったところ、ｍ／ｚ６９４．６６［（Ｍ＋Ｈ）^＋］であった。これらによって化合物２１の構造を確認することができた。なお、この化合物２１の分子質量は６９３．３０である。
（７）リガンド複合体（化合物２２）の合成
以下、式（３１）にしたがって説明する。

化合物２０（９．０ｍｇ，１７．０μｍｏｌ）とマルトース（５．８ｍｇ，１７．０μｍｏｌ）をメタノール／水（１：１，１ｍｌ）に溶解し、酢酸（５０μｌ）を加え、３７℃で２４時間放置した。反応液に酢酸（４５０μｌ）とシアノ水素化ホウ素ナトリウム（３．２ｍｇ，５１．０μｍｏｌ）を加え、３７℃でさらに１２０時間放置した。反応液を濃縮した。得られた残渣は、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ，３０ｇ，メタノール／水＝５０／５０）によって精製した。化合物２２は白色の固体として得られた。収量は２．３６ｍｇ（１６％）であった。
この化合物２２について^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）測定を行ったところ、

−ＮＨＣＯＣＨ _２ＣＨ_２−），１．７６−１．６９（ｍ，１Ｈ，−ＳＣＨ_２ ＣＨ _２（１Ｈ）−），１．５２−１．３１（ｍ ４Ｈ，−ＣＯＣＨ_２ ＣＨ _２ＣＨ_２ ＣＨ _２−），１．１８−１．１０（ｍ，２Ｈ，−ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ ＣＨ _２ＣＨ_２−）であった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定を行ったところ、ｍ／ｚ８７８．３９［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。これらによって化合物２２の構造を確認することができた。なお、この化合物２２の分子質量は８５５．３５である。
〔実施例４：リガンド複合体（化合物２６、２７）の合成〕
本実施例では、実施の形態において説明した７番目および８番目のリガンド複合体に分類されるリガンド複合体を合成した。すなわち、７番目のリガンド複合体の一つである上記一般式（１４）にて表される構造においてｎ^１が３であり、上記Ｘが一般式（４）にて表される構造を備え、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒにグルコースが導入された構造を有するリガンド複合体（化合物２６）、および、８番目のリガンド複合体の一つである上記一般式（１４）にて表される構造においてｎ^１が３であり、上記Ｘが一般式（４）にて表される構造を備え、Ｒ’が水素（Ｈ）であり、Ｒにマルトースが導入された構造を有するリガンド複合体（化合物２６）を以下の手順で合成した。
なお、測定方法、試薬等については、上記実施例３に記載のものと同じである。
（１）化合物２４の合成
以下、式（３２）にしたがって説明する。

γ−メルカプト酪酸の２量体（化合物２３）（３４４ｍｇ，１．４４ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（２５ｍｌ）に溶解し、室温、アルゴン雰囲気下でＨＯＢｔ（３５９ｍｇ，２．６４ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（５０８ｍｇ，２．６４ｍｍｏｌ）、Ｎ−Ｂｏｃ−フェニレンジアミン（化合物１１）（５０２ｍｇ，２．４ｍｍｏｌ）を０°Ｃで順に加え、遮光下１７時間攪拌した。この反応溶液を減圧濃縮して得られた濃縮残渣をクロロホルムで抽出し、有機層を１０％クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で１回ずつ洗浄して、乾燥剤として無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。減圧濃縮によって得られた濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（５０ｇ，トルエン：酢酸エチル＝５：１）で精製して、化合物２４（２２０ｍｇ，収率：３０％）を黄色の油状物として得た。この化合物２４のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ６４１．２５［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。これによって化合物２４の構造を確認することができた。なお、この化合物２４の分子質量は６１８．２５である。
（２）化合物２５の合成
化合物２４（１０３ｍｇ，１１．６７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２ｍｌ）に溶解し、０℃でＴＦＡ（２４７μｌ）を加え、同温で１時間攪拌した。反応溶液を濃縮後、トルエンで共沸した。得られた濃縮残渣を酢酸エチルに溶解し、トリエチルアミン水溶液を加えて、水相のｐＨを８とした後、有機相を無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。得られた濃縮残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（５ｍｇ、クロロホルム：アセトン＝５：１）で精製し、化合物２５を黄色の油状物として得た。収量は４６．８ｍｇ（６７％）であった。この化合物２５について^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）測定を行ったところ、

であった。また、化合物２５のＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）測定を行ったところ、ｍ／ｚ４１９．０６［（Ｍ＋Ｈ）^＋］であった。以上から化合物２５の構造を確認することができた。なお、この化合物２５の分子質量は４１８．１５である。
（３）リガンド複合体（化合物２６）の合成
以下、式（３３）にしたがって説明する。

化合物２５（５．０４ｍｇ，１２μｍｏｌ）とグルコース（４．７９ｍｇ，２６μｍｏｌ）をメタノール／水（１：１，１ｍｌ）に溶解し、酢酸（５０μｌ）を加え、３７℃で４時間放置した。反応液に酢酸（９５０μｌ），メタノール／水（１：１，１ｍｌ），シアノ水素化ホウ素ナトリウム（５．１４ｍｇ，７２μｍｏｌ）を加え、３７℃でさらに７２時間放置した。反応液を濃縮した。得られた残渣は、ＬＨ−２０を用いたカラムクロマトグラフィー（５０ｇ，メタノール／水＝５０／５０）によって精製した。化合物２６は白色の固体として得られた。収量は２．５８ｍｇ（２９％）であった。
この化合物２６について^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）測定を行ったところ、

であった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定を行ったところ、ｍ／ｚ７４７．２１［（Ｍ＋Ｈ）^＋］であった。これらによって化合物２６の構造を確認することができた。なお、この化合物２６の分子質量は７４６．２９である。
（４）リガンド複合体（化合物２７）の合成
以下、式（３４）にしたがって説明する。

化合物２５（５．１ｍｇ，１２μｍｏｌ）とマルトース（９．２ｍｇ，２６μｍｏｌ）をメタノール／水（１：１，１ｍｌ）に溶解し、酢酸（５０μｌ）を加え、３７℃で４時間放置した。反応液に酢酸（９５０μｌ），メタノール／水（１：１，１ｍｌ），シアノ水素化ホウ素ナトリウム（５．２２ｍｇ，７２μｍｏｌ）を加え、３７℃でさらに１２０時間放置した。反応液を濃縮した。得られた残渣は、ＬＨ−２０を用いたカラムクロマトグラフィー（５０ｇ，メタノール／水＝５０／５０）によって精製した。化合物２７は白色の固体として得られた。収量は２．７４ｍｇ（２１％）であった。
この化合物２７について^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）測定を行ったところ、

であった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定を行ったところ、ｍ／ｚ１０９３．２７［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。これらによって化合物２７の構造を確認することができた。なお、この化合物２７の分子質量は１０７０．３９である。
［実施例５］
上記一般式（９）にて表される構造においてｎ^１およびｑが０であり、上記群（２０）に示される糖鎖が導入されたリガンド複合体を合成した。なお、測定方法、試薬等は、上記実施例４と同じである。
（１）リガンド複合体（化合物３０）の合成
リガンド複合体（化合物３０）の合成の手順を、式（３５）にしたがって説明する。

化合物２８（２．４７ｍｇ，８．２４μｍｏｌ）とシアル酸含有三糖（化合物２９、５．１１ｍｇ，７．５７μｍｏｌ）をジメチルアセトアミド／水（１：１，１．０ｍｌ）に溶解し、酢酸（１００μｌ）を加え、３７℃で１０時間放置した。反応液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１．５５ｍｇ，２４．７・ｍｏｌ）を加え、３７℃でさらに７２時間放置した。反応液にアセトン３ｍｌを加え、未反応のジアノ化ホウ素ナトリウムをクエンチした後、濃縮した。得られた残渣は、Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳを用いたカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（カラム：ＤＡＩＳＯ ＳＰ−１２０−５−ＯＤＳ−ＢＰ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５を用いたクロマトグラフィーを順に行って精製した。化合物３０は白色の固体として得られた。収量は２．３１ｍｇ（３２％）であった。
この化合物３０の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）測定を行った。図７に示すチャートが得られた。またＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定を行ったところ、ｍ／ｚ９７７．５［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。これらによって化合物３０の構造を確認することができた。なお、この化合物３０の分子質量は９５４．３４である。
（２）リガンド複合体（式（３６））の合成
式（３６）にて表されるリガンド複合体を上記（１）と同様の手順で合成した。

このリガンド複合体の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、得られたチャートを図８に示した。これによって、式（３６）にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。
（３）リガンド複合体（式（３７））の合成
式（３７）にて表されるリガンド複合体を上記（１）と同様の手順で合成した。

このリガンド複合体の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、得られたチャートを図９に示した。これによって、式（３７）にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。
（４）リガンド複合体（式（３８））の合成
式（３８）にて表されるリガンド複合体を上記（１）と同様の手順で合成した。

このリガンド複合体の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、得られたチャートを図１０に示した。これによって、式（３８）にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。
（５）リガンド複合体（式（３９））の合成
式（３９）にて表されるリガンド複合体を上記（１）と同様の手順で合成した。

このリガンド複合体の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、得られたチャートを図１１に示した。これによって、式（３９）にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。
（６）リガンド複合体（式（４０））の合成
式（４０）にて表されるリガンド複合体を上記（１）と同様の手順で合成した。

このリガンド複合体の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、得られたチャートを図１２に示した。これによって、式（４０）にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。
（７）リガンド複合体（式（４１））の合成
式（４１）にて表されるリガンド複合体を上記（１）と同様の手順で合成した。

このリガンド複合体の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、得られたチャートを図１３に示した。これによって、式（４１）にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。
（８）リガンド複合体（式（４２））の合成
式（４２）にて表されるリガンド複合体を上記（１）と同様の手順で合成した。

このリガンド複合体の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、得られたチャートを図１４に示した。これによって、式（４２）にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。
（９）リガンド複合体（式（４３））の合成
式（４３）にて表されるリガンド複合体を上記（１）と同様の手順で合成した。

このリガンド複合体の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、得られたチャートを図１５に示した。これによって、式（４３）にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。
（１０）リガンド複合体（式（４４））の合成
式（４４）にて表されるリガンド複合体を上記（１）と同様の手順で合成した。

このリガンド複合体の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、得られたチャートを図１６に示した。これによって、式（４４）にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。
（１１）リガンド複合体（式（４５））の合成
式（４５）にて表されるリガンド複合体を上記（１）と同様の手順で合成した。

このリガンド複合体の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、得られたチャートを図１７に示した。これによって、式（４５）にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。
（１２）リガンド複合体（式（４６））の合成
式（４６）にて表されるリガンド複合体を上記（１）と同様の手順で合成した。

このリガンド複合体の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、得られたチャートを図１８に示した。これによって、式（４６）にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。
（１３）リガンド複合体（式（４７））の合成
式（４７）にて表されるリガンド複合体を上記（１）と同様の手順で合成した。

このリガンド複合体の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、得られたチャートを図１９に示した。これによって、式（４７）にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。
（１４）リガンド複合体（式（４８））の合成
式（４８）にて表されるリガンド複合体を上記（１）と同様の手順で合成した。

このリガンド複合体の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、得られたチャートを図２０に示した。これによって、式（４８）にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。
（１５）リガンド複合体（式（４９））の合成
式（４９）にて表されるリガンド複合体を上記（１）と同様の手順で合成した。

このリガンド複合体の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、得られたチャートを図２１に示した。これによって、式（４９）にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。
（１６）リガンド複合体（式（５０））の合成
式（５０）にて表されるリガンド複合体を上記（１）と同様の手順で合成した。

このリガンド複合体の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、得られたチャートを図２２に示した。これによって、式（５０）にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。
（１７）リガンド複合体（式（５１））の合成
式（５１）にて表されるリガンド複合体を上記（１）と同様の手順で合成した。

このリガンド複合体の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、得られたチャートを図２３に示した。これによって、式（５１）にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
産業上の利用の可能性
以上のように、本発明にかかるリガンド複合体は、一つのリガンド複合体内に複数の糖分子を導入することができるので、上記リガンド複合体同士が支持体表面に集合化することを避けつつ、糖分子については集合化させることができる。本発明のリンカー化合物を用いることによって、上記糖分子とタンパク質との相互作用を再現性よく評価することが可能になる。
また、本発明にかかるリガンド担持体は、未知タンパク質の同定に利用することができるという効果を奏する。さらに、本発明にかかるタンパク質の分析方法によれば、未知タンパク質の同定を行うことができる。
本発明は、タンパク質の機能解析に有効利用することのできる新規なリガンド複合体やリガンド担持体などを提供するものである。オリゴ糖鎖を固定化したリガンド担持体（チップ）が糖鎖やタンパク質の機能解析のツールとして発展すれば、オリゴ糖鎖が関与する生命現象の解明に貢献するだけでなく、医薬品開発における重要な技術となることが期待される。それゆえ、本発明の有用性は高いと考えられる。

Claims (5)

1. 一般式（１）
   

   

   （式中、ｐ，ｑはそれぞれ独立して１以上６以下の整数）にて表される構造を備えているリガンド複合体であって、
   上記Ｘは、
   一般式（２）、（３）または（４）
   

   

   

   

   （式中、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３，ｍ^４，ｍ^５はそれぞれ独立して０以上６以下の整数。Ｒ’は水素（Ｈ）またはＲ。）にて表される構造を備え、
   上記Ｙは、Ｓ−Ｓ結合またはＳＨ基を含む炭化水素構造であり、
   上記Ｚは、式（５）または式（６）
   

   

   （式中、ｎ^１，ｎ^２はそれぞれ１以上６以下の整数。）にて表される構造を備え、
   上記Ｒは、下記群（１０１）
   

   

   から選択される糖鎖由来化合物であることを特徴とするリガンド複合体（ただし、Ｘが一般式（２）にて表される構造である場合、Ｚは式（６）にて表される構造でない。）。
2. 一般式（１０７）
   

   

   （式中、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３はそれぞれ独立して０以上６以下の整数であり、ｎ^１は１以上６以下の整数であり、Ｒ’は水素（Ｈ）またはＲ。）にて表される構造、または
   一般式（１０８）
   

   

   （式中、ｍ^４，ｍ^５はそれぞれ独立して０以上６以下の整数であり、ｎ^１は１以上６以下の整数であり、Ｒ’は水素（Ｈ）またはＲ。）にて表される構造、または
   一般式（１０９）
   

   

   （式中、ｎ^１，ｑはそれぞれ独立して１以上６以下の整数であり、Ｒ’は水素（Ｈ）またはＲ。）にて表される構造、または
   一般式（１１０）
   

   

   （式中、ｎ^２は１以上６以下の整数であり、Ｒ’は水素（Ｈ）またはＲ。）にて表される構造を備えることを特徴とする請求項１に記載のリガンド複合体。
3. 請求項１または２に記載のリガンド複合体を、表面に金属を有する支持体上に固定化させてなることを特徴とするリガンド担持体。
4. タンパク質の分析に使用されることを特徴とする請求項３に記載のリガンド担持体。
5. 請求項１または２に記載のリガンド複合体を、支持体と接触させることによって、当該リガンド複合体を支持体上に固定化させたリガンド担持体を作成する工程と、
   上記リガンド担持体を、タンパク質溶液と接触させた後、分子間相互作用の測定を行う工程と、
   上記分子間相互作用の測定の後に質量分析を行って、上記リガンド担持体に結合しているタンパク質を同定する工程と、
   からなることを特徴とするタンパク質の分析方法。

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