TWI356816B - Carbohydrate-ligand conjugate and method for analy - Google Patents

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1356816 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於在連結化合物中導入含有還原末端之糖 鏈所成之新穎配體複合體，以及使該配體複合體集合及固 定於表面以金、銀或銅等金屬包覆之晶片上所成之配體承 載體。再者，本發明係關於使用上述配體複合體之蛋白質 分析方法。 • 【先前技術】 身體内存在之各種糖在維持生物之活動及生命之機制 中擔任重要角色。為了精密地解明此等糖之機能，依據糖 之複雜構造解析彼等之機能有其必要。在糖之機能解析方 面，使用構造已解明之糖鏈並再現糖之每一部分構造，藉 此明白糖全體之構造與機能關係之手法曾被採用。 關於上述糖之機能解析手法，已知例如表面電漿共振 (以下稱為SPR)。亦即，將包含模擬糖之一部分之寡糖之 ®配體複合體導入感測晶片之表面上，並使用已導入該配體 複合體之感測晶片，以鑑定與寡糖特異地相互作用之蛋白 質等物質。藉此，可以依據寡糖構造正確地評價生物活性。 但是，由於寡糖僅為一分子時活性不怎麼高，在評價 寡糖之生物活性時，必須將寡糖集合在感測晶片上。總之， 藉由使用集合化之寡糖以及解析與蛋白質之相互作用，可 以進行寡糖之生物活性之評價。 所以，本發明者至今得到分子中具有可固定於感測晶 6 1356816 片表面之部位及可導入寡糖之部位之連結化合物，以及在 該連結化合物上導入1單位或2單位寡糖之配體複合體。 因而發現藉由使用該配體複合體，可以於感測晶片上集合 化及導入寡糖(例如參照專利文獻1及非專利文獻1等）。 [專利文獻1]特開2003-83969號公報(2003年3月19 日公開）。 [非專利文獻1]「曰本化學會第79次春季年會-講演預 稿集II」、社團法人日本化學會、2001年3月15日、p.1042。 但是，在上述各文獻中記載之配體複合體中，導入之 糖鏈（寡糖鏈）限於發明者所合成之硫酸化糖，對於是否能 導入市售之具有還原末端之麥芽糖、乳糖等寡糖並加以晶 片化則不明白。再者，上述文獻中記載之所謂「將固定化 配體複合體所得到之感測晶片用於採用SPR之測定後，鑑 定與晶片上之糖鏈鍵結之蛋白質」之利用方法，雖然自先 前以來一直被提倡，但尚無能令人滿意之資料。 本發明鑑於上述之問題點，以提供導入市售之具有還 原末端之糖之新穎配體複合體以及可用於蛋白質之鑑定之 配體承載體為目的。 【發明内容】 本案發明者為解決上述課題，進行深入檢討之結果發 現：將在先前申請案（申請案號：特願2003-190568，公開 號：特開2004-157108(公開日：2004年6月3日），在本案 之優先權日（2004年2月18日）之時點尚未公開）中記載之 7 ⑧ 1356816 連結化合物（任一者皆係由本案發明者所發現）與市售之麥 芽糖或乳糖反應，分別合成在末端具有α葡萄吼喃糖或半 乳°比喃糖之配體複合體。再者，本發明者製作此等配體複 合體固定於金包覆晶片上所成之糖晶片（配體承載體）。 又，為了使用此等糖晶片檢討與蛋白質之相互作用，藉由 SPR測定確認相互作用後，將該糖晶片以原樣用MALDI-TOF/MS分析，可以鑑定出在各糖晶片中所鍵結之蛋白 質，本發明於焉完成。 亦即，本發明之配體複合體之特徵為具備連結化合物 與具有還原末端之糖經由下述之芳香族胺基鍵結而成之構 造；其中該連結化合物具備通式（1)表示之構造：

…⑴ (式中，ρ及q各自獨立，為0以上6以下之整數）；上 述X具備含有1、2或3條烴衍生物鏈之構造，該烴衍生 物鏈於末端具有芳香族胺基，同時在主鏈中可具有碳-氮 鍵；上述Y具備硫原子或含硫原子之烴構造，以及上述Z 具備含碳-碳鍵或碳-氧鍵之直鏈構造。 上述烴衍生物鏈意指包含碳及氫之烴鏈中，一部份碳 及氫可用其他原子或取代基取代者。亦即，上述烴衍生物 鏈意指末端具有芳香族胺基，且為烴鏈之主鏈構造之碳- 8 ⑧ 1356816 碳鍵（C-C鍵）之一部份可用碳-氮鍵(C-N鍵）、碳-氧鍵(C-0 鍵）、醯胺鍵（C-N鍵）取代者。 又，上述含硫原子之烴構造意指包含碳及氫之烴構造 中，一部份碳用硫取代。又，該含硫原子之烴構造可為鏈 狀（包含直鏈或分枝鏈二者），可為環狀，亦可為包含鏈狀 構造及環狀構造兩者之構造。 在本發明之配體複合體中，上述連結化合物中之Υ可 為含S-S鍵或SH基之烴構造。總之，上述含硫原子之烴 _構造中，可包含二硫鍵（S-S鍵）或巯基（SH基）。 在本發明之配體複合體中，上述X可為具備通式（2) 表不之構造. ΟΛΟΛ

ΗΝ ΗΝ , ΗΝ R R R

2) /IV (式中，m1、m2、m3各自獨立地為0以上6以下之整 數；R’為氫(Η)或R)，且上述R為來自糖鏈之化合物。 1356816 在本發明之配體複合體中，上述X可為具備通式（3) 表不之構造.

R， R—N —N—(CH2)m4 R—Ν—N -(CH2)m5 N—C-II o ⑶ (式中，m4、m5各自獨立地為0以上6以下之整數；R’ 為氫(Η)或R)，且上述R為來自糖鏈之化合物。 本發明之配體複合體中，上述X可為具備通式(4)表 不之構造.

(式中，R’為氫(Η)或R)，且上述R為來自糖鏈之化合物。 在本發明之配體複合體中，上述Z可具備通式（5)或（6) 表不之構造· 1356816 …⑸ Η? 一一c—{~och2ch2·^ · · ·⑹ (式中’ η1、η2各自獨立地為】以上6以下之整數）。 又，本發明之配體複合體之製造方法之特徵為：使用具備 通式（7)表示之構造之連結化合物：

(式中，m1、m2、m3各自獨立為〇以上 ηιΑι ^下之整數 為1以上6以下之整數）、或 数 具備通式（8)表示之構造之連結化合物： —(CH2)m4 ⑻ (式中，m、m5各自獨立為0以上6 以上6以下之整數）、或 之正數，η為 具備通式⑼絲之構造之連結化合物： η2ν 〇-NH-C~(cH2)nl^ Ο

⑼ 以下之整數）、或 (式中，ni、q各自獨立為〇以上6 具備通式（ίο)表示之構造之連結化合

(式中，η為1以上6以下之整數）、或 具備通式（11)表示之構造之連結化合物： •••(10) 1356816 h2n n

C-N

NH 2 .(11) (式中，y為1以上6以下之整數）， 與具有還原末端之糖進行還原胺化反應。 本發明之配體承載體之特徵為將上述任一配體複合體 固定於表面上具有金屬之支持體。上述配體承載體可用於 蛋白質之分析。 又，本發明之蛋白質之分析方法之特徵為包含下列步 驟： 藉由使上述任一配體複合體與支持體接觸，以製成使 該配體複合體固定於支持體上之配體承載體之步驟； 將上述配體承載體與蛋白質溶液接觸後，進行分子間 相互作用之測定之步驟；以及 於測定上述分子間交互作用後進行質量分析，以鑑定 鍵結於上述配體承載體上之蛋白質之步驟。 【實施方式】 以下，詳細地說明本發明。 本發明之配體複合體係固定於表面電漿共振（SPR)之 感測晶片及親和層析體之支持體等蛋白質分析用支持體上

13 Ϊ356816 而使用者，係由可與支持體表面鍵結之配體化合物以及可 與為分析對象之蛋白質等特異地相互作用之糖鏈所構成。 在上述SPR及親和層析中，以特定化及分離與糖分子特異 性地相互作用之蛋白質等物質為目的。因此，上述配體複 合體必須為不會與蛋白質等物質并特異性地相互作用者。 所以，本發明之配體複合艤含有具備上述通式（1)所示 之構造之連結部份（連結化合物）。該構造中，以γ所示之

構造中包含硫原子(S)，該硫原子(S)，例如與包覆在蛋白質 分析用支持體表面之金屬（例如AU)形成金屬_硫鍵（例如 Au-S鍵）’而可以強固地鍵結於支持體。 又，上述連結化合物以包含丨 構造做為上述通式⑴之X，動 ^㈣衍生物鏈之 族胺基，同時於主鏈可具有碳德:。^鏈於末端具有芳香 物可使糖分子集合及排列於蛋白柄、藉此，上述連結化合 同時藉由末端具有之芳香族胺基貝^刀析用之支持體表面， 再者，上迤連結化合物，从^以簡便地導入糖分子。 I健構造做為上述通式（1)之2。，、有碳''碳鍵或碳•氧鍵之 易製造之觀點言之，Z以具有上^具體而言，從化合物容 為較位。又，在上述通式（1)中，’式（5)或式(6)表示之構造 >6以下之整數’將無限定。又及q若各自獨立地為0 芳各自獨立地為1以上6从下上述式（S)之η1及式(6) — 再者，做為上述連結化合物者之整數，將無限定。 式（1)中，ρ為4’q為卜γ為含有s可列舉具有『上述通 為上述式（5)』之構造者。上述s s鍵之環狀烴構造_0_ c 、'D化合物，例如可為具 1356816 備通式（12):

2)Π1 (CH -( X

SIS …⑽ 表示之構造者。該連結化合物可用硫辛酸(thioctic acid) 做為原料來合成。 又，做為上述連結化合物者，可列舉具有『上述通式（1) 中，p為4，q為1，Y為含有S-S鍵之環狀烴構造且Z為 上述式（6)』之構造者。上述連結化合物，例如可為具備以 通式（13):

- X H2 c H2 HN n2

SIS 表示之構造者。該連結化合物可用硫辛酸做為原料來 合成。 再者，做為上述連結化合物者，可列舉由具有『上述 通式（1)中，P為〇，q為〇，Y含有硫原子且Z為上述式（5) 或上述式（6)』之構造者所形成之二聚體。上述連結化合 物，例如可為具備通式（14): …（14) 1356816

表不之構造者。 以上述通式（12)、通式（13)及通式（14)表示之連結化合 鲁物包含二硫鍵(S-S鍵）。該S-S鍵中之硫，例如與包覆在蛋 白貝为析用支持體之表面上之金屬（例如Au)形成金屬-硫 鍵（例如Au-S鍵），而可以強固地鍵結在支持體上。又，關 於Y，雖不限於通式（12)、通式（13)或通式（14)所示者，但 從易於形成金屬·硫鍵（例如Au-S鍵）之觀點言之，以包含 S-S鍵或SH基之烴構造為較佳。 本發明之配體複合體，由在上述連結化合物之芳香族 胺基上導入含有還原末端之糖鏈而調製。換言之，本發明 籲之配體複合體具有上述連結化合物與含還原末端之糖經由 芳香族胺基中介而鍵結成之構造。該糖之導入，例如，藉 由上述連結化合物之芳香族胺基之胺基(_NH2基)與糖之還 原胺化反應而進行。總之，藉由基於糖中之平衡所生成之 醛基(-CHO基）或酮基(-CRO基’R為烴基）與上述連結化合 物所具有之胺基進行反應。然後藉由繼續還原該反應所生 成之史契夫鹼(Schiff base)，可容易地將糖導入芳香族胺 基。 ' XJ?68l6 在本發明辛，尤其關於上述含有還原末端之糖，非為 如上述先前申請案中記載之由發明者合成之硫酸化糖，而 係使用市售者，或將市售之多糖分解所調製成者。又，上 逑所謂「含還原末端之糖」係異頭物（anomer)之碳原子未 红取代之單糖或寡糖。總之’上述含有迷原末端之糖為還 原糖》 上述含有還原末端之糖’更具體而言，可列舉麥芽糖、 乳糖、葡萄峨喃寡糖(panose)、纖維二糖(ce丨丨〇bi〇se)、蜜二 糖(melibiose)、甘露寡糖、酮寡糖及鼠李寡糖，但不:: 此等糖。如上述之具有麥芽糖及乳糖等寡糖之配體複合 體，與先前具有硫酸化糖之配體複合體相較，具有在: 質測定方面應用範圍較廣之有利點。 ' 關於本發明之配體複合體，具體而言，可列 連結化合物之芳香族胺基上導入含右误 在 者，該連結化合物係下述具有通式< 端之糖之構造 合物： 示之構造之連結化

NH

NH

N'(CH2)m' (cH2)m2 N- Π—

NH

Η Ο (CH2)m3/ o s I s • · ·⑺ (式中 自獨立 n為1以上6以下之整數)、或 下之整數’ 具有通式(8)表示之構造之連結化合物： h2n-0^h_(ch^4 s I s ㈣n，—nHy^ ο •⑻ (式中，m4、m5 為二二1各自獨立為0以上6以下之整數，n 以上6以下之整數）、或 具有通式(9)表*之構造之連結化合物： h2n c— s Is ⑼ ο ο o以(Λ中’n,、q各自獨立為0以上6以下之整數，n】為 上6以下之整數）、或 具有通式（1〇)表示之構造之連結化合物：

H2N <^ν^-〇24-οοη2οη2-^ν

S s · · * (1〇) 0 1356816 (式中，η2為1以上6以下之整數）、或 具有通式（11)表示之構造之連結化合物：

(式中，η1為1以上6以下之整數）。 上述配體複合體，例如可藉由使用具有通式（7)至（11) 表示之構造之連結化合物及含有還原末端之糖並進行還原 胺化反應而製造。 上述具有通式（7)表示之構造之連結化合物，總言之， 為具有3條烴衍生物鏈者，其藉由末端具有芳香族胺基之 3條烴衍生物鏈鍵結於1個碳（C)而形成分歧構造。又，上 鲁述通式（7)中，m1、m2及m3若為0以上6以下之整數，將 無特殊限定；η1若為1以上6以下整數，將無特殊限定， 其可為彼此相異之整數，亦可為一部份或全部相同之整 數。其中，上述m1至m3，從製造時之簡便性觀點言之， 以彼此相同之整數為較佳，而以2為特佳。 上述具有通式（8)表示之構造之連結化合物，總言之， 為具有2條烴衍生物鏈者，其藉由末端具有芳香族胺基之 2條烴衍生物鏈鍵結於1個氮(N)而形成分歧構造。又，上 述通式（8)中，m4及m5若為0以上6以下之整數，將無特 19 ⑧ 1356816 殊限定；η1若為1以上6以下整數，將無特殊限定，其可 為彼此相異之整數，亦可為一部份或全部相同之整數。其 中，上述m4及m5，從製造時之簡便性觀點言之，以彼此 相同之整數為較佳，而以2為特佳。 上述具有通式（9)表示之構造之連結化合物，為具有1 條烴衍生物鏈者。又，上述通式（9)中，η1及q若為0以上 6以下之整數，將無特殊限定，其可為彼此相異之整數， 亦可為相同之整數。 上述具有通式（10)表示之構造之連結化合物為具有1 條烴衍生物鏈者。又，上述通式（10)中，η2若為1以上6 以下之整數，將無特殊限定。 上述具有通式（11)表示之構造之連結化合物為具有1 條烴衍生物鏈形成之二聚體者。又，上述通式（11)中，η1 若為1以上6以下之整數，將無特殊限定。 如上述通式（7)或通式（8)所示，上述X可具備複數條上 述烴衍生物鏈鍵結於碳或氮等原子上並形成分歧構造而成 之多分歧型部位。又，當上述X包含複數條烴衍生物鏈時， 以全部相同為較佳，但若末端具有芳香族胺基，則可為彼 此相異之構造。 如上述，本發明配體複合體所包含之連結化合物具有 可與蛋白質分析用之支持體鍵結之硫原子以及可與募糖鏈 等糖分子鍵結之胺基。因此，例如藉由Au-S鍵等金屬-硫 鍵，上述連結化合物固定在蛋白質分析用支持體上，又經 由該連結化合物，可使糖分子強固且容易地結合於上述持

20 1356816 體上。 又，上述連結化合物可具有多分歧型部位，在該情況 於該多分歧型部位之各末端具有芳香族胺基。因此，藉由 使用在上述連結化合物上導入含有還原末端之糖之本發明 配體複合體，可以更有效率地使糖分子集合於上述支持體 表面。 再者，上述連結化合物大致可忽略與蛋白質之非特異 性相互作用之影響。所以，藉由使用具有上述連結化合物 籲之本發明配體複合體，能以良好之再現性評價上述糖與蛋 白質之相互作用。 上述連結化合物，例如藉由以下所示之方法製造。總 言之，上述通式（7)、（8)、（9)或（10)所示之連結化合物，藉 由硫辛酸與芳香族胺基末端經保護基保護之胺化合物進行 縮合反應，並將上述芳香族胺基末端之保護基脫保護而製 造。又，上述通式（11)所示之連結化合物，藉由7-魏基丁 $酸之二聚體與二分子芳香族胺基末端經保護基保護之胺化 合物進行縮合反應，並將上述芳香族胺基末端之保護基脫 保護而製造。 上述硫辛酸(thioctic acid)具備下述通式（15)所示之構 造：

1356816 上述胺化合物，若為具有經保護基保護之芳香族胺基 末端者，將無限定。 上述保護基，係為了使芳香族胺基之胺基不會進行上 述縮合反應而導入之取代基。此等保護基，雖無特殊限定， 但可列舉，例如，第三丁氧羰基（-COOC(CH3)3基；記載為 Boc基）、苄基、烯丙氧羰基（-COOCH2CH=CH2，Alloc基) 等。 上述胺化合物，例如為具備下述通式（16)

BocHN

甘一(〇Η2)ηΐ—

•" · (16). 表示之構造之第1級胺化合物。再者，上述通式（16) 中之ΙΏ1至m3各自獨立，為0以上6以下之整數，η1為1 以上6以下之整數。該通式（16)表示之胺化合物與硫辛酸 之縮合反應，以及隨後所進行之將芳香族胺基末端之保護 基脫保護所得到之連結化合物為上述通式（7)所表示之連 結化合物。 22 1356816 再者，上述胺化合物之其他實例，例如可列舉具備下 述通式（17)所示之構造之第二級胺化合物。

又，上述通式（17)中之m4及m5各自獨立，為0以上6 以下之整數，η1為1以上6以下之整數。藉由該通式（17) 表示之胺化合物與硫辛酸之縮合反應以及隨後進行之芳香 族胺基末端之保護基脫保護所得到之連結化合物，為以上 述通式（8)表示之連結化合物。此等胺化合物之合成方法， 將在以後之實施例中詳述。 藉由上述硫辛酸或Τ -籬基丁酸與胺化合物之縮合反 應，硫辛酸或Τ -巯基丁酸之羧基(-COOH基）與胺基化合物 之胺基（-ΝΗ2)縮合，形成醯胺鍵。之後，藉由將芳香族胺 基末端之保護基進行脫保護反應，除去保護基，形成芳香 族胺基，可以得到上述連結化合物。 本發明之連結複合體，係在如上述製作之連結化合物 上導入具有還原末端之麥芽糖及乳糖等寡糖而成者。本發 明之配體複合體，具體而言，例如以下所示者。 23 ⑧ 1356816 第1種配體複合體，係在上述通式（12)表示之構造中， 以上述通式（2)所示之構造做為上述X，且R’為氫(H)及在R 上導入具有下述式（18):

所示構造之麥芽糖者。 第2種配體複合體，係在上述通式（12)表示之構造中， 以上述通式（2)所示之構造做為上述X，且R’為氫(H)及在R 上導入具有下述式（19):

所示構造之乳糖者。 該第1及2種配體複合體，由於係在具有3條烴衍生 物鏈之連結化合物中各導入1個寡糖，所以在末端具有3 單位之寡糖。換言之，上述第1種配體複合體，在末端具 有3單位之α-葡萄吡喃糖；上述第2種配體複合體，在末 端具有3單位之;5-半乳吡喃糖。又，在上述通式（2)中， 24 m1至m3若為〇以 為彼此相異之整數6 數’將热特殊限定’其可 者，在上述通式(12;:可為二部份或全部相同之整數。再 無特殊限定。 n若為1以上6以下之整數’將 造中，以上述通合體’係在上述通式⑽表示之構 β产T? I·道日所不之構造做為上述χ，且R’為氫(Η) 在上導入，、有上述式（18)所示構造之麥芽糖者。 第4種配體複合體，係在上述通式（12)表示之構造中， 以上述通式（3)所示之構造為上述χ，且R，為氫(Η)及在r 上導入具有上述式（19)所示構造之乳糖者。 該第3及4種配體複合體，由於係在具有2條烴衍生 又，第3

物鏈之連結化合物中各導入1個寡糖，所以在末端具有2 單位之寡糖。換言之，上述苐3種配體複合體’在末端具 有2單位之α-葡萄吡喃糖；上述第4種配體複合體，在末 端具有2單位之石-半乳吡％糖。又，在上述通式(3)中， m4及^若為0以上.6以下之整數，將無特殊限定其可 為彼此相異之整數，亦町為〜部份或全部相同之整 者，在上述通式（12)中，η1若為〗以上6以下之整數將 無特殊限定。 第5種配體複合體，係在上述通式（13)表示之構造中， 以上述通式（4)所示之構做為χ，且R’為氫(H)及在R上導 入葡萄糖者。又，在上述通式（13)中，n2若為丨以上6以 下之整數，將無特殊限定。 第6種配體複合體，係在上述通式（13)表示之構造中，

25 1356816 以上述通式（4)所示之構造做為上述X，且R’為氫(Η)及在R 上導入麥芽糖者。又，在上述通式（13)中，η2若為1以上6 以下之整數，將無特殊限定。 第7種配體複合體，係在上述通式（14)表示之構造中， 以上述通式（4)所示之構造做為上述X，且R’為氫(Η)及在R 上導入葡萄糖者。又，在上述通式（14)中，η1若為1以上6 以下之整數，將無特殊限定。 第8種配體複合體，係在上述通式（14)表示之構造中， • 以上述通式（4)所示之構造做為上述X，且R’為氫(Η)及在R 上導入麥芽糖者。又，在上述通式（14)中，η1若為1以上6 以下之整數，將無特殊限定。 再者，可列舉在具備以上述通式（9)表示之構造之化合 物中分別導入下述群(20):

26 ⑧ 1356816

所示之17種糖鏈所成之17種配體複合體，做為本發 明之配體複合體之具體例。 27 上述配體複合體，由於任一者皆包含配體化合物及糖 分子，因而可藉由連結化合物内之S-S鍵與蛋白質分析用 之支持體表面之金屬經由金屬-硫（S)鍵，例如金-硫(Au-S) 鍵而鍵結在一起。藉此，經由該Au-S鍵，可以提供使糖分 子集合及固定於上述支持體表面之配體承載體。關於上述 支持體表面之金屬，除可使用上述Au之外，亦可使用Cu、 Ag、Pt等金屬，尤其以使用Au為較佳。 上述配體複合體，如下述實施例所示，確認顯示與蛋 白質不同之相互作用。所以被認為可有效地利用於未知蛋 白質之鑑定。 導入本發明配體複合體中之上述寡糖可為相同單糖分 子構成之單一寡糖，亦可為各種單糖分子及其衍生物構成 之複合糖質。又，上述寡糖之任一者可為從自然界單離及 精製所得之各種天然糖，亦可為人工合成之糖。又，上述 寡糖可為分解多糖所得者。 又，本發明亦包含將如上述之本發明配體複合體經由 上述金屬-硫鍵固定於表面有金屬之支持體所成之配體承 載體。該配體承載體不限於用在蛋白質之分析；用於調查 與糖分子之交互作用之蛋白質以外之物質，亦可用該配體 承載體來分析。 上述配體承載體，藉由將包含該配體複合體之配體複 合體溶液與表面有金屬膜之支持體接觸，使配體複合體之 S-S鍵之各S原子與支持體表面之金屬經由金屬-硫鍵鍵 結，而將上述配體複合體導入支持體表面上。具體而言，

28 將蛋白質分析用之支持體浸潰於上述配體複合體溶液歷經 所定時間，或者藉由將配體複合體溶液注入上述支持體（使 配體複合體溶液流過支持體表面），使上述配體複合體（配 體複合體所包含之連結化合物）之S-S鍵，變換成與上述支 持體表面之金等之Au-S鍵，而可以使上述配體複合體固定 於支持體表面。 配體複合體所用之溶媒，無特殊限定，例如可列舉曱 醇、水及二曱基乙醯胺(DMAc)，以及彼等之混合溶媒等。 又，浸漬時間宜為約0.5小時至12小時，注入濃度宜 為約1 // Μ至1 mM。 如此，本發明之配體複合體由於具有S-S鍵，可以容 易地固定於蛋白質分析用之支持體表面，而可容易地將糖 分子導入上述支持體上。 本發明之配體承載體可用於分析糖分子與例如蛋白質 等以外之其他物質之交互作用。具體而言，上述配體承載 體適合用於SPR測定及親和層析等。 舉例言之，關於蛋白質分析，可如下述進行SPR測定。 亦即，使用將本發明之配體複合體固定於蒸著有金薄膜等 金屬薄膜之支持體上而成之配體承載體，使該配體承載體 與蛋白質接觸，使用表面電漿共振裝置依照常法測定共振 角度，可以觀測該配體承載體與蛋白質之結合行為。又， 用於SPR測定之上述支持體（感測晶片），例如可使用玻 璃、塑膠等，尤其適合用於玻璃。再者，配體承載體與蛋 白質之接觸，例如可藉由使溶於操作缓衝液(running buffer)

29 之蛋白質流入該配體承載體之表面而進行。做為該操作緩 衝液者，可列舉例如填酸緩衝液等。 又，本發明之配體承載體，如下述實施例所示，由於 確認與各個蛋白質顯示不同的相互作用，可以利用於蛋白 質之鑑定。總之，使用本發明之配體承載體進行未知蛋白 質之分析，可容易地判定該蛋白質是否為糖結合性蛋白 質，以及該蛋白質為哪種蛋白質。再者，若製作以各固定 有上述配體複合體之配體承載體中之至少2種為一組之晶 片套組，可以更簡便地進行蛋白質（尤其是糖鏈結合性蛋白 質）之鑑定。 現說明本發明之配體承載體之利用方法。本發明之配 體承載體可做為感測晶片，用於分子間相互作用之測定（例 如下述之SPR測定）。亦即，使用將第1配體複合體固定於 支持體表面而成之第一感測晶片，以及將與第1配體複合 體之種類不同之第2配體複合體固定於支持體表面而成之 第二感測晶片，然後檢測出使用第1感測晶片所得之SPR 測定之檢測結果與使用第2感測晶片所得之SPR測定之檢 測結果之差異，可以觀測糖分子之相互作用。 此等感測晶片可以使用被固定之糖分子不同之配體複 合體，或者被固定之糖分子相同，但連結化合物之部分不 同之上述各配體複合體。關於此種不同之配體複合體，例 如可以列舉上述之各配體複合體。再者，較佳為從上述配 體複合體之中，選擇連結化合物部分具有相同構造，但寡 糖部分具有不同構造者（例如上述第1種配體複合體與第2 1356816 種配體複合體之套組，或者上述第3種配體複合體與第4 種配體複合體之套組）。 在上述SPR測定中，使用能特異性地作用於第1感測 晶片之糖分子之蛋白質等，在一定之測定條件下，使該蛋 白質作用於上述二感測晶片，然後觀測二者之共振角度。 藉由檢測出該二者之共振角度之差異，可以測定糖分子與 蛋白質等之特異性相互作用。 又，欲觀測與糖分子相互作用之物質，不限於蛋白質。 在上文中，雖同時測定2種感測晶片，但不限於此， 測定二種以上之感測晶片亦可，不同時測定亦可。再者， 可以使用至少在一個感測晶片中未導入糖分子者。例如可 以使用只固定連結化合物者。 當進行上述之SPR測定時，由於可以使用至少二個具 有除糖分子以外構造相同之配體複合體來進行測定，因此 該至少二個感測晶片相互作用之差異，被當作起因於糖分 子來觀測。所以，若使用上述測定方法，可使糖分子以外 之部分與其他物質之非特異性之相互作用減低，而可以觀 測糖分子與其他物質之特異性相互作用。 再者，可以使用二種固定有「糖分子相同但連結化合 物部分之構造不同之配體複合體」之感測晶片進行上述 SPR測定。在該情況，可以測定感測晶片上糖分子之集合 化度不同對於蛋白質之結合行為之影響。關於此等感測晶 片之套組之例子，可以列舉上述第1種配體複合體與第3 種配體複合體之套組。 再者，藉由上述之SPR測定確認糖分子與其他物質之 特異性交互作用後，將該SPR測定所使用之結合蛋白質之 配體承載體以原樣付諸於質量分析，可以鑑定出與感測晶 片結合之蛋白質。上述質量分析，使用基質支援型雷射脫 離/飛行時間質量分析計(MALDI-TOF/MS)等先前公知之質 量分析計，依照先前公知之方法實施。 若採用上述之步驟，可以使用本發明之配體複合體進 行蛋白質之分析。總之，本發明之蛋白質之分析方法包含 下述步驟：藉由使上述本發明之配體複合體與表面上有金 屬之支持體接觸，將該配體複合體固定於支持體上，製成 配體承載體之步驟；使上述配體承載體與包含為分析對象 之蛋白質之溶液接觸而交互作用後，進行如SPR之分子間 相互作用之步驟；於測定上述分子間相互作用後，進行質 量分析；以及鑑定結合於上述配體承載體之蛋白質之步驟。 在該蛋白質之分析方法中，如上述，分別使用二種以 上固定有種類不同之配體複合體之配體承載體進行蛋白質 之分析，比較檢討各個結果，可以解析各蛋白質之特性。 <實施例> 以下，詳細地說明本發明之配體複合體之合成。再者， 在本實施例中，使用合成之配體複合體進行SPR測定及質 量分析，並進行蛋白質之分析。對於此等分析亦一併說明。 [實施例1 :配體複合體（化合物1至4)之合成] 在本實施例中，合成於實施形態說明中被分類為第1 至4種配體複合體之4個配體複合體。

32 1356816 第1種配體複合體（化合物U之合成 為上述第1種配體複合體之―，且具有上述通式（12) 所表示之構造中，η1為1 ’ X具備通式（2)表示之構造，R， 為風(Η)，在r中導入上述式（18)所表示之麥芽糖，且m1、 m及m3為2之構造之配體複合體（化合物1)，以下述步驟 合成。 在上述配體複合體（化合物〗）之合成之前階段，首先合 成具有3條分枝鏈且各鏈之芳香族胺基末端被保護基保護 之連結化合物A。 如下述式(21)所示，在65°C至7〇。(：之二甲氧乙烷中， 於風乳化卞基三甲基链存在下’使3單位之丙稀酸第三丁 醋（化合物6)與硝基甲烷(化合物5)進行麥克耳(Michael)反 應，以91%之產率得到化合物7。接下來，於氫氣蒙氣（6 kg/cm2)下，在5〇°c之乙醇中，使用雷尼鎳(Raney Ni)還原 上述化合物7之硝基’以98%之產率得到化合物8。 然後’在CHAl2中，於1.1當量1-羥基_7_氮雜苯并三 唾（式中，HOAc)及〗.1當量水溶性碳化二亞胺鹽酸鹽（式 中’ EDC HC1)存在下’使上述化合物與〗丨當量ζ·甘胺酸 縮合，以85%產率得到Ζ-甘胺酸體(化合物9)。

33 1356816

更具體s之’上述化合物8’首先依照文獻（GR Newkome et al.，0PPI BRIEFS，28 卷 p 495 1996)，將硝基 曱烷（12.2 g，200 mmol)溶於1,2-二甲氧基乙烷5〇 m卜加 熱至65 i 7Gt ’加入4G%氫氧化节基三f基敍甲醇溶液 (2 ml) ’作成硝基甲烷溶液。繼而，使該硝基甲烷溶液之溫 度上升至75 C，慢慢滴人丙稀酸第三丁醋（90·8 ml，620 卿〇1)後’—面將溶液溫度保持在70至75t，一面分“ :二40%氫氧化苄基三甲基銨甲醇溶液每次⑽，並‘ 今硝5其Γ，得叫基丙馳第三了81反應溶液。將 这峭基甲烷/丙烯酴笼二丁 & ^ & 时 =酸r 縮，_==溶:::: 到二=之==及水洗…:得 殘逢溶液乾燥，用石p 納做為乾燥劑，使該 缩後，將:農彻^ 乾燥’除去該乾燥劑，並減屋濃 將-殘餘物溶於乙醇並進行再結晶，得到為^ 34 ⑸.6816 針狀結晶之化合物7(81.8 g，91%)。 接著，將化合物7之結晶（10 g，22.4 mm〇1)及T-1雷 =(6.〇 g)加至無水乙醇5G ml中，於6 kgW之氯^ 辞^^〇以拌23小時後，將使心藻以去W雷尼 沒=之化合物7反應溶液減壓濃縮。將藉由該化合物7 仿m減壓濃縮得到之濃縮殘㈣娜層析（溶媒：氯 g，精製’得到為白色固體之化合物8(產量9.2 蠢1 具Q體而言，在將Ζ·甘胺酸〇·26 g，662则1)、 (氣90 g，6.62 mmol)及 EDC.Ha (1 27 g，6 & 職〇ι) ;;:Γ8…甘胺酸溶液中，於代之溫度條 _之化人物8(250 g，6.02随。1)溶於無水二氯甲烧(2 得,JZ = 8溶液，於氬氣蒙氣下，於室溫攪拌36小時’ 付到Z-甘胺酸/化合物8反應溶液。在該z甘胺酸/化合物 8氯ΐίΓ中’加入二氣甲烧及1〇%檸檬酸水溶液並用二 卒取，將有減时、鮮錢⑽水溶液及水洗 制無水硫酸鈉做為乾燥劑進行乾職，遽去該 並進行減m將該藉由減壓濃縮得到之濃縮 夕膠層析(溶媒：氯仿)精製，得到為白色固體之 化口物9(產量：3 〇9 g ;產率：85%)。 時間上述化㈣9進行咖MS(陽性)測定（飛行 +。貝里刀析计測疋），m/z (質量/電荷比）為629 4 [(M + )]再者，進行核磁共振（Ή ，4⑻，cDC1〇 、'J疋」得下列數據δ 7 37 7 26⑽，⑺，ph)，& 43 (1H，bs. ⑧ 35 1356816 CONHC), 5.38 (1H, bs, Gly-NH), 5.13 (2H, s, CH2Ph), 3.78 (2H, d, J = 7.7 Hz, Gly-CH2), 2.20 (6H, t, J = 7.7 Hz, CCUiCUg), 1.96 (6H, t, J = 7.7 Hz, CC^CIL), 1.44 (27H, s, CH3)。藉此，可以確認化合物9之構造。又，化合物9之 分子量為606.35。 接下來，如下述式（22)所示，在CH2C12/H20 = 10/1之 混合溶媒中，使用三氟乙酸（以下，記載為TFA)將上述化 合物9之第三丁氧羰基(-COOC(CH3)3基；式(22)中，tBu) 參脫保護，得到化合物10，產率：95%。 然後，於4.5當量磷酸（五氟苯基二苯基）酯（式中， FDPP)、11當量二異丙基乙基胺（式中，DIPEA)及Ν,Ν-二 甲基甲醯胺(DMF)存在下，使上述化合物10與胺基經Boc

⑧ 1356816 基保護之間-苯二胺衍生物（化合物u，10當量）縮合，以 99%之產率得到n-Boc胺衍生物（化合物12)。接著，在甲 醇（式中，Me〇H)中，於Pd/C(活性碳承載鈀）存在下，進行 接觸氫化還原，使與化合物12縮合之上述z_甘胺酸之苄 氧羰基（式中，Z基)脫保護，得到化合物13，產率：79%。 為了得到上述化合物10至13，具體而言，進行下述 操作。 亦即’為了得到化合物10 ’將化合物9(2.98 g，4.90 mm〇1)溶於二氣甲烷（15 ml)，於·1〇ΐ加入TFA(15 ml)及水 (1.5 ml)後，於室溫攪拌i 5小時，得到化合物9反應溶液。 將该化合物9之反應溶液減壓濃縮後，於冰浴中，在濃縮 殘餘物中加入10%氫氧化鈉水溶液至pH為5，然後加入濃 鹽酸直至pH成為2’以析出白色固體。將得到之白色固體 用水洗淨’得到為白色固體之化合物1〇(產量：2.04g，產 率：95%) 〇 對於得到之化合物1〇，進行ESI-MS(陰性）測定，m/z 為 437.1[(M-H)]。再者，進行核趟共振（1h_NMR 4〇〇mHz， d6_DMS〇)測定’測得下列數據：δ7·34-7.30 (6H，m，Ph, CONHC), 7.15 (1H, s, Gly-NH)} 5.〇i (2H, s, CJLPh), 3.55 (2H, d, J = 5.9 Hz, Gly.CH,), 3.33 〇H, brs, C02H), 2.11 (6H, % CQi^)，1.81 (6H，m，CCH2CH2)。藉此，可以確認化 合物10之構造。又，化合物10之分子量為438 16。 又，為了得到化合物η，將間-苯二胺（0.50 g，4.62 37 1356816 mm〇1)溶於甲酵(35如），於0〇C，加入(B〇c)20 (1·06⑹， 4.62 mmol)及—乙胺（0·65 ml，4.65 mmol)後’於室溫搜拌 24小時亚進灯減壓濃缩。將該藉由減壓濃縮得到之濃縮殘 餘物用矽膠層析（溶媒：氣仿/丙酮=〗〇/1)精製 ，得到為白色 固體之化合物11(產量：665 mg;產率：68%)。 進=上述化合物11之ESI-MS(陽性）測定，m/z為231.2 [(M+Na)]。再者’進行 lH NMR^〇〇 ΜΉζ，θα)測定， 測得下列數據：0 7.02 (1H，t，J = 8.0 Hz，芳香族），6.95(1H， • bs ’ 芳香族)，6.54 (1H，dd，j = 2.0 Hz，j = 8 〇 Hz，芳香 族）,6.41 (1H，bs，<：0他)，6.35 (1H，dd，】=2 2 Hz,】=7 9 Hz ’ 芳香族），3.66 (2H，bsNiL), 1.50 (9H，s，第三丁基）。 藉此，可以確認化合物u之構造。又，化合物^之 分子量為208.12。 又，為了得到化合物12，將上述化合物1〇(1〇〇邮， 228 "mol)、上述化合物 11(475 mg，2 28 mm〇i)jwi>(^

mg ’ 1·〇3 mm〇1^二異丙基乙胺(447//】，2 57刪叫溶於 無水二甲基甲酿胺(2 ml)，於氬氣蒙氣下，於室溫_ 29 小時後，加入乙酸乙酯及水並用乙酸乙酯萃取將有機層 用0.5N鹽酸、水、飽和碳酸氫鈉水溶液及飽和食鹽水洗淨 1次，用無水硫酸鈉做為乾燥劑使之乾燥，得到=燥反應 ;谷液。從得到之乾燥反應溶液遽去乾燥劑並減壓濃縮，將 濃縮殘餘物用矽膠層析（溶媒：氣仿/丙 精製，得到 為白色固體之化合物12(產量：228 mg ;產率：99〇/) 進行上述化合物12之ESI_MS(陽性）蜊定9/lz為 38 1356816 1009.5 [(M+H)+]。再者，進行 ^-NMRGOO MHz，CDC13) 測定，測得下列數據：J8.75(3H，s，NHC02tBu)，7.67(3H， s，CONiiPh)，7.30-6.95 (15H，m，芳香族，CH2CONE)，6.52 (1H, bs, Gly-NH), 5.04(2H, s, CH2Ph),3.71(2H, d, J = 5.0 Hz, Gly-CHs), 2.23(6H, m, CH2CH2CO), 1.97 (6H, m, CH2CE2CO)，1.47 (27H, s，第三丁基）。藉此，可以確認化 合物12之構造。又，化合物12之分子質量為1008.50。 又’化合物13 ’具體而言，藉由下述方法得到。亦即， 籲將化合物12 (200 mg，198# mol)溶解於曱醇（3 ml)，加入 10%Pd/C (62.3 mg) ’於氫氣蒙氣下，於室溫攪拌15小時 後’濾去上述Pd/C，並進行減壓濃縮。藉由該減壓濃縮得 到之濃縮殘餘物用矽膠層析（溶劑：氯仿/甲醇=8/1)精 製’得到為白色固體之化合物13(產量136mg，產率：78%)。 進行上述化合物13之ESI-MS(陽性）測定，m/z為 875.5[(M + H)+]。再者，進行〗Η-ΝΜΙΙ(400 MHz，CDC13) 鲁測定，測得下列數據：δ 9.〇〇(3H，s，NECCMBu)，7.57(2H，s， NH2)，7.35 (1H，bs，Gly-NH)，7.14-7.00 (15H，m，芳香族， CH2CONH), 3.21(2H, s, Gly-C^), 2.26(6H, m, Ci^C^CO), 2.04 (6H，m，CH2CH2C〇)，1.45 (27H，s，第三丁基）。藉此， 可以確認化合物13之構造。又，化合物η之分子質量為 874.46。 再者’如下述式（23)所示，在ί ο當量EDC.HC1、1.0 當量卜羥基苯并三唑（式（23)中，HOBt)及CH2C12中，使上 述化合物13與1.0當量之硫辛酸(化合物1句縮合，得到硫

39 1356816 辛酸衍生物（化合物15)，產率為75%。 將在上文得到之化合物15在CH2C12中，於三曱基石夕 烷基氣化物（式中，TMSC1)及酚（PhOH)存在之酸性條件 下，脫去上述Boc保護基，得到包含3條具有芳香族胺基 之烴衍生鏈之連結化合物，即化合物A (產率32%)。

14 (1.0 eq) -i EDC»HQ (1.0 eq), HOBt(1.0 eq) ch2ci2

S丨S

C

..(23) 具體而言，為了得到化合物15及化合物A，進行以下 之操作。 亦即，為了得到化合物15，將化合物14(23.6 mg, 114 1356816 mol)與 HOBt (15.4 mg，114 mmol)溶於無水二氣甲烧(23 ml) ’於〇C之溫度條件下’加入化合物13 (2 5〇呵，6 〇2 mmol)，於氬氣蒙氣下，於遮光及室溫攪拌％小時後加 入10%檸檬酸水溶液，並用氣仿萃取，將有機層用飽和碳 酸氫鈉水溶液洗淨，用無水硫酸鈉做為乾燥劑使之乾燥。 之後，濾去該乾燥劑並減壓濃縮，將濃縮殘餘物用矽膠層 析（溶媒：氣仿/甲醇=40/1)精製，得到為白色固體之化合 物 15(產量：91.0 mg ;產率：75%)。 進行上述化合物15之ESI-MS(陽性）測定，m/z為 1085.5 [(M + H)+]。再者’進行丨H-NMR(400 MHz，CD3C1) 測定’測得下列數據：5 9.01 (3H，bs，NHC02tBu)，7.67 (3H， s, CONHPh), 7.31 (1H, bs, CONHCH2), 7.27-7.00 (12H, m, 芳香族），3·71 (2H, bs，Gly-CJ^)，3.64-3.39 (1H, m, SSCH)， 3.12-2.99 (2H，m，Ci^SS)，2.33 (1H，m，CiLCHzSS)，2.32 (6H, m, CCH2CH2CO), 2.20 (2H, m, CH2CONHCH2), 2.04 (6H，m，CCH2CH2CO)，1.82-1.73 (1H，m，CH2CH2SS)， 1.62-1.47 (4H，m，CH2(CH2)2CONH，（CHAQ^CI^CONH)， 1.47 (27H，s，t-butyl)，1.39-1.25 (2H，m，CH2CH2(CH2)2CONH)。藉 此，可以破認上述化合物15之構造。又，化合物15之分 子質量為1062.49。 又，為了得到化合物A，將三甲基矽烷基氣化物(0.25 ml，2.64 mmol)溶於二氣曱烧（0.49 ml)，加入齡（549 mg， 5.83 mmol)溶於二氯甲烧（1.46 ml)之酚溶液並授拌後，再加 入化合物15(34.7 mg，32.6 y mol)，並於室溫及遮光下授拌 1356816 1.5小時，得到化合物15反應溶液。接著，將該化合物j $ 反應溶液加至氯仿中，將有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液洗 淨，析出黃色固體。將析出之黃色固體溶於乙酸並冷卻至 4°C，濾除凝集之固體’得到為白色固體之化合物A(產量 7.9 mg，產率 32%)。 進行上述化合物A之ESI-MS(陽性）測定，m/z為763.6 [(Μ + H)+]。再者，進行〗H-NMR(400 MHz，CD3C1)測定， 測得下列數據：δ9.57 (3H，m，CONEPh)，7.97 (1H，m， • CONiiCH2)，6·87(6Η，Hi,芳香族)，6.67 (3H，d，J = 7.7 Hz, 芳香族），6.21 (3H，d，J = 7.7 Hz,芳香族），4.98 (6H，bs， NH2), 3.67 (2H, d, J = 5.1 Hz, Gly-CI^), 3.56 (1H, m, SSCH), 3.16-3.04 (2H, m, CH2SS), 2.36 (1H, m, CiLC^SS), 2.25 (6H, m, CCH2CH2CO), 2.19-2.07 (2H, m? CH2CH2CONHCH2 193 (6H, m, CCH2CH2CO), 1.83 (1H, m, CI^C^SS), 1.50 (4Ή, CH2(CH2)3CONH, (CH2)2CH2CH2CONH), 1.33 (2H, 鲁m，CH2CH2(CH2)2C〇NH)。藉此，可以择認上述化合物a 之構造。又，化合物A之分子質量為762 33。 接著，使用如此得到之連結化合物A，依照下述式（2句 之反應式’合成具有以上述式（12)表示之構造中，η1為卜 乂通式（2)表不’m、m2及爪3為2之構造之配體複合體（化 ⑧ 1356816

麥芽糖水合物 K5eq) 95% NaBH3CN (10eq) 令->

H20：DMAc：Ac0H AcOH 37¾ =1 ： 1 : O.i 37°C 50%

"•(24) MALDI-TOF/MS 確切質量：丨740.70 晚;1764.41IM+Na广 如式（24)所示’將得到之連結化合物a及為上述式（18) 所表示之寡糖之市售麥芽糖水合物（4.5當量）溶於H20/二 甲基乙醯胺（式中，DMAc)/乙酸(AcOH) = 1/1/0.1混合溶 媒，在pH 4至4.5、37°C下形成史契夫鹼(Schiffbase)後， 在溶媒中加入AcOH，再加入1〇當量之95% NaBH3CN， 於pH 3至4.5及37°C下’進行還原胺化反應。之後，使用 Sephadex G-50(Amersham Biosystem 公司製）將得到之化合 物藉由凝膠過濾層析精製，然後進行脫鹽處理，得到末端 包含3單位α-葡萄°比喃糖之配體複合體，即化合物1。上 述化合物1之鑑定，藉由MALDI-TOF/MS及NMR進行。 MALDI-TOF/MS 之結果，m/ζ : 1764.41 [(M + Na)+]。 又，進行巾小1^11光譜(600 1^1^，020)測定，測得下列數 據：（5 7.01 (3H，dd，J= 8.2, 8.2 Hz，芳香族），6.70 (3H，s，芳 43 1356816 香族），6.58 (3H, d，J = 8.2 Hz，芳香族），6.44 (3H，d，J = 8.2 Hz，芳香族），4.90 (3H，d, J = 3.4 Hz，H-l，x3)，3.79-3.73 (6H，m，h_2x3, H-5x3)，3.71 —3.66 (6H，m，H-3x3, H-5，x3)， 3·64 (3H，dd, J = 2.1，12.4 Hz，H-6a，x3)，3.59 (3H, dd，J = 4.8，l2.4Hz，H-6b，x3)，3.59—3.52 (3H，m，H-6ax3)，3.54-3.51 (6H，m，H-4x3, H-3，x3)，3.43 (3H，dd，J = 6.9, 12.4 Hz， H-6bx3), 3.39-3.34 (1H, m, CH2CH(CH2-)(S-)), 3.37 (3H, dd，J = 3.4, 9.6 Hz, H-2’x3), 3.25 (3H，dd, J = 9.6, 9.6 Hz， • H，4’x3)，3·11 (3H，dd，J 二 4.8, 13.7 Hz，H-lax3)，3.01 (3H， dd, J = 7.7, 13.7 Hz, H-lbx3), 2.98-2.86 (2H, m, -SCHrl 2.27 —2.23 (6H, m，-趣CH2CO-x3), 2.19-2.14 (1H，m, -SCH2CH2(1H)-), 2.10 (2H, t, J = 7.6 Hz, -NHCOCHzCH,-l 1.98- 1.94 (6H, m, -CH2CH，CO-x31 1.72- 1.65 (1H, m, -SCH2CH2(1H)-), 1.43- 1.36 (2H, m, -COCH^CH.CH.CH.-l 1.39- 1.29 (2H, m, -COCH,CH?CH,CHz-^ 1.19—1.13 (2H, • m,-COCHbCI^^i^CHr)。從此等結果，可以確認上述化合 物1之構造。又，化合物〗之分子質量為1740.70。 第二種配體複合體(化合物2)之合成 藉由下述步驟合成上述第2種配體複合體之一，即具 有上述通式（12)表示之構造中’η1為卜X為以通式(2)表示 之構造，R’為氫(Η)，R中導入上述式G9)表示之乳糖，m1、 m2及m3為2之構造之配體複合體（化合物2)。 在上述配體複合體（化合物2)之合成中，首先將配體化 合物A，以與上述第1種配體複合體之合成步驟相同之步 44 (§> 1356816 驟合成。 接著，使用得到之連結化合物A，依照下述式（25)之 步驟，合成具有在上述通式（12)表示之構造中，η1為1 ’ X 具備通式(2)表示之構造，R’為氫(Η)，在R中導入上述式（19) 表示之乳糖，且m〗、m2及m3為2之構造之配體複合體（化 合物2):

νΛ-ην A

MALDHOF/MS 確切質量：1740.70 mte; 1766.92[Ι^Ν8Γ 如式（25)所示，將以上述方法得到之連結化合物a及 為上述式（19)所表示之寡糖之市售乳糖水合物(4.5當量）溶 於H2〇/二甲基乙醯胺（式中，dmAc)/乙酸(AcOH)= 1/1/0.1 混合溶媒，在PH4至4.5、37°C下形成史契夫鹼(Schiffbase) 後’在溶媒中加入AcOH，再加入10當量之95% NaBHfN，於PH 3至4.5及37。(：下，進行還原胺化反應。 之後’使用 Sephadex G-50(Amersham Biosystem 公司製）將 45 1356816 得到之化合物藉由凝膠過濾層析精製，然後進行脫鹽處 理，得到末端包含3單位；5-乳吡喃糖之配體複合體，即化 合物2。上述化合物2之鑑定，藉由MALDI-TOF/MS及 NMR進行。 MALDI-TOF/MS 之結果，m/z : 1766.92[(M + Na)+]。又，進 行1Η-NMR光譜(600 MHz，D20)測定，測得下列數據：5 6.99 (3H， dd，J = 7.9, 8.2 Hz,芳香族)，6.70 (s，3H，芳香族)，6.61 (3H，d，J = 7.9 1¾ 芳香族)，6.43 (3H，d，J = 8.2 Hz，芳香族)，4.27 (3H，d, J = • 7.6 Hz, Η-Γχ3), 3.90-3.85 (3Η, m, Η-2χ3), 3.74-3.70 (3Η, m, Η-5，χ3)，3.69—3.66 (3Η，m，Η-4χ3)，3.68—3.62 (3Η，m，H-6a，x3), 3.65 —3.62 (3H，m，H-3x3), 3.57 (3H，br，H-4，x3)，3.53 (3H，dd, J = 5.8, 11.7 Hz，H-6b，x3)，3.47 —3.43 (6H，m，H-6x3)，3.41 (3H，m, J = 3.1, 10.0 Hz, Η-35χ3), 3.38 (3H, brt, J = 5.8 Hz, H-5x3), 3.35 (3H, dd, J = 7.6, 10.0 Hz, ^2^3), 3.36-3.29 (1H, m, CU7CU(CU^)(S-)\ 3.12 (3H, brd, J = 10.7 Hz, H-lax3), 2.91 (3H, dd, J = 7.6, 12.0 Hz, _ H-lbx3), 2.90 - 2.83 (2H, m, -SCH2 ), 2.23 - 2.16 (6H, m, -OT2CH2CO-X3), 2.18-2.10 (1H, m, -SCH7CH2(1HV\ 2.06 (2H, t, J =5.8 Hz, -NHCOCH2CH2-), 1.95-1.89 (6H, m, -CHzCH,CO-x3\ 1.68 — 1.59 (1H，m，-SC^Oi^lH)-)，1.41 — 1.30 (2H，m， -COCH2CH2CH2CH2-), 1.32-1.22 (2H, m, -COCH?CH?CH,CHrI 1.15 — 1.08 (2H，m, -COCi^CHbQ^CHr)。從此等結果，可以確 認上述化合物2之構造。又，化合物2之分子質量為 1740.70。 (3)第三種配體複合體（化合物3)之合成

46 !35ι5816 藉由下述步驟合成上述第3種配體複合體之一 ’即具 有上述通式（12)表示之構造中，η1為1，X具備通式（3)表示 之構造’R’為氫(H)，R中導入上述式（18)表示之麥芽糖，m4 及m5為2之構造之配體複合體（化合物3)。 在上述配體複合體（化合物3)之合成之前階段’首先合 成具有2條芳香族胺基末端經保護基保護之分枝鏈之連結 化合物B。 如下式(26)所示，將胺基苯曱酸(B-1)之胺基經Boc基 鲁保護之胺基苯甲酸衍生物（B-2)與二伸乙基三胺(B-3)’用 HOBt及EDC-HC1縮合，得到二醯胺體(B-4)，產率為79%。 在DMF中’使用FDPP做為縮合劑，將二醯胺體(B_4)與 胺基經Z基保護之甘胺酸(Z-Gly)反應，得到（B-5)，產率： 75%。藉由接觸氫還原除去z基，製成(B_6)後，與硫辛酸 (B-7)縮合，得到(B_8)，產率為97〇/(^最後，藉由TFA除 去Boc基，得到具有2單位芳香族胺基之連結化合物B， 產率為95%。 47 1356816

(Boc>2〇, Et3N

COCHI

BocHN

MeOH ~Qr COC»l

ΗΟΒζ EDC-HCJ CHjCJz B-l B-2

BocHN

BocHN

N Z-Gly FDPP. MPEA DMF rt

B-5

5% Pd/C

MeOH,rt B-4

* · ·(26) 更具體而言，上述化合物B-2藉由下法製造：將4-胺 基苯甲酸(B-l)(2.00 g，14.6 mmol)溶於甲醇140 m卜加入 (Boc)20 (6.7 ml，29.1 mmol)及三乙胺（3.06 ml，21.9 48 ⑧ 1356816 mm〇i) ’並於室溫攪拌16小時。將反應溶液減壓濃縮’在 殘餘物中加入己烷及飽和碳酸氫鈉水溶液（5 0 ml)並萃取 水層。在該水層中，加入10%檸檬酸鈉水溶液直至pH = 4，使白色固體析出。將得到之固體溶於乙酸乙酯用水洗 淨後，減壓濃縮。將殘餘物用乙酸乙酯_己烷再結晶，得到 為無色結晶之化合物B-2(3.25 g，產率：91.3%)。 將得到之上述化合物B-2進行1H-NMR(270 MHz， CDsOD)測定’得到下列數據：占9 24(1H，s，N过)，7 % (2H, d，J = 8.9 Hz，芳香族)，7.55 (2H, d，J = 8.6 Hz，芳香族）， 1.56 (9H，s，第三丁基）。又，進行上述化合物b_2之 ESI-MS(陰性）測定，m/z : 236.20[(M-H)-]。藉此，可以確 認化合物B-2之構造。該化合物B-2之分子質量為237.25。 接著’將上述化合物 B-2 (1.30 g，5.46 mmol)、HOBt (0.738 g，5.46 mmol)及 EDC · HC1 (1.05 g，5.46 mmol)溶於 無水二氣甲烷(30 ml)’於氬氣蒙氣下，於〇°c攪拌50分鐘。 在該溶液中’加入二伸乙基三胺（B-3)(0.283 ml, 2.60 mmol) ’於遮光及室溫下授拌終夜，得到白色結晶。遽取 該白色結晶後，從甲醇中再結晶，得到為白色結晶之化合 物 Β-4 (1.23 g，產率：87.4%)。 將得到之上述化合物B-4進行1H-NMR(400 MHz， CD3OD)測定，得到下列數據：5 7.77-7.74 (4H，d，J = 8.67 Hz，芳香族），7.50-7.48 (4H，d，J = 8.57 Hz，芳香族）， 3.70-3.66 (4H，m, J = 5.19 Hz，NCE2CH2NHCO)，3.34-3.28 (4H，m, J = 5.61Hz，NC£i2CH2NHCO)，1.53(18H，s，第三丁 49 ⑧ 1356816 基）。又’進行上述化合物B-4之ESI-MS(陽性）測定，m/z : 542.64[(M+H)+]。藉此，可以確認化合物B-4之構造。該 化合物B-4之分子質量為541.60。 接著’將上埤化合物B·4 (1·〇3 g，] 85 mmo丨）、Ζ·甘胺 酸（0.430 g ’ 2.〇4 mmol)及 FDPP (1.07 mg 2 mm〇1)溶於 無水二甲基甲醯胺（8 ml)後，加入二異丙基乙胺(〇 36 ^卜 2.78 mmol) ’於氬氣蒙氣及室溫下授拌2〇小時。將該反應 溶液減壓濃縮’然後將得到之殘餘物溶於氣仿，將有機層 •用10%檸檬酸及飽和碳酸氫鈉水溶液依次洗淨後，用無水 硫酸鈉乾燥，濾去乾燥劑並進行減壓濃縮。將濃縮殘渣用 矽膠層析（50 g，氣仿：丙嗣=1 : 2)精製，得到為白色固 體之化合物B-5 (1.02 g，產率：75.0%)。 令得到之上述化合物B-5進行iH-NMR(400 MHz， CDC130iJ 定，得到下列數據：（5 7.88 (1H，bs，NIiCOPh)， 7.73-7.66 (10H, m, NHCOPh,芳香族），7.56 (1H，bs， ^ NHCOPh), 7.38 (4H, d, J = 8.4 Hz, COPhNH), 7.34-7.29 (8H, m,芳香族），5.37 (1H, bs, G】y-N|i)，5.00 (2H, s，PhCiy， 3.64 (4H, m, NCH2CH2NH, NCH2CH2NH ), 3.49, 3.47 (4H, m, NCH2CH^NH ), 3.43, 3.27, 3.17 (6H, bt, bt, bt, NCi^CH2NH )，1.50, 1.49 (36H，s，s,第三丁基）。又，進行 上述化合物B-5之ESI-MS(陽性）測定，m/z : 755.36[(M+Na)+]。藉此’可以破認化合物B-5之構造。該 化合物B-5之分子質量為732.32。 接著，將上述化合物B-5(0.193 g，0.264 mmol)溶於曱 ⑧ 1356816 • 1 醇(3 ml)，加入10%Pd/C(120 mg)，於氫氣蒙氣及室溫下攪 拌3小時後，濾去Pd/C並減壓濃縮，得到為白色固體之化 合物 B-6(0.230 g，產率：94.4%)。 對於得到之化合物B-6，進行1H-NMR(400 MHz， d6-DMSO)測定，得到下列數據：09.54 (4H，d，J = 9.5 Hz， COPhNH), 8.58； 8.53, 8.46 (4H, bs, bs, bs, NHCOPh), 8.10 (2H, bs, NHb), 7.56 (1H, bs, NHCOPh), 7.76-7.73 (8H, m, 芳香族），7.53-7.48 (8H，m，芳香族），4.39, 4.24 (4H，bs，bs, • CONCH2), 3.80 (2H, bs, CH2NH2), 3.42-3.33(16H, m, NCH2CH2NH，NCH2CH2NH)，1.46, 1.45 (36H，s，s，第三丁 基）。又，進行上述化合物B-6之ESI-MS(陽性）測定，m/z : 599.33[(M+H)+]。藉此，可以確認化合物B-6之構造。又， 該化合物B-6之分子質量為598.39。 接著，將硫辛酸(B-7) (41.0 mg，0.200 mmol)、HOBt (35.0 mg ’ 0.200 mmol)及 EDC . HC1 (42.1 g，0.200 mmol) 鲁溶於二甲基甲醯胺（3ml)，於氬氣蒙氣、遮光及0°C下攪拌 1.5小時。接著，將上述化合物B-6(0.1 g，0.167 mmol)溶 於二甲基甲醯胺(2 ml)，滴下上述二甲基甲醯胺溶液後，於 室溫擾拌19小時。在反應溶液中加入氯仿，萃取出有機 層，將該有機層用10%檸檬酸水溶液及飽和碳酸氫鈉水溶 液洗淨’用無水硫酸鈉乾燥後，濾去乾燥劑並減壓濃縮。 將濃縮殘餘物用矽膠層析（50 g，氯仿：曱醇=7 : 1)精製， 得到為白色固體之化合物B-8 (0.128 g，產率：97.0%)。 對於得到之化合物B-8,進行1H-NMR(400 MHz，CDC13) 51 ⑧ 1356816 測定，得到下列數據：（5 7.76-7.69(llH，m, NliCOPh，芳香 族)，7.55 (1H，bs，NHCOPh)，7.45-7.35 (9H，m，芳香族，COPhNH)， 7.13, 7.00, 6.97 (3H, bs, bs, bs, COPhNH), 5.83 (1H, bs, Gly-NH), 4.04 (2H, bs, Gly- CKb), 3.73-3.66 (4H, m, CONCH2 ), 3.54-3.46 (11H, m, NCH2CH2NH, NCH2CH2NH, SSCHCH2), 3.41, 3.29, 3.22(6H, bs, bs, bs, NCH2CH2NH), 3.16-3.03 (2H, m, CH2SSCH), 2.39 (1H, m, CH2CH2SS), 2.02 (2H, t, J = 6.9 Hz, CH2CH2CH2CONH), 1.84 (1H, m, CHCH2SS), 1.58-1.52 (4H, m, • <：Η2(：ί^(：Η2<：ΟΝΗ，QfcCH2CH2CONH )，1,51，1.49 (18H，s, s，第 三丁基)，1.35 (2H，m，CHaCH2CH2CH2CONH)。又，進行上述化 合物 B-8 之 ESI-MS(陽性）測定，m/z ·· 809.33[(M+Na)+]。 藉此’可以择認化合物B-8之構造。又，該化合物b-8之 分子質量為787.30。 將上述化合物B-8 (0.128 g，0.16 mmol)溶於二氯甲烧 (1 ml)’加入TFA(2ml)’於遮先及〇°c下攪拌〗5小時後， 籲進行減壓濃縮，將得到之殘餘物溶於甲醇，通過D〇wex Marathon A (OH形式）之管柱並中和、減壓濃縮，得到為黃 色固體之化合物Β(89·3 mg，產率：95.2%)。 對於得到之化合物B，進行1h-NMR(400 MHz， de-DMSO)測定’得到下列數據：占8 20，8 〇7 (2H，m， NHCOPh), 7.83 (1H, t, J = 5.5 Hz, Gly-NH), 6.51-6.48 (8H, m，芳香族），5.57 (8H, d，J = 14 3 Hz, PhNH^)，4.34, 4.12 (4H, bs, bs, CONCH2), 3.82 (2H, bs, Gly- CH2), 3.64-3.55 (1H，m，SSCHCH2)，3.50-3.32 (16H，帶狀，NCI^Ci^NH，

52 1356816 NCHiCH2NH)，3.18-3.04 (2H，m，CH^SSCH)，2.38 (1H, m, CHiCH2SS)，2·02 (2H，t, J = 7.1 Hz，CH2CH2Cii^CONH)， 1.85 (1H, m, CH2CH2SS), 1.57-1.47 (4H, m, CH2CH2CH2CONH, Q^CI^C^CHbCONH)，1.35 (2H, m，CH2CH2CH2CONH)。又，進 行上述化合物B之ESI-MS(陽性）測定，m/z : 587.24 [(M+H)+]。藉此，可以確認化合物B之構造。又，該化合 物B之分子質量為586.24。 繼而，使用得到之連結化合物B，依照下述式（27)之步 驟’合成具有上述通式（12)表示之構造中，η1為1，X具備 通式(3)表示之構造，R，為氫(Η)，在R中導入上述式（18) 表示之麥芽糖，m4及m5為2之構造之配體複合體（化合物 3)〇

麥芽糖水合物 (4.5eq)_ Ha〇:DMAc:A 95%NaBHaCN (10ec〇 ----

Ac〇H3nc l：0.1 42%

如式（27)所示’將以上述方法得到之配體化合物B與 為上述式（18)表示之寡糖之市售麥芽糖水合物（4.5當量）溶 1356816 於H20/二曱基乙醯胺（式中，DMAc)/乙酸(AcOH) = l/l/O.l 混合溶媒，調至pH 4至4.5，於37°C形成史契夫鹼後，在 溶媒中加入AcOH，加入10當量之95% NaBH3CN，調至 pH 3至4.5 ’於37°C進行還原胺化反應。然後，使用Sephadex G-50(Amersham Biosystem公司製）將得到之化合物藉由凝 膠過濾層析精製，然後進行脫鹽處理，得到末端包含2單 位α -葡萄吡喃糖之配體複合體，即化合物3。上述化合物 3之鑑定，藉由MALDI-TOF/MS及NMR進行。 MALDI-TOF/MS 之結果，m/z: 1239.36 [(Μ +Η)+]。又， 進行1H-NMR光譜(600 MHz，D20)測定，測得下列數據： 5 7.39 (2H，d，J = 8.2 Hz，芳香族)，7.38 (2H，d，J = 8.2 Hz， 芳香族)，6.56 (2H，d, J = 8·2 Hz，芳香族），6·55 (2H，d，J = 8.2 Hz，芳香族），4.91 (2H，d，J = 3.4 Hz，H-l，x2)，3·84 (2H， s, -NHCOCH2NH-), 3.83-3.78 (2H, m, H-2x2), 3.75 (2H, dd, J = 4.1, 6.9 Hz, H-5x2), 3.72 (2H, dd, J = 2.7, 4.8 Hz, H-3x2), 3.69 (2H, dd, J = 4.1, 4.8 Hz, H-4x2), 3.69-3.66 (2H, m, H-5x2)，3·64 (2H，dd, J = 2·1, 12.4 Hz, H-6a，x2), 3·58 (2H， dd，J = 4.8, 12.4 Hz，H-6b’x2)，3.55-3.51 (2H，m, H-6ax2)， 3.53 (2H，dd，J = 8.9· 9.6 Hz, Η-3，χ2)，3.47 —3.40 (8H，m， -CONHCH2CH2N-X2), 3.44-3.41 (2H, m, H-6bx2), 3.37 (2H, dd, J = 3.4, 9.6 Hz, H-2* x 2), 3.37 - 3.30 (1H, m, CH2CH(CH2-)(S-)), 3.23 (2H, dd, J = 8.9, 10.3 Hz, H-4,x2), 3.20 (3H, dd, J = 4.8, 13.7 Hz, H-lax2), 3.12 (2H, dd, J = 8.2, 13.7 Hz, H-lbx2), 3.00-2.89 (2H, m, -SCH2-V 2.22-2.15 54 ⑧ 1356816 » > (1H，m, -SCH2CH2(1H)-), 1.98 (2H, t, J = 6.9 Hz, -NHCOCH2CH2-), 1.72- 1.64 (1H, m, -SCH?CH2nHV^ 1.45 -1.37 (1H, m, -C0CH2CH2CH2CH,(1H)-), 1.35- 1.23 (3H, m, -COCH2CH2CH2CH2-, -COCH2CH?CH9CH〇nH)~). 1.09 — 1.02 (2H, m, -COCH2CH7CHzCH9-)。從此等結果，可以確 認上述化合物3之構造。又’化合物3之分子質量為 1238.48 ° (4)第4種配體複合體(化合物4)之合成 上述第4種配體複合體之一，即具有上述通式（12)表 示之構造中，n〗為1，X具備通式(3)表示之構造，r，為氫 (H) ’在R中導入上述通式（19)表示之乳糖，m4及m5為2 之構造之配體複合體（化合物4)以下述步驟合成。 在上述配體複合體（化合物4)之合成之前階段，首先如 上述合成具有2條芳香族胺基末端被保護基保護之分枝鏈 之連結化合物。繼而，使用得到之連結化合物B ,依照下 述式（28)之步驟，合成具有在上述通式（12)表示之構造中 η1為卜X具備通式(3)表示之構造，R’為氫(H)，在r中導 入上述式（19)表示之乳糖’ m4及πι5為2之構造之配體複合 體（化合物4)。 55 ⑧ 1356816

HjN H2N

麥芽糖水合物丨95%NaBH3CN(10eq) <4.5eq)____^ HzO: DMAc : AcOH AcOH 37¾ =1 :1 : 0.1 37¾ B 31%

MALDI-TOF/MS 確切質量：1238.48 mfz = 1261.15[M+Na]

…（28) 如式（28)所示，將以上述方法得到之連結化合物B與 為上述式（19)表示之寡糖之市售乳糖水合物(4.5當量）溶於 H20/二甲基乙醯胺（式中，DMAc)/乙酸(AcOH) = 1/1/0.1之 混合溶媒中，於pH 4至4.5及37°C下，形成史契夫鹼後， 在溶劑中加入AcOH，加入10當量之95%NaBH3CN，於 鲁pH 3至4.5及37°C下，進行還原胺化反應。之後，將得到 之化合物使用 Sephadex G-50(Amersham Biosystem 公司製） 經由凝膠過濾層析精製，再進行脫鹽處理，得到在末端包 含2單位β-半乳nt喃糖之配體複合體以作為化合物4。上 述化合物4之鑑定藉由MALDI-TOF/MS及NMR進行。 MALDI-TOF/MS 之結果，為 m/z : 1261.15 [(M+Na)+]。又， 進行111->^^11光譜(6001^2,020)測定，測得下列數據：67.40 (2H, d，J = 8·9 Hz，芳香族)，7.39 (2H，d，J = 8.9 Hz，芳香族)，6.59 (2H, d, J = 8.9 Hz，芳香族)，6.58 (2H，d，J = 8.9 Hz，芳香族)，4.30 56 ⑧ 1356816 (d, 1H, J = 7.6 Hz, Η-Γ), 4.29 (1H, d, J - 7.6 Hz, Η-Γ), 3.93-3.89 (2H, m, H-2x2), 3.84 (2H, s, -CONHCHzNH-), 3.74-3.71 (2H, m, H-5，x2)，3.71 -3.69 (4H, m, H-4x2, H-4’x2)，3.69 —3.66 (2H, m，H-3 x2)，3.65 (2H，dd，J = 3.0, 11.7 Hz，H-6a，x2)，3.53 (2H，dd，J = 5.5, 11.7 Hz，H-6b，x2), 3.48 — 3.42 (12H, m，H-5x2，H-3’x2, -CONHCH2CH2N-x21 3.41-3.39 (4H, m, H-6x2), 3.37-3.32 (1H, m, CH2£H(CH2-)(S-))，3.35 (2H，dd, J = 7.6, 8.9 Hz，H-2’x2)，3.23 (2H, dd, J = 4.1, 13.7 Hz, H-lax2), 3.04 (2H, dd, J = 7.6, 13.7 Hz, # H-lbx2), 3.01-2.90 (2H, m, -SCBg-% 2.23-2.16 (1H, m, -SCH9CH2(1HV\ 1.99 (2H, t, J = 6.9 Hz, -NHCO〇^CH2-), 1.73-1.66 (1H, m, -SCH2CH2(1H)-), 1.46 - 1.39 (1H, m, -COCH2CH2CH2CH2aH)-), 1.35 一 130 (1H， m， -COCH2CH2CH2CH2〇H)-), 1.32 一 126 (2¾ m, -C〇CH?CH2CH,CH?-\ 1.11 — 1.04 (2H，瓜-COCH2ch2£B2CH2·)。 從此等結果，可以確認上述化合物4之構造。又’化合物4之分 $子質量為1238.48» [實施例2 :藉由SPR測定及質量分析之蛋白質分析] 在實施例2中，使用在實施例1中製作之各配體複合 體（化合物1至4)，對於與蛋白質之糖鏈之結合特性，藉由 SPR測定及質量分析解析。其之少驟說明於下。 在圖1中，將在本實施例中之蛋白質分析之步驟示於 步驟1至步驟12中。在圖丨中，少騨1至步驟7係將各配 體複合體（化合物1至4)固定於以金(Au)包覆之支持體表 面，以製作配體承載體（感測晶片）之步驟。使上述配體承 ⑧ 1356816 載體與為分析對象之含蛋白質溶液接觸之步驟8之後所實 施之步驟，為進行SPR測定之步驟。再者，將支持體表面 用水洗之步驟10之後所實施之步驟，係藉由質量分析（MS) 鑑定蛋白質之步驟。 在本實施例中，SPR測定，使用曰本雷射電子公司製 之SPR-8B進行。又，質量分析，使用為應用生物公司製 之基質支援型雷射脫離/飛行時間型質量分析計 (MALDI-TOF/MS)之 Voyager RP-DE 進行。 分析所使用之蛋白質有：屬於葡萄吡喃糖結合性之凝 集素蛋白質之Concanavalin A(簡稱為ConA)、PS A、LCA 以及屬於半乳吡喃糖結合性之凝集素蛋白質之RCA及 PNA共5種。而且，使用牛血清白蛋白（BSA)作為陰性對 照組。 首先，依照圖1所示之步驟1至步驟7,製作分別固 定有上述化合物1至4之四種配體承載體。繼而，將上述 5種凝集素蛋白質及BSA分別溶於PBS緩衝液，以調製蛋 白質溶液。之後，進行圖1所示之步驟8，使各配體承載 體與各蛋白質溶液分別接觸及相互作用。繼而，進行SPR 測定，並進行配體承載體與蛋白質之結合測定。 使用固定有α-葡萄吼喃糖之配體承載體（感測晶片）分 析凝集素蛋白質結合行為，並將其結果示於圖2、圖3及 表1中。於圖2中顯示固定化合物3(二價型）之配體複合體 之感測晶片之結果，於圖3中顯示固定化合物1(三價型） 之配體複合體之感測晶片之結果。圖2及圖3中，（a)顯示 58 1356816

ConA之結合行為結果，（b)顯示PSA之結合行為結果，（c) 顯示LCA之結合行為結果。 二價型 三價型 KD ka kd KD κ kd ConA 11.33 0.45 0.51 4.34 1.95 0.85 PSA 8.58 0.87 0.75 9.86 234 1.01 LCA 未發現 6.04 2.40 1.45 RCA 未發現 未發現 PNA 未發現 未發現 KD:解離常數（//M) ka:結合速率（M_1S ΛΐΟ4) kd:解離速率（S'lO1) 從圖2及圖3可以明白，就ConA及PSA而言，不因 配體複合體之配體部分之構造不同，仍顯示同樣的結合行 為。但是，就LCA而言，雖顯示與化合物1(具有3單位糖 分子之配體複合體）結合，但未與化合物3(具有2單位糖分 子之配體複合體）結合。雖未示於圖中，但可知為陰性對照 組之BSA未與固定有化合物〗或3之晶片結合。 又，在表1中，彙整各個蛋白質之結合行為。觀測與 α葡萄糖結合性之凝集素蛋白質之特異性結合，可以計算 出結合常數。該表顯示與使用二價配體結合體之情況相 較，在使用三價配體結合體之情況，解離常數(KD)為同等 或較小，且隨著每個配體複合體之糖鏈數增加，結合活性 上升。

59 1356816, 將使用固定有yS-半乳吡喃糖之配體承載體（感測晶片） 所測得之凝集素蛋白質之結合行為結果示於圖4、圖5及 表2中。將固定有化合物4(二價型）之配體複合體之感測晶 片之結果示於圖4中；將固定有化合物2(三價型）之配體複 合體之感測晶片之結果示於圖5中。圖4及圖5中，（a)顯 示RCA之結合行為結果，（b)顯示PNA之結合行為結果。 二價型 三價型 KD K kd KD kd Con A 未發現 *1 PSA 未發現 未發現 LCA 未發現 未發現 RCA 12.23 0.74 0.61 7.79 0.52 0.41 PNA 4.95 1.71 0.85 5.83 1.98 1.15

KD: 解離常數（//M) ka: 結合速率（Μ—ΑΛίΟ4) kd: 解離速率（S—^IO1) *1 :非特異性吸附 (與劑量無關） 如圖4及圖5所明白顯示，RCA及PNA顯示不因配 體複合體之配體部分之構造不同，仍顯示同樣的結合行 為。雖未示於圖中，但可知為陰性對照組之BSA未與固定 有化合物2或4之晶片結合。 又，在表2中，彙整各個蛋白質之結合行為。觀測與 1356816 /3葡萄糖結合性之凝集素蛋白質之特異性結合，可以計算 出結合常數。又，就ConA而言，在使用化合物3作成之 晶片中，觀測到非依存於蛋白質濃度之非特異性結合行 為。與使用二價配體結合體之情況相較，在使用三價配體 結合體之情況，解離常數(KD)為同等或較小，且隨著每個 配體複合體之糖鏈數增加，結合活性上升。 從以上結果可以明白，蛋白質對於糖鏈之結合活性隨 著糖鏈之集合化度而不同，藉由該系統可以測定出凝集素 鲁蛋白質之糖鏈結合特性。 再者，對於進行該SPR測定之配體承載體中已確認結 合有蛋白質者，進行步驟9及步驟10後，以質量分析計進 行結合於配體承載體之蛋白質之鑑定。又，於進行質量分 析之時，在已進行結合測定之部分上加入基質溶液（飽和A CHCA或芥子酸(sinapinic acid))，乾燥後，以質量分析計 進行分子質量之測定。 $ 在上述一連串步驟中，確認配體承載體與蛋白質之結 合行為後，在步驟11中使配體承載體與蛋白質之結合解離 後，在步驟12中，用PBS緩衝液進行洗淨。之後，使用 其他蛋白質溶液，重覆步驟8至步驟10,以進行SPR測定 及質量分析。對於各配體承載體及各蛋白質重覆實施該作 業。 將質量分析之結果示於圖6及表3中。在圖6(a)中顯 示ConA之分析結果，在圖6(b)中顯示PNA之分析結果。

61 1356816 凝集素 蛋白質 分子量 實測值 (m/z) Con A 104000( a 4) 25572(a) 25523 (a鏈） PSA 50000( a 2 ^2) 6000( a) 18000( β) 5801 (a 鏈） 19210(yS 鏈） LCA 46000( a 2 β 2) 5710 ⑷ 17572(^) 5742 (a 鏈） 8594 (Θ 鏈，2+) PNA 98000( a 4) 24500( a ) 24736 ( a 鏈） RCA 120000( a 2 ^2) 31000(a) 32000( p) 未檢測1

62 1 在晶片上之結合蛋白質 20.00 fmol/mm2 如圖6(a)及圖6(b)所明示，可以觀測到相當於構成該 蛋白質之亞單位之分子質量之1價及2價離子尖峰。 又，在表3中彙整其他凝集素蛋白質之結果。觀測到 與各個凝集素蛋白質之亞單位之1價或2價之分子質量相 近之離子尖峰。但是，對於RCA，由於亞單位之分子質量 高達3萬道爾頓以上，因此在所使用之質量分析計中可以 檢測出該離子尖峰。若使用更高性能之MALDI-TOF/MS 機器，則可以檢測出。 該質量分析之結果，除RCA之外，觀測到相當於所結 合之各個凝集素蛋白質之分子量，並成功地鑑定凝集素蛋 1356816 白質。 如上述，從本實施例之結果可以確認若使用本發明之 配體複合體進行SPR測定及質量分析並進行蛋白質之分 析，可以正確地鑑定蛋白質。又，從本實施例之結果可以 確認縱使末端具有相同糖鏈之配體承載體，與蛋白質之結 合活性亦會隨著糖鏈之集合化度之差異而有所不同。總 之，本發明之蛋白質之分析方法被認定為可用於糖鏈之集 合化度與蛋白質之結合活性之關係之解析。此等糖鏈之集 籲合化度與蛋白質之結合活性之關係之解析，由於無法用既 存之方法判定，所以本發明之有用性更高。 [實施例3 :配體複合體（化合物21、22)之合成] 在本實施例中，合成在實施形態中所說明之被分類為 第5種及第6種配體複合體之配體複合體。亦即，依照下 述步驟合成第5種配體複合體，即具有在上述通式（13)表 示之構造中，η2為4，上述X具備通式（4)表示之構造，R’ I為氫(Η)且在R中導入葡萄糖之構造之配體複合體（化合物 21) ，以及第6種配體複合體，即具有在上述通式（13)表示 之構造中，η2為4，上述X具備通式(4)表示之構造，R’為 氫(Η)且在R中導入麥芽糖之構造之配體複合體（化合物 22) 。 [測定方法、試藥等] 在1H-NMR光譜之測定中，使用JEOL-Delta600分光 光度計。化學位移，在CDC13之情況，以四曱基矽烷(0.00 ppm)做為基準物質並以（5值表示。質量分析，使用

63 1356816

PerSeptive Biosystem MarinerTM生物分光光度測疋工作 站。矽膠層析係使用 Si丨icagel 60 (Merck ’ 0.040-0.063 mm) 進行。薄層層析使用 Precoated Silicagel 60 F254 (Merck，0.5 mm)。全部的試藥及脫水溶媒，均係購入關東化學股份有 限公司製造者。 化合物16之合成 以下，依照式（29)說明。

硫辛酸 1 J»〇 IJ mDMF 63%

…（29)

TFA/CHjCVHjO "没1, 首先，式(29)之化合物係藉由以下之步驟合成。 將雙[2-(2-羥基乙氧基）乙基]醚（14.57 ml，80 mmol)及 8卩3.£!2〇(2521«卜2 111111〇1)溶於無水二氯甲烷501*11卜於0 °C滴入二偶氮乙酸乙酯（1·8 ml，17.35 mmo】)後，於室溫攪 拌70分鐘。在反應溶液中加入飽和氣化銨水溶液20 m卜 用二氣曱烷萃取，並用無水硫酸鎂乾燥。濾去乾燥劑並減 壓濃縮，將濃縮之殘餘物用層析（600 g，己烧：乙酸乙酯= 1 : 3)精製，得到為無色液體之乙基化體化合物（2.26g，產 1356816. .· 率：47〇/〇)。

將上述乙醋體化合物（2.15 g，7.66 mmol)及DMAP (Μ·7 mg，337 mmo丨）溶於無水吡啶8爪卜在該溶液中於 〇JC滴入對甲苯磺酸氣化物（〗.75 g，9.19 mmol)溶於無水二 氯甲烷f ml之溶液’並於室溫攪拌3小時。在反應溶液中， 加入-氣甲统及冰水’並用二氯甲烧萃取。將有機層用飽 和崚酸氫鈉水溶液、水及飽和食鹽水洗淨丨次，並用無水 硫酸鎂乾燥。濾去乾燥劑並減壓濃縮，將濃縮殘渣用層析 〇〇〇 g，氣仿：丙酮=4 : 1)精製，得到為黃色液體之甲笨 %酿體化合物(2.59 g，產率：78%)。 將上述甲笨磺醯體化合物（1.01 g，2.31 mmol)及疊氮化 納0.53 g ’ 2.31 mmol)溶於無水二曱基曱醯胺50 m卜於遮 光及120°C下，在氮氣蒙氣下攪拌1〇小時。將反應溶液用 氣仿萃取，以水及飽和食鹽水洗淨有機層〗次，並用無水 硫酸鎂乾燥。濾去乾燥劑並減壓濃縮，將濃縮殘餘物用層 籲析（10 g ’氯仿：丙酮==2 : 1)精製，得到為黃色液體之疊 氮體化合物（638 mg ’產率：90%)。 將上述之豐氮體化合物（614 mg，2.01 mmol)溶於甲醇 24 m〗’於遮光及〇°C下，加入iNNaOH4.3ml後，於室溫 攪拌21小時。將反應溶液減壓濃縮，在濃縮殘餘物中加入 氣仿後，加入IN HC1成為pH = 2，然後用氯仿萃取。將 有機層用飽和食鹽水洗淨1次，並用無水硫酸鎮乾燥1次。 將乾燥劑渡去並減壓濃縮，得到為無色液體之化合物16 (549 mg，產率：90%)。

65

1356816 • I 對於該化合物16 ’進行ih_Nmr(40〇]V[Hz，CDC13)測 定，得到下列數據：6 6.19 (iH，bs, C02ii)，4.16 (2H，s， OCH2CO2H), 3.75-3.64 (12H, m, OCILCiLO), 3.68 (2H, m, N3CH2CH2)，3Λ1 (2H，t, J = 5」Hz，N3CH2)。又，進行上述 化合物 16 之 ESI-MS(陽性）測定，m/z: 300 54 [(M+Na)+]。 藉此’可以確認化合物16之構造。又，該化合物16之分 子質量為277.13。 (2) 化合物17之合成 將化合物16 (228 mg ’ 0.823 mmol)溶於無水二氯甲烧 (4 ml)’ 於 0°C 依次加入 HOBt (135 mg，0.987 mmol)、EDC . HC1 (192 mg ’ 0.987 mmol)、化合物 11 (205 mg，0.987 mmol)’並於遮光下攪拌20小時。將該反應溶夜減壓濃縮， 將得到之濃縮殘餘物用氯仿萃取，將有機層用1〇。/〇檸檬 酸、飽和碳酸氫鈉水溶液洗淨1次，用無水硫酸鎂做為乾 燥劑乾燥後’濾去乾燥劑並進行減壓濃縮。將減壓濃縮得 到之濃縮殘餘物用矽膠層析（80 g，氯仿：甲醇=1〇 : 1) 精製’得到為黃色油狀物質之化合物17 (367 mg，產率： 95%)。進行該化合物17iESI-MS(陽性）測定，m/z: 490,24 [(M+Na)+P藉此，可以確認化合物3之構造。又，該化合 物17之分子質量為467.24。 (3) 化合物18之合成 將化合物17 (29 mg，0.062 mmol)溶於甲醇（3 mi)，力口 入10% Pd/C (5.0 mg)，於氫氣蒙氣下，於室溫攪拌9小時。 濾去上述P d / C並將濾液減壓濃縮。將得到之濃縮殘餘物用

66 1356816 矽膠層析（1.5g ’氣仿：甲醇=7. : 1)精製，得到為黃色油 狀物質之化合物18 (22 mg ’產率：82%)。進行該化合物 18 之 ESI-MS(陽性）測定，m/z : 442.27 [(M+H)+]。藉此， 可以確認化合物18之構造。又，該化合物18之分子質量 為 C2iH35N3〇7 . 441.25。 (4) 化合物19之合成 將琉辛酸(12..6 mg，0.061 mmol)溶於無水二甲基甲醯 胺（2 ml) ’ 於氬氣下依次加入 HOBt (8.3 mg , 0.061 mmol)、 EDC . HC1 (11.8 mg，0.061 mmol) ’於遮光下回到室溫並 攪拌2小時。加入化合物18 (22·4 mg ’ 0.051 mmo】)溶於無 水二1f基f醯胺(2 ml)，並於室溫及遮光下攪拌1日。在反 應液中加入甲笨、濃縮，將有機層用10%擰檬酸及飽和碳 酸致納水溶液依次洗淨，用無水硫酸鎮乾燥後，遽去乾燥 劑並進行減壓濃縮。將得到之濃縮殘餘物用石夕膠層析（3 g， 氯仿：甲醇=10 : 1)精製，得到為黃色油狀物質之化合物 19 (367 mg ’產率：95%)。產量為27 mg(84%)。該化合物 19 之 ESI-MS(陽性）測定，m/z : 652.28 [(M+Na)+]。藉此， 可以確認化合物19之構造。又’該化合物19之分子質量 為 629.28。 (5) 化合物20之合成 將化合物19 (31 mg，〇 〇50 mmol)溶於二氯甲烷（2 ml)，於〇。(：加入TFA(147 y 1)，並於同溫度攪拌3小時。 將反應溶液濃縮後，與曱苯共沸。將得到之濃縮殘餘物溶 於二氣曱烧，加入三乙胺水溶液’將水相之pH調為8後，

67 1356816 將有機相用無水硫酸鎂乾燥，濾去乾燥劑並進行減壓濃 縮。將得到之濃縮殘餘物用矽膠管柱層析（1〇 g，氣仿：曱 醇=5 : 1)精製’得到為黃色油狀物之化合物2〇。產量為 26.1 mg (59%)。對於該化合物 2〇,進行 ih nmr(6〇〇 mhz， CDCI3)測定’得到下列數據：17(s，m，芳香族），7丨（机 1H，J = 8.6, 8.3 Hz 芳香族)，6 91 (d，m，J = 8.2 Hz 芳香族）6.45 (d, 1H, J = 8.2 Hz 芳香族）4] (s, 2H，-OCHzCONH-\ 3.78-3.49 (m, 15H,乙二醇鏈，CH2£g(CH2-)(S-))，3.41 (q，2H，J = 5.5 Hz， -C0NHCH2CH20->, 3.16 (m, 1H, -SCH2_-\ 3.08 (m, 1H, -SCH2(1H)-), 2.46-2.44 (m, 1H, -SCH錢(1H)-)，2.13-2.10 (t, 2H, J = 7.6 Hz, -NHCOCH2CH,A 1.92 - 1.88 (m, 1H, -SCH2CH2(lH)-)? 1.43-1.40 (m 4H, -COCH?CH?CH，CB>A 1.26 — 1.24 (m, 2H, -COCH2CH9CH2CHd。又，對於化合物 20，進行 ESI-MS(陽性)測定，m/z : 552.31 [(M+Na)+]。從上述可以確認化合 物20之構造。又，該化合物20之分子質量為529.23。

(6)配體複合體（化合物21)之合成 以下’參照式（30)說明。

1>葡萄糖（3<0 eq) 2)NaBH3CN(10eq)

•"(30)

MeOHm2(yAcOH(W〇L2)

37X 將化合物 20(15.5 mg，29.3 μ mol)及葡萄糖（5.8 mg， 32.2//mol)溶於 DMAc/水（1 : 1，1 ml)，加入乙酸(200// 1)， ⑧ 丄356816 、- 亚於37°C放置2日。在反應液中加入氰基氫硼化鈉（5 5 … mg ’ 87.9以m〇l)，於37°C再放置6日。將反應液濃縮。將 得到之殘餘物藉由ODS管柱層析（Chr〇mat〇rex〇DS，3〇 g， 曱醇/水=50/50)精製。得到為白色固體之化合物21。產量 為 4.54 mg (22%)。 對於該化合物21 ’進行1H-NMR光譜(6〇〇 MHz，D20)測定， 得到下列數據：57.17(s，lH，芳香族),71(dd lH, J = 8 6 8 3 Hz 芳香族)，6.91 (d, 1H，J = 8.2 Hz 芳香族）6 45 (d，1H, J = 8.2 Hz 芳 鲁香族）4.1(5,2氏-〇趣(：〇顺-)，3.80—3.76 (111，111，11-2)，3.68-3.35 (m，19H，乙二醇鏈，H-3，H-6a，H-5，H-4，H_6b)，3.20-3.10 (m，2H， H-l-a, CH2CH(CH2-)(S-)), 3.05-2.94(m,lH,H-lb, -SCH2V 2.28-2.23 (m，1H, -SCH^CIH)-), 2.13-2.10 (t, 2H, J = 7.6 ,6.9Hz, -NHCOCHzCH,-\ 1.78-1.69 (m, 1H, -SCH，CH2(lHV)r 1.53-1.36 (m 4H, -COCH,CH2CH?CH?-11.20 - U〇 (m, 2H, -COCH2CH2〇^CH2 )。進行 MALDI-TOF-MS 測定，m/z : 鲁694.661(1^+1¾^。藉此，可以確認化合物21之構造。又，該化合 物21之分子質量為693.30。 (7)配體複合體（化合物22)之合成 以下，參照式（31)說明。 ⑧ 1356816.

將化合物 20 (9.0 mg，17.0// mol)及麥芽糖（5.8 mg，17.0

// mol)溶於甲醇/水（1 : 1，1 ml)，加入乙酸（5〇以j)，並於 37C放置24小時。在反應液中加入乙酸(45〇"丨)及氰基氫 硼化鈉（3.2 mg，51.0//m〇】）’於37〇c再放置12〇小時。將 反應液濃縮。得到之殘餘物藉由〇DS管柱層析 (Chromatorex ODS，30 g ’ 甲醇/水=5〇/s〇)精製。得到為白 色固體之化合物22。產量為2 36 mg 〇6%)。 對於該化合物22 ’進行1H-Nmr光譜(6〇〇，d2〇)測定，

得到下列數據· δ 7.〇7_7‘〇4 (t，1H，J == 8 2, Hz> 芳香族)，6 76 (s，m， 芳香族)，6.63 (d，1H，J = 8.2 电芳香族)，6 48 (dd，1H，； = 2丄 6 2 Hz，芳香族），4.91 (d，1H，J = 4 】Ηζ，η]), 4」（s，2H， -Oei^CONH-)，3.82-3.78 (m，1H，H-2)，3.75-3.34(m，24H，乙二醇 鏈，H-2’，H-5’，H-5, H-6，a，H-6，b，H-6a，H-6b，H-3, H-3，，H-4，）3.25 (m， 1H， CH2CH(CH2-)(S-)),3.18-3.1 l(m, 3H， Hl，b， -CONHCH2CH2O-),3.07-2.93(m, 3H, Hra, -80^),2.29-2.20 (m, 1H, -SCH2CH2(1H)-), 2.05 - 1.96 (t, 2H, J = 7.6, 6.9 Hz, -NHCOCH2CH2-), 1.76-1.69 (m, 1H, -SCH7CH2(1HV). 1.52-1.31 1.10 (m, 2H, (m 4H, -COCH,CH2CH?CH2-X ! 18 1356816. -COCH2CH2£H2CHr)。進行 MALDI-TOF-MS 測定，m/z : 878.39 [(M+Na)+]。藉此’可以確認化合物22之構造。又，該化合物22 之分子質量為855.35。 [實施例4 :配體複合體（化合物26、27)之合成] 在本實施例中’合成在實施形態中說明之被分類為第 7種及第8種配體複合體之配體複合體。亦即，第7種配 體複合體之一即具備上述通式（14)表示之構造中ηι為3, 上述X為通式(4)表示之構造，R，為氫(η)且R中導入葡萄 糖之構造之配體複合體（化合物26)，以及第8種配體複合 體之―’即具備上述通式（14)表示之構造中為3,上述X 為通式(4)表示之構造，R，為氫田)且R中導入葡萄糖之構 4之配體複合體（化合物26)，依照下述步驟合成。 又’關於測定方法及試藥等，與上述實施例記載者相 同。 化合物24之合成 以下，依照式（32)說明。

將r·巯基丁酸之二聚物（化合物23)(344 mg，144 ⑧ 1356816. mmol)溶於無水二氣甲烷(25 ml)，於氬氣蒙氣下，於〇。€依 次加入 HOBt (359 mg，2.64 mmol)、EDC · HC1 (508 mg， 2.64 mmol)、N-Boc-苯二胺（化合物 11)(502 mg, 2.4 mmol) 於遮光下攪拌17小時。將該反應溶液減壓濃縮，並將得到 之濃縮殘餘物用氯仿萃取’將有機層用10%檸檬酸及飽和 碳酸氫鈉水溶液洗淨1次，用無水硫酸鎂做為乾燥劑乾燥 後’濾、去乾燥劑並進行減壓濃縮。將減壓濃縮得到之濃縮 殘餘物用碎膠層析（5〇 g，甲苯：乙酸乙酿=5 :])精製，得 到為頁色油狀物質之化合物24 (220 mg，產率：30%)。對 於该化合物24，進行ESI-MS(陽性）測定，m/z : 641.25 [(M+Na)+]。藉此可以確認化合物24之構造。又，該化合 物24之分子質量為618 25。 (2)化合物25之合成 將化合物24 (103 mg，11.67 mmol)溶於二氣曱烧(2 ml)，於〇°C加入TFA(247 // 1) ’於同溫度下攪拌1小時。 將反應溶液濃縮後，與甲苯共沸。將得到之濃缩殘餘物溶 於乙酸乙酯，加入三乙胺水溶液，將水相調為後，將 有機相用無水硫酸鎮乾燥，濾去乾燥劑並進行減壓濃縮。 將得到之濃縮殘餘物用矽膠管柱層析（5 mg，氣仿：丙_ =5 : 1)精製’得到為黃色油狀物質之化合物25。產量為 46.8 mg(67%)。對於該化合物25 ’進行1H-NMR光譜(600 MHz’CDCI3)測定，得到下列數據：（5 6.93-6.89 (m，2H，芳 香族），6.71-6.68 (d，1H，J = 8.4 Hz，芳香族)，6 37—6 35 (d， 1H，J = 8.4 Hz，芳香族)，2.66 (t，2H，J = 6.6 Hz，Q^C-CH?). ⑧ 1356816 • · 2.36 (t, 2H, J = 7.2 Hz, CH2-S), 1.98- 1.94 (m, 2H, J = 6.6

Hz，14.4 Hz,CH2Cii2CH2)。又’對於化合物 25 ’ 進行 ESI-MS(陽性）測定，m/z : 419.06 [(M+H)+]。從上述可以確 認化合物25之構造。又，該化合物25之分子質量為418·15。 (3)配體複合體（化合物26)之合成 以下，依照式(33)説明。

%萄糖（3>0eq> 2)NaBH)CN(10eq) AcOH (0.1)

ΙηΜβΟΗΜ,ΟΙίη) 37-C

."(33)

將化合物25(5.04邮’ 12 "励〇及葡萄糖(4·79叫’ 26以—^於平##(1 :卜1 ml) ’加入乙酸(5〇W) ’並 於37°C放置4小時。在反應液中加入乙酸(95〇//丨）、甲醇 /水（1 : 1，1 ml)及氰基氫蝴4匕納（5·14 mg，72//m〇1)，並 於37。(：再敌置72小特。將反應液濃縮°將得到之殘餘物 藉由使用1^20之管杜層析（5〇g^醇/水=5〇/5〇)精 製。得到為白色闺艨之化合物26。產量為2.58mg(29%)。 對於該化合物％ ’進行iH_NMR光譜（600 MHz ’ A0) 測定，得到下列數據：56·94 (t，〗H，J = 7 8 Ήζ，芳香族）， 6‘66(5，出，芳香族），6.55(£1，]11，卜8.4沿，芳香族），6.37 (d, 1Η, J = 9.6Hz，努香族)，3.714_3 7〇7(m，1H，J = 4 2Hz)， 3.58 —3.51 (m, 3ίί)，3.44-3.37 (m，2Η，)，31α*3.07 (m，2H， J = 8.4 Hz, i3 8 2*56-2.50 (m, 2H, 0=0-0^), 2.24 (t,

73 1356.816 2H, J = 3.6 Hz, CH^-S)，ι .83 — ! 81 (m 2H，现现叫）。進 行 MALDI-TOF-MS 測定，m/z : 747 21 [(M+H)+]。藉此， 可以確認化合物26之構造。又，該化合物26之分子質量 為 746.29。 ' (4)配體複合體（化合物27)之合成 以下’依照式（34)說明。

邮 -8〜VSqt1 25

.· · (34) 將化合物 25(5.1 mg ’ 12# ^οΐ)及麥芽糖(9.2 mg，26 "111〇1)溶於甲醇/水（1:1，11111)’加入乙酸（5〇以1)，並於 37。(：放置4小時。在反應液中加入乙酸(950；/1)、甲醇/水 (1 : 1 ’ 1 ml)及亂基氧爛化鈉(5.22 mg，72 // mol)，並於 37 。(：再放置120小時。將反應液濃縮。將得到之殘餘物藉由 籲使用LH-20之管柱層析（5〇g，甲醇/水= 50/50)精製。得到 為白色固體之化合物27。產量為2.74 mg (21%)。 對於該化合物27 ’進行ih_NMR光譜(600 MHz，D20) 測定’得到下列數據：ό 7.04 (t，1H，J = 4.2 Hz,芳香族）， 6.77(5,111，芳香族)，6.64((!，111，】=7.8 1^，芳香族)，6.54 (d, 1H，J = 8.4 Hz，芳香族），4 93 (d，1H，j =3 6 HZ)， 3.82-3.78 (m, 2H), 3.75-3.70 (m, 3H), 3.63-3.56 (m, 3H), 3.48 (dd, 1H, J = 6.6 Hz, 11.4 Hz), 3.41-3.39 (m, 1H) 3.27 (t, 1356816. 1H, J = 9.0 Hz), 3.18 (s, 3H), 3.08-3.06 (m, 1H), 2.65 (t, 2H, 4.8 Hz ,0=C-CH2), 2.34 (t, 2H, J = 7.2 Hz, CH2-S), 1.91 (t, 2H, J = 7.2 Hz, CH2CE2CH2)。進行 MALDI-TOF-MS 測定， m/z : 1093.27 [(M+Na)+]。藉此，可以確認化合物27之構 造。又，該化合物27之分子質量為1070.39。 [實施例5] 合成上述通式（9)表示之構造中η1及q為0,且導入上 述群（20)所示之糖鏈之配體複合體。又，測定方法及試藥 ♦等與上述實施例4相同。 配體複合體（化合物30)之合成 配體複合體（化合物30)之合成步驟，參照式（35)說明。

75 1356816

28 Ίν Η

NaBH3CN DMAc/H20/Ac0H (1/1/0^)

---(35)

將化合物28 (2.47 mg，8.24 // mol)及含唾液酸三糖（化 合物29，5.11 mg，7.57 " mol)溶於二甲基乙醯胺/水（1 : 1， 1.0 ml)，加入乙酸（100/zl)，並於37°C放置10小時。在反 應液中加入氰基氫硼化鈉（1.55 mg，24.7 mo】），於37°C再 放置72小時。在反應液中加入丙酮3 m卜使未反應之氰基 氫硼化鈉失活後濃縮。將得到之殘餘物依次進行使用 Chromatorex ODS 之管柱層析、HPLC(管柱：DIASO 76 ⑧ 1356.816 SP-120-5-ODS-BP)、使用 Sephadex G-25 之層析以精製。 得到為白色固體之化合物30。產量為2.31 mg (32%)。 對於該化合物30,進行1H-NMR光譜(600 MHz，D20) 測定，得到圖7所示之圖。又，進行MALDI-TOF-MS測定， m/z : 977.5 [(M+Na)+]。藉此，可以蜂認化合物30之構造。 又，該化合物27之分子質量為954.34。 配體複合體（式（36))之合成 以與上述（1)同樣之步驟合成式（36)所示之配體複合

測定該配體複合體之W-NMR光譜，將得到之圖示於 鲁圖8中。藉此，可以確認式（36)表示之配體複合體之構造。 配體複合體（式（37))之合成 以與上述（1)同樣之步驟合成式（37)所示之配體複合 1356816 • «

"•(37) 測定該配體複合體之W-NMR光譜，將得到之圖示於 圖9中。藉此，可以確認式（37)表示之配體複合體之構造。 (4)配體複合體（式（38))之合成 以與上述（1)同樣之步驟合成式（38)所示之配體複合

•••(38) 78 1356816 ♦ · 測定該配體複合體之W-NMR光譜，將得到之圖示於 圖10中。藉此，可以確認式（38)表示之配體複合體之構造。 (5)配體複合體（式（39))之合成 以與上述（1)同樣之步驟合成式（39)所示之配體複合體。

•••(39) 測定該配體複合體之W-NMR光譜，將得到之圖示於 圖11中。藉此，可以確認式（39)表示之配體複合體之構造。 (6)配體複合體（式（40))之合成 以與上述（1)同樣之步驟合成式（40)所示之配體複合

79 (40) 1356816 測定該配體複合體之W-NMR光譜，將得到之圖示於圖12中。 藉此，可以確認式（40)表示之配體複合體之構造。 (7)配體複合體（式（41))之合成 以與上述（1)同樣之步驟合成式（41)所示之配體複合

測定該配體複合體之W-NMR光譜，將得到之圖示於 圖13中。藉此，可以確認式（41)表示之配體複合體之構造。 (8)配體複合體（式（42))之合成 以與上述（1)同樣之步驟合成式（42)所示之配體複合

測定該配體複合體之W-NMR光譜，將得到之圖示於 圖14中。藉此，可以確認式（42)表示之配體複合體之構造。 (9)配體複合體（式（43))之合成 1356.816 以與上述（1)同樣之步驟合成式（43)所示之配體複合

鲁 …(43) 測定該配體複合體之W-NMR光譜，將得到之圖示於 圖15中。藉此，可以確認式（43)表示之配體複合體之構造。 (10)配體複合體（式（44))之合成 以與上述（1)同樣之步驟合成式（44)所示之配體複合

S nhcoch3 …(44) 測定該配體複合體之W-NMR光譜，將得到之圖示於圖16 中。藉此，可以確認式（44)表示之配體複合體之構造。 1356.816 (11)配體複合體（式（45))之合成 以與上述（1)同樣之步驟合成式（45)所示之配體複合

CH9OH

nhcoch3 • · · (45) 測定該配體複合體之W-NMR光譜，將得到之圖示於 圖17中。藉此，可以確認式(45)表示之配體複合體之構造。 (12)配體複合體（式(46))之合成 以與上述（1)同樣之步驟合成式（46)所示之配體複合體。

圖18中。藉此，可以確認式（46)表示之配體複合體之構造。 (13)配體複合體（式（47))之合成

82 1356816 • > 以與上述（1)同樣之步驟合成式（47)所示之配體複合 ch7oh

測定該配體複合體之W-NMR光譜，將得到之圖示於 圖19中。藉此，可以確認式（47)表示之配體複合體之構造。 (14)配體複合體（式（48))之合成 以與上述（1)同樣之步驟合成式（48)所示之配體複合

…(48) 測定該配體複合體之W-NMR光譜，將得到之圖示於 圖20中。藉此，可以確認式（48)表示之配體複合體之構造。 (15)配體複合體（式(49))之合成 以與上述（1)同樣之步驟合成式（49)所示之配體複合 83 ⑧

1356816 I

測定該配體複合體之i-NMR光譜，將得到之圖示於 圖21中。藉此，可以確認式（49)表示之配體複合體之構造。 (16)配體複合體（式（50))之合成 以與上述（1)同樣之步驟合成式（50)所示之配體複合

測定該配體複合體之W-NMR光譜，將得到之圖示於圖 22中。藉此，可以確認式（50)表示之配體複合體之構造。 (17)配體複合體（式（51))之合成 84 ⑧ 1356816 以與上述（1)同樣之步驟合成式（51)所示之配體複合

• · · (51)

測定該配體複合體之W-NMR光譜，將得到之圖示於圖23 中。藉此，可以確認式（51)表示之配體複合體之構造。 又，實施發明之最佳形態項中所舉之具體實施態樣或實施 例清楚地說明本發明之技術内容，但不應狭義地解釋為只 限於此等具體例；在本發明之精神及下文記載之申請專利 範圍内，可以進行各種變更而實施。 [產業上利用之可能性]

如上述，本發明之配體複合體，由於在一個配體複合體内 可以導入複數個糖分子，因此可以避免上述配體複合體彼 此集合在支持體表面之情況下，使糖分子集合化。藉由使 用本發明之連結化合物，可以評價上述糖分子與蛋白質之 相互作用且評價結果之再現性良好。 又，本發明之配體承載體能發揮所謂「利用於未知蛋白質 之鑑定」之效果。再者，藉由本發明蛋白質之分析方法， 可以進行未知蛋白質之鑑定。 本發明提供可以有效地利用於蛋白質之機能解析之新穎配 ⑧ 1356816 • · 體複合體及配體承載體等。若將固定有寡糖鏈之配體承載 體（晶片）開發做為糖鏈及蛋白質之機能解析之手段，不僅 可解明寡糖鏈參與之生命現象，而且可以期待成為醫藥品 開發上之重要技術。所以，本發明被認為具高有用性。 【圖式簡單說明】 【圖1】 係顯示使用本發明之配體複合體之蛋白質分析方法之步驟 Φ之模式圖。 【圖2(a)】 係顯示使用已固定具有2分子α葡萄吡喃糖之配體複合體 之感測晶片測定ConA之結合行為之結果之曲線圖。 【圖2(b)】 係顯示使用已固定具有2分子α葡萄《比喃糖之配體複合體 之感測晶片測定PSA之結合行為之結果之曲線圖。 I【圖2(c)】 係顯示使用已固定具有2分子α葡萄吡喃糖之配體複合體 之感測晶片測定LCΑ之結合行為之結果之曲線圖。 【圖3(a)】 係顯示使用已固定具有3分子α葡萄吡喃糖之配體複合體 之感測晶片測定ConA之結合行為之結果之曲線圖。 【圖3(b)】 係顯示使用已固定具有3分子α葡萄吡喃糖之配體複合體 之感測晶片測定PSA之結合行為之結果之曲線圖。

86 1356816 * * 【圖3(c)】 係顯示使用已固定具有3分子α葡萄吡喃糖之配體複合體 之感測晶片測定LCA之結合行為之結果之曲線圖。 【圖4(a)】 係顯示使用已固定具有2分子半乳吡喃糖之配體複合體 之感測晶片測定RCA之結合行為之結果之曲線圖。 【圖4(b)】 係顯示使用已固定具有2分子点-半乳°比喃糖之配體複合體 籲之感測晶片測定PNA之結合行為之結果之曲線圖。 【圖5(a)】 係顯示使用已固定具有3分子点-半乳吡喃糖之配體複合體 之感測晶片測定RCA之結合行為之結果之曲線圖。 【圖5(b)】 係顯示使用已固定具有3分子/9-半乳吡喃糖之配體複合體 之感測晶片測定PNA之結合行為之結果之曲線圖。 【圖6(a)】 係質量分析結合於感測晶片之ConA之結果之圖。 【圖6(b)】 係質量分析結合於感測晶片之PNA之結果之圖。 【圖7】 係配體複合體(化合物30)之1H-NMR光譜測定圖 【圖8】 係配體複合體（式（36))之1H-NMR光譜測定圖 【圖9】

87 1356816 係配體複合體（式（37))之1H-NMR光譜測定圖 【圖10】 係配體複合體（式（38))之1H-NMR光譜測定圖 【圖11】 係配體複合體（式（39))之1H-NMR光譜測定圖 【圖12】 係配體複合體（式（40))之1H-NMR光譜測定圖 【圖13】 • 係配體複合體（式（41))之1H-NMR光譜測定圖 【圖14】 係配體複合體（式（42))之1H-NMR光譜測定圖 【圖15】 係配體複合體（式（43))之1H-NMR光譜測定圖 【圖16】 係配體複合體（式(44))之1H-NMR光譜測定圖 |【圖17】 係配體複合體（式（45))之1H-NMR光譜測定圖 【圖18】 係配體複合體（式(46))之1H-NMR光譜測定圖 【圖19】 係配體複合體（式(47))之1H-NMR光譜測定圖 【圖20】 係配體複合體（式（48))之1H-NMR光譜測定圖 【圖21】 88 ⑧

Claims (1)

1. 一種配體複合體’其賴料備連結 末:之糖經由下述之芳香族胺基鍵結而°成=具有還原 該連結化合物具備通式（1)表二t .战之構造；其中 申請專利範圍 不之構造 X—Z •⑴ (式中’p及q各自獨立’為〇以上6以下之整數），· 上述X係為通式(2)、通式（3)或通式（4) R 一N一R’ R—N—R*

   (CH2)m2—C一N一C-H II Ο .⑵ R_N_^-1L N -(CH2)m4 R_N_^-L N ^(CH2)m N一C 一 II 0 ⑶ R， I (式中m1、m2、m3、m4、m5各自獨立，為0以上6以下 之整數；R為具有還原末端的糖且該糖之結構係選自於 如下群(20) ; R’為氫或R)所示之構造；

   1356816. ' 修正版修正曰期：2011/10/14

   91 1356816. 修正版修正日期：2011/10/14

   上述Y係為含有硫-硫之五員環的烴構造； 上述Z係為通式（5)或通式(6) 92 1356-816 修正版修正日期：2011/10/14

   OCH2CH2

   …⑹ (式中，η1、η2係各自為1以上6以下之整數)所示之構 造， 其中，X為通式(2)表示之構造時，Ζ並非通式(6)表示 之構造。

   93 1356816. 2. 修正版修正日期：2011/10/14 m本n體之製造方法，其频為··使用具備通式 (7)表示之構造之連結化合物·· NH,

   !~〇^ν (式t ’ m4、m5各白猸 …⑻ 1以上ό以下之整數）、*'、、以上6以下之整數，η1為 -備通式(9)表示之構造之連結化合物： η2ν ν

   ⑼ ο ίΐ f v s ο 各自獨立為〇以上6 具備通式⑽表示之構造之連結化合物之整幻或 94 1356816. 修正版修正日期：2011/11V14

   (式中，η2為1以上6以下之整數），與具有還原末端之 糖進行還原胺化反應，且該糖之結構係選自於如下群 (20)

   〇 95 〜UO丄ϋ · 3.!:::Γ圍第1項所述之配體複 化合物具有如下列通式： R务R， 6-^λ R~M-R，

   (式中m〗、m2、m3及A , nl係為1以上6以;之4立為。以上6以下之整數’ 且該糖之钍構俘、“ a R係為具有還原末端之糖 4.如申請專於群(2㈣，為氳所述之構造。 化合物具有如下列通=边之配體複合體，其中該連結

   j伙，）τ(·νΗ。 (式中，m4、m5 # Α 係為！以上6各自獨立為0以上6以下之整數，η! 該糖之結·^數，R係為具有還原末端之糖I 如申請專群(2G);R，錢或R)所述之構造。 利範固第1項所述之配體複合體，其中該連結 96 5. 化合物具有如下列通式 修正版修正曰期：2011/10/14 Rf

   R-N 0 (式中，η1、q係各自獨立為〇以 為具有還原上6从下之整數，R係 為氫或騎述之構造。 構係選自於群(20);R’ 6.如申請專·_丨項所述之轉複 化合物具有如下列通式： ，、中該連、、. R，

   c2+〇ch2ch 七 H R-N (式+，η2係為1以卜 端之糖且該糖之4二=，'係為具有還原末 之構造。 構係選自於群(20);R，為氫或R)所述 5 體承载體’其特徵為將申請專利範圍第卜3、4、 之1持^任—項之配體複合體固定於表面上具有金屬 暂申％專利1&圍第7項所述之配體承載體，可用於蛋白 買之分析。 9· 一種蛋白曾^· /V 析方法，其特徵為包含下列步驟： 97 1356816. 修正版修正日期：2011/10/14 藉由使申請專利範圍第1、3、4、5或6項中任一項 之配體複合體與支持體接觸，製成使該配體複合體固定 於支持體上之配體承載體之步驟； 將上述配體承載體與蛋白質溶液接觸後，進行分子 間相互作用之測定之步驟；以及 於測定上述分子間交互作用後進行質量分析，以鑑 定鍵結於上述配體承載體上之蛋白質之步驟。

   98 1356816 . 十一、圖式：

   修正版修正日g 公告本 __ _ , :2〇ii/i〇/14

   以MeOH :出〇 = 1 ··丨5〇//】清洗金屬表面5次(步帮 1 加入(U 糖鏈配體複合體(MeOH : Hz〇 = ] : 1)5〇叫步驟2) 以MeOH : HzO= 1 ·· ：! 5〇从1清洗金屬表面5次(步驟3) i 使金表面乾燥(步琢4) 各 用PBS緩衝液5〇#丨清洗5次(步称5) 用10mM硫酸月桂酯鈉50 //1清洗(步驟6) 用PBS緩衝液5〇#】清洗5次(步琢乃 r>加入溶於PBS緩衝液之凝集素溶液(步驟8)_^视測定 I (步驟10) 成為平衡p態時，用PBS緩衡液5〇/ί1清洗5次(步驟9)—用水清洗金表面 在10mMNaOH 50 μ 1中使之解離(步麻⑴ MS Lj定 (若不解離’用100mM甘胺醆鹽酸鹽或1〇mM SDS清洗> i -用PBS緩衝液50〆1清洗5次(步味I?) 99 1356816. 圖 2(a) 修正版修正日期：2011/10乃4 Con A 圖 2(b) 價型

   PSA 圖 2(c) • 價型 價型

   LCA

   100 1356816 . 修正版修正曰期：2011/10/14 圖 3(a) 價型 Con A

   400 300 bb S200 E 100 Q <Κ63μΜ 5外口聞 2.50 μΜ

   1 51 #1151201251301^1 時間/10(秒） >25 μΜ 0.31 μΜ 圖 3(c) 價型 LCA

   101 1356816 . 修正版修正日期：2011/10/14 圖4⑻ 價型

   時間/10(秒) 圖 4(b) 價型

   時間A〇(秒) 102 1356816 圖 5(a) 修正版修正日期：20im〇/14 價型 RCA

   時間/1〇(秒) 圖 5(b) 價型 PMA

   時間/!〇(秒) 103 1356816. 修正版修正日期：20im〇/14 圖6⑻ Con A 12766.531 25523.36 (Z = 1) L (2=2) 在晶片上之結合蛋白質 测 ^tyrikutrlUit,!^ 圖 6(b) pm

   Linuhtj

   11M70.78 冑在晶片上之結合蛋白質 P - 2) (Z = 1) 104 1356816 . 修正版修正日期：2011/10/14

   105 1356816 修正版修正日期：2011/10/14

   -CM 00 Μ 106 1356816 修正版修正日期：201U10/14

   〇\ 画 107 1356816 修正版修正日期：2011/10/14

   •CM •CO ^r S 〇Q.£L

   108 1356816 修正版修正日期：2011/10/14

   109 1356816 修正版修正日期：2011/1 (V14

   110 1356816 修正版修正日期：2011/10/14

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   111 1356816 修正版修正日期：2011/10/14

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   〇.£t ο •eg -to .寸 113 1356816 修正版修正日期：2011ΑΟΠ4

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