JP5215298B2 - グリコシル化された基質から切断される末端単糖の固相検出 - Google Patents
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Description
・Mulla et al.、「3-Methoxycarbonyl-5-nitrophenyl boronic acid: high affinity diol recognition at neutral pH」、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letter 14 (2004) 25-27
・Dowlut et al.、「An Improved Class of Sugar-Binding Boronic Acids, Soluble and Capable of Complexing Glycosides in Neutral Water」、J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 4226-7
・Hoeg-Jensen.、「Preparation and Screening of Diboronate Arrays for Identification of Carbohydrate Binders」、QSAR Comb., Sci. 2004, 23
・Boduroglu et al.、「A calorimetric titration method for quantification of millimolar glucose in a pH 7.4 aqueous phosphate buffer」、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letter 15 (2005) 3974-3977
・Davis et al.、「Simple and Rapid Visual Sensing of Saccharides」、Organic Letter, 1999 Vol. 1, No. 2, 331-334
・He et al.、「Chromophore Formation in Resorcinarene Solutions and the Visual detection of Mono- and Oligosaccharides」、J. Am. Chem. Soc. 2003, 124, 5000-5009
・Gray et al.、「Specific sensing between inositol epimers by a bis(boronate)」、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15 (2005) 5416-5418)
しかし、前述化合物のいずれも、固体支持体に固定化された炭水化物、また、実際、固体支持体に結合した末端単糖を標識および検出するために用いられなかった。
(i)好ましくはエキソグリコシダーゼを用いて前記グリコシル化基質から前記単糖を分離するステップ、
(ii)前記分離した単糖を固体支持体上の捕捉基に共有結合させるステップ、
(iii)前記共有結合された単糖を、式X:
TAG−R−ボロネート
(式中、
TAG=検出可能なタグ部分、
R=有機部分、
ボロネート=ボロン酸部分またはそのエステル)
を有する検出剤と一緒にインキュベートするステップであって、前記ボロネートは前記R基に含まれる炭素原子に結合されるステップ、
(iv)検出剤を単糖に結合させるステップ、
(v)単糖に結合した検出剤を検出するステップを含む。
上式で、R’およびR’’は脂肪族または芳香族でよく、任意選択でRと共有結合する。
脂肪族基:脂肪族化合物は、炭素原子が環よりもむしろ直鎖状または分枝鎖状に結合している非芳香族の有機化合物である。脂肪族には、脂肪酸およびパラフィン炭化水素(アルカン)の他の誘導体だけでなく、不飽和化合物、例えばエチレン(アルケン)およびアセチレン(アルキン)も含まれる。炭素鎖に結合している最も高い頻度で発見される非炭素原子には、水素、酸素、窒素、硫黄および様々なハライドが含まれる。シクロアルカンなどの脂環式化合物は、それらの化学構造に1つまたは複数の非芳香環を有する脂肪族化合物である。ビシクロアルカンは、1つまたは2つの炭素の位置で結合した2つの炭素環を有する。ほとんどの脂肪族化合物は非常に発熱性の燃焼反応を有し、したがって、例えば、メタンなどの炭化水素が研究室のブンゼンバーナーに燃料を供給することを可能にする。
・アルデヒドカルボニルまたは潜在的なアルデヒドカルボニル基を有する単糖は、アルドースと呼ばれ、ケトンカルボニルまたは潜在的なケトンカルボニル基を有するものは、ケトースと呼ばれる。用語「潜在的なアルデヒドカルボニル基」は、閉環から生じるヘミアセタール基を指す。同様に、用語「潜在的ケトンカルボニル基」は、ヘミケタール構造を指す。
・5員環(テトラヒドロフラン)を有する糖の環状ヘミアセタールまたはヘミケタールはフラノースと呼ばれ、6員環(テトラヒドロピラン)を有するそれらはピラノースと呼ばれる。
・2つの(潜在的)アルデヒドカルボニル基を含有する単糖は、ジアルドースと呼ばれる)
・2つの(潜在的)ケトンカルボニル基を含有する単糖は、ジケトースと呼ばれる
・1つの(潜在的)アルデヒド基および1つの(潜在的)ケトン基を含有する単糖は、ケトアルドースと呼ばれる。
・アルコールのヒドロキシ基が水素原子によって置換された単糖は、デオキシ糖と呼ばれる
・アルコールのヒドロキシ基がアミノ基によって置換された単糖は、アミノ糖と呼ばれる
ヘミアセタールのヒドロキシ基が置換される場合、化合物はグリコシルアミンと呼ばれる。
・CHOH基による単糖のカルボニル基の置換から形式的に生じる多価アルコールは、アルジトールと呼ばれる。
・カルボキシ基によるアルデヒド基の置換によってアルドースから形式的に誘導されるモノカルボン酸は、アルドン酸と呼ばれる。
・カルボニル基による第二のCHOH基の置換によってアルドン酸から形式的に誘導されるオキソカルボン酸は、ケトアルドン酸と呼ばれる。
・カルボキシ基によるCH2OH基の置換によってアルドースから形式的に誘導されるモノカルボン酸は、ウロン酸と呼ばれる。
・カルボキシ基による両方の末端基(CHOおよびCH2OH)の置換によってアルドースから形成されるジカルボン酸は、アルダル酸と呼ばれる。
グリコシル化基質上の末端単糖の分析方法
本発明の第一の態様では、グリコシル化基質上の末端単糖の分析方法が提供され、前記方法は、
(i)好ましくはエキソグリコシダーゼを用いて前記グリコシル化基質から前記単糖を分離するステップと、
(ii)前記分離した単糖を固体支持体上の捕捉基に共有結合させるステップと、
(iii)前記共有結合された単糖を、式X:
TAG−R−ボロネート
(式中、
TAG=検出可能なタグ部分、
R=有機部分、
ボロネート=ボロン酸部分またはそのエステル)
を有する検出剤と一緒にインキュベートするステップであって、前記ボロネートは前記R基に含まれる炭素原子に結合されるステップと、
(iv)検出剤を単糖に結合させるステップと、
(v)単糖に結合した検出剤を検出するステップとを含む。
(i)前記グリコシル化基質から前記単糖を分離する
本発明の方法の段階(i)は、グリコシル化基質A(例えば図1を参照)から単糖を分離するステップを含む
本発明の一実施形態では、前記グリコシル化基質が、一般構造糖−C=N−リンカー−スペーサー−固体の固定化された糖ではないことが好ましい。
(ii)前記分離した単糖を固体支持体上の捕捉基に共有結合させること
本発明の方法の段階(ii)は、前記分離した単糖を固体支持体上の捕捉基に共有結合させるステップを含む。
1つまたは複数のカルボニル基(−CH−CO−)、
ニトリル基(例えば−CH−CNを生成する)
ニトロ基(例えば−CH−NO2を生成する)
スルホン基(例えば−CH−SO2−を生成する)
・少なくとも1つの−NH2基を含む捕捉基:本発明の好ましい一実施形態によると、リンカーは捕捉基を含み、その捕捉基は少なくとも1つの−NH2基を含む。好ましいフォーマットでは、捕捉基は、任意選択の基Rを通してリンカーに結合する−NH2基で終わる。したがって、捕捉基は、好ましくはR−NH2構造である。Rは、単純アルキル、アリールまたは置換されたアルキルまたはアリール基であることができる。好ましくは、リンカー−M−NH2型の構造を形成するために、Rは−NH2基に直接結合しているヘテロ原子を含有すべきであり、上式で、Mはヘテロ原子(すなわち炭素ではない)であり、好ましくは、MはN、OおよびSからなる群から選択される。構造リンカー−O−NH2、リンカー−NH−NH2、リンカー−CO−NH−NH2、リンカー−NH−CO−NH−NH2、リンカー−S(O)2NH−NH2およびリンカー−S−NH2などのように、Mがヘテロ原子である化合物が特に好ましい。
(iii)前記共有結合された単糖を検出剤と一緒にインキュベートする
本発明の方法の段階(iii)は、前記共有結合された単糖を式X:、
TAG−R−ボロネート
(式中、
TAG=検出可能なタグ部分、
R=有機部分、
ボロネート=ボロン酸部分またはそのエステル)
を有する検出剤と一緒にインキュベートするステップであって、前記ボロネートは前記R基に含まれる炭素原子に結合されるステップを含む。
好ましくは、過剰量の前記検出剤を用いる。
TAG−R−B(OH)2、TAG−R−B(OH)(OR’)またはTAG−R−B(OR’)(OR’’)
からなる群から選択される式を有することが好ましく、上式で、R’およびR’’は脂肪族または芳香族でよく、任意選択でRと共有結合し、例えば、環状ボロネート構造を生じる。例えば、R’およびR’’は、C1〜6直鎖状または分枝状アルキル、C5〜7脂肪族環およびC5〜7芳香族環からなる群から個々に選択することができる。Rが環である場合には、R’はRと融合環を形成することもでき、この実施形態では、R’は4〜7員環の脂肪族ヘテロ環であることができ、それは任意選択で置換される。例えば、前記ヘテロ環は、R’が結合するBおよびO原子を含む5員環であることができる。前記ヘテロ環は置換することができないか、または置換することができる。
・Mulla et al.、「3-Methoxycarbonyl-5-nitrophenyl boronic acid: high affinity diol recognition at neutral pH」、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letter 14 (2004) 25-27
・Dowlut et al.、「An Improved Class of Sugar-Binding Boronic Acids, Soluble and Capable of Complexing Glycosides in Neutral Water」、J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 4226-7
・Hoeg-Jensen.、「Preparation and Screening of Diboronate Arrays for Identification of Carbohydrate Binders」、QSAR Comb., Sci. 2004, 23
・Boduroglu et al.、「A calorimetric titration method for quantification of millimolar glucose in a pH 7.4 aqueous phosphate buffer」、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letter 15 (2005) 3974-3977
・Davis et al.、「Simple and Rapid Visual Sensing of Saccharides」、Organic Letter, 1999 Vol. 1, No. 2, 331-334
・He et al.、「Chromophore Formation in Resorcinarene Solutions and the Visual detection of Mono- and Oligosaccharides」、J. Am. Chem. Soc. 2003, 124, 5000-5009
・Gray et al.、「Specific sensing between inositol epimers by a bis(boronate)」、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15 (2005) 5416-5418)
・キャッピングおよび還元:捕捉基に末端単糖を結合した後に、固定化された単糖(例えば図3の化合物G〜L)に結合した固体支持体は、未反応の遊離捕捉基をまだ有してもよく、その有用性の範囲を増加させる特異な操作を受けさせることができる。したがって、一実施形態では、本方法のステップ(iv)の前に、キャッピング剤を未結合の捕捉基に結合させる。例えば、本発明の好ましい一実施形態では、還元糖の固定化の後に、結合した単糖が好ましくは固体支持体上の捕捉基から放出されない条件下で、未反応の捕捉基をキャッピング剤によってキャップする。キャッピングの後、固体支持体は遊離捕捉基をもはや含まず、含まれるのは、例えば親電子体に対して減少した反応性を有するキャップされた基だけである。
本発明の方法の段階(iv)は、検出剤を単糖に結合させるステップを含む。
本発明の方法の段階(v)は、単糖に結合した検出剤を検出するステップを含む。
方法を繰り返す
有利には、本明細書で記載の方法は少なくとも1回、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10回またはそれ以上、繰り返すことができる。このことは、例えば、本明細書で記載の方法を、多糖などのグリコシル化された分子の単糖の配列決定のために用いることを望む場合に有利であり得る。本明細書で開示される方法のいずれかの繰り返しを、グリコシル化基質の異なる試料について並行して実施すること、および/または前記グリコシル化基質から単糖を分離するために異なる方法を用いて実施することができる。例えば、用いるグリコシダーゼの特異性を通して関連する単糖のアイデンティティを間接的に判定するために、1つまたは複数の異なる特異的グリコシダーゼを(任意選択で並行試料について)用いてその方法を繰り返すことができる。
疾患の診断方法
本発明の方法は、ある病的状態と関連する特定のグリコシル化パターンを特定するために用いることができ、したがって、本発明のさらなる態様では、異常な糖タンパク質グリコシル化と関連する疾患の診断方法であって、患者から得られた糖タンパク質の試料に、本明細書で開示される方法のいずれかを適用することを含む方法が開示される。関心のあるグリコシル化基質上の1つまたは複数の単糖の同定は、例えば、特定の疾患クラスと関連する特異的グリコシル化パターンの診断を可能にする。異常なグリコシル化パターンに関連する好ましい疾患には、それらに限定されないが、炭水化物欠乏グリコシル化症候群(CDGS)、CDGS I、CDGS II、CDGS III、CDGS IV、ニューロン疾患、糖尿病、テイ・サックス病および癌が含まれる。
生成物の細菌汚染のモニタリング方法
本発明の方法は、生成物の細菌汚染について検査するために有利に用いることもできる。したがって、本発明の他の態様では、食品、飲料品または医薬用生成物などの生成物の細菌汚染についてモニタリングする方法であって、前記生成物の試料に本明細書で開示される方法の1つを適用することを含む方法が提供される。これは、例えばSinclair et al.「Glycoengineering: the Effect of Glycosylation on the Properties of Therapeutic proteins」に開示されているように、例えば治療的グリコシル化タンパク質の品質を確認するために特に有利であろう。したがって、本発明の好ましい一実施形態では、治療的グリコシル化タンパク質を特徴付ける方法であって、本明細書で記載の方法のいずれかを実施することを含む方法が提供される。
共有結合付加物
本発明の方法を実施する場合、本明細書で開示されるように、単糖と検出剤との間に共有結合付加物が形成される。したがって、本発明の一態様では、本明細書で開示される単糖のいずれかなどの固相上に捕捉される単糖と、式X:
TAG−R−ボロネート、
を有する検出剤、例えば本明細書で開示される検出剤のいずれかとの間に形成される、共有結合付加物が開示される。
蛍光化合物
本発明の方法を実施する場合、蛍光化合物を、検出剤のTAG成分として用いることが好ましい。したがって、本発明の一態様では、TAG化合物として有用な新規蛍光化合物が開示され、それは、本発明で用いられる検出剤を作製するために用いることができる。本明細書で開示される蛍光化合物のどれでも用いることができる。2つの好ましい蛍光化合物は、以下の構造、蛍光ヒドロキシメチル−ボロネート1(図11に示す)および蛍光ニトロ−ボロネート2(図12に示す)を有する
本明細書で開示される蛍光化合物のいずれかの製造方法は、例えば「Boronic Acids: Preparation, Applications in Organic Synthesis and Medicine」、Dennis G. Hall編、Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim出版、特にchapter 1「Structure, Properties, and Preparation of Boronic Acid Derivatives. Overview of Their Reactions and Applications」に開示されているように、当分野の技術者に公知である。
部品キット
本発明の他の態様では、本発明の方法で用いるために適する部品キットであって、少なくとも1つの固体支持体(例えば、本明細書で開示される固体支持体のいずれか)、少なくとも1つの捕捉基(例えば、本明細書で開示される捕捉基のいずれか)、および、本明細書で開示される検出剤のいずれかなどの、1つまたは複数の検出剤を含む部品キットが開示される。前記部品キットは、少なくとも1つの特異的グリコシダーゼ、および/またはグリコシル化基質の試料を、好ましくは定量的または定性的アッセイにおける陽性対照用として、さらに含むこともできる。
使用略語
AMP−CPG:アミノプロピル制御孔ガラス
DMF:ジメチルホルムアミド
DIPEA:ジイソプロピルエチルアミン
TBTU:N,N,N’,N’−テトラメチル−O−(ベンゾトリアゾル−1−イル)ウロニウムテトラフルオロボレート
DCM:ジクロロメタン
DBU:1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデス−7−エン
6−TRITC:6−テトラメチルローダミンイソチオシアネート
ES−MS:エレクトロスプレー質量スペクトル
EDC:N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
BSA:ウシ血清アルブミン
rt:室温
実施例1
捕捉ビーズの合成(図10)
アミノプロピル制御孔ガラス(AMP−CPG、ミリポア社製品番号AMP 1400B)(500mg、負荷アミノ基、約50μmol/g)を、DMF(3×2mL)、DMF中の50%DIPEA(3×2mL)、およびDMF(3×2mL)で洗浄した。次に、ビーズを室温で2時間、DMF(2mL)中のヒドロキシルアミンリンカー3(45mg、100μmol)、TBTU(25mg、75μmol)およびDIPEA(13μL、75μmol)の混合液で処理した。ビーズを、DMF(3×2mL)およびDCM(3×2mL)で洗浄した。室温で15分間、ビーズをピリジン(2mL)中の50%Ac2Oで処理することによって、未反応のアミノ基をキャップした。室温で30分間、ビーズをトルエン(2mL)中の5%ジクロロジメチルシランで処理し、続いて乾燥MeOH中で10分間インキュベートすることによって、シラノール基(ガラス表面の)をキャップした。シラノールキャッピングを繰り返した。ビーズを、MeOH、DMFおよびDCMで洗浄した。ビーズの小部分を取り出し、既知の濃度の切断されたFmoc基を用いて作成した標準曲線と比較した、DMF中の10%DBUによる処理後に放出されたFmoc基の吸光度に基づき、負荷は約35μmol/gであると判定された。
蛍光ヒドロキシメチルボロネート1の合成(図11)
6−TRITC(4、7.4mg、17μmol)を、0.1MのNaHCO3/Na2CO3緩衝液pH9(1mL)およびDMF(1mL)中の5−アミノ−2−ヒドロキシメチルフェニルボロン酸(5、Combi−Blocks社製品番号BB−2043、3.1mg、17μmol)の溶液に加えた。暗所で、混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を真空下で濃縮し、未精製の生成物を水に溶解し、Sep−Pakカートリッジ(C−18)に吸着させ、それをH2Oで洗浄した。H2O中の30〜50%MeCN(10%の0.1M HClを含有する)による溶出は、紫色の固体(6.3mg、64%)の1を与えた。ES−MS、m/z測定値593.2([MH]+計算値593.2)。
エチレンジアミン伸長リサミン7の調製(図12)
DCM(5mL)中のエチレンジアミン(232μL、3.47mmol)の溶液に、リサミンローダミンBスルホニルクロリド(6、5/6異性体の混合物、100mg、0.17mmol)を一気に加えた。暗所で、混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を真空下で濃縮し、未精製の生成物を、Sep−Pakカートリッジ(C−18)への吸着によって精製し、それをH2Oで洗浄した。H2O中の30%MeCN(10%の0.1M HClを含有する)による溶出は、紫色の固体の7を与え、それを、さらなる特徴付けなしに用いた。
蛍光ニトロボロネート2の合成(図12)
乾燥DCM(1mL)中の(3−カルボキシ−5−ニトロフェニル)ボロン酸(8、Combi−Blocks社製品番号BB2476、1.76mg、8.33μmol)、HOBt.H2O(1.13mg、8.33μmol)、EDC・HCl(1.60mg、8.33μmol)およびDIPEA(1.45μL、8.33μmol)の懸濁液に、7(5.00mg、8.33μmol)を加えた。暗所で、混合物を室温で2時間撹拌した。さらなるDCM(5mL)を加え、混合物を飽和NaHCO3および0.1MのHClで洗浄した。有機相を真空下で濃縮し、未精製の生成物を、CHCl3(1%の0.1M HClを含有する)中の50%MeOHを用いて乾燥カラム真空クロマトグラフィーによって精製した。生成物を含有する分画を濃縮し、DCM(5mL)で再溶解し、半飽和NaHCO3水で洗浄した。有機相を乾燥(Na2SO4)、ろ過および濃縮し、紫色の固体(4.7mg、70%)の生成物2を得た。ES−MS、m/z測定値816.3([MNa]+、計算値816.2)。
酵素消化のためのウシ血清アルブミン(BSA)の調製。
糖タンパク質消化のためのβ−ガラクトシダーゼの調製。
タンパク質および糖タンパク質の試料のβ−ガラクトシダーゼによる消化。
捕捉−ビーズ上のガラクトースの捕捉。
蛍光ヒドロキシメチルボロネート1による処理の後の、処理された捕捉ビーズ上の捕捉されたガラクトースの染色および視覚的検出(図13)
Fet−、Fet+、AFet−、AFet+、BSA−、BSA+、Gal−stdおよびブランク溶液のそれぞれに曝露させた上記の乾燥させた捕捉ビーズ(2mg)を、DMF(1×0.5mL)で洗浄し、DMF(100μL)中の0.5mMの1(図11)と0.1Mカーボネート緩衝液pH9(100μL)との混合液で処理した。生じた試料を、室温で1時間穏やかに振盪した。ビーズを、DMF(3×0.5mL)、0.1Mカーボネート緩衝液pH9(1×0.5mL)、H2O(1×0.5mL)、DMF(3×0.5mL)、DCM(3×0.5mL)で洗浄した。ビーズの一部を小さなガラスバイアルへ移し、携帯デジタルカメラで撮影した(図13、上パネル)。
染色したビーズからの蛍光ボロネートの放出(図13)
グリセロール/MeOH/H2O(1:2:2、v/v/v、100μL)の溶液を、図13の上パネルに示すビーズを含有する試験管のそれぞれに加えた。試料を、1時間穏やかに振盪した。上清を各試験管から取り出し、新しいプラスチックエッペンドルフ試験管に移した。AFet+およびGal−stdと命名した試験管からの上清は明赤色であったが、他のビーズからの上清は透明であった(図13、下パネル)。グリセロール/MeOH/H2O(1:2:2、v/v/v、100μL)により残りのビーズをもう一度洗浄すると、AFet+およびGal−stdと命名したビーズは再び白色になり、他から区別できなかった(図13、中パネル)。
(これらの実施例は、図11に示す化合物1の使用を例示する。図12に示す化合物2は、捕捉ビーズの上で捕捉されるガラクトースの染色および検出について化合物1に等しく効果的であることが見出され、グリセロールによる処理後、等しく効率的に放出された。)
Claims (52)
- グリコシル化された基質上の末端単糖の分析方法であって、
(i)エキソグルコシダーゼを用いて前記グリコシル化基質から前記単糖を分離するステップと、
(ii)前記分離した単糖を固体支持体上の捕捉基に共有結合させるステップと、
(iii)前記共有結合された単糖を、式X:
TAG−R−ボロネート
(式中、
TAG=検出可能なタグ部分、
R=有機部分、
ボロネート=ボロン酸部分またはそのエステルである)
を有する検出剤と一緒にインキュベートするステップであって、前記ボロネートは前記R基に含まれる炭素原子に結合されるステップと、
(iv)検出剤を単糖に結合させるステップと、
(v)単糖に結合した検出剤を直接または間接に検出するステップとを含む方法。 - ステップ(iv)の後にさらなるステップを含み、未結合の検出剤が好ましくは洗浄によって除去される、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉基がリンカー基を通して固体支持体に結合される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- ステップ(iv)の前にキャッピング剤を未結合の捕捉基に結合させる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記キャッピング剤が、図9に記載されているもののいずれかから選択される、請求項4に記載の方法。
- 捕捉基が−NHR基を含むかまたはそれからなり、式中、Rは、水素(H)、アルキル、アリール、置換されたアルキルまたは置換されたアリール基からなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記捕捉基が硫黄またはリン原子を含むかまたはそれからなる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記捕捉基が、カルバニオンへのイオン化および続く糖アルデヒドへの求核攻撃が可能な酸性−CH−基を含むかまたはそれからなる、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記捕捉基が構造−M−NH2を含むかまたはそれからなり、式中、Mはヘテロ原子である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記固体支持体が、重合体、固体、不溶性粒子および表面、例えばPEGAまたはSPOCCからなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記固体支持体がビーズである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記固体支持体が、ガラススライド、マイクロタイターウェルまたは金属コーティングされたスライド、例えば金コーティングされたスライドなどのスライドである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記固体支持体がヒドロキシルアミンで修飾された表面、例えば制御孔ガラス(CPG)ビーズまたはガラススライドである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記分析がグリコシル化基質上の末端単糖の少なくとも1つの同定を可能にする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記検出ステップが吸光度の測定によって実施される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記検出ステップが蛍光の測定によって実施される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記検出ステップが蛍光分光分析などの分光分析によって実施される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記分析がグリコシル化基質上の単糖の少なくとも1つの定量を可能にする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記定量化が得られた結果を標準試料と比較することによって実施される、請求項18に記載の方法。
- 前記グリコシル化基質が、グリコシル化された抗生物質、糖タンパク質、糖脂質、グリコシル化されたステロイド、オリゴ糖、多糖からなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記グリコシル化基質が、好ましくは真核生物由来の糖タンパク質、糖脂質またはプロテオグリカンからなる群から選択される、請求項1から19のいずれかに記載の方法。
- 前記グリコシル化基質が、真核生物細胞の細胞膜から得ることができるかまたは得られる、糖タンパク質、糖脂質またはプロテオグリカンからなる群から選択される、請求項1から19のいずれかに記載の方法。
- 前記グリコシル化基質が、原核生物から得ることができるかまたは得られる、糖タンパク質、糖脂質または多糖からなる群から選択される、請求項1から19のいずれかに記載の方法。
- 前記グリコシル化基質が、原核生物の細胞表面または細胞膜から得ることができるかまたは得られる、糖タンパク質、糖脂質または多糖からなる群から選択される、請求項1から19のいずれかに記載の方法。
- 前記グリコシル化基質が、グリコシル化された抗生物質、グリコシル化されたステロイド、グリコシル化された天然生成物またはグリコシル化されたペプチドからなる群から選択される、請求項1から19のいずれかに記載の方法。
- 前記単糖が、アルドース、ケトース、デオキシ糖、アミノ糖およびそれらの誘導体、例えばそれらの酸化誘導体、またはそれらの置換された誘導体からなる群から選択されるような単糖類である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記分離ステップが細菌のエキソグリコシダーゼを用いて実施される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記末端単糖が、細菌性多糖または糖脂質に作用して、デオキシ糖、アミノ糖、置換アミノ糖、分枝鎖糖、O−メチル糖などを切断するグリコシダーゼを用いて分離される、請求項27に記載の方法。
- 前記エキソグリコシダーゼが、α−マンノシダーゼ、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−キシロシダーゼ、α−フコシダーゼ、α−N−アセチルグルコサミニダーゼ、α−N−アセチルガラクトサミニダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−イズロニダーゼ、α−シアリダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−キシロシダーゼ、β−フコシダーゼ、β−N−アセチルグルコサミニダーゼ、β−N−アセチルガラクトサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−イズロニダーゼおよびβ−シアリダーゼからなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
- 前記末端単糖が酸加水分解、例えば穏やかな酸加水分解を用いて分離される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記分析されるグリコシル化基質が試料中に含まれ、ステップ(i)の後に追加のステップを含み、前記試料の成分が、例えばサイズ排除によって、好ましくは限外ろ過または透析によって除去される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記試料の前記成分が、C18または炭素などの疎水性相上での吸収によって除去される、請求項31に記載の方法。
- 前記検出剤が、TAG−R−B(OH)2、TAG−R−B(OH)(OR’)またはTAG−R−B(OR’)(OR’’)から選択される式を有し、
上式で、R’およびR’’は脂肪族または芳香族でよく、任意選択でRと共有結合する、前記請求項のいずれかに記載の方法。 - 前記検出剤が、図5に開示されている群のいずれかから選択される式を有する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記検出剤が、図6に開示されている群のいずれかから選択される式を有する、請求項1から33のいずれかに記載の方法。
- 前記検出剤が、図7に開示されている群のいずれかから選択される式を有する、請求項1から33のいずれかに記載の方法。
- 前記検出剤が、図8に開示されている群のいずれかから選択される式を有する、請求項1から33のいずれかに記載の方法。
- 前記検出剤が、図11および12に示す式1または2を有する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記検出剤がアリールボロネートまたはヘテロアリールボロネートを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記検出剤のTAG部分が、蛍光部分、発光部分および着色部分からなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記検出剤のTAG部分が、クマリン、テトラメチルローダミン、リサミンまたはフルオレセインからなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記検出剤のR部分が、脂肪族または芳香族の部分である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記検出剤が、検出ステップの前または後に固体支持体から放出される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 前記放出ステップが、固体支持体を、単糖との結合を巡って検出剤と競合する溶解性化合物の溶液と接触させることによって達成される、請求項43に記載の方法。
- 前記溶解性化合物が、グリセロールまたはグルシトールなどの多価アルコール、またはジエタノールアミンなどのアミノアルコールである、請求項44に記載の方法。
- グリコシル化基質上で少なくとも1回、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10回またはそれ以上繰り返される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
- 異なる試料について並行して実施される、請求項46に記載の方法。
- 1つまたは複数の異なるグリコシダーゼを用いて繰り返される、請求項46又は47に記載の方法。
- 多糖の配列を決定する方法であって、多糖または多糖を含む分子に、前記請求項のいずれかに記載の方法を適用することを含む方法。
- 異常な糖タンパク質または糖脂質のグリコシル化と関連する疾患の検査方法であって、患者から得られた糖タンパク質または糖脂質の試料に、前記請求項のいずれかに記載の方法を適用することを含む方法。
- 異常なグリコシル化パターンに関連する前記疾患が、炭水化物欠乏グリコシル化症候群(CDGS)、CDGS I、CDGS II、CDGS III、CDGS IV、ニューロン疾患、糖尿病、テイ・サックス病および癌からなる群から選択される、請求項50に記載の方法。
- 医薬用生成物などの生成物の細菌汚染についてモニタリングする方法であって、前記生成物の試料に請求項1から49のいずれかに記載の方法を適用することを含む方法。
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