JP2009256261A - 多岐用途型蛍光性リンカー化合物、及びその製造方法ならびにそれを用いて製造するリガンド複合体。 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、微量オリゴ糖鎖を自然界から単離・精製し、センサーチップやアフィニティークロマトグラフィーの担体等の蛋白質分析用の支持体に一段階で導入し、固定することが可能なリンカー化合物に関するものである。糖鎖の機能的重要性は近年明らかになってきており、その機能解析技術も進化している。これまでにオリゴ糖鎖を簡便に金チップや金ナノ粒子に固定化するためのリンカー化合物を開発し、それらのツールを用いて、容易に蛋白質分析を行うことが可能になった。しかしながら、オリゴ糖鎖を多量に天然から得ることは困難であり、また、合成も容易ではないという問題がある。
【解決手段】従来のリンカー化合物では1マイクロモルのオリゴ糖鎖を必要とした。本発明は、上記問題点を解決するためになされたものであり、蛍光性のリンカーを開発し、１ナノモルのオリゴ糖鎖でも分子レベルの研究を行うことを可能にした。
【選択図】なし

Description

本発明は、微量オリゴ糖鎖を自然界から単離、精製し、表面プラズモン共鳴等のセンサーチップやアフィニティークロマトグラフィーの担体等の蛋白質分析用の支持体に一段階で導入し、固定することが可能なリンカー化合物に関するものである。

生体内の細胞に限らず、ウイルス、細菌等はその組織内にオリゴ糖鎖構造を有している。これらオリゴ糖鎖の機能の重要性は近年明らかになってきており、その機能解析技術も日々進化している。これまでにオリゴ糖鎖を用いた蛋白質分析技術として表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を支持体に用いた分析法を考案している。

すなわち、下記一般式（２）で示されるリンカー化合物にオリゴ糖鎖を簡便に導入し、リガンドを直接、蛋白質分析用の支持体に共有結合させ、オリゴ糖を蛋白質分析用の支持体表面に固定化している。これにより、容易に蛋白質分析を行うことが可能になった。

特開２００３−８３９６９号公報

オリゴ糖鎖を分子レベルで研究を行う為に、自然界から研究対象物となる可能性のあるオリゴ糖鎖を大量に得ることは困難であり、また、化学合成や酵素合成といった手法を用いても容易に得ることが困難であるという問題がある。

従来のリンカー化合物ではオリゴ糖鎖との縮合反応後、精製過程において、その構造内に存在する芳香族が有するＵＶ吸収で追跡する。これには1μｍｏｌ以上のオリゴ糖鎖リガンドが必要となり、それ以下では検出が困難になるという問題があった。このため微量のオリゴ糖鎖をリンカー化合物と縮合しても精製過程で可視化できず、微量オリゴ糖鎖を蛋白質との相互作用分析に用いることが難しかった。

本発明は、上記問題点を解決するためになされたものであって、その目的は、自然界から単離、精製して得られる種々の微量オリゴ糖をそのまま用いて一段階で蛋白質分析用の支持体表面にオリゴ糖鎖を簡便に固定化することができると共に、蛋白質分析用の支持体を用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用による影響がなく、種々の蛋白質との結合相互作用を連続的かつ定量的に評価できる蛋白質分析用の支持体を得ることができるリンカー化合物を提供することにある。

本発明者は、上記の目的を達成すべく鋭意検討した結果、リンカー化合物の分子内に蛍光波長を示すピリジン環を採用した。そうすることにより従来のＵＶ検出器の測定域から比較するとおよそ１０００倍検出感度がよい蛍光検出器を用いてオリゴ糖鎖リガンド複合体を精製することができるようになる。これにより従来の１０００分の１のオリゴ糖鎖量でオリゴ糖鎖リガンド複合体の調製が可能となる。

微量のオリゴ糖鎖を分子内に簡便に導入できる部分をリンカー化合物に組み込むと共に、自然界から単離、精製して得られる種々のオリゴ糖をそのまま用いて蛋白質分析用の支持体表面にオリゴ糖鎖を一段階で簡便に固定化することができ、分析対象の蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用による影響も無く、種々の蛋白質との結合相互作用を連続的かつ定量的に評価できる。

即ち、本発明にかかるリンカー化合物は、上記の課題を解決するために、下記一般式（３）で表されることを特徴としている。ここでｍ、ｎは０以上６以下の整数、ＸはＨである。

一般式（３）であらわされた化合物のようにその分子内に従来リンカー化合物の持つベンゼン環のような紫外可視光よりも強いシグナルが得られる蛍光波長を示すピリジン環を持つことにより、自然界から単離するオリゴ糖鎖がより微量でも精製が可能となる。

本発明は、自然界から単離、精製して得られる種々のオリゴ糖をそのまま用いて一段階で蛋白質分析用の支持体表面にオリゴ糖鎖を簡便に固定化することができると共に、蛋白質分析用の支持体を用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用による影響が低減され、種々の蛋白質との結合相互作用を連続的かつ定量的に評価できるリンカー化合物の開発を行うことである。

本発明にかかるリンカー化合物は、分子内に蛍光波長を示すピリジン環と支持体と簡便に共有結合することが可能なジスルフィド結合を有する化合物であり、前記一般式（３）で表される構造を有している。

上記一般式（３）で表されるリンカー化合物は、ｍ＝０，ｎ＝０，Ｘ＝Ｈの場合例えば以下の反応式で示される反応により容易に得ることができる。

先ず、芳香族ジアミンである下記一般式（４）で表される２，６−ジアミノピリジンを、上記反応式に示すように、ＤＭＦ中、水溶性カルボジイミド（式中、ＥＤＣ・ＨＣｌと記す）、並びに、３Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，６−ｂ］ピリジン−３−オール（式中、ＨＯＡｔと記す）の存在下で、ジスルフィド結合を有する下記一般式（５）で表されるチオクト酸と縮合反応させることにより、前記一般式（３）（ｍ＝０）で表される化合物が得られた。

本実施の形態では、該一般式（４）で表される化合物をＥＤＣ・ＨＣｌおよびＨＯＡｔの存在下で、前記一般式（５）で表されるチオクト酸と縮合反応させることにより、前記一般式（３）（ｍ＝０）で表される化合物を収率９５％で調製した。図１、図２にあるように前記一般式（２）で表したリンカー化合物は３３０ｎｍに蛍光励起波長、３８０ｎｍに蛍光発光波長を示した。図３に示す通り前記一般式（２）で表される従来のリンカー化合物は蛍光を示さない。

続いて、このリンカー化合物の反応性、非特異的吸着の有無を確認するために該リンカー化合物をラクトースと縮合反応させたところ、下記一般式（６）で表される親水性の糖鎖リガンド複合体を合成することができた。

すなわち、本発明にかかる上記一般式（１）で表されるリンカー化合物は、下記一般式（７）に示したラクトースを導入することにより、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物に由来する構造単位、特に、ピリジン環をその分子内に有すると共に、オリゴ糖鎖の導入に際し、親水性部分がリンカー化合物との間に形成される親水性の糖鎖リガンド複合体であり、下記反応式で示されるように、前記一般式（１）で示されるリンカー化合物を、ＮａＢＨ₃ＣＮ、ＣＨ₃ ＣＯＯＨ（式中、ＡｃＯＨと記す）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（式中、ＤＭＡｃと略する）およびＨ_２Ｏの存在下、反応温度３７℃にて下記一般式（７）で表されるラクトースと還元アミノ化反応させることにより容易に調製することができる。

本実施の形態では、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物を上記条件下で、一般式（７）で表されるラクトースと還元アミノ化反応させることにより、還元末端を効率良く利用して、前記一般式（６）で表されるラクトースリガンド複合体を５０％の収率で得た。

また、前記一般式（６）で示したラクトースリガンド複合体の反応性、非特異的吸着の有無を比較するために該リンカー化合物をマルトースと反応させたところ、下記一般式（８）で表される親水性の糖リガンド複合体を合成することができた。

すなわち、本発明にかかる上記一般式（１）で表されるリンカー化合物は、マルトースを導入することにより、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物に由来する構造単位、特に、ピリジン環をその分子内に有すると共に、オリゴ糖鎖の導入に際し、親水性部分がリンカー化合物との間に形成される親水性の糖鎖リガンド複合体であり、下記反応式で示されるように、前記一般式（１）で示されるリンカー化合物を、ＮａＢＨ₃ＣＮ、ＣＨ₃ ＣＯＯＨ（式中、ＡｃＯＨと記す）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（式中、ＤＭＡｃと略する）およびＨ₂Ｏの存在下、反応温度３７℃にて下記一般式（６）で表されるマルトースと還元アミノ化反応させることにより容易に調製することができる。

本実施の形態では、前記一般式（１）で表されるリンカー化合物を上記条件下で、一般式（９）で表されるマルトースと還元アミノ化反応させることにより、還元末端を効率良く利用して、前記一般式（８）で表される、糖鎖リガンド複合体を４６％の収率で得た。

このように分子内に蛍光波長を示すピリジン環を導入することで、前記一般式（１）で示したリンカー化合物に蛍光波長の性質を持たせることができるだけではなく、図４にあるようにＵＶ吸収においても５倍の検出感度を得た。さらにピリジン環に含まれる窒素の不対電子により従来以上に親水性に富み、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）を持たせた部位をリンカー化合物に導入することで、前記一般式（２）リンカー化合物と同様に、前記一般式（１）のリンカー化合物をＳＰＲのセンサーチップ等をはじめとする蛋白質分析用の支持体表面にコートした金とイオウ−金結合（Ｓ−Ａｕ結合）させ易く、かつ、これら蛋白質分析用の支持体に、上記リンカー化合物に結合させたオリゴ糖鎖を強固に結合させることができ、図５にあるように非特異的吸着も観測されなかった。

以下、実施例により本発明について詳しく説明するが、本発明の内容は実施例に限られるものではない。

なお、下記の実施例において、各種のスペクトルには次の機器を使用した。
＊） 質量分析：Ｍａｒｉｎｅｒ（登録商標） Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（登録商標）
Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ （商品名、ＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳ， ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）
ＶＯＹＡＧＥＲ−ＤＥＲＰ （商品名、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ， ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）
＊） 表面ブラズモン共鳴バイオセンサー：ＳＰＲ６７０Ｍ（商品名、モリテックス）
＊） 分光蛍光光度計：ＦＰ−６３００（商品名、日本分光）
また、クロマトグラフィーには次のシリカゲルを用いた。
＊） 薄層クロマトグラフィー：Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４ （Ｎｏ．５７１５）
（商品名）
＊） 調製的薄層クロマトグラフィー：Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４ （Ｎｏ．５７４４） （商品名）
＊） 中圧カラムクロマトグラフィー：Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ （Ｎｏ．９３８５，
０．０４０−０．０６３ ｍｍ，２３０−４００ ｍｅｓｈ） （商品名）
〔実施例１・リンカー化合物の合成〕
本発明のリンカー化合物は、以下の手順にて合成した。

２，６‐ジアミノピリジン（９．７ｍｍｏｌ，２．０ ｅｑ．）の無水Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド（式中ＤＭＦ,１０ｍｌ）溶液にＥＤＣ・ＨＣｌ（４．８ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）、ＨＯＡｔ（４．８ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）、チオクト酸（４．８ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）を加え、氷冷した後、ジイソプロピルエチルアミン（式中ＤＩＥＡ，４．８ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）を加えてアルゴン雰囲気下室温で６時間反応させた。反応溶液にジクロロメタン（２０ｍｌ）を加え水（２０ｍｌ）で３回洗浄した後、有機層に硫酸マグネシウム（３．０ｇ）を加えて乾燥し、濾去後、濾液を減圧濃縮した。残渣を中圧クロマトグラフィー（シリカゲル：８０ｇ、トルエン：酢酸エチル＝１：１）で精製し、白色固体として上記一般式（１）で表したリンカー化合物（ｍ＝０，ｎ＝０，Ｘ＝Ｈ）を収率９８％で得た。

〔実施例２・リガンド複合体の調整〕
本発明に関してリンカー化合物とラクトースの縮合は以下の手順で合成した。

リンカー化合物（０．０６ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）をＤＭＡｃ１．０ｍｌに溶解し、ラクトース（０．５６ｍｍｏｌ）をＨ_２Ｏ１．０ｍｌに溶解したものに添加し、酢酸０．２ｍｌを添加して遮光し３７℃で１２時間加温した。ＮａＢＨ_３ＣＮ（２．８０ｍｍｏｌ、０．２８ｅｑ．）を加え、遮光し３７℃で１．５日間加温した。その後凍結乾燥し、残渣をＯＤＳカラムで精製したところ、白色固体として上記一般式（５）のラクトースリガンド複合体（ｍ＝０，ｎ＝０）を５０％の収率で得た。

本発明に関してリンカー化合物とマルトースの縮合は以下の手順で合成した。

リンカー化合物（０．０６ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ．）をＤＭＡｃ１．０ｍｌに溶解し、マルトース（０．５６ｍｍｏｌ）をＨ_２Ｏ１．０ｍｌに溶解したものに添加し、酢酸０．２ｍｌを添加して遮光し３７℃で１２時間加温した。ＮａＢＨ_３ＣＮ（２．８０ｍｍｏｌ、０．２８ｅｑ．）を加え、遮光し３７℃で１．５日間加温した。その後凍結乾燥し、残渣をＯＤＳカラムで精製したところ、白色固体として上記一般式（７）のマルトースリガンド複合体（ｍ＝０，ｎ＝０）を４６％の収率で得た。

本発明によれば、リンカー分子内ピリジン環を導入したことで上記リンカー化合物に蛍光という新たな性質を持たせることができ、これにより従来の１０００分の１のオリゴ糖鎖を用いて糖鎖リガンド複合体を調製し、それを単離・精製することができるようになる。また従来の特性であるジスルフィド結合を組み込むことで、該リガンド複合体を例えばＳ−Ａｕ結合を介して蛋白質分析用の支持体に共有結合により直接結合させることができる。このため、上記のリガンド複合体、すなわち、前記一般式（２）で表されるリンカー化合物を用いれば、微量のオリゴ糖鎖を蛋白質分析用の支持体表面に簡便に固定化することができると共に、蛋白質分析用の支持体を用いて分析する蛋白質との疎水性相互作用に基づく非特異的な相互作用をほぼ無視でき、糖鎖と蛋白質などとの特異的な相互作用を簡便に検出できるシステムを構築することができる。

本発明のリンカー化合物の蛍光励起・発光波長を測定した結果を表す３次元グラフである。 本発明のシンカー化合物の蛍光発光波長を測定した結果を表す２次元グラフである。 従来のリンカー化合物の蛍光励起・発光波長を測定した結果を表す３次元グラフである。 ＵＶ吸収を基にしたラクトースリガンド化合物の検量線である。 ラクトースリガンド複合体とマルトースリガンド複合体の特異的結合相互作用と非特異的吸着を調べた表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）による測定の結果を表すグラフである。

Claims (2)

1. 一般式（１）
   （式中、ｎまたはｍは０以上６以下の整数、ＸはＨ）にて表される構造を備え、その構造内に蛍光波長を持つピリジン環を備えていることを特徴とするリンカー化合物。
2. 上記Ｘが糖鎖、または蛋白質であることを特徴とするリガンド複合体。