WO2005077965A1

WO2005077965A1 - 糖鎖リガンド複合体、およびそのリガンド複合体を用いたタンパク質の分析方法

Info

Publication number: WO2005077965A1
Application number: PCT/JP2005/003220
Authority: WO
Inventors: Yasuo Suda
Original assignee: Japan Science And Technology Agency; National University Corporation Kagoshima University
Priority date: 2004-02-18
Filing date: 2005-02-18
Publication date: 2005-08-25
Also published as: TW200533632A; CN1930179B; US20070287195A1; JPWO2005077965A1; US20140295566A1; CA2556406A1; EP1726596A4; CA2556406C; KR20060122961A; JP5339310B2; TWI356816B; IL177526A0; KR100811969B1; JP2011201921A; CN1930179A; EP1726596A1; JP4800771B2; US8765384B2

Abstract

本発明は、タンパク質の機能解析に有効利用することのできる新規なリガンド複合体、リガンド担持体、および、タンパク質の分析方法を提供する。　リガンド複合体は、下記一般式（１）【化１】（式中、ｎ，ｐは０以上６以下の整数）にて表される構造を備え、上記Ｘとして、末端に芳香族アミノ基を有するとともに、主鎖に炭素−窒素結合を有していてもよい炭化水素誘導鎖を、１鎖又は２鎖又は３鎖含んでなる構造を備え、上記Ｙとして、硫黄原子を含む炭化水素構造を備え、上記Ｚとして、炭素−炭素結合又は炭素−酸素結合を持つ直鎖構造を備えているリンカー化合物と、還元末端を有する糖とが、上記芳香族アミノ基を介して結合している構造である。

Description

5 003220

1

明細書発明の名称

糖鎖リガンド複合体、およびそのリガンド複合体を用いたタンパク質の分析方法技術分野

本発明は、リンカー化合物に還元末端を有する糖鎖が導入された新規リガンド複合体、および、このリガンド複合体を金や銀、銅などの金属で表面をコートしたチップ上に集合化させ固定化したリガンド担持体に関するものである。さらに、本発明は上記リガンド複合体を用いたタンパク質の分析方法に関するものである。背景技術

生体内に存在する種々の糖は、生物の活動や生命を維持するためのメ力二ズムの中で重要な役割を果たしている。このような糖の機能を精密' に解明するためには、糠の複雑な構造に基づいてそれらの機能を解析する必要がある'。糖の機能解析には、構造が解明されている糖鎖を用いて、糖の構造を一部ずつ再現し、これによつて糖全体の構造と機能との関係を明らかにする手法が用いられる。

- 上記糖の機能解析の手法としては、例えば、表面プラズモン共鳴（以下、 S P Rと記載する）が知られている。すなわち、糖の一部を模擬したオリゴ糖を含んでなるリガンド複合体をセンサチップ表面上に導入し、このリガンド複合体が導入されてなるセンサチップを用いて、オリゴ糖と特異的に相互作用するタンパク質等の物質を特定する。これにより、ォリゴ糖の構造に基づく生物活性の正しい評価を行うことができる。

ところが、オリゴ糖は、 1分子だけでは活性がそれほど高くないため、オリゴ糖の生物活性を評価する場合には、オリゴ糖をセンサチップ上に集合化させることが必要となる。つまり、集合化したオリゴ糖を用いて、タンパク質との相互作用を解析することにより、オリゴ糖の生物活性の評価を行うことが可能になる。

そこで、本発明者らは、これまでに、センサチップ表面に固定可能な部位及びオリゴ糖を導入可能な部位を分子内に有するリンカー化合物を得、このリンカー化合物に 1単位又は 2単位のオリゴ糖を導入してなるリガンド複合体を得ている。そして、このリガンド複合体を用いることによって、センサチップ上に、オリゴ糖を集合化して導入することができることを見出している（例えば、特許文献 1、非特許文献 1等を参照

) o .

〔特許文献 1〕特開 2 0 0 3— 8 3 9 6 9号公報（ 2 0 0 3年 3月 1 9 日公開）

〔非特許文献 1〕「日本化学会第 7 9回春季年会一講演予稿集 IIJ 、社団法人日本化学会、 2 0 0 1年 3·月 1 5 日、 p . 1 0 4 2

しかしながら、上記の各文献に記載されたリガンド複合体においては、導入される糖鎖（オリゴ糖鎖）は、発明者らによって合成された硫酸化糖に限られており、市販の還元末端を有するマルトース、ラタトースなどのオリゴ糖を導入しチップ化できるかどうかについては明らカこされていない。また、上記の文献に記載のリガンド複合体を固定化して得られたセンサチップを S P Rを用いた測定に使用した後に、チップ上の糖鎖と結合したタンパク質の同定に使用するという利用方法は、従来から提唱されてはいたが、データ的に満足できるものは存在し.なかった。本発明は上述の問題点に鑑みてなされたものであって、市販の還元末端を有する糖を導入してなる新規リガンド複合体、および、タンパク質の同定に使用することのできるリガンド担持体を提供することを目的とするものである。発明の開示

本願発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、先出願（出願番号：特願 2 0 0 3— 1 9 0 5 6 8、公開番号：特開 2 0 0 4 - 1 5 7 1 0 8 (公開日： 2 0 0 4年 6月 3 日）、本願の優先日（ 2 0 0 4年 2月 1 8 日）の時点で未公開）に記載のリンカ一化合物（何れも本願発明者らによって見出されたもの）に市販のマルトースまたはラクトースを反応させ、それぞれ末端に αダルコビラノースまたは ]3ガラクトピラノースを有するリガンド複合体を合成した。さらに、本願発明者はこれらのリガンド複合体を金コーティングチップに固定化させたシュガーチップ（リガンド担持体）を作製した。そして、これらのシュガ一チップを用いてタンパク質との相互作用を検討するために、 S P R測定で相互作用を確認後、当該シュガーチップをそのまま MA LD I - Τ O F/M Sに供した.ところ、各シュガーチップに結合するタンパク質を同定することができること見出し本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明のリガンド複合体は、一般式（ 1 )

(式中、 p , qはそれぞれ独立して 0以上 6以下の整数）にて表される構造を備え、上記 Xとして、末端に芳香族アミノ基を有するとともに、主鎖に炭素—窒素結合を有していてもよい炭化水素誘導鎖を、 1鎖又は 2鎖又は 3鎖含んでなる構造を備え、上記 Yとして、硫黄原子又は硫黄原子を含む炭化水素構造を備え、上記 Zとして、炭素一炭素結合又は炭素一酸素結合を持つ直鎖構造を備えているリンカー化合物と、還元末端を有する糖とが、上記芳香族アミノ基を介して結合している構造を有していることを特徴としている。

上記炭化水素誘導鎖とは、炭素及び水素からなる炭化水素鎖にて、一部の炭素や水素が他の原子や置換基に置き換わっていてもよいものを指すものとする。すなわち、上記炭化水素誘導鎖とは、末端に芳香族アミノ基を有し、炭化水素鎖の主鎖構造である炭素—炭素結合（C— C結合 ) の一部が、炭素一窒素結合（C— N結合）、炭素—酸素結合（C一 O 結合）、アミド結合（C O— N H結合）に置き換わっていてもよいものを指す。

また、上記硫黄原子を含む炭化水素構造とは、炭素及び水素からなる炭化水素構造にて、一部の炭素が硫黄に置き換わっているものを意味する。また、この硫黄原子を含む炭化水素構造は、鎖状（直鎖、枝分かれ鎖の両方を含む）であっても、環状であってもよく、また、鎖状構造おょぴ環状構造の両方の構造を含んでいてもよいものとする。

本発明のリガンド複合体において、上記リンカ一化合物は、上記 Yとして、 S— S結合または S H基を含む炭化水素構造を備えているものであってもよい。つまり、上記硫黄原子を含む炭化水素構造中に、ジスルフィド結合（ S— S結合）またはチオール基（ S H基）が含まれていてもよい。

本発明のリガンド複合体において、上記 Xは、一般式（ 2 )

(式中、 m¹, m²， ³はそれぞれ独立して 0以上 6以下の.整数。 R' は水素（H) または R。）にて表される構造を備え、上記 Rは糖鎖由来化合物であるものであってもよい。

本発明のリガンド複合体において、上記は、一般式（ 3 )

(式中、 m⁴， m⁵はそれぞれ独立して 0以上 6以下の整数。 R' は水素 (H) または R。）にて表される構造を備え、上記 Rは糖鎖由来化合物であるものであってもよい。

本発明のリガンド複合体において、上記 Xは、一般式（4 )

(式中、 R，は水素（H) または R) にて表される構造を備え、上記 R は糖鎖由来化合物であるものであってもよい。

'本発明のリガンド複合体において、上記 Zは、式（ 5 )·または式（ 6

)

(式 '中、 II ¹， n ²はそれぞれ 1以上 6以下の整数）にて表される構造を備えているものであってもよい。

また、本発明にかかるリガンド複合体の製造方法は、一般式（ ⁷ )

(式中、 m¹, m², m³はそれぞれ独立して 0以上 6以下の整数、 n ¹ は 1以上 6以下の整数）にて表される構造を備えているリンカー化合物、または、. 一般式（ 8 )

(式中、 m⁴, m⁵はそれぞれ独立して 0以上 6以下の整数、 n ¹は 0以上 6以下の整数）にて表される構造を備えているリンカ一化合物、または、一般式（ 9 )

(式中、 n ¹, qはそれぞれ独立して 0以上 6以下の整数）にて表される構造を備えているリンカー化合物、または、一般式（ 1 0 ) 03220

8

(式中、 n は 1以上 6以下の整数）にて表される構造を備えているリンカー化合物、または、一般式（ 1 1 )

(11) j (式中、 n ¹は 1以上 6以下の整数）にて表される構造を備えているリ ^カー化合物と、還元末端を有する糖とを用いて還元アミノ化反応を行うことを特徴としている。

i また、本発明にかかるリガンド担持体は、上記の何れかのリガンド複合体を、表面に金属を有する支持体上に固定化させてなることを特徴とするものである。そして、上記リガンド担持体は、タンパク質の分析に使用してもよい。

また、本発明にかかるタンパク質の分析方法は、上記の何れかのリガンド複合体を、支持体と接触させることによって、当該リガンド複合体を支持体上に固定化させたリガンド担持体を作成する工程と、上記リガンド担持体を、タンパク質溶液と接触させた後、分子間相互作用の測定を行う工程と、上記分子間相互作用の測定の後に質量分析を行って、上記リガンド担持体に結合しているタンパク質を同定する工程と、からなることを特徴としている。図面の簡単な説明

図 1は、本発明のリガンド複合体を用いたタンパク質分析方法の手順を示す模式図である。 .

図 2 ( a ) は、一ダルコビラノースを 2分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用いて C o n Aの結合挙動を測定した結果を示すグラフである。

図 2 ( ) は、 a —ダルコビラノースを 2分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用いて P S Aの結合挙動を測定した結果を示すダラフである。

図 2 ( c ) は、ひ一ダルコピラノースを 2分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用いて L C Aの結合挙動を測定した結果を示すグラフである。

図 3 ( a ) は、ひ一ダルコビラノースを 3分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用いて C ο η Αの結合挙動を測定した結果を示すグラフである。

図 3 ( b ) は、 _α—ダルコビラノースを 3分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用いて P S Αの結合挙動を測定した結果を示すダラフである。

図 3 ( C ) 'は、 α —ダルコビラノースを 3分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用いて L C Αの結合挙動を測定した結果を示すグラフである。

. 図 4 ( a ) は、 ]3—ガラクトピラノースを 2分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用いて R C Aの結合挙動を測定した結果を示すグラフである。

図 4 ( b ) は、 /3—ガラクトピラノースを 2分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用いて P N Aの結合挙動を測定した結果を示すグラフである。

図 5 ( a ) は、 β —ガラクトピラノースを 3分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用.いて R C Αの結合挙動を測定した結果を示すグラフである。

図 5 ( b ) は、 β —ガラクトピラノースを 3分子有するリガンド複合体を固定化したセンサチップを用いて Ρ Ν Αの結合挙動を測定した結果を示すグラフである。

図 6 .( a ) は、センサチップに結合した C o n Aを質量分析した結果を示すチャートである。

図 6 ( b ) は、センサチップに結合した P N Aを質量分析した結果を示すチヤ一トである。

図 7は、リガンド複合体（化合物 3 0 ) の¹ H— NMRスペクトル測定チヤートである。 .

図 8は、リガンド複合体（式（ 3 6 ) ) の¹ H— NMRスペクトル測定チャートである。

図 9は、リガンド複合体（式（ 3 7 ) ) の¹ H— NMRスぺタトル測定チャートである。

図 1 0は、 "リガンド複合体（式（ 3 8 ) ) の¹ H— NMRスペクトル測定チャートである。

図 1 1は、リガンド複合体（式（ 3 9 ) ) の¹ H— NMRスペクトル測定チヤ一トである。

図 1 2は、リガンド複合体（式（4 0 ) ) の¹ H— NMRスペクトル測定チャートである。

図 1 3は、リガンド複合体（式（4 1 ) ) の¹ H— NMRスペクトル測定チャ卜である 0

図 1 4は、リガンド複合体 (式 (4 2) ) の — NMRスぺクトル測定チャ一卜である 0

図 1 5は、リガンド複合体 (式 (4 3 ) 〕の ^JH — NMRスぺクトル測定チャ一卜である 0

図 1 6は、リガンド複合体 (式 (4 4 ) ) の ^!H — NMRスぺクトル測定チャ卜である o

図 1 7は、リガンド複合体 (式 (4 5 ) 〕の ^JH — NMRスぺクトル測定チャ一卜である 0

図 1 8はゝリガンド複合体 (式 (4 6 ) ; の ^JH一 NMRスぺクトル測定チャ一卜である o

図 1 9は、リガンド複合体 (式 (4 7 ) 、' の 'Η一 NMRスぺクトル測定チャ一卜である o

図 2 0は、リガンド複合体 (式 (4 8 ) ：の ^lH一 NMRスぺクトル測定チャ一卜である o

図 2 1は、リガンド複合体 (式 (4 9 ) : ) の Ή一 NMRスぺクトル測定チャ卜である o

図 2 2はリガンド複合体 (式 ( 5 0 ) ： ) の ^JH一 NMRスぺクトル測定チャ一である 0

図 2 3は、リガンド複合体 (式 ( 5 1 ) 、 ) の一 NMRスぺクトル測定チャ卜である □ 発明を実施するための最良の形態

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明のリガンド複合体は、表面プラズモン共鳴（ S P R) のセンサチップやァフィ二ティクロマトグラフィーの担持体等のタンパク質分析用の支持体に固定化されて用いられるものであり、支持体表面と結合することのできるリンカー化合物と、分析対象となるタンパク質などと特異的に相互作用することのできる糖鎖とから構成されている。上記 S P Rゃァフイエティクロマトグラフィーでは、糖分子と特異的に相互作用するタンパク質などの物質を特定することや分離することを目的としている。そのため、上記リガンド複合体は、タンパク質等の物質と非特異的に相互作用を起こさないものであることが必要とされる。

そこで、本発明のリガン'ド複合体は、上記一般式（ 1 ) で表される構造を備えたリンカ一部分（リンカ一化合物）を有している。この構造中の Yで示す構造中には、硫黄原子（ S ) が含まれており、この硫黄原子 ( S ) は、例えば、タンパク質分析用の支持体表面にコートされた金属 (例えば A u ) と、金属一硫黄結合（例えば A u— S結合）を形成し、支持体に強固に結合することができる。

また、上記リンカ一化合物は、上記一般式（ 1 ) の Xとして、末端に芳香族アミノ基を有するとともに主鎖に炭素一窒素結合を有していてもよい炭化水素誘導鎖を、 1鎖又は 2鎖又は 3鎖含んでなる構造を備えている。これによつて、上記リンカ一化合物は、タンパク質分析用の支持体表面に糖分子を集合化して配列することができるとともに、末端に芳香族アミノ基を有していることによって、糠分子を簡便に導入することができる。

. また、上記リンカ一化合物は、上記一般式（ 1 ) の Zとして、炭素一炭素結合又は炭素一酸素結合を持つ直鎖構造を備えている。より具体的には、化合物の製造が容易であることから、 Zは、上記式（ 5 ) または式（ 6 ) にて表される構造を有することが好ましい。なお、上記一般式 ( 1 ) において、 p， qはそれぞれ独立して 0以上 6以下の整数であれば限定されない。また、上記式（ 5 ) の n ¹および式（ 6 ) の n ²はそれぞれ 1以上 6以下の整数であれば限定されない。

さらに、上記リンカ一化合物として、上記一般式（ 1 ) において、 p が 4であり、 qが 1であり.、 Yとして、 S — S結合を有する環状炭化水素構造を備えており、 Zが上記式（ 5 ) である構造を有しているものを挙げることができる。上記リンカ一化合物としては、例えば一般式（ 1 2 )

にて表される構造を備えるものであってもよい。このリンカー化合物は、チォクト酸を原料として合成することが可能である。

また、上記リンカ一化合物として、上記一般式（ 1 ) において、 Pが 4であり、 qが 1であり、 Yとして、 S — S結合を有する環状炭化水素構造を備えており、 Zが上記式（ 6 ) である構造を有しているものを挙げることができる。上記リンカ一化合物としては、例えば一般式（ 1 3 ) . ,

にて表される構造を備えるものであってもよレ、。このリンカー化合物は. 、チォクト酸を原料として合成することが可能である。また、上記リンカ一化合物どして、上記一般式（ 1 ) において、が 0であり、 qが 0であり、 Yとして、硫黄原子（ S) を有しており、 Z が上記式（ 5 ) または上記式（ 6 ) である構造が 2量体を形成しているものを挙げることができる。上記リンカー化合物としては、例えば一般式（ 1 4) · · · ( 14)

にて表される構造を備えるものであってもよい。

上記一般式（ 1 2 ) 、一般式（ 1 3 ) および一般式（ 1 4 ) にて表されるリンカ一化合物は、ジスルフイド結合（S— S結合）が含まれており、この S— S結合中の硫黄（ S) は、例えば、タンパク質分析用の支持体表面にコートされた金属 (例えば Au) と、金属—硫黄結合（例えば Au— S結合）を形成し、支持体に強固に結合することができる。なお、上記 Yとしては、一般式（ 1 2) 、一般式（ 1 3 ) または一般式（ 1 4) で示されるものに限定されることはないが、金属一硫黄結合（A u— S結合）を容易に形成することができるという点で、 S— S結合または S H基が含まれている炭化水素構造であることが好ましい。

そして、本,発明のリガンド複合体は、上記リ.ンカー化合物の芳香族ァミノ基に、還元末端を有する糠鎖が導入され調製される。言い換えれば、本発明のリガンド複合体は、上記リンカ一化'合物と、還元末端を有する糖とが、芳香族アミノ基を介して結合している構造を有している。この糖の導入は、例えば、上記リンカ一化合物の芳香族ァミノ基のアミノ基（一 NH₂基）と糖との還元アミノ化反応によって行うことができる。つまり、糖中の平衡によって生 Dるアルデヒド基（一 CHO基）また 5 はケトン基（一 C R O基、 Rは炭化水素基）と、上記リンカ一化合物が有するアミノ基とが反応する。そして、この反応によって形成されたシッフ塩基を引き続き還元することによって、芳香族ァミノ基に容易に糖を導入することができる。

本発明では、特に上記還元末端を有する糖として、上記先出願に記載のような発明者らによって合成された硫酸化糖ではなく、市販のもの、あるいは、市販の多糖を分解して調製したものを用いる。なお、上記「還元末端を有する糖」とは、ァノマー炭素原子が置換を受けていない単糖またはオリゴ糖である。つまり、上記還元末端を有する糖とは、還元糖（？ぁ ·ο。

上記還元末端を有する糖としてより具体的には、マルトース、ラクトース、パノース、セロビオース、メリビオース、マンノオリゴ糖、キトオリゴ糖、ラミナリオリゴ糖などが挙げられるが、これに限定されることはない。このように、マルトース.やラタトースなどのオリゴ糖を有するリガンド複合体は、従来の硫酸化糖を有するリガンド複合体と比較して、タンパク質測定に関して応用範囲が広いと言う利点を有している。本発明のリガンド複合体として具体的には、一般式（ 7 )

(式中、 m¹, m², m³はそれぞれ独立して 0以上 6以下の整数、 n ¹ は 1以上 6以下の整数）にて表される構造を有するリンカ一化合物、または、一般式（ 8 )

(式中.、 m⁴, m⁵はそれぞれ独立して 0以上 6以下の整数、 n ¹は 1以上 6以下の整数）にて表される構造を有す.るリンカ一化合物、または、一般式（ 9 )

(式中、 n ¹, qはそれぞれ独立して 0以上 6以下の整数）にて表される構造を有するリンカー化合物、または、一般式（ 1 0 )

(式中、 n ²は 1以上 6以下の整数）にて表される構造を有するリンカ一化合物、または、一般式（ 1 1 )

(式中、 n ¹は 1以上 6以下の整数）にて表される構造を有するリンカ一化合物の芳香族ァミノ基に、還元末端を有する糖が導入された構造を有するものが挙げられる。

：上記のリガンド複合体は、例えば、一般式（ 7 ) 〜（ 1 1 ) にて表される構造を有するリンカー化合物と、還元末端を有する糖とを用いて還元アミノ化反応を行うことによつて製造することができる。

上記一般式（ 7 ) にて表される構造を有するリンカ一化合物とは、つまり、炭化水素誘導鎖を 3鎖有するものであり、末端に芳香族ァミノ基を有する 3鎖の炭化水素誘導鎖が、 1つの炭素（C) に結合することによって分岐構造を形成している。なお、上記一般式（ 7 ) において、 m ¹ , m², m³は、 0以上 6以下の整数であれば限定されず、 n ¹は 1以上 6以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく

、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。このうち、上記！!！¹〜 m³は、製造時の簡便さの点から互いに同じ整数であることが好ましく、特に 2であることが好ましい。上記一般式（ 8 ) にて表される構造を有するリンカ一化合物とは、つまり、炭化水素誘導鎖を 2鎖有するものであり、末端に芳香族ァミノ基を有する 2鎖の炭化水素誘導鎖が、 1つの窒素（N) に結合することによって分岐構造を形成している。なお、上記一般式（ 8 ) において、 m ⁴， m⁵は、 0以上 6以下の整数であれば限定されず、 11 ¹は 1以上 6以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。このうち、上記 m⁴, m⁵は、製造時の簡便さの点から互いに同じ整数であることが好ましく、特に 2であることが好ましい。

上記一般式（ 9 ) にて表される構造を有するリンカ一化合物は、炭化水素誘導鎖を 1鎖有するものである。なお、上記一般式（ 9 ) において、 n ¹, qは、 0以上 6以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、同じ整数であってもよい。

上記一般式（ 1 0 ) にて表される構造を有するリンカー化合物は、炭化水素誘導鎖を 1鎖有するものである。なお、上記一般式（ 9 ) において、 n ²は、 1以上 6以下の整数であれば限定されない。

上記一般式（ 1 1 ) にて表される構造を有するリンカー化合物は、炭化水素誘導鎖を 1鎖有するものが 2量体を形成したものである。なお、上記一般式 C1 1 ) において、 n ¹は、 1以上 6以'下の整数であれば限定されない。 '

上記一般式（ 7 ). または一般式（ 8 ) のように、上記 Xは、炭素ゃ窒素等の原子にて、上記炭化水素誘導鎖を複数結合して分岐構造を形成している多分岐型部位である構造を備えているものでもよい。なお、上記 Xに複数の炭化水素誘導鎖が含まれる場合は、すべて同じであることが好ましいが、末端に芳香族アミノ基を有していれば、互いに異なる構造 0

1 9 であってもよい。

以上のように、本発明のリガンド複合体に含まれるリンカ一化合物は、タンパク質分析用の支持体に結合可能な硫黄原子と、オリゴ糖鎖等の糖分子に結合可能なァミノ基とを有している。従って、例えば A u— S 結合などの金属—硫黄結合により上記リンカ一化合物が、タンパク質分析用の支持体上に固定されるので、上記リンカ一化合物を介して、上記支持体上に糖分子を強固にかつ簡単に結合させることができる。

また、上記リンカ一化合物は、多分岐型部位を有していてもよく、この場合該多分岐型部位の各末端に芳香族ァミノ基を有している。そのため、上記リンカ一化合物に還元末端を有する糖が導入された本発明のリガンド複合体を用いることにより、上記支持体表面により効率よく糖分子を集合化させることができる。

さらに、上記リンカ一化合物は、タンパク質との非特異的な相互作用の影響をほぼ無視することができる。それゆえ、上記リンカ一化合物を有する本発明のリガンド複合体を用いることによって、 '上記糖とタンパク質との相互作用を再現性よく評価することが可能になる。

上記リンカー化合物は、例えば以下に示す製造方法によって製造される。つまり、上記一般式（ 7 ) 、（ 8 ) 、（ 9 ) または（ 1 0 ) にて表されるリンガー化合物は、チォクト酸と、芳香族アミノ基末端が保護基によって保護されたァミン化合物との縮合反応を行い、上記芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護することによって製造される。また、上記一般式（ 1 1 ) にて表されるリンカ一化合物は、 γ—メルカプト酪酸の 2 量体と、 2分子の芳香族アミノ基末端が保護基によって保護されたアミン化合物との縮合反応を行い、上記芳香族ァミノ基末端の保護基を脱保護することによって製造される。 · 上記チォクト酸は、下記一般式（ 1 5 )

にて表される構造を備えている。

また、上記アミン化合物は、保護基によって保護された芳香族ァミノ基末端を有するものであれば特に限定さ.れるものではない。

上記保護基とは、芳香族アミノ基のアミノ基が'上記縮合反応によって反応しないように導入される置換基である。このような保護基は、特に限定されるものではないが、例えば、 t—ブトキシカルポュル基（一 C O O C (CH₃) ₃基； B o c基と記載する）、ベンジル基、ァリルカルバメート基（一 CO O CH₂CH= CH₂、 A 1 1 o c基）等を挙げることができる。

上記ァミン化合物としては、例えば、下記一般式（ 1 6 )

) にて表される構造を備えている第 1級アミン化合物を挙げることができる。なお、上記一般式（ 1 6 ) 中の！!！¹〜 XII ³は、それぞれ独立して、 2

0以上 6以下の整数であり、 n ¹は 1以上 6'以下の整数である。この一般式（ 1 6 ) にて表されるァミン化合物と、チォクト酸との縮合反応、および、その後に行われる芳香族ァミノ基末端の保護基を脱保護によつて得られるリンカ一化合物は、上記一般式（ 7 ) にて表されるリンカ一化合物である。

^! また、上記アミン化合物の他の例としては、例えば、下記一般式（ 1 7

— (CH₂)_n1— ΝΗ₂ ·'··(17)

にて表される構造を備えている第 2級ァミン化合物を挙げることができる。なお、上記一般式（ 1 7) 中の m⁴， m⁵は、それぞれ独立して、 0以上 6以下の整数であり、 n ¹は 1以上 6以下の整数である。この一般式（ 1 7 )' にて表されるァミン化合物と、チォクト酸との縮合反応、. および、その後に行われる芳香族ァミノ基末端の保護基を脱保護によつて得られるリンカ一化合物は、上記一般式（ 8 ) にて表されるリンカ一化合物である。これらのァミン化合物の合成方法については、後の実施例にて詳述する。

上記チォクト酸または γ —メルカプト酪酸とァミン化合物との縮合反応により、チォタト酸またはツーメルカプト酪酸のカルボキシル基（一 C O OH基）と、ァミン化合物のアミノ基（一 NH₂基）とが縮合して、アミド結合が形成される。その後、芳香族ァミノ基末端の保護基を脱保護して、保護基を取り外し、芳香族ァミノ基にすることによって、上記したリンカー化合物を得ることができる。

本発明のリガンド複合体は、上述のようにして作製されたリンカー化合物に、還元末端を有するマルトースゃラクトースなどのオリゴ糖が導入されたものである。本発明のリガンド複合体として具体的には、以下に示すものを拳げることができる。

1番 '目のリガンド複合体は、上記一般式（ 1 2) にて表される構造において、上記 Xとして上記一般式（ 2 ) にて表される構造を備え、 R' が水素（H) であり、 Rに下記式（ 1 8 )

にて表される構造を有するマルトースを導入してなるものである。

2番目のリガンド複合体は、上記一般式（ 1 2) にて表される構造において、上記 Xとして上記一般式（ 2 ) にて表される構造を備え、 R' が水素（H) であり、 Rに下記式（ 1 9 ) ..

こて表される構造を有するラクトースを導入してなるものであるこの 1， 2番目のリガンド複合体は、 3鎖の炭化水素誘導鎖を有しているリンカー化合物にオリゴ糖がそれぞれ 1個導入されているので、末端に 3単位のオリゴ糠を有している。言い方を換えれば、上記 1番目のリガンド複合体は、末端に 3単位の α—ダルコビラノースを有しており、上記 2番目のリガンド複合体は、末端に 3単位の j8—ガラクトビラノースを有している。なお、上記一般式（ 2 ) において、！!!¹〜！!！³は、 0 以上 6以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。また、上記一般式（

1 2 ) において、 n ¹は 1以上 6以下の整数であれば特に限定されない。

また、 3番目のリガンド複合体は、上記一般式（ 1 2 ) にて表される構造において、上記 Xとして上記一般式（ 3 ) にて表される構造を備え、 R'が水素（H) であり、 Rに上記式（ 1 8 ) にて表される構造を有するマルトースを導入してなるものである。

4番目のリガンド複合体は、上記一般式（ 1 2 ) にて表される構造において、上記 Xとして上記一般式（ 3 ) にて表される構造を備え、 R' が水素（H) であり、 Rに上記式（ 1 9 ) にて表される構造を有するラクトースを導入してなるものである。

この 3 , 4'番目のリガンド複合体は、 2鎖の炭化水素誘導鎖を有しているリンカ一化合物にオリゴ糖がそれぞれ 1個導入されているので、末端に 2単位のオリゴ糖を有している。言い方を換えれば、上記 3番目の .リガンド複合体は、末端に 2単位の α—ダルコビラノースを有しており、上記 4番目のリガンド複合体は、末端に 2単位の β —ガラクトビラノースを有している。なお、上記一般式（ 3 ) において、 m⁴， m⁵は、 0以上 6以下の整数であれば限定されず、互いに異なる整数であってもよく、一部あるいは全てが同じ整数であってもよい。また、上記一般式 ( 1 2) において、 n ¹は 1以上 6以下の整薮であれば特に限定されなレヽ o

5番目のリガンド複合体は、'上記一般式（ 1 3 ) にて表される構造において、上記 Xとして上記一般式（ 4 ) にて表される構造を備え、 R'. が水素（H) であり、 Rにグルコースを導入してなるものである。なお、上記一般式（ 1 3 ) において、 n ²は 1以上 6以下の整数であれば特に限定されない。

6番目のリガンド複合体は、上記一般式（ 1 3 ) にて表される構造において、上記 Xとして上記一般式（4) にて表される構造を備え、 R' が水素（H) であり、 Rにマルトースを導入してなるものである。なお、上記一般式（ 1 3 ) において、 n ²は 1以上 6以下の整数であれば特に限定されない。

7番目のリガンド複合体は、上記一般式（ 1 4 ) にて表される構造において、上記 Xとして上記一般式（4) にて表される構造を備え、 R' が水素（H) であり、 Rにグルコースを導入してなるものである。なお、上記一般式（ 1 4) において、 n ¹は 1以上 6以下の整数であれば特に限定されない。

8番目のリ'ガンド複合体は、上記一般式（ 1 4 ) にて表される構造において、上記 Xとして上記一般式（ 4 ) にて表される構造を備え、 R' が水素（H) であり、 Rにマルトースを導入してなるものである。なお、上記一般式（ 1 4) において、 n ¹は 1以上 6以下の整数であれば特に限定されない。

さらに、上記一般式（ 9 ) にて表される構造を備えているリンカ一化合物に、下記群（ 2 0 )

に示される 1 7種類の糖鎖をそれぞれ導入した 1 7種類のリガンド複合体が、本発明のリガンド複合体の^ r体例に挙げられる。上記のリガンド複合体は、いずれもリンカー化合物と糖分子とを含んでなつているので、リンカ一化合物内の S— S結合にて、タンパク質分析用の支持体表面の金属と、金属一硫黄（S ) 結合、 .例えば金一硫黄（ A u - S ) 結合により結合する'ことができる。これにより、この A u— S結合を介して、上記支持体表面に糖分子を集合化して固定化されてなるリガンド担持体を提供することができる。上記支持体表面の金属としては、上記 A uの他、 C u、 A g、 P t等の金属を用いることができるが、特に A uを用いることが好ましい。

また、.上記各リガンド複合体は、後述の実施例に示されるように、タンパク質と異なる相互作用を示すことが確認された。それゆえ、未知タンパク質の同定に有効に利用することができると考えられる。

なお、本発明のリガンド複合体に導入されている上記オリゴ糖は、同一の単糖分子からなる単一オリゴ糖であってもよいし、種々の単糖分子やその誘導体からなる複合糖質であってもよい。また、上記オリゴ糖は、いずれも、自然界から単離 ' 精製して得られる種々の天然の糖であつてもよく、人工的に合成された糖であってもよい。また、上記オリゴ糖は、多糖を分解して得られたものであってもよい。

また、上述のような本発明のリガンド複合体を、表面に金属を有する支持体に金属一硫黄結合を介して固定化させてなるリガン.ド担持体も本発明に含まれる。このリガンド担持体はタンパク質分析の用途に限定されず、糠分子との相互作用を調べるために、タンパク質以外の物質の分析用として用いることもできる。

上記リガンド担持体は、該リガンド複合体を含むリガンド複合体溶液と表面に金属膜を有する支持体とを接触させることにより、リガンド複合体の S— S結合の各 S原子が、支持体表面の金属と金属—硫黄結合によって結合して、支持体表面に上記リガンド複合体が導入される。具体的には、上記リガンド複合体溶液に、タンパク質分析用の支持体を所定時間浸漬する、あるいは、上記支持体にリガンド複合体溶液を注入する (支持体表面にリガンド複合体溶液を流す）ことによって、上記リガンド複合体（リガンド複合体に含まれるリンカ一化合物）の S— S結合を、上記支持体表面の金等との A u— S結合に変換して、支持体表面に上記リガンド複合体を固定することができる。

リガンド複合体溶液に用いる溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、メタノール、水、ジメチルァセトアミド ( D M A c ) や、これらの混合溶媒等を挙げることができる。また、浸漬時間は、 0 . 5時間〜 1 2時間程度であればよく、注入濃度は、 1 μ Μ〜 1 πι Μ程度であればよい。

このように、本発明のリガンド複合体は、 S— S結合を有しているので、タンパク質分析用の支持体表面に簡単に固定化することができ、上記支持体上に糖分子を簡単に導入することができる。

本発明のリガンド担持体は、糖分子と、例えばタンパク質等の他の物質との相互作用の分析に、利用可能である。具体的には、上記リガンド担持体は、 S P R測定、ァフィ二ティクロマトグラフィー等に適用することができる。

例えば、タンパク質分析として、 S P R測定を行うには、以下のようにすればよい。すなわち、金薄膜等の金属薄膜を蒸着した支持体に、本発明のリガンド複合体を固定化してなるリガンド担持体を用い、該リガンド担持体とタンパク質とを接触させ、常法に従って、表面プラズモン共鳴装置を用いて共鳴角度を測定すれば、該リガンド担持体とタンパク質との結合挙動を観測することができる。なお、 S P R測定に用いる上記支持体（センサチップ）としては、例えば、 .ガラス、プラスチック等を用いることができ、特にガラスが好適に用いられる。また、リガンド担持体とタンパク質の接触は、例えば、'タンパク質をランニングバッファ一に溶解した溶液を、該リガンド担持体の表面に流入することにより行えばよい。このランニングバッファ一としては、例えば、リン酸緩衝溶液等を挙げることができる。

また、本発明のリガンド担持体は、後述の実施例に示されるように、各々のタンパク質と異なる相互作用を示すことが確認されているため、タンパク質の同定に利用することができる。つまり、本発明のリガンド担持体を用いて未知タンパク質の分析を行うことによって、そのタンパク質が糖結合性タンパク質であるか否か、また、そのタンパク質がどの種のタンパク質であるかを容易に判定することができる。なお、上記のリガンド複合体をそれぞれ固定化したリガンド担持体のうち、少なくとも 2種類を一組のセットとして含むチップセットを作製すれば、より簡便にタンパク質（特に、糖鎖結合性のタンパク質）. の同定を行うことができるため有用である。

• ここで、本発明のリガンド担持体の利用方法について説明する。本発明のリガンド担持体は、分子間相互作用の測定（例えば、以下のような S P R測定）'にセンサチップとして使用することができる。すなわち、第 1のリガンド複合体が支持体表面に固定化されてなる第 1 のセンサチップと、上記第 1のリガンド複合体とは種類の異なる第 2のリガンド複合体が支持体表面に固定化されてなる第 2のセンサチップとを用いて、第 1のセンサチップを用いて得られた S P R測定の検出結果と、第 2のセンサチップを用いて得られた S P R測定の検出結果との差を検出し、糖分子の相互作用を観測することができる。これらのセンサチップには、固定化される糖分子が異なっているリガンド複合体、あるいは、固定化されている糖分子は同じであるがリンカ一化合物の部分が異なっているリガンド複合体を用いればよい。この種類の異なるリガンド複合体としては、例えば上述の各リガンド複合体を挙げることができる。そして、上記のリガンド複合体のうちから、リンカー化合物部分は同じ構造を有しているが、オリゴ糖の部分が異なる構造を有するもの（例えば、上記 1番目のリガンド複合体と 2番目のリガンド複合体のセット、あるいは、上記 3番目のリガンド複合体と 4番目のリガンド複合体とのセット）を選択することが好ましい。

上記 S P R測定では、第 1のセンサチップの糖分子に特異的に作用するタンパク質等を用いて、測定条件を一定にして、上記 2つのセンサチップに作用させ、両者の共鳴角度を観測する。この両者の共鳴角度の差を検出することで、糠分子とタンパク質等との特異的な相互作用として測定することができる。

また、糖分子との相互作用を観測する物質は、タンパク質に限定はされない。

上記では、 2つの種類のセンサチップを同時に測定したが、これに限定されることはなく、 2種類以上のセンサチップを測定してもかまわないし、同時に測定しなくてもかまわない。また、少なくとも 1つのセンサチップに糖分子を導入していないものを用いてもよい。例えば、リンカー化合物のみを固定化したものを用いてもよい。

. 上記のような S P R測定を行うと、糠分子以外は同じ構造のリガンド複合体を有する少なくとも 2つのセンサチップを用いて、測定をすることができるため、少なくとも 2つのセンサチップ相互作用の差は、糖分子に起因したものとして観測される。従って、上記測定方法を用いれば、糖分子以外の部分と、他の物質との非特異的な相互作用を低減させ、糖分子と他の物質との特異的な相互作用を観測することができる。

また、糖分子は同じであって、リンカ一化合物部分の構造が異なるリガンド複合体が固定化された 2'種類のセンサチップを用いて上記のような S P R測定を行ってもよい。この場合は、センサチップ上の糠分子の集合化度の違いによるタンパク質の結合挙動を測定することができる。このようなセンサチップのセットの例としては、上記 1番目のリガンド複合体と 3番目のリガンド複合体とのセットを挙げることができる。

さらに、上述の S P R測定によつて糖分子と他の物質との特異的な相互作用を確認した後に、 S P R測定に使用したタンパク質の結合したリガンド担持体をそのまま質量分析にかければ、センサチップと結合したタンパク質を同定することができる。上記質量分析は、マトリックス支援型レーザ脱離 Z飛行時間型質量分析計（M A L D I - T O F /M S ) などの従来公知の質量分析計を使用し、従来公知の方法に従って実施すればよい。

上述したような手順を用いれば、本発明のリガンド複合体を用いてタンパク質の分析を行うことができる。つまり、本発明のタンパク質の分析方法は、上記の本発明のリガンド複合体を、表面に金属を有する支持体と接触させることによって、当該リガンド複合体を支持体上に固定化させたリガンド担持体を作成する工程と、上記リガンド担持体を分析対象となるタンパク質を含む溶液と接触させて相互作用させた後、例えば .S P Rのような分子間相互作用の測定を行う工程と、上記分子間相互作用測定の後に質量分析を行って、上記リガンド担持体に結合しているタンパク質を同定する工程とからなるものである。

このタンパク質の分析方法においては、上述したように、種類の異なるリガンド複合体が固定化された 2.種類以上のリガンド担持体を用いてそれぞれタンパク質の分析を行って、それぞれの結果を比較検討し各タンパク質の特性を解析することができる。

ぐ実施例 >

以下、本発明のリガンド複合体の合成についてより詳細に説明する。また、本実施例では、合成したリガンド複合体を用いて S P R測定と質量分析を行い、タンパク質の分析を行った。それについても併せて説明する。

. 〔実施例 1 ：リガンド複合体（化合物 1〜 4 ) の合成〕

本実施例では、実施の形態において説明した 1〜 4番目のリガンド複合体にそれぞれ分類される 4個のリガンド複合体を合成した。

( 1 ) 1番目のリガンド複合体（化合物 1 ) の合成

上記 1番目のリガンド複合体の一つである、上記一般式（ 1 2 ) にて表される構造において、 n ¹が 1であり、 Xが一般式（ 2 ) にて表される構造を備え、 R'が水素（H) であり、 Rに上記式（ 1 8 ) で表されるマルトースが導入され、 m¹, m², m³が 2である構造を有するリガンド複合体（化合物 1 ) を以下の手順で合成した。

上記リガンド複合体（化合物 1 ) の合成の前段階として、まず、芳香族アミノ基末端が保護基によって保護された分岐鎖を 3鎖有するリンカ —化合物 Aの合成を行った。

先ず、下記式（ 2 1 ) に示すように、 6 5 °C— 7 0 °Cのジメトキシェタン中、水酸化べンジルトリメチルアンモニゥムの存在下にて、ニトロメタン（化合物 5 ) に対し、 3単位の t—ブチルァクリレート（化合物 6 ) をマイケル付加させ、 9 1 %の収率にて化合物 7を得た。次いで、水素雰囲気下（ e k g Z c m²) 、 5 0 °Cのエタノール中にて、ラネー P2005/003220

32 ニッケル（Raney Ni) を用いて、上記化合物 7のニトロ基を還元して'、 9 8 °/。の収率.にて化合物 8を得た。

その後、 CH₂C 1₂中、 1. 1当量の 1—ヒドロキシ一 7—ァザペンゾトリアゾール（式中、 HOA t ) 、 1. 1 当量の水溶性カルポジイミド塩酸塩（式中、 ED C . HC 1 ) の存在下にて、上記化合物 8に 1. 1当量の Z—グリシンを縮合させ、 8 5 %の収率にて Z—グリシン体（化合物 9 ) を得た。

•(21)

より具体的に説明すれば、上記化合物 8は、文献（G. R. Newkome'b 、 0PPI BRIEFS, 28卷， p.495， 1996) の方法に従って、まずニトロメタン（ 1 2." 2 g， 2 0 0 mm o l ) を 1， 2—ジメトキシェタン 5 0 mLに溶解して、 6 5— 7 0 °0に加熱し、 4 0 %水酸化ベンジルトリメチルアンモニゥム一メタノール溶液（ 2 mL) を加えて、ニトロメタン溶液とした。次いで、このニトロメタン溶液の温度を 7 5 °Cまで上昇させ、 t 一ブチルアタリレート（ 9 0. 8 m L , 6 2 0 mm o 1 ) をゆつくり滴下した後、溶液温度を 7 0— 7 5 °Cに保ちながら、 4 0 %水酸化ベンジノレトリメチルァンモニゥム一メタノール溶液を 1 m Lずつ 4回に分けて加えて 2. 5時間攪拌し、ニトロメタン/ tーブチルァクリレート反応溶液を得た。このニトロメタン/ t一プチルァクリレート反応溶液中の不溶物をデカンテーシヨンにより'取り除いて濃縮し、得られた残渣をジェチルエーテルに溶かして、氷冷した 1 0 %塩酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液、及び水で 2回ずつ洗浄して残渣溶液を得た。その後、乾燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて、該残渣溶液を乾燥させ、セライトを用いて該乾燥剤を除去して、減圧濃縮した後、濃縮残渣をエタノールに溶解して再結晶を行い、化合物 ₇ ( 8 1. 8 g , 9 1

%) を白色針状結晶として得た。

続いて、ィ匕合物 7の結晶（ 1 0 g , 2 2. 4 mm o 1 ) と T— 1 ラネ一ニッケル（ 6. 0 g ) とを無水エタノール 5 0 m Lに加え、 6 k g Z c m²の水素雰囲気下、 5 0°Cで 2 3時間攪拌した後、セライトを用いて T一 1 ラネーニッケルを濾去することによつて得られた化合物 7反応溶液を減圧濃縮した。この化合物 7反応溶液の減圧濃縮によって得られた濃縮残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（溶媒：クロ口ホルム/ メタノール = 2 0 / 1 ) で精製し、化合物 8 (収量 9. 2 g、収率 9 8 %) を白色固体として得た。

より具体的には、 Z—グリシン（ 1. 2 6 g , 6. 6 2 m o 1 ) と、 HOA t ( 0'· 9 0 g , 6 6 2 mm o 1 ) と、 ED C . HC 1 . ( 1. 2 7 g , 6. 6 2 mm o 1 ) とを無水ジクロロメタン（ 2 8 mL) に溶かした Z—グリシン溶液に、 0 °Cの温度条件下、化合物 8 ( 2. 5 0 g , 6. 0 2 mm o 1 ) を無水ジクロロメタン（ 2 mL) に溶かした化合物 8溶液を加えて、アルゴン雰囲気下、室温で 3 6時間攪拌して、 Z— グリシン Z化合物 8反応溶液を得た。この Z—ダリシン化合物 8反応溶液に、ジクロロメタンと 1 0 %クェン酸水溶液とを加えてジクロロメタンで抽出し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、および水で 1回ずつ洗浄し、乾燥剤として無水硫酸ナトリゥムを用いて乾燥させた後、該乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行た。この減圧濃縮によって得られた濃縮残渣をシリ力ゲルクロマトグラフィー（溶媒：ク口口ホルム ) で精製し、化合物 9 (収量 3. 0 9 g、収率 8 5 %) を白色固体として得た。

得られた上記化合物 9の E S I — M S (positive) 測定（飛行時間型質量分析計測定）を行ったところ、 mZ z (質量/電荷比） 6 2 9. 4 [(M+Na).⁺]であった。また、核磁気共鳴 H— NMR、 4 0 0 MH z , C D C 1 a ) 測を行ったところ、 S 7.37— 7.26 (5H, m, Ph) , 6.43 (1

H, bs， CONHC) , 5.38 (1H, bs， Gly-NH), 5.13 (2H， s, CH₂Ph) , 3.78 (2H, d， J = 7.7 Hz, Gly-Ct^), 2.20 (6H, t， J = 7.7 Hz, C(¾CH₂) ,

I.96 (6H, t, J = 7.7 Hz, CCH₂(¾) , 1.44 (27H， s, CH3)であった。これにより、化合物 9の構造を確認することができた。なお、化合物 9の分子質量は 6 0 6. 3 5である。

次に、下記式（ 2 2 ) にて示すように、 CH s C l aZHs O - l O Z 1 の混合溶媒中にて、トリフルォロ酢酸（以下、 T F Aと記載する）を用いて、上記化合物 9の t—プトキシカルボニル基（― C O O C ( C H ₃) ₃基；式 '（ 2 2 ) 中、 t B u ) を脱保護して、収率 9 5 %にて化合物 1 0を得た。

その後、 4. 5 当量のペンタフノレオロフェニノレジフエニルホスフエ一小（式中、 F D P P) 、 1 1 当量のジイソプロピルェチルァミン（式中、 D I P E A) 、 N, N—ジメチルホルムアミド（DMF) の存在下にて、上記化合物 1 0 と B o c基によってアミノ基が保護された m—フエ二レンジァミン誘導体（化合物 1 1 、 1 0当量）とを縮合させ、収率 9 9 %にて N— B o cァミン誘導体（化合物 1 2 ) を得た。続いて、メタノール（式中、 M e OH) 中、 P d /C (活性炭担持パラジウム）の存在下にて接触水素還元を行い、化合物 1 2に縮合した上記 Z—ダリシンのべンジルォキシカルボニル基（式中、 Z基）を脱保護して、収率 7 9 %にて化合物 1 3を得た。

すなわち、化合物 1 0を得るために、化合物 9 ( 2. 9 8 g , 4. 9 0 mm 0 1 ) をジクロロメタン（ 1 5 m L ) に溶かし、一 1 0 °Cで T F TJP2005/003220

36

A ( 1 5 m L) と水（ 1. 5 mL) とを加えた後、室温で 1. 5時間攪拌して化合物 9反応溶液を得た。該化合物 9反応溶液を減圧濃縮した後、氷浴中で濃縮残渣に p Hが 5になるまで 1 0 %水酸化ナトリウム水溶液を加え、さらに p Hが 2になるまで濃塩酸を加えて、白色固体を析出させた。得られた白色固体を水で洗浄し、化合物 1 0 (収量 2. 0 4 g 、収率 9 5 %) を白色固体として得た。

得られた上記化合物 1 0の E S I — M S (negative) 測定を行ったところ、 m/ z 4 3 7. 1 [(M- H)-]であった。また、核磁気共鳴 — NMR、. 4 0 0 MH z , d ₆— D M S O ) 測定を行ったところ、 δ 7.34 - 7.30 (6H， m, Ph, CONHC) , 7.15 (1H, s， Gly-NH) , 5.01 (2H， s, (¾P h)， 3.55 (2H, d, J = 5.9 Hz, Gly-CIL), 3.33 (3H, brs, C0₂H) , 2.1 1 (6H， m， CCH₂CH₂) , 1.81 (6H， m,

であった。これらにより、化合物 1 0の構造を確認することができた。なお、化合物 1 0の分子質量は 4 3 8. 1 6である。

また、化合物 1 1 を得るために、 m—フエ二レンジァミン（ 0. 5 0 g , 4. 6 2 mm o 1 ) をメタノール（ 3 5 mL) に溶かし、 0 °Cで（ B o c ) ₂O ( 1. 0 6 m L , 4. 6 2 m m o 1 ) とトリエチルァミン

( 0. 6 5 m L , 4. 6 5 mm o 1 ) とを加えた後、室温で 24時間攪拌して、減圧'濃縮を行った。該減圧濃縮によって得られた濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶媒：クロ口ホルム Zアセトン = 1 0 Z 1 ) で精製し、化合物 1 1 (収量6 6 5 111 _§、収率 6 8 %) を白色固体として得た。

上記化合物 1 1の. E S I — M S (positive) 測定を行ったところ、 m / z 2 3 1. 2〔（M+Na)⁺]であった。また、 ifi— NMR (4 0 0 MH z , C D C 13) 測定を行ったところ、 S 7.02 (1H， t, J = 8.0 Hz, arom atic), 6.95 (1H, bs, aromatic), 6.54 (1H, dd, J = 2.0 Hz, J = 8. 0 Hz, aromatic), 6.41 (1H， bs, CONH) , 6.35 (1H, dd, J = 2.2 Hz, J = 7.9 Hz, aromatic), 3.66 (2H, bs, Ni^) , 1.50 (9H, s， t - butyl) であった。これらにより、化合物 1 1の構造を確認することができた。なお、化合物 1 1 の分子質量は 2 0 8. 1 2である。

また、化合物 1 2を得るために、上記化合物 1 0 ( l O O m g , 2 2 8 μ m 0 1 ) 、上記化合物 1 1 (4 7 5 m g , 2. 2 8 mm o 1 ) 、 F D P P ( 3 9 4 m g , 1. O 3 mm o l ) 、及びジイソプロピルェチルァミン .（ 4 4 7 L, 2. 5 7 mm o l ) を無水ジメチルホルムアミド ( 2 m L ) に溶かし、アルゴン雰囲気下で、室温で 2 9時間攪拌した後、酢酸ェチル及び水を加えて酢酸ェチルで抽出し、有機層を 0. 5 N塩酸、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、及び飽和食塩水で 1回ずつ洗浄して、乾燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させて、乾燥反応溶液を得た。得られた乾燥反応溶液から、乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶媒：クロ口ホルム Z アセトン = 3 / 1 ) で精製し、化合物 1 2 (収量 2 2 8 m g、収率 9 9 %) を白色固体として得た。

上記化合物 1 2の E S I — M S (positive) 測定を行ったところ z 1 0 0 9ノ 5 [ (M+H) ⁺]であった。また、 ¹H— NMR ( 4 0 0 MH z ， C D C 1₃) 測定を行ったところ、 δ 8.75 (3Η, s， NHC0₂tBu) , 7.67 (3Η， s, CONHPh) , 7.30-6.95 (15H, m， aromatic, CH₂C0NH) , 6.52 (1H , bs, Gly-NH), 5.04 (2H, s， Cl^Ph) , 3.71 (2H, d, J = 5.0 Hz, Gl y-CH₂) , 2.23 (6H， m， Ci^C^CO) , 1.97 (6H， m, Cl^C^CO)， 1.47 (27H ， s， t - butyl)であった。これらにより、化合物 1 2の構造を確認することができた。なお、化合物 1 2の分子質量は 1 0 0 8. 5 0である。また、化合物 1 3は、具体的には次のようにして得た。すなわち、化合物 1 2 ( 2 0 0 m g , 1 9 8 μ m o 1 ) をメタノール（ 3 m L ) に溶解し、 1 0 % P d / C ( 6 2 . 3 m g ) を加え、水素雰囲気下、室温で 1 5時間攪拌した後、上記 P d'Z Cを濾去して、減圧濃縮を行った。該減圧濃縮によって得られた濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶媒：クロ口ホルム/メタノール = 8 / 1 ) で精製して、化合物 1 3 ( 収量 1 3 6 m g、収率 7 8 %) を白色固体として得た。

上記化合物 1 3 の E S I — M S (positive) 測定を行ったところ、 m / z 8 7 5 . 5【（M+H)⁺]であった。また、 — NMR ( 4 0 0 MH z ， C D C 1 ₃) 測定を行ったところ、 S 9.00 (3H, s， NHC0₂tBu) , 7.57 (2Η, s, Hs) , 7.35 (1H， bs， Gly-NH) , 7. 14-7.00 (15H, m， aromatic ， CH₂C0NH) , 3.21 (2H, s， Gly-(¾)， 2.26 (6H， m, (¾CH₂C0)， 2.04 ( 6H， m，

1. 5 (27H, s， t— butyl)であった。これらにより、化合物 1 3 の構造を確認することができた。なお、化合物 1 3 の分子質量は 8 7 4 . 4 6である。

さらに、下記式（ 2 3 ) にて示すように、 1 . 0当量の E D C ' H C 1、 1 . 0当量の 1 —ヒドロキシベンゾトリアゾール（式（ 2 3 ) 中、 H O B t ) 、 C H ₂ C 1 ₂中、上記化合物 1 3を、 1 . 0当量のチォクト酸（化合物' 1 4 ) と縮合させ、収率 7 5 %にてチォタト酸誘導体（化合物 1 5 ) を得た。

上記にて得られた化合物 1 5を、 C H ₂ C 1 ₂中、トリメチルシリルクロリド（式中、 TM S C 1 ) 、フエノール（P h O H) の存在する酸性条件下にて、上記 B o c基を脱保護し、芳香族ァミノ基を有する炭化水素誘導鎖を 3鎖含んでなるリンカ一化合物として、化合物 Aを得た（収率 3 2 %) 。

具体的に、化合物 1 5および化合物 Aを得るために以下の操作を行つた。

すなわち、ィヒ合物 1 5を得るために、化合物 1 4 ( 2 3. 6 m g , 1 1 4 m o 1 ) と HO B t ( 1 5. 4 m g , 1 1 4 m m o 1 ) を無水ジクロロメタン（ 2. 3 m L).に溶解し、 0 °Cの温度条件下、化合物 1 3 ( 2. 5 0 m g , 6. 0 2 mm o l ) を加えて、アルゴン雰囲気下で、遮光して室温で' 3 6時間攪拌した後、 1 0 %クェン酸水溶液とを加えてからクロロホルムで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液で洗浄し、乾燥剤として無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させた。その後、該乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、濃縮残渣をシリ力ゲルク口マトグラフィ一（溶媒：クロ口ホルム/メタノール = 4 O Z 1 ) で精製して、ィ匕合物 1 5 (収量 9 1 . O m g、収率 7 5 %) を白色固体として得た。

上記化合物 1 5の E S I — MS (positive) 測定を行ったところ、 m / z 1 0 8 5. 5 〔（M+H)⁺]であった。また、 ¹H— NMR (4 0 0 MH z , C D₃C 1 ) 測定を行ったところ、 S 9.01 (3H, bs， NHC0₂tBu) , 7. 67 (3H，. s， CONHPh)， 7.31 (1H, bs, CONHCH,) , 7.27-7.00 (12H, m， a romatic), 3.71 (2H， bs, Gly - (¾)， 3.64-3.39 (1H, m, SSCH) , 3.12- 2.99 (2H， m, (¾SS) , 2.33 (1H， m, Cj^CH₂SS)， 2.32 (6H， m, CCH^CH, CO), 2.20 (2H, m, (¾C0NHCH₂)， 2.04 (6H, m, CCHsCH^O) , 1.82-1.73 (1H, m， CH2CH₂SS), 1.62-1.47 (4H, m, Ci^ (CH₂) ₂C0NH, (CH₂) ^i^CH^O NH), 1. 7 (27H, s, t— butyl), 1.39—1.25 (2H, ra, CH₂C^ (CH₂) ₂C0NH) であった。これらにより、化合物 1 5の構造を確認することができた。なお、化合物 1 5の分子質量は 1 0 6 2. 4 9である。

また、化合物 Aを得るために、トリメチルシリルクロリド（ 0. 2 5 m L , 2. 6 4 mm o 1 ) をジクロロメタン（ 0. 4 9 m L) に溶角？し、フエノーノレ' （ 5 4 9 m g， 5. 8 3 mm o 1 ) をジクロロメタン（ 1 - 4 6 Hi L ) に溶解したフエノール溶液を加えて攪拌した後、さらに、化合物 1 5 ( 3 4. 7 m g , 3 2. 6 m o 1 ) を加え、室温で、遮光下 1. 5時間攪拌して、化合物 1 5反応溶液を得た。続いて、該化合物 1 5反応溶液にクロ口ホルムを加え、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄して、黄色固体を析出させた。析出した黄色固体を酢酸に溶解して 4 °Cまで冷却し、凝集した固体を濾別して、化合物 A (収量 7 . 9 m g、収率 3 2 %) を白色固体として得た。

上記化合物 Aの E S I — M S (positive) 測定を行ったところ、 πιΖ z 7 6 3. 6 〔（M+H)⁺]であった。また、ェ：¾一 NMR (4 0 0 MH ζ , C D C 1 a ) 測定を行ったところ、 59.57 (3H， m， CONHPh) , 7.97 (1Η ， m， C0NHCH₂) , 6.87 (6H, m， aromatic) , 6.67 (3H, d, J = 7.7 Hz, a romatic) , 6.21 (3H, d， J = 7.7 Hz, aromatic) , 4.98 (6H， bs， NH₂) ， 3.67 (2H, d， J = 5.1 Hz, Gly - (¾)， 3.56 (1H, m, SSCH), 3.16-3. 04 (2H, m, C SS) , 2.36 (1H， m， CH₂CH₂SS), 2.25 (6H， m, CCH₂CH₂C0 ), 2.19-2.07 (2H, m,

， 1.93 (6H, m， C(¾CH₂C0)， 1.8 3 (1H， m,

, 1.33 (2H， m， < ( （CH₂) ₂C0NH)であった。これらにより、化合物 Aの構造を確認することができた。なお、化合物 Aの分子質量は 7 6 2. 3 3である。

続いて、このように得られたリンカ一化合物 Aを用いて、上記一般式 ( 1 2 ) にて表される構造において、 n ¹が 1であり、 Xが一般式（ 2 ) にて表され、 m¹, m²， m³が 2である構造を有するリガンド複合体 (化合物 1 ) を下記式（ 2 4) の手順にて合成した。

ALDI-TOF/MS Exact Mass: 1740.70

m/z; 1764.41IM+Na]⁺ 式（ 24) に示すように、得られたリンカ一化合物 Aと、上記式（ 1 8 ) にて表されるオリゴ糖である市販のマルトース水和物（4. 5当量 ) とを、 H₂0/ジメチルァセトアミド '(式中、 D.MA c ) Z酢酸（ A c OH) = 1 / 1 / 0. 1の混合溶媒に溶解し、 ρ Η 4〜4 · 5、 3 7 °Cにて、シッフ塩基を形成させた後、'溶媒に A c OHを加え、 1 0当量の 9 5 %N a BH₃CNを加えて、 p H 3 ~4. 5、 3 7 °Cにて、還元アミノ化反応を行った。その後、得られた化合物を Sephadex G - 50 (ァマーシャムイォシステムズ社製）を用いて、ゲル濾過クロマトグラフィ一により精製し、さらに脱塩処理を行って、末端にひ一ダルコピラノースを 3単位含んでなるリガンド複合体として化合物 1を得た。上記化合物 1の同定は、 MA L D I — T O F/M Sおよび NMRによって行つた。

M A L D I — T O F /M Sの結果は、 mZ z ； 1764.41 [ (M+Na) ⁺]であつた。また¹ H— NMRスペクトル（ 6 0 0 M H z、 D ₂ O) 測定を行ったところ、 S 7.01 (3H， dd， J = 8.2, 8.2 Hz, aromatic) , 6.70 (3H, s， a romatic), 6.58 (3H, d， J = 8.2 Hz, aromatic) , 6.44 (3H, d, J = 8 .2 Hz, aromatic), 4.90 (3H, d， J = 3.4 Hz, H - X3), 3.79-3.73 (6H, m, H - 2X3, H - 5X3), 3.71— 3.66 (6H, m， H-3X3, H- 5， X3)， 3.64 (3H, dd, J = 2.1, 12.4 Hz, H - 6a， X3), 3.59 (3H， dd， J = 4. 8, 12.4 Hz, H - 6b' X 3), 3.59— 3.52 (3H, m， H- 6aX3), 3.54—3.51 (6H， m, H - 4X3， H - 3， X3), 3.43 (3H, dd, J = 6.9, 12.4 Hz, H - 6b X 3), 3.39— 3.34 (1H， m, CH₂CH(CH₂-) (S-) ) , 3.37 (3H， dd, J = 3.4 , 9.6 Hz, H-2' X3), 3.25 (3H, dd, J = 9.6, 9.6 Hz, H- 4， X 3) , 3 .11 (3H, dd, J = 4.8, 13.7 Hz, H— laX3), 3.01 (3H, dd, J = 7.7, 13.7 Hz, H-lbX3), 2.98- 2.86 (2H, m, -SCl^-) , 2.27— 2.23 (6H, m , -CH,CH₉C0-X3) , 2.19-2.14 (1H, m, - SCH,CH₉ (1H) -）， 2.10 (2H, ΐ, J = 7.6 Hz, -NHC0CH_?CH,-) , 1.98- 1.94 (6H, m， -CH CH,C0- X 3) , 1. 72- 1.65 (1H, m, -SCH.CH, (1H) -) , 1.43— 1.36 (2H, m, - COCH₉CH。CH。C H₂ -）， 1.39— 1.29 (2H, m， -COCH₂CH₂CH₂CH₂-) , 1.19—1.13 (2H, m, -C 0CH₂CH₂ei₂CH₂- )であった。これらの結果から化合物 1の構造を確認することができた。なお、この化合物 1の分子質量は 1 7 4 0. 7 0である

( 2 ) 2番目のリガンド複合体（化合物 2 ) の合成

上記 2番目のリガンド複合体の一つである、上記一般式（ 1 2 ) にて表される構造において、 n ¹が 1であり、 Xが一般式（ 2 ) にて表される構造を備え、 R'が水素（H) であり、 Rに上記式（ 1 9 ) で表されるラタトースが導入され、 m¹ , m²， m³が 2である構造を有するリガンド複合体（化合物 2 ) を以下の手順で合成した。

上記リガンド複合体（化合物 2 ) の合成においては、まず、リンカ一化合物 Aを、上述の 1番目のリガンド複合体の合成における手順と同じ手順で合成した。

続いて、得られたリンカー化合物 Aを用いて、上記一般式（ 1 2 ) にて表される構造において、 n ¹が 1であり、 Xが一般式（ 2 ) にて表される構造を備え、 R'が水素（H) であり、 Rに上記式（ 1 9 ) で表されるラタトースが導入され、 m ¹ , m², m³が 2である構造を有するリガンド複合体（化合物 2) を下記式（ 2 5 ) の手順にて合成した。

MALDI-TOF/MS Exact Mass: 1740.70

mfe; 176B.92[M+Na]⁺ " 式（ 2 5 )"に示すように、上記の方法で得られたリンカー化合物 Aと、上記式（ 1 9 ) にて表されるオリゴ糖である市販のラタトース水和物

(4. 5当 *) とを、 H₂〇ノジメチルァセトアミド（式中、 DMA c ) Z酢酸（A c OH) = 1 / 1 / 0. 1の混合溶媒に溶解し、 p H 4〜 4. 5、 3 7°Cにて、シッフ塩基を形成させた後、溶媒に A c OHを加え、 1 0当量の 9 5 %N a B H₃C Nを加えて、 p H 3〜4. 5、 3 7 °Cにて、還元アミノ化反応を行った。その後、得られた化合物を Sephad ex G-50 (アマ一シャムバイオシステムズ社製）を用いて、ゲル濾過ク口マトグラフィ一により精製し、さらに脱塩処理を行って、末端に /3 — ガラクトピラノースを 3単位含んでなるリガンド複合体として化合物 2 を得た。上記化合物 2の同定は、 M A L D I — T O F ZM Sおよび NM Rによって行った。

M A L D I - T O F/M Sの結果は、 m / z 1766.92 [ (M+Na) ⁺]であつた。また NMRスベクトル（ 6 0 0 M H z、 D ₂ O) 測定を行ったところ、 δ 6.99 (3Η, dd, J = 7.9, 8, 2 Hz, aromatic), 6.70 (s， 3H, aro matic),- 6.61 (3H, d， J = 7.9 Hz, aromatic), 6.43 (3H, d， J = 8.2 Hz, aromatic), 4.27 (3H， d, J = 7.6 Hz, Η- X3)， 3.90— 3.85 ( 3H, m, H - 2 X 3), 3.74- 3.70 (3H, m, H- 5， X 3), 3.69- 3.66 (3H, m, H - 4X3)， 3.68- 3.62 (3H， m， H- 6a， X 3), 3.65- 3.62 (3H， m, H- 3 X3) , 3.57 (3H, br, H - 4， X3)， 3.53 (3H， dd, J = 5.8, 11.7 Hz, H- 6b， X 3), 3.47- 3.43 (6H, m， H - 6X3)， 3.41 (3H， m, J = 3.1， 10 .0 Hz, H-3' X3), 3.38 (3H, brt， J = 5.8 Hz, H— 5X3)， 3.35 (3H， dd, J = 7.6， 10.0 Hz, H - 2' X 3)， 3.36— 3.29 (1H, m， CH₂CH(CH₂-) ( S— )), 3.12 (3H, brd, J = 10.7 Hz, H— laX3)， 2.91 (3H， dd, J = 7. 6, 12.0 Hz, H— lbX3)， 2.90- 2.83 (2H， m， -SCH₂~) , 2.23-2.16 (6H , m, — ^Cl^CO- X3), 2.18— 2.10 (1H, m, -SCH^ (1H) -) , 2.06 (2H， t, J = 5.8 Hz,

, 1.95— 1.89 (6H, m, - CH_?CHク CO - X 3)， 1.68- 1.59 (1H， m, -SCH^ (1H) -) , 1.41—1.30 (2H， m, -C0CH₂CH₂C H₂CH₂- )， 1.32— 1.22 (2H, m, - C0CH₂CH₂CH₂^ -） , 1.15- 1.08 (2H， m, -COCf^CH^^CHs -）であった。これらの結果から化合物 2の構造を確認することができた。なお、この化合物 2の分子質量は 1 7 4 0 . 7 0である。 ( 3 ) 3番目のリガンド複合体（化合物 3 ) の合成

上記 3番目のリガンド複合体の一つである、上記一般式（ 1 2 ) にて表される構.造において、 n ¹が 1であり、 Xが一般式（ 3 ) にて表される構造を備え、 R'が水素（H) であり、 Rに上記式（ 1 8 ) で表されるマルトースが導入され、 m⁴， m⁵が 2である構造を有するリガンド複合体（化合物 3 ) を以下の手順で合成した。

上記リガンド複合体 .（化合物 3 ) の合成の前段階として、まず、芳香族アミノ基末端が保護基によって保護された分岐鎖を 2鎖有するリンカ一化合物 Bの合成を行った。

下記式（ 2 6 ) にて示すように、ァミノ安息香酸（B— 1 ) のァミノ基を Boc基で保護したァミノ安息香酸誘導体（B— 2 ) とジエチレントリアミン（B— 3 ) を HOBtと EDO HC1を用いて縮合し、ジアミド体（B 一 4 ) を 7 9 %の収率で得た。 DMF中、縮合剤として FDPPを用いて、ジアミド体（B— 4 ) とアミノ基を Z基で保護したグリシン（ Z— G 1 y ) とを反応させ、（B— 5 ) を 7 5 %の収率で得た。 Z基を接触水素還元により除去して（B— 6 ) とした後、チォタト酸（B— 7 ) と縮合させ、（B— 8 ) を 9 7 %の収率で得た。最後に、 TFAによって Boc基を除去し、芳香族ァミノ基を 2単位有するリンカー化合物 Bを 9 5 %の収率で得た。 ' B-3

H

(Boc)₂O_f Et₃N HOBt, EDC-HCI

H₂N- VCOOH BocH - -COOH

eOH CH2CI2

B-l B-2

BocHN- —薦

O 5% Pd/C 儿ひ

BocHN- -NH MsO¾rt

B-5

B-

B-6

B-8

B より具体的に説明すれば、上記化合物 B— 2は、 4ーァミノ安息香酸 ( B - 1 ) (2.00 g, 14.6 mmol) をメタノール 1 4 0 m Lに溶解させ (Boc)₂0 (6.7 mL, 29.1 rtimol)とトリェチルァミン（3.06 mL、 21.9 m mol) を加えて室温で 1 6時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮し、残渣にへキサンと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（ 5 0 m L ) を加え、水層を抽出した。この水層に 1 0 %タエン酸ナトリゥム水溶液を p H = 4になるまで加え、白色の固体を析出させた。得られた固体を酢酸ェチルに溶解させ、水で洗浄した後、減圧濃縮した。残査を酢酸ェチルーへキサンで再結晶して化合物 B — 2 (3.25 g, 収率： 91.3 % ) を無色結晶として得た。

得られた上記化合物 B — 2の ¹ H— NMR ( 2 7 0 MH z , C D_sO D ) 測定を行ったところ、 δ 9· 24 (1H, s, NH) , 7.96 (2H, d, J = 8.9 H , aromatic) , 7. 55 (2H, d, J = 8.6 Hz, aromatic) , 1.56 (9H, s, t- butyl)であった。また、上記化合物 B — 2の E S I — M S (negative ) 測定を行ったところ、 m/z 236.20 [ (M - H) ]であった。これによつて化合物 B — 2の構造を確認することができた。なお、この化合物 B — 2 の分子質量は 2 3 7 . 2 5である。

続いて、上記化合物 B — 2 (1.30 g、 5.46 mmol ) 、 H O B t (0.73

8 g、 5.46 mmol ) および EDC · HC1 (1.05 g, 5.46 mmol) を無水ジクロロメタン（30mL) に溶解させ、.アルゴン雰囲気下に 0 °Cで 5 0分間攪拌した。この溶液にジエチレントリアミン（B — 3 ) (0.283mL, 2.60 mmol ) を加、遮光下に室温で終夜攪拌し、白色結晶を得た。この白色結晶を濾取した後、メタノールから再結晶して、化合物 B — 4 (1.23 g, 収率： 87.4 % ) を白色結晶として得た。

. 得られた上記化合物 B — 4の ¹ H— NMR ( 4 0 0 MH z , C D₃O D ) 測定を行ったところ、 δ 7.77 - 7.74 (4Η, d, J = 8.67 Hz, aromatic) , 7. 50-7.48 (4H， d, J = 8.57 Hz, aromatic), 3.70-3.66 (4H, ra, J = 5. 19 Hz, NCH₂CH₂NHC0) , 3.34-3； 28 (4H, m, J = 5.61 Hz, NCH₂CH₂NH CO), 1.53 (18H, s, t- butyl)であった。また、上記化合物 B— 4の E S I — MS (positive) 測定を行ったところ、 m/z 542.64 [ (M+H) ⁺]であった。これによつて化合物 B— 4の構造を確認することができた。なお、この化合物 B— 4の分子質量は 5 4 1. 6 0である。

続いて、上記化合物 B— 4 (1.03 g, 1.85 mmol) 、 Z—グリシン（0

. 30 g, 2.04 mmol) および F D P P (l.07 mg, 2.78 mmol ) を無水ジメチルホルムアミド（8 mL) に溶解した後、ジイソプロピルェチルアミン（0.36 mL, 2.78 mmol ) を加え、アルゴン雰囲気下に室温で 2 0時間攪拌した。この反応溶液を減圧濃縮して得られた残渣をク口口ホルムに溶解し、有機層を 1 0 %クェン酸、飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液で順に洗浄した後、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥させ、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（50 g, クロ口ホルム：アセトン = 1 ： 2 ) で精製して、化合物 B— 5 (1. 02 g, 収率： 75.0 % ) を白色固体として得た。

得られた上記化合物 B— 5の ¹ H— NMR ( 4 0 0 MH z , C D C 1₃

) 測定を行ったところ、 δ 7.88 (1H, bs, NHCOPh) , 7.73-7.66 (10Η, m ， NHCOPh, aromatic), 7.56 (1H, bs, NHCOPh) , 7.38 (4H， d， J = 8.4 Hz, COPhNH) , 7.34-7.29 (8H， m， aromatic), 5.37 (1H, bs, Gly-NH) ， 5.00 (2H, s, PhC¾)， 3.64 (4H, m, NCH₂CH₂NH, NC¾CH₂腿）， 3.49， . 3.47 (4H, m， NCH₂CH₂NH ), 3.43， 3.27， 3.17 (6H, bt, bt， bt， NC¾ CH₂NH )， 1.50, 1.49 (36H, s， s， t- butyl)であった。また、上記化合物 B— 5の E S I — MS (positive) 測定を行ったところ、 m/z 755.36 〔（M+Na)⁺]であった。これによつて化合物 B— 5の構造を確認することができた。なお、この化合物 B— 5の分子質量は 7 3 2. 3 2である。続いて、上記化合物 B— 5 (0.193 g, 0.264 mmol ) をメタノール（ 3 mL) に溶解し、 l O o/o P d/C (120 mg ) を加え、水素雰囲気下、室温で 3時間攪拌した後、 P ci/Cを濾去して減圧濃縮し、化合物 B— 6 (0.230 g，収率： 94.4% ) を白色固体として得た。

得られた上記化合物 B— 6の ¹ H— NMR ( 4 0 0 MH z， d ₆ - D MS O) 測定を行ったところ、 59.54 (4H, d, J = 9.5 Hz, COPhNH) , 8.58, 8.53, 8.46 (4H, bs， bs， bs， NHCOPh) , 8.10 (2H， bs， NH₂) , 7 .56 (1H, bs, NHCOPh) , 7.76-7.73 (8H， m， aromatic), 7.53-7.48 (8H ， m, aromatic), 4.39, 4.24 (4H, bs, bs, CONCH^) , 3.80 (2H, bs, C NH₂)， 3.42-3.33 (16H, ra, NCH₂(¾NH, N(¾CH₂NH ), 1.46, 1.45 (36H ， s, s, t- butyl)であった。また、上記化合物 B— 6'の E S I — M S ( positive) 測定を行ったところ、 m/z 599.33 [ (M+H) ⁺]であった。これによって化合物 B— 6の構造を確認することができた。なお、この化合物 B— 6の分子質量は 5 9 8. 3 9である。

続いて、チォクト酸（B— 7 ) (41.0 mg, 0.200 mmol ) 、 HO B t (35.0 mg, 0.200 mmol ) および EDC · HC1 (42.1 g, 0.200 mmol) をジメチルホルムアミド（3 mL) に溶解し、窒素雰囲気下に遮光して 0 °C で 1. 5時間攪拌した。次いで、上記化合物 B— 6 (0.1 g, 0.167 mmo 1 ) をジメチルホルムアミド（2 mL) に溶解して、上記のジメチルホルムアミド溶液に滴下した後、室温で 1 9時間攪拌じた。反応溶液にクロ口ホルムを加え、有機層を抽出し、この有機層を 1 0 %クェン酸水溶液と飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液とで洗浄し、無水硫酸ナトリゥムで乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。濃縮残渣をシリカゲノレクロマトグラフィー（50 g，クロロホノレム：メタノーノレ = 7 ： 1 ) で精製して、化合物 B― 8 (0.128 g, 収率： 97.0 % ) を白色固体として得た。得られた上記化合物 B— 8の ¹ H— NMR ( 4 0 0 MH z , C D C 1 ₃ ) 測定を行ったところ、 δ 7.76- 7.69 (11H, m， NHCOPh, aromatic), 7. 55 (1H, bs, NHCOPh) , 7.45-7.35 (9H, m, aromatic, COPhNH) , 7.13， 7.00, 6.97 (3H, bs, bs, bs, COPhNH) , 5.83 (1H, bs, Gly-NH), 4.04 (2H， bs, Gly- CH₂) , 3.73-3.66 (4H, m， CONCI^ )， 3.54-3.46 (11H， m, NCH₂CH₂NH, NCH^CH^H, SSCHCH₂) , 3.41, 3.29, 3.22 (6H, bs, bs, bs, N(¾CH₂NH)， 3.16-3.03 (2H， ra, CH₂SSCH) , 2.39 (1H， m， CH₂CH₂SS ), 2.02 (2H， t, J = 6.9 Hz, CH₂CH₂CH₂C0NH) , 1.84 (1H, m， CHCH₂SS) , 1.58-1.52 (4H, m, CH^H^CH^ONH, Ci^C^C^CONH ), 1.51, 1.49 (18 H， s, s, t- butyl), 1.35 (2H， m， Cj^CH^H^i^CONH)であった。また、上記化合物 B— 8の E S I — M S (positive) 測定を行ったところ、 m/ z 809.33 [(M+Na)⁺]であった。これによつて化合物 B— 8の構造を確認することができた。なお、この化合物 B— 8の分子質量は 7 8 7. 3 0 である。

上記化合物 B— 8 (0.128 g, 0.16 mmol) をジクロロメタン（1 mL) に溶解し、 T F A (2 mL) を加えて、遮光下 0 °Cで 1 . 5時間攪拌した後、減圧濃縮を行い、得られた残渣をメタノールに溶解して、 Dowex Ma rathon A (OH" form) のカラムに通して中和し、減圧濃縮し、化合物 B (89.3 mg, 収率： 95.2 % ) を黄色固体として得た。

得られた上記化合物 Bの ¹ H— NMR ( 4 0 0 MH z , d ₆ - DM S

O) 測定を行ったところ、 S 8.20, 8.07 (2H, ra， NHCOPh) , 7.83 (1Η, t, J = 5.5 Hz, Gly-NH) , 6.51-6.48 (8H, m， aromatic) , 5.57 (8H， d ， J = 14.3 Hz, PhNHg), 4.34, 4.12 (4H, bs, bs, C0NCH₂) , 3.82 (2H ， bs, Gly- CH₂), 3.64-3.55 (1H， m， SSCHCH₂) , 3.50-3.32 (16H， ban d， NCHaCI^NH, NCH₂CH₂NH) , 3.18-3： 04 (2H， m， CH₂SSCH) , 2.38 (1H， m ,

, 2.02 (2H， t, J = 7.1 Hz, CH₂CH₂CH₂C0NH) , 1.85 (1H, m , CH^SS), 1.57-1.47 (4H， m，〇Η₂(¾〇Η₂〇0ΝΗ, CH^CH^HaCH^ONH) , 1. 35 (2H, m, Cl2CH₂CH₂C0NH)であった。また、上記化合物 Bの E S I — M S (positive) 測定を行ったところ、 m/z 587.24 [ Οί+Η) ⁺]であった。これによつて化合物 Βの構造を確認することができた。なお、この化合物 Βの分子質量は 5 8 6. 2 4である。

続いて、得られたリンカー化合物 Βを用いて、上記一般式（ 1 2 ) にて表される構造において、 η ¹が 1であり、 Xが一般式（ 3 ) にて表される構造を備え、 R'が水素（Η) であり、 Rに上記式（ 1 8 ) で表されるマルトースが導入され、 m⁴, m ⁵が 2である構造を有するリガンド複合体（化合物 3 ) を下記式（ 2 7 ) の手順にて合成した。

MALDI-TOF/MS Exact Mass: 1238.48 --. (27)

Mol, Wt; 1239.36 式（ 2 7 ) に示すように、上記の方法で得られたリンカー化合物 Bと、上記式（ 1 8 ) にて表されるオリゴ糖である市販のマルトース水和物

( 4. 5当量）とを、 H₂0ノジメチルァセトアミド（式中、 DMA c ) Z酢酸（A c O H) = 1 / 1 / 0. 1の混合溶媒に溶解し、 p H 4〜 4. 5、 3 7 °Cにて、シッフ塩基を形成させた後、溶媒に A c OHを加え、 1 0当量の 9 5 %N a BH₃CNを加えて、 p H 3〜4. 5、 3 7 °Cにて、還元アミノ化反応を行った。その後、得られた化合物を Sephad ex G-50 (アマ一シャムバイオシステムズ社製）を用いて、ゲル濾過ク口マトグラフィ一により精製し、さらに脱塩処理を行って、末端にひ一ダルコビラノースを 2単位含んでなるリガンド複合体として化合物 3を得た。上記化合物 3の同定は、 MA L D I — T O Fノ M Sおよび NMR によって行った。

MA L D I — T O F_ M Sの結果は、 m/ z 1239.36 [ (M+H) ⁺]であつた。また¹ H— NMRスペクトル（ 6 0 0 MH z、 D ₂〇）測定を行っところ、 57.39 (2H， d， J = 8.2 Hz, aromatic), 7.38 (2H, d， J = 8.2 H z, aromatic), 6.56 (2H, d， J = 8.2 Hz, aromatic) , 6.55 (2H, d, J = 8.2 Hz, aromatic), 4.91 (2H, d, J = 3.4 Hz, H - Γ X2), 3.84 ( 2H, s, -NHC0CH₉NH-) , 3.83- 3.78 (2H, m, H - 2X2)， 3.75 (2H, dd, J = 4.1， 6.9 Hz, H - 5 X 2) , 3.72 (2H， dd, J = 2.7, 4.8 Hz, H - 3 X 2)， 3.69 (2H， dd, J = 4.1, 4.8 Hz, H - 4X2), 3.69— 3.66 (2H, m， H - 5 X2)， 3.64 (2H， dd, J = 2.1, 12.4 Hz, H - 6a， X2), 3.58 (2H， dd, J = 4.8, 12.4 Hz, H - 6b， X2), 3.55—3.51 (2H, m, H - 6aX2), 3.53 (2H, dd, J = 8.9. 9.6 Hz, H-3， X2), 3.47— 3.40 (8H， m， -C0NHCH, CH₂N- X 2) , 3.44-3.41 (2H, m, H- 6bX2)， 3.37 (2H， dd, J = 3.4， 9 .6 Hz, H-2' X2)， 3.37— 3.30 (1H， m， CH₂CH(CH₂-) (S -））， 3.23 (2H, • dd, J = 8.9， 10.3 Hz, H-4' X 2)， 3.20 (3H， dd, J = 4.8, 13.7 Hz ， H - laX2) , 3.12 (2H， dd, J = 8.2, 13.7 Hz, H - lbX2), 3.00-2.89 (2H， m, -SCH2-), 2.22—2.15 (1H, m, -SCH₂CH₂ (1H) -) , 1.98 (2H， t， J = 6.9 Hz, - NHC0CH— ₂CH₂ -）， 1.72- 1.64 (1H， m， -SCH₂CH₂ (1H) -) , 1. 45— 1.37 (1H, m， - C0CH₂CH₂CH （1H) -）， 1.35— 1.23 (3H， m, - C0CH₂ CH₂CH₂CH₂-_; -C0CH₂CH₂CH₂CH₂(1H)-) , 1.09— 1.02 (2H, m, - COCH CH₉CH₉C H₂ -）であった。これらから結果から化合物 3の構造を確認することができた。なお、この化合物 3の分子質量は 1 2 3 8. 4 8である。

(4 ) 4番目のリガンド複合体（化合物 4 ) の合成

上記 4番目のリガンド複合体の一つである、上記一般式（ 1 2 ) にて表される構造において、 n ¹が 1であり、 Xが一般式（ 3 ) にて表される構造を備え、 R'が水素（H) であり、 Rに上記式（ 1 9 ) で表されるラタトースが導入され、 m⁴, m⁵が 2である構造を有するリガンド複合体（化合物 4 ) を以下の手順で合成した。

上記リガンド複合体（化合物 4 ) の合成の前段階として、まず、芳香族ァミノ基末端が保護基によって保護された分岐鎖を 2鎖有するリンカ一化合物 Bの合成を上記のように行った。続いて、得られたリンカ一化合物 Bを用いて、上記一般式（ 1 2 ) にて表される構造において、 n ¹ が 1であり、 Xが一般式（ 3 ) にて表される構造を備え、 R'が水素（ H) であり、 Rに上記式（ 1 9 ) で表されるラクトースが導入され、 m ⁴, m⁵が 2である構造を有するリガンド複合体（化合物 4 ) を下記式 ( 2 8 ) 手順にて合成した。

4

ALDI-TOF/MS Exact Mass: 1238.48

m/z = 1261,15【M+Na] 式（ 2 8) に示すように、上記の方法で得られたリンカー化合物 Bと、上記式（ 1 9 ) にて表されるオリゴ糖である市販のラクトース水和物

(4. 5当量）とを、 H₂O/ジメチルァセトアミド（式中、 DMA c ) ノ酢酸（A c OH) = 1 / 1 / 0. 1の混合溶媒に溶解し、 p H 4〜 4. 5、 3 7 °Cにて、シッフ塩基を形成させた後、溶媒に A c OHを加え、 1 0当量の 9 5 %N a BH₃CNを加えて、 p H 3〜4. 5、 3 7 °Cにて、還元アミノ化反応を行った。その後、得られた化合物を Sephad ex G-50 (アマ一シャムバイオシステムズ社製）を用いて、ゲル濾過ク口マトダラライ一により精製し、さらに脱塩処理を行って、 .末端に） 3— ガラクトピラノースを 2単位含んでなるリガンド複合体として化合物 4 を得た。上記化合物 4の同定は、 MAL D.I — T O F/MSおよび NM Rによって行った。

MA L D I — T O F /M Sの結果は、 m/ z 1261.15 [ (M+Na) ⁺]であつた。また¹ H— NMRスペクトル（ 6 0 0 MH z、 D ₂0) 測定を行ったところ、 δ 7.40 (2H， d， J = 8.9 Hz, aromatic) , 7.39 (2H， d, J = 8.9 Hz, aromatic) , 6.59 (2H, d J = 8.9 Hz, aromatic) , 6.58 (2H, d J = 8.9 Hz, aromatic), 4.30 (d 1H, J = 7.6 Hz, H - 1' ) , 4.29 (1 H, d, J = 7.6 Hz, Η-Ϊ" ) , 3.93— 3.89 (2H, m H - 2X2)， 3.84 (2H, s, - CONHCH NH -） , 3.74—3.71 (2H, m, H - 5 X2)， 3.71— 3.69 (4H m H - 4X2 H- 4 X2)， 3.69- 3.66 (2H, m, H - 3X2)， 3.65 (2H, dd J = 3.0 11.7 Hz, H-6a' X 2) , 3.53 (2H, dd, J = 5.5, 11.7 Hz, H - 6 b X2)， 3.48- 3.42 (12H, m, H - 5X2 H - 3 X2 -CONHCH₉CH₉N- X 2) , 3.41-3.39 (4H m, H-6X2), 3.37— 3.32 (1H m, CH₂CH(CH₂-) (S-)) 3.35 (2H, dd, J = 7.6, 8.9 Hz, H - 2 X2)， 3.23 (2H dd, J = 4. 1, 13.7 Hz, H-laX2), 3.04 (2H, dd, J = 7.6 13.7 Hz, H - lbX2)， 3.01-2.90 (2H m, -SCH_?-), 2.23— 2.16 (1H, m - SCH^L (1H) -）， 1. 99 (2H, t J = 6.9 Hz, -NHC0CH₉CH -) , 1.73— 1.66 (1H, m, -SCH₉CH₉ (1H) -）， 1.46— 1.39 (1H m, - C0CH CH CH CH₉ (1H) -） , 1.35— 1.30 (1H, m, -C0CH,CH₉CH₉CH,(1H)-) , 1.32- 1.26 (2H m, -COCH^CH^H^) , 1 .11-1.04 (2H m - COCH₂CH₂ei2CH₂-)であった。これらの結果から化合物 4の構造を確認することができた。なお、この化合物 4の分子質量は 1 2 3 8. .4 8である。

〔実施例 2 S P R測定と質量分析によるタンパク質の分析〕実施例 2では、実施例 1にて作製した各リガンド複合体（化合物 1 4 ) を用いて、タンパク質の糖鎖との結合特性について、 S P R測定および質量分析によつて解析した。その手順について以下に説明する。 • 図 1には、本実施例におけるタンパク質の分析の手順を工程 1〜工程 1 2 として示す。図 1において、工程 1〜工程 7は、各リガンド複合体 (化合物 1 4 ) を、金（A u ) でコーティングされた支持体表面に固定化させてリガンド担持体（センチップ）を作製する工程である。そして、上記リガンド担持体を、分析対象となるタンパク質を含む溶液と接触させる工程 8 の後に実施される工程が、 S P R測定を行う工程である。さらに、支持体表面を水で洗う工程 1 0の後に実施される工程が、質量分析（M S ) によってタンパク質を同定する工程である。

本実施例において、 S P R測定は日本レーザ電子社製の S P R— 8 B を用いて行った。また、質量分析はアプライドバイォ社製のマトリックス支援型レーザ脱離/飛行時間型質量分析計（MA L D I 一 T O F /M S ) である Voyager RP—DEを用レヽて行った。

分析に用いたタンパク質は、ダルコビラノース結合性のレクチンタンパク質として C o n c a n a v a 1 i n A ( C o n Aと略記する ) 、

P S A、 L C A、および、ガラクトピラノース結合性のレクチンタンパク質として R C A、 P NAの 5種類であった。そして、ネガティブコントロールとしてゥシ血清アルブミン（B S A) を用いた。

まず、図 1に示す工程 1〜工程 7に基づいて、上記化合物 1〜 4をそれぞれ固定化した 4種類のリガンド担持体を作製した。続いて、上記の 5種のレクチンタンパク質および B S Aを、それぞれ P B Sバッファーに溶解してタンパク質溶液を調製した。その後、図 1に示す工程 8を行い、各リガンド担持体と各タンパク質溶液とをそれぞれ接触させて相互作用させた。続いて、 S P R測定を行い、リガンド担持体とタンパク質との結合測定を行った。

a—ダルコピラノースを固定化したリガンド担持体（センサチップ）を用いたレクチンタンパク質の結合挙動の結果を図 2、図 3および表 1 に示した。図 2には化合物 3 (Di-valent type) のリガンド複合体を固定化したセンサチップの結果を示し、図 3には化合物 1 (Tri- valent t ype) のリガンド複合体を固定化したセンサチップの結果を示した。図 ) は C o n Aの結合挙動結果、（b ) . は

は L C Aの結合拳動結果を示している。

K_D :解離常数 M)

k_a:結合速度常数（wrV¹xio⁴)

：解離速度常数(3-¹ 10¹) 図 2および図 3から明らかなように、 C o n Aおよび P S Aについては、リガンド複合体のリンカ一部分の構造の違いによらず同様の結合挙. 動を示した。しかし、 L C Aについては、 3単位の糖分子を有するリガンド複合体である化合物 1 とは結合することが示された、 2単位の糖分子を有するリガンド複合体化合物 3 とは結合しないことが示された。図には示していないが、ネガティプコントロールである B S Aは化合物 1または 3 固定化したチップには結合しないことが分った。

また、.表 1には、それぞれのタンパク質の結合拳動をまとめた。 αグルコース結合性のレクチンタンパク質に、特異的結合が観測され、' 結合 '定数の算出も可能であった。 Di- valentリガンド結合体を用いた場合よりも、 Tri- val entリガンド結合体を用いた場合の方が解離定数（K _D ) が同等または小さく算出されており、 1つのリガンド複合体当たりの糖鎖の数が増えることによって、結合活性が上昇していることが明らかと TJP2005/003220

59 なつた'。

β —ガラクトビラノースを固定化したリガンド担持体（センサチップ ) を用いたレクチンタンパク質の結合挙動の結果を図 4、図 5および表 2に示した。図 4には化合物 4 (.Di-valent type) のリガンド複合体を固定化したセンサチップの結果を示し、図 5には化合物 2 (Tri-valent type) のリガンド複合体を固定化したセンサチップの結果を示した。図 4およぴ図 5 とも、（ a ) は R CAの結合挙動結果、（b ) は P NA の結合挙動結果を示している。

K_D:解離常数（/zM)

'結合速度常数（ 3-¹ 10⁴)

：解離速度常数(3-¹ 10¹)

*1：蛋白質濃度に依存しない

非特異的吸着が観測された図 4および図 5から明らかなように、 R C Aおよび P N Aはリガンド複合体のリンカ一部分の構造の違いによらず同様の結合挙動を示した。図には示していないが、ネガティブコトロールである B S Aは化合物 2または 4を固定化したチップには結合しないことが分った。

また、表 2には、それぞれのタンパク質の結合挙動をまとめた。 jSガラクトース結合性のレクチンタンパク質に、特異的結合が観測され、結合定数の算出も可能であった。なお、 C o n Aについては化合物 3を用いて作成したチップにおいて、タンパク質の濃度に依存しない非特異的な結合挙動が観測された。 Di- valentリガンド結合体を用いた場合よりも、 Tri- valentリガンド結合体を用いた場合の方が解離定数（K _D ) が同等または小さく算出されており、 1つのリガンド複合体当たりの糖鎖の数が増えることによって、結合活性が上昇していることが明らかとなつた。

以上の結果から、糖鎖の集合化度によってタンパク質の糖鎖に対する結合活性が異なる場合があることが明らかとなり、レクチンタンパク質の糖鎖結合特性もこの系によって測定することが出来ることが示されたさらに、この S P R測定に供したリガンド担持体のうち、タンパク質との結合が確認されたものについては、工程 9および工程 1 0を行った後、質量分析計に供することで、リガンド担持体に結合しているタンパク質の同定を行った。なお、質量分析を行う際には、結合測定を行った部分にマトリックス溶液（飽和 a C H C Aまたはシナピン酸）を乗せ、乾燥させてから質量分析計に供し、分子質量の測定を行った。

上記の一連の工程で、リガンド担持体とタンパク質との結合拳動を確認した後、工程 1 1においてリガンド担持体とタンパク質との結合を解離させた後、工程 1 2において P B Sバッファーで洗浄を行った。その後、別のタンパク質溶液を用いて、再度工程 8〜工程 1 0までを繰り返し、 S P R測定および質量分析を行った。この作業を各リガンド担持体および各タンパク質について繰り返し実施した。

質量分析の結果を図 6およぴ表 3に示した。図 6 ( a ) には C o n A の分析結果を示し、図 6 ( b ) には P N Aの分析結果を示した。

図 6 ( a ) およぴ図 6 (b ) から明らかなように、それぞれのタンパク質を構成するサブュニットの分子貧量に相当する 1価と 2価のイオンピークが観測された。

また、表 3には他のレクチンタンパク質の結果も合わせてまとめた。各々のレクチンタンパク質のサブユニットの 1価または 2価の分子質量に近いイオンピークが観測された。ただし、 R C Aについてはサブニットの分子質量が 3万ダルトン以上と大きいために、用いた質量分析計ではそのイオンピークを検出することは出来なかった。より高性能な M AL D I — TO F/MS機器を用いれば検出は可能であろう。

この質量分析の結果、 R CAを除いて、結合した各々のレクチンタンパク質に相当する分子量が観測され、 .レクチンタンパク質の同定に成功した。

以上のように、本実施例の結果から、本発明にかかるリガンド複合体を用いて S P R測定および質量分析を行ってタンパク質の分析を行えば、タンパク質を正確に同定することができることが確認された。また、本実施例の結果から、末端に同じ糖鎖を有しているリガンド担持体であつても、糖鎖の集合化度の差によってタンパク質との結合活性が異なることが確認された。つまり、本発明のタンパク質の分析方法は、糖鎖の集合化度とタンパク質の結合活性との関係の解析にも利用することができると考えられる。このような糖鎖の集合化度とタンパク質の結合活性との関係の解析は、既存の方法では判別不可能であるため、本発明の有用性をより高めるものと言える。

〔実施例 3 ：リガンド複合体（化合物 2 1、 2 2 ) の合成〕

本実施例では、実施の形態において説明した 5番目および 6番目のリガンド複合体に分類されるリガンド複合体を合成した。すなわち、 5番目のリガンド複合体である上記一般式（ 1 3 ) にて表される構造において n ²が 4であり、上記 Xが一般式（4) にて表される構造を備え、 R ，が水素（H) であり、 Rにグルコースが導入された構造を有するリガンド複合体 (化合物 2 1 ) 、および、 6番目のリガンド複合体である上記一般式（ 1 3 ) にて表される構造において n ²が 4であり、上記が一般式（4 ) にて表される構造を備え、 R'が水素（H) であり、にマルトースが導入された構造を有するリガンド複合体（化合物 2 2 ) を以下の手順で合成した。

〔測定方法、試薬等〕

1 H - NMR トルの測定には、 JE0L-Delta600 Spectrometerを用いた。化学シフトは、 CDC1₃ の場合はテトラメチルシラン（0.00 ppm 2005/003220

63

) を基準物質にして δ値で表した。 D₂0の場合は DH0 (4.65 ppm)- を基準物質にして δ値で表した。質量分析は PerSeptive Biosystem Mariner™ Biospectrometry Workstationを用レヽて則定した。シリカゲノレカラムク口マトグラフィ一は、 Silicagel 60 (Merck, 0.040-0.063 mm) を用いて行つた。薄層クロマトグラフィ一は Precoated Silicagel 60 F254 (M erck_N 0.5 mm) を使用した。全ての試薬、脱水溶媒は関東化学株式会社製のものを購入して使用した。

( 1 ) 化合物 1 6の合成

以下、式（ 2 9 ) にしたがって説明する。

16 17

thiociicacid

18

まず、式（ 2 9 ) の化合物 1 6を以下の手順で合成した。 ' . ビス [2- (2-ヒドロキシエトキシ）ェチル]エーテル（14.57 ml, 80 mmo 1) と BF₃ · Et₂0 (252 ml，. 2 mmol) を無水ジクロロメタン 50 ml に溶解し、 0 °Cでジァゾ酢酸ェチル（1.8 ml, 17.35 mmol) を滴下した後、室温で 70 分間攪拌した。反応溶液に飽和塩化アンモニゥム水溶液 20 ml を加え、ジクロロメタンで抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、濃縮残渣をクロマトグラフィー（600 g 、へキサン：酢酸ェチル = 1 : 3 ) で精製してェチル化体化合物（2. 26 g，収率： 47%) を無色液体として得た。

上記のェチル体化合物（2. 15 g, 7. 66 mmol ) と DMAP (41. 7 mg, 337 mmo l) を無水ピリジン 8ml に溶解した。この溶液に 0 °Cで p-トルエンスルホン酸クロリド（1. 75 g， 9. 19mmol) を無水ジクロロメタン 8 ml に溶解した溶液を滴下し、室温で 3時間攪拌した。反応溶液にジクロロメタンと氷水を加えてジクロロメタンに抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で 1回ずつ洗浄し、無水硫酸マグネシゥムで乾燥した。。乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、濃縮残渣をクロマトグラフィー（100 g 、クロ口ホル Λ : アセトン = 4 ： 1 ) で精製してトシル体化合物（2. 59 g, 収率： 78%)を黄色液体として得た。

上記のトシル体化合物（1. 01 g， 2. 31 mmol) とアジ化ナトリウム（1. 53 g， 2. 31 mmol) を無水ジメチルホルムアミド 50 ml に溶解し、遮光して 1 2 0 °Cで窒素雰囲気下 1 0時間攪拌した。反応溶液をクロロホルムで抽出し、水、飽和食塩水で有機層を 1回ずつ洗浄し、無水硫酸マグネシゥムで乾燥した。乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、濃縮残渣をクロマトグラフィー（10 g 、クロ口ホルム：アセトン = 2 ： 1 ) で精製してアジド体化合物（638 mg, 収率： 90°/。）を黄色液体として得た。

上記のアジド体化合物（614 mg, 2. 01 mmol) をメタノール 24 ml に溶解し、遮光下 0 °Cで IN NaOH 4. 3 ml を加えた後、室温で 2 1時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、濃縮残渣にクロ口ホルムを加えた後、 1 N HC1 を pH = 2 になるまで加え、クロ口ホルムで抽出した。有機層を飽和食塩水で 1回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥剤を濾去して減圧濃縮し、化合物 1 6 (549 mg，収率： 90%) を無色液体とし 5003220

て得た。

この化合物 1 6について ¹ H— NMR ( 4 0 0 MH z , C D C 1 ₃) 測定を行ったところ、 56.19 (1H， bs, C0₂H) , 4.16 (2H, s， OCl^CO^) ， 3.75-3.64 (12H, m, OC^C^O) , 3.68 (2H， m, N₃CH₂CH₂) , 3.41 (2H, t, J = 5.1 Hz, Ν₃(¾₂)であった。また、上記化合物 6の E S I — M S (negative) 測定を行ったところ、 m/z 328.14 [ (M+Na) ⁺]であった。これによって化合物 6の構造を確認することができた。なお、この化合物 1 6の分子質量は 2 7 7. 1 3である。

( 2 )· 化合物 1 7の合成

化合物 1 6 (228 mg, 0.823 mmol)を無水ジクロロメタン（4 ml') に溶解し、室温、画 t (135 mg, 0.987mmol) 、 EDC - HC1 (192 mg, 0.987 mmol) 、化合物 1 1 (205 mg, 0.987 mmol)を 0 。 Cで順に加え、遮光下 2 0時間攪拌した。この反応溶液を減圧濃縮して得られた濃縮残渣をク口口ホルムで抽出し、有機層を 10% クェン酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で 1回ずつ洗浄して、乾燥剤として無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。減圧濃縮によって得られた濃縮残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（80 g，クロ口ホルム：メタノール = 10 ： 1) で精製して、化合物 1 7 (367 mg, 収率： 95 %) を黄色オイル状物質として得た。この化合物 1 7の E S I — M S (p ositive) 測定を行ったところ、 m/z 490.24 [ (M+Na) ⁺]であった。これによって化合物 3の構造を確認することができた。なお、この化合物 1 '7の分子質量は 4 6 7. 2 4である。

( 3 ) 化合物 1 8の合成

化合物 1 7 (29 rag, 0.062 mmol) をメタノール（3 ml) に溶解し、 1 0% Pd/C (5.0 mg) を加え、水素雰囲気下、室温で 9時間攪拌した。上 05003220

66 . 記 Pd/Cを濾去して濾液を減圧濃縮した。得られた濃縮残渣をシリ力ゲルクロマトグラフィー（1.5 g，クロ口ホルム：メタノール = 7 ： 1) で精製して、化合物 1 8 (22 mg, 収率： 82%) を黄色オイル状物質として得た。この化合物 1 8の E S I — M S (positive) 測定を行ったところ、 m/z 442.27 [ (M+H) ⁺]であった。これによつて化合物 1 8の構造を確認することができた。なお、この化合物 1 8の分子質量は C₂₁H₃₅N₃0₇ ： 4 4 1 . 2 5である。

( 4 ) 化合物 1 9の合成

チォクト酸（12.6 mg, 0.061 mmol) を無水ジメチルホルムアミド（2 ml) に溶解し、アルゴン雰囲気下、 HOBt (8.3 mg, 0.061 mmol) 、 EDC • HC1 (11.8 mg, 0.061 mmol) を順に加え、遮光下室温に戻して 2時間攪拌した。化合物 1 8 (22.4 mg、 0.051 mmol) を無水ジメチルホルムアミド（2 ml) に溶解して加え、室温で遮光下 1 日撹拌した。反応液にトルエンを加えて、濃縮し、有機層を 1 0 %クェン酸、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。得られた濃縮残渣をシリカゲノレカラムクロマトグラフィー（ 3 g、クロロホノレム：メタノーノレ = 10 ： 1) で精製し、化合物 1 9を黄色の油状物として得た。収量は 27 mg ( 84%) であった。この化合物 1 9の E S I — M S (positive) 測定を行つたところ、 m/z 652.28 [ (M+Na) +]であった。これによつて化合物 1 9 の構造を確認することができた。なお、この化合物 1.9の分子質量は 6 •2 9 · 2 8である。

( 5 ) 化合物 2 0の合成

化合物 1 9 (31 mg, 0.050 mmol) をジクロロメタン（2 ml) に溶解し、 0°Cで TFA (147 μ 1) を加え、 '同温で 3時間攪拌した。反応溶液を濃 05003220

67 縮後、トルエンで共沸した。得られた濃縮残渣をジクロ口メタ.ンに溶解し、トリェチルァミン水溶液を加えて、水相の pHを 8 とした後、有機相を無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。得られた濃縮残渣をシリ力ゲルカラムクロマトグラフィ一（10g、クロ口ホルム：メタノール = 5 : 1) で精製し、ィ匕合物 2 0を黄色の油状物として得た。収量は 26.1 mg (59%) であった。この化合物 2 0について¹ H—NMRスぺクトル（600 MHz, CDC1₃) 測定を行ったところ、 δ 7.17 (s， 1H， aromatic), 7.1 (dd， 1H, J = 8.6, 8.3 Hz aroma tic), 6.91 (d， 1H, J = 8.2 Hz aromatic) 6.45 (d, 1H, J = 8.2 Hz aromatic) 4.1 (s， 2H, -0CH₂C0NH-) , 3.78- 3.49 (m, 15H, ethylene glycol chain, CH₂CH(CH₂-) (S-)), 3.41 (q, 2H, J = 5.5 Hz, -CONHCH^ CH₂0— ), 3.16 (m, 1H， - S^ lH)— )， 3.08 (m， 1H, -SCH (1H)-), 2.46 — 2.44 (m， 1H, -SCH^ (1H) -) , 2.13—2.10 (t， 2H, J = 7.6 Hz, — N HCOCH^CH^) , 1.92— 1.88 (m, 1H， -SCH₂CH₂ (1H) -) , 1.43- 1.40 (m 4H, -C0CH₉CH₉CH CH₉-) , 1.26— 1.24 (m, 2H, -C0CH,,CH,CH₉CH₉-)であった。また、化合物 2 0の E S I -MS (positive) 測定を行ったところ、 m/ z 552.31 〔（M+Na)⁺]であった。以上から化合物 2 0の構造を確認することができた。なお、この化合物 2 0の分子質量は 5 2 9. 2 3である。

( 6 ) ·リガンド複合体（化合物 2 1 ) の合成

以下、式（ 3 0 ) にしたがって説明する。

21 (30) 化合物 2 0 (15.5 mg, 29.3 μ mol) とグルコース（5.8 mg, 32.2 μ mol) を DMAc/水（1:1, 1 ml) に溶解し、酢酸（200 μ 1) を加え、 ³7°C で 2日放置した。反応液にシァノ水素化ホウ素ナトリウム（⁵.5 mg， 87. 9 μ mol) を加え、 37°Cでさらに 6日間放置した。反応液を濃縮した。得 'ちれた残渣は、 0DSカラムクロマトグラフィー (Chromatorex 0DS, 30g，メタノール/水 = 50/50) によって精製した。化合物 2 1は白色の固体として得られた。収量は 4.54 mg (22%) であった。

この化合物 2 1について¹ H-NMRスぺクトル（600 MHz, D₂0) 測定を行つたところ、 δ 7.17 (s, 1H， aromatic), 7.1 (dd, 1H， J = 8.6, 8.3 Hz aromatic), 6.91 (d, 1H， J = 8.2 Hz aromatic) 6.45 (d， 1H， J =

8.2 Hz aromatic) 4.1 (s， 2H, -OCH^CONH-) , 3.80- 3.76 (m, 1H, H - 2)， 3.68- 3.35 (m, 19H, ethylene glycol chain, H - 3， H- 6a, H - 5， H - 4， H - 6b)， 3.20,-3.10 (m, 2H, H - 1 - a， CH₂CH(CH₂-) (S-)), 3.05 - 2.94 (m， 1H ,Ή-lb, -SC^), 2.28- 2.23 (m, 1H， -SCH₂CH2 (1H) -) , 2.13-2.10 (t， 2 H， J = 7.6 , 6.9Hz, -NHC0CH_?CH_?-), 1.78— 1.69 (m, 1H, -SCH,CH_?(1H )- )， 1.53- 1.36 (m 4H, -C0CH,CH₇CH_?CH₉-) , 1.20- 1.10 (m, 2H， -C0CH ₂CH₂^₂CH₂ -）であった。 MALDト T0F - MS測定を行ったところ、 m/z 694.66 ' 〔(M+H)+]であった。これらによって化合物 2 1 の構造を確認することができた。なお、この化合物 2 1の分子質量は 6 9 3. 3 0である。 2005/003220

69 リガンド複合体（化合物 2 2 ) の合成

式（ 3 1 ) にしたがって説明する。

22 (31). ィ匕合物 2 0 (9.0 mg, 17.0 μ mol) とマルトース（5.8 mg, 17.0 μ m ol) をメタノール/水（1:1， 1 ml) に溶解し、酢酸（50 μ 1) を加え、 37°Cで 24時間放置した。反応液に酢酸（450 μ 1) とシァノ水素化ホゥ素ナトリウム（3.2 m_g， 51.0 mol) を加え、 37°Cでさらに 120時間放置した。反応液を濃縮した。得られた残渣は、 0DSカラムクロマトグラフィー（Chromatorex 0DS, 30g, メタノール/水 = 50/50) によって精製した。化合物 2 2は白色の固体として得られた。収暈は 2.36 mg (16 %) であった。

• この化合物 2 2について¹ H-薩 Rスぺクトル（600 MHz、 D₂0) 測定を行つたところ、 5 7.07—7.04 (t， 1H, J = 8.2', Hz, aromatic), 6.76 (s，

1H, aromatic) , 6.63 (d, 1H， J = 8.2 Hz, aromatic), 6.48 (dd, 1H , J = 2.1, 6.2 Hz, aromatic), 4.91 (d, 1H， J = 4.1 Hz, H— 1), 4.1

(s, 2H, -OCHpCONH-) , 3.82- 3.78 (m， 1H， H - 2)， 3.75 - 3· 34 (m， 24H, e •thylene glycol chain H - 2，， H - 5，， H - 5, H - 6' a, H - 6， b, H - 6a, H - 6b, H-3, H— 3， , H-4' ) 3.25 (m, 1H, CH₂CH(CH₂-) (S-)), 3.18-3.11 (m ， 3H， HI' b，

, 2.29- 2.20 (m， 1H, -SGH₂CH₂(1H)-), 2.05— 1.96 (t， 2H, J = 7.6, 6, 9 Hz, -NHC0CH2CH₂-) , 1.76— 1.69 (m, 1H - SCH^ (1H) -）， 1.52—1.31 (m 4H -C0CH CH₉CH_?CH_?-) , 1.18—1.10 (m 2H, - COCH CH₉CH CH₉ -）であつた。 MALDI- TOF- MS測定を行ったところ、 m/z 878.39 [ (M+Na) +]であった。これらによって化合物 2 2の構造を確認することができた。なお、この化合物 2 2の分子質量は 8 5 5. 3 5である。

〔実施例 4 ：リガンド複合体（化合物 2 6 2 7 ) の合成〕

本実施例では、実施の形態において説明した 7番目および 8番目のリガンド複合体に分類されるリガンド複合体を合成した。すなわち、 7番目のリガンド複合体の一つである 5番目のリガンド複合体の一つである上記一般式（ 1 4 ) にて表される構造において η ¹が 3であり、上記 X が一般式（4 ) にて表される構造を備え、 R'が水素（Η) であり、 R にグルコースが導入された構造を有するリガンド複合体（化合物 2 6 )

、および、 8番目のリガンド複合体の一つである上記一般式（ 1 4 ) にて表される構造において η ¹が 3であり、上記 Xが一般式（4 ) にて表される構造を備え、 R'が水素（Η) であり、 Rにマルトースが導入された構造を有するリガンド複合体（化合物 2 6 ) を以下の手順で合成した。

なお、測定方法、試薬等については、上記実施例 3に記載のものと同じである。

( 1 ) 化合物 2 4の合成

以下、式（ 3 2 ) にしたがって説明する。 7

γ —メルカプト酪酸の 2量体（化合物.2 3 ) (344 mg, 1.44 mmol) を無水ジクロロメタン（25 ml) に溶解し、室温、アルゴン雰囲気下で H OBt (359 mg, 2.64 mmol) 、 EDC · HC1 (508 mg, 2..64 mmol) 、 N - Boc - フエ二レンジァミン（化合物 1 1 ) (502 mg， 2.4 mmol) を 0 ° Cで順に加え、遮光下 17時間攪拌した。この反応溶液を減圧濃縮して得られた濃縮残渣をクロ口ホルムで抽出し、有機層を 10% クェン酸、飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液で 1回ずつ洗浄して、乾燥剤として無水硫酸マグネシゥムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。減圧濃縮によって得られた濃縮残渣をシリ力ゲルクロマトグラフィー (50 g, トルエン：酢酸ェチル = 5 : 1) で精製して、化合物 2 4 (220 mg, 収率： 30%) を黄色の油状物として得た。この化合物 2 4の E S I — M S (positive) 測定を行ったところ、 m/z 641.25 [ (M+Na) ⁺]であった。これによつて化合物 2' 4の構造を確認することができた。なお、この化合物 2 4の分子質量は 6 1 8. 2 5である。

( 2 ) 化合物 2 5の合成

化合物 2 4 (103 mg, 11.67 mmol) をジクロロメタン (2 ml) に溶解し、 0°Cで TFA (247 μ 1) を加え、同温で 1時間攪拌した。反応溶液を濃縮後、トルエンで共沸した。得.られた濃縮残渣を酢酸ェチルに溶解し 05003220

72

、トリェチルァミン水溶液を加えて、水相の pHを 8 とした後、有機相を無水硫酸マグネシゥムを用いて乾燥させた後、乾燥剤を濾去して減圧濃縮を行った。得られた濃縮残渣をシリカゲル力ラムクロマトグラフィー

(5 m_g、クロ口ホルム：アセトン = 5： 1) で精製し、ィヒ合物 2 5を黄色の油状物として得た。収量は 46.8 mg (67%) であった。この化合物 2 5につレヽて¹ H- NMRスペクトル（600 MHz、 CDC1₃) 測定を行ったところ、 δ 6.93-6.89 (m, 2H, aromaric), 6..71-6.68 (d, 1H, J = 8.4 Hz, ar omaric) , 6.37— 6.35 (d， 1H， J = 8.4 Hz, aromaric), 2.66 (t， 2H, J = 6.6 Hz, 0=C - C^), 2.36 (t, 2H， J = 7.2 Hz, (¾ - S), 1.98—1.9 4 (m， 2H, J

であった。また、化合物 2 5の E S I — MS (positive) 測定を行ったところ、 m/z 419.06 [ (M+H )⁺]であった。以上から化合物 2 5の構造を確認することができた。なお、この化合物 2 5の分子質量は 4 1 8 · 1 5である。

( 3 ) リガ:ンド複合体（化合物 2 6 ) の合成

. 以下、式（ 3 3 ) にしたがって説明する。

26

•••(33) 化合物 2 5 (5.04 mg, 12 μ mol) とグルコース（4.79 mg， 26 μ mol .) をメタノール/水（1:1， 1 ml) に溶解し、酢酸（50 μ 1) を加え、 37 °Cで 4時間放置した。反応液に酢酸（950 μ 1) ，メタノール/水（1:1, 1 ml) ，シァノ水素化ホウ素ナトリウム（5.14 mg, 72 μ mol) を加え、 37°Cでさらに 72時間放置した。反応液を濃縮した。得られた残渣は、 2005/003220

73

L H— 2 0を用いたカラムクロマトグラフィー（50 g，メタノール水 =50 / 50) によって精製した。化合物 2 6は白色の.固体として得られた。収量は 2.58 mg (29%) であった。

この化合物 2 6について¹ H- NMRスぺクトル（600 MHz、 D₂0) 測定を行つたところ、 56.94 (t, 1H, J = 7.8 Hz, aromaric) , 6.66 (s， 1H, a romaric), 6.55 (d, 1H， J = 8.4 Hz, aromaric), 6.37 (d, 1H, J = 9 .6 Hz, aromaric), 3.714 - 3.707 (m, 1H, J = 4.2 Hz) , 3.58—3.51 (m, 3H), 3.44- 3.37 (m， 2H，）， 3.10-3.07 (m, 2H, J = 8.4 Hz, 13.8 Hz ), 2.56-2.50 (m， 2H， 0=C - ， 2.24 (t， 2H， J = 3.6 Hz, - S) , Ϊ.83— 1.81 (m, 2H, であった。 MALDI - T0F-MS測定を行ったところ、 m/z 747.21[(M+H)⁺]であった。これらによって化合物 2 6の構造を確認することができた。なお、この化合物 2 6の分子質量は 7 4 6. 2 9である。

(4 ) リガンド複合体（化合物 2 7 ) の合成

以下、式（ 3 4 ) に.したがって説明する。

(34) 化合物 2 5 (5.1 mg, 12 μ mol) とマルトース（9.2 mg， 26 μ mol) をメタノール/水（1:1， 1 ml) に溶解し、酢酸（50 μ 1) を加え、 37°C. で 4時間放置した。反応液に酢酸（950 μ 1) ，メタノール/水（1:1, 1 ml) , シァノ水素化ホウ素ナトリウム（5.22 mg, 72 μ mol) を加え、 3 7°Cでさらに 120時間放置した。反応液を濃縮した。得られた残渣は、 L H - 2 0を用いたカラムクロマトグラフィー（50 g，メタノール水= 50/50) によって精製した。化合物 2 7は白色の固体として得られた。収量は 2.74 mg (21%) であった。

この化合物 2 7について¹ H-NMRスぺクトル（600 MHz, D₂0) 測定を行つたところ、 δ 7.04 (t, 1H， J = 4.2 Hz, aromaric) , 6.77 (s, 1H, a romaric) , 6.64 (d， 1H， J = 7.8 Hz, aromaric) , 6.54 (d， 1H, J = 8 .4 Hz, aromaric) , 4.93 (d, 1H， J =3.6 Hz), 3.82-3.78 (m， 2H) , 3. 75 - 3.70 (m, 3H) , 3.63—3.56 (m, 3H)， 3.48 (dd， 1H, J = 6.6 Hz, 11 .4 Hz), 3.41-3.39 (m, 1H) 3.27 (t， 1H, J = 9.0 Hz), 3.18 (s, 3H) , 3.08-3.06 (m， 1H) , 2.65 (t, 2H, 4.8 Hz , 0=C-CH₂) , 2.34 (t, 2H, J = 7.2 Hz, CH^-S) , 1.91 (t, 2H， J = 7.2 Hz, CHsC^CH であった。 MALDI- T0F-MS測定を行ったところ、 m/z 1093.27 [ (M+Na) +]であった。これらによって化合物 2 7の構造を確認することができた。なお、この化合物 2 7の分子質量は 1 0 7 0. 3 9である。

〔実施例 5〕

上記一般式（ 9 ) にて表される構造において n ¹および qが 0であり、上記群（ 2 0 ) に示される糖鎖が導入されたリガンド複合体を合成した。なお、測定方法、試薬等は、上記実施例 4 と同じである。

( 1 ) リガンド複合体（化合物 3 0 ) の合成

リガンド複'合体（化合物 3 0 ) の合成の手順を、式（ 3 5 ) にしたがつて説明する。

NaBH₃CN

DMAo/H₂0/AcOH (1/1/0.2)

30

•••(35) 化合物 2 8 (2.47 mg, 8.24 μ mol) とシアル酸含有三糠（化合物 2 9、 5.11 mg, 7.57 μ mol) をジメチルァセトアミド /水 (1:1, 1.0 ml ) に溶解し、酢酸（100 μ 1) を加え、 37°Cで 10時間放置した。反応液にシァノ水素化ホウ素ナトリウム（1.55 mg， 24.7 - mol) を加え、 37 °Cでさらに 72時間放置した。反応液にアセトン 3 mlを加え、未反応のシァノ化ホウ素ナトリウムをクェンチした後、濃縮した。得られた残渣は、 C h r o m a t o r e x OD Sを用いたカラムクロマトグラフィー、 H P L C (カラム： DAISO SP - 120 - 5 - ODS - BP) 、 Sephadex G-25を用レヽたクロマトグラフィーを順に行って精製した。化合物 3 0は白色の固体として得られた。収量は 2.31 mg (32%) であった。

この化合物 3 0の¹ H- NMRスぺクトル（600 MHz、 D₂0) 測定を行った。図 7に示すチヤ一トが得られた。また MALDI - T0F - MS測定を行ったところ、 m/z 977.5 〔（M+Na)⁺]であつた。これらによつて化合物 3 0の構造を確認することができた。なお、この化合物 3 0の分子質量は 9 5 4. 3 4である。

( 2 ) リガンド複合体（式（ 3 6 ) ) の合成

式（ 3 6 ) にて表されるリガンド複合体を上記（ 1 ) と同様の手順で合成した。

•(36) このリガンド複合体の¹ H - NMRスぺクトルを測定し、得られたチャートを図 8に示じた。これによつて、式（ 3 6 ) にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。

. ( 3 ) リガンド複合体（式（ 3 7 ) ) の合成 . . 式（ 3 7 ) にて表されるリガンド複合体を上記. （ 1 ) と同様の手順で合成した。

•(37) このリガンド複合体の NMRスぺクトルを測定し、得られたチャート ¾図 9に示し。これによ.つて、式（ 3 7 ) にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。

： (4 ) リガンド複合体（式（ 3 8 ) ) の合成

式'（ 3 8 ) にて表されるリガンド複合体を上記（ 1 ) と同様の手順で合成した。

•••(38) このリガンド複合体の - NMRスぺクトルを測定し、得られたチャートを図 1 0に示した。これによつて、式（ 3 8 ) にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。

( 5 ) リガンド複合体（式（ 3 9 ) ) の合成

式（ 3 9 ) にて表されるリガンド複合体を上記（ 1 ) と同様の手順で合成した。

•••(39) このリガンド複合体の ¾- NMRスぺクトルを測定し、得られたチャートを図 1 1に示した。これによつて、式（ 3 9 ) にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。

( 6 ) リガンド複合体（式（4 0 )' ) の合成

式（ 4 0 )' にて表されるリガンド複合体を上記（ 1 ) と同様の手順で合成した。

•(40) このリガンド複合体の¹ H- NMRスぺクトルを測定し、得られたチャートを.図 1 2に示した。これによつて、式（.4 0 ) にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。 .

( 7 ) リガンド複合体（式（4 1 ) ) の合成

式（4 1 ) にて表されるリガンド複合体を上記（ 1 ) と同様の手順で合成した ₀

•'•(41)

" このリガンド複合体の - NMRスベクトルを測定し、得られたチャートを図 1 3に示した。これによつて、式（4 1 ) にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。

( 8 ) リガンド複合体（式（4 2 ) ) の合成

式（4 2 ) にて表されるリガンド複合体を上記（ 1 ) と同様の手順で '合成した。

このリガンド複合体の NMRスベクトルを測定し、得られたチャートを図 1 4に示した。これによつて、式（4 2 ) にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。

( 9 ) リガンド複合体.（式（4 3 ) ) の合成

• 式（4 3 ) にて表されるリガンド複合体を上記（ 1 ) と同様の手順で合成した。

•(43)

• このリガンド複合体の - NMRスぺクトルを測定し、得られたチャートを図 1 5に示した。これによつて、式（4 3 ) にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。

( 1 0 ) リガンド複合体（式（4 4 ) ) の合成式（4 4) にて表されるリガンド複合体を上記（ 1 ) と'同様の手順で合成した。

•(44)

' このリガンド複合体の¹ H - NMRスペクトルを測定し、得られたテヤートを図 1 6に示した。これによつて、'式（44) にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。

I ( 1 1 ) リガンド複合体（式（4 5 ) ) の合成

式（4 5) にて表されるリガンド複合体を上記（ 1 ) と同様の手順で合成した。

••'(45) このリガンド複合体の - NMRスぺクトルを測定し、得られたチャートを図 1 7に示した。これによつて、式（4 5 ) にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。

( 1 2 ) リガンド複合体（式（4 6 ) ) の合成

式（4 6 ) にて表されるリガンド複合体を上記

合成した。

•(46) このリガンド複合体の ^-NMRスぺクトルを測定し、得られたチャートを図 1 8に示した。これによって、式（4 6 ) にて表されるリガンド複合体の構造を確認するこ.とができた。

( 1 3 ) リガンド複合体（式（4 7 ) ) の合成

'. '式 (4 7 ) にて表されるリガンド複合体を上記（ 1 ) と同様の手順で "合成した。

(47) このリガンド複合体の NMRスぺクトルを測定し、得られたチャートを図 1 9に示した。これによつて、式（4 7 ) にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。

( 1 4) リガンド複合体（式（4 8 ) ) の合成

式（ 4 8 ) にて表されるリガンド複合体を上記（ 1 ) と同様の手順で合成した。

•■•(48) このリガンド複合体の¹ H-丽 Rスぺクトルを測定し、得られたチヤ一トを図 2 0に示した。これによつて、式（4 8 ) にて表されるリガンド複合体の構造を確認するこ'とができた。

( 1 5 ) リガンド複合体（式（4 9 ) ) の合成

式（4 9 ) にて表されるリガンド複合体を上記（ 1 ) と同様の手順で合成した。

•(49) このリガンド複合体の - NMRスぺクトルを測定し、得られたチャートを図 2 1に示した。これによつて、式（4 9 ) にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。

( 1 6 ) リガンド複合.体（式（ 5 0 ) ) の合成

式（ 5 0 ) にて表されるリガンド複合体を上記（ 1 ) と同様の手順で合成した。

•■•(50) このリガンド複合体の ^ - NMRスぺクトルを測定し、得られたチャートを図 2 2に示した。これによつて、式（ 5 0 ) にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。

( 1 7 ) リガンド複合体（式（ 5 1 ) ) の合成

式（ 5 1 ) にて表されるリガンド複合体を上記

合成した。

•(51) このリガンド複合体の¹ H - NMRスぺクトルを測定し、得られたチヤ一トを図 2 3に示した。これによつて、式（ 5 1 ) にて表されるリガンド複合体の構造を確認することができた。

なお、発明を実施する.ための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべ 'きものではなく、本発明の精神.と次に記载する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。産業上の利用の可能性

以上のように、本発明にかかるリガンド複合体は、一つのリガンド複合体内に複数の糖分子を導入することができるので、上記リガンド複合体同士が支持体表面に集合化することを避けつつ、糖分子については集合化させることができる。本発明のリンカー化合物を用いることによつて、上記糖分子とタンパク質との相互作用を再現性よく評価することが可能になる。

また、本発明にかかるリガンド担持体は、未知タンパク質の同定に利用することができるという効果を奏する。さらに、本発明にかかるタンパク質の分析方法によれば、未知タンパク質の同定を行うことができる本発明は、タンパク質の機能解析に有効利用することのできる新規なリガンド複合体やリガンド担持体などを提供するものである。オリゴ糖鎖を固定化したリガンド担持体（チップ）が糠鎖やタンパク質の機能解祈のツールとして発展すれば、ォリゴ糖鎖が関与する生命現象の解明に貢献するだけでなく、医薬品開発における重要な技術となることが期待される。それゆえ、本発明の有用性は高いと考えられる。

Claims

87

請求の範囲

一般式（ 1 )

(式中、 P , qはそれぞれ独立して 0以上 6以下の整数）にて表される構造を備え、

上記 Xとして、末端に芳香族アミノ基を有するとともに、主鎖に炭素一窒素結合を有していてもよい炭化水素誘導鎖を、 1鎖又は 2鎖又は 3 鎖含んでなる構造を備え、上記 Yとして、硫黄原子又は硫黄原子を含む炭化水素構造を備え、上記 Zとして、炭素一炭素結合又は炭素一酸素結合を持つ直鎖構造を備えているリンカー化合物と、還元末端を有する糖とが、上記芳香族アミノ基を介して結合している構造を有していることを特徴とするリガンド複合体。

2 . 上記 Yは、 S— S結合または S H基を含む炭化水素構造であることを特徴とする請求項 1に記載のリガンド複合体。

3 . 上記 Xは、一般式（ 2 )