JP5940057B2 - 水性検体溶液中の8−オキソ2’−デオキシグアノシンを高感度で定量検出する方法 - Google Patents
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Description
1)微粒子の表面にスペーサーユニットを介して8−オキソ 2’ −デオキシグアノシンに対して特異的な蛍光応答を示す蛍光プローブ分子を固定し、該微粒子に前記検体溶液を接触させる工程、及び
2)前記検体溶液との接触の前と後の前記微粒子における物性変化を測定する工程を含む方法に関するものである。
上記を可能とするために、8-oxo-dGに対して特異的な蛍光応答を示す低分子蛍光プローブが開発されている(例えば、非特許文献4、5参照)。
この低分子蛍光プローブは有機溶媒中で多点水素結合形成することにより8-oxo-dGを認識し、特異的に蛍光消光を示すものであるため、蛍光消光の程度を測定することにより、系中に存在する8-oxo-dGの量を検出できるものである。
また、これらの低分子蛍光プローブの誘導体展開の中から、2' −デオキシグアノシン(以降、dGとも記載する)に対して特異的な蛍光応答を示す低分子蛍光プローブも見出されている(例えば、非特許文献6参照)。
以下に、8-oxo-dGに対して特異的な蛍光応答を示す低分子蛍光プローブが8-oxo-dGを認識して多点水素結合を形成する様式(A)及びdGに対して特異的な蛍光応答を示す低分子蛍光プローブがdGを認識して多点水素結合を形成する様式(B)を示す。
尚、Aで示される8-oxo-dGに対して特異的な蛍光応答を示す低分子蛍光プローブの、クロロホルム溶液中における8-oxo-dGとの錯体形成能は、dGとの錯体形成能の10倍であり、Bで示されるdGに対して特異的な蛍光応答を示す低分子蛍光プローブの、クロロホルム溶液中におけるdGとの錯体形成能は、8-oxo-dGとの錯体形成能の25倍であると報告されている。
更に、尿中の通常の8-oxo-dGの濃度は非常に低い10-20ng/mL(分子量283とすると35-70nM)程度と報告されているため、低分子蛍光プローブを尿中の8-oxo-dGの検出のために使用するためには、これより低い濃度での検出が可能となるよう感度を向上させる必要があった。
またこれにより、8-oxo-dGの高感度での定量検出に用いるデバイスの提供も可能となる。
[1]水性検体溶液中の8−オキソ 2’ −デオキシグアノシンを定量検出する方法であって、
1)微粒子の表面にスペーサーユニットを介して8−オキソ 2’ −デオキシグアノシンに対して特異的な蛍光応答を示す蛍光プローブ分子を固定し、該微粒子に前記検体溶液を接触させる工程、及び
2)前記検体溶液との接触の前と後の前記微粒子における物性変化を測定する工程を含む方法、
[2]前記8−オキソ 2’ −デオキシグアノシンに対して特異的な蛍光応答を示す蛍光プローブ分子が、式(1)
[3]Xがスペーサーユニット(該スペーサーユニットは、―(CH2)m−NHCO−(式中、mは2〜10の整数を表す。)を表す。)を表し、Yが−SiR3R4R5(式中、R3、R4及びR5は、それぞれ独立して、メチル基、第三ブチル基又はフェニル基を表す。)を表す前記[2]記載の方法、
[4]前記微粒子が、無機粒子又はポリマー樹脂粒子であり、前記物性変化の測定が蛍光強度の測定により行われる前記[1]ないし[3]の何れか1つに記載の方法、
[5]前記無機粒子が、シリカゲル粒子である前記[4]記載の方法、
[6]前記微粒子をマイクロプレートのウェルに入れて該ウェル内に乾着させ、該ウェル内に前記水性検体溶液を入れて加温しながら微粒子の蛍光強度を測定することにより前記定量検出を行う前記[4]又は[5]記載の方法、
[7]前記微粒子をカラムに充填し、該カラムに前記水性検体溶液を流し、充填された微粒子の蛍光強度を測定することにより前記定量検出を行う前記[4]又は[5]記載の方法、
[8]表面にスペーサーユニットを介して式(1)
[9]Xがスペーサーユニット(該スペーサーユニットは、―(CH2)m−NHCO−(式中、mは2〜10の整数を表す。)を表す。)を表し、Yが−SiR3R4R5(式中、R3、R4及びR5は、それぞれ独立して、メチル基、第三ブチル基又はフェニル基を表す。)を表す前記[8]記載のシリカゲル粒子、
[10]8−オキソ 2’ −デオキシグアノシンを分離するための分離カラムであって、前記[8]又は[9]記載のシリカゲル粒子を充填材として使用する分離カラム、
に関するものである。
本発明の方法は、8-oxo-dGに対して特異的な蛍光応答を示す蛍光プローブ分子を用いることにより非常に簡便な操作で8-oxo-dGの高感度の定量検出を達成することができるため非常に優れた方法といえる。
図1に本発明の概念図を示した。
図1のように、微粒子表面1にスペーサーユニット3を介して8-oxo-dG4に対して特異的な蛍光応答を示す蛍光プローブ分子2が固定されると、表面上に微小疎水空間6が形成され、水相7に存在するdG5と8-oxo-dG4のうち8-oxo-dG4だけが、微小疎水空間6の中でプローブ分子2と多点水素結合を形成し、8-oxo-dG4と多点水素結合した蛍光プローブ分子2だけが蛍光消光することになる。
本発明の水性検体溶液中の8−オキソ 2’ −デオキシグアノシンを定量検出する方法は、
1)微粒子の表面にスペーサーユニットを介して8-oxo-dGに対して特異的な蛍光応答を示す蛍光プローブ分子を固定し、該微粒子に前記検体溶液を接触させる工程、及び
2)前記検体溶液との接触の前と後の前記微粒子における物性変化を測定する工程を含む。
上記に加えて、本発明に使用し得る水性検体溶液としては、天然及び人工化学物質を含む食品、化粧品、医薬品、廃棄物を原材料としたリサイクル商品等の水溶液、土壌及び大気成分の抽出水、環境水等も含まれる。
蛍光測定により定量検出を行なう場合、励起光として、波長が300〜400nm、好ましくは、330〜380nm、より好ましくは345〜365nmの紫外線を照射し、これにより放出される410〜520nm、好ましくは、420〜470nmの蛍光の強度を測定することにより達成される。
また、吸収スペクトルによる定量検出は、事前に、蛍光プローブ分子を固定した微粒子に、種々の濃度の8-oxo-dGを添加し、紫外線等の吸収スペクトルを測定し、吸収スペクトルが最も変化する波長領域における変化量から検量線を作成しておき、検体溶液を用いた際に測定された吸収スペクトルにおける前記波長領域における変化量を検量線と照らし合わせて8-oxo-dGの濃度を算出することにより達成される。
無機粒子の具体例としては、例えば、シリコン粒子(シリカゲル粒子)、石英ガラス粒子、アルミナ粒子、グラファイト粒子、カーボンナノチューブ粒子、グラフェン粒子、グラファイト粒子、フラーレン粒子等が挙げられる。
ポリマー樹脂粒子の具体例としては、ポリ−N−ドデシルアクリルアミド(PDDA)、ポリ(フェニルアセチレン)、ポリ(フェニレンブタジイニレン)、ポリピロール、ポリメチルメタクリレート(PMAA)、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、セルロース等から構成される粒子が挙げられる。
ヒドロキシ基の保護基としては、トリメチルシリル基、第3ブチルジメチルシリル基、第3ブチルジエチルシリル基、第3ブチルジフェニルシリル基、メトキシメチル基、エトキシメチル基、エトキシエチル基、メトキシエトキシメチル基、第3ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等が挙げられる。
スペーサーユニットとしては、有機化学に分野で使用されるスペーサーユニットであれば特に限定されないが、具体的には、例えば、−(CH2CH2O)j−CH2CH2−、−(CH2CH2O)j−CH2CH2CO−、−(CH2CH2O)j−CCH2CH2SCO−、−(CH2CH2O)j−CH2CH2NHCO−、−(CH2CH2O)j−CO−、−(CH2CH2O)j−CS−、−(CH2)k−、−(CH2)k−CO−、−(CH2)k−OCO−、−(CH2)k−SCO−、−(CH2)k−NHCO−等が挙げられる。
尚、上記式のjは、1ないし10の整数、好ましくは、1ないし4の整数を表し、kは2ないし30の整数、好ましくは2ないし12の整数を表す。
また、スペーサーユニットは、上記微粒子の表面に、炭素原子、硫黄原子、酸素原子、窒素原子等による物理的吸着や共有結合により固定され得る。
mが3である分子がより好ましい。
上記無機粒子及びポリマー樹脂粒子の具体例及び粒径並びに蛍光消光の程度又は蛍光消光の程度と吸収スペクトルの変化の程度による定量検出法は、上述の通りである。
微粒子が無機粒子であり、該無機粒子がシリカゲル粒子である上記の方法が好ましい。
使用するマイクロプレートは、特に限定されるものではなく、例えば、市販の96ウェル、384ウェル等のマイクロプレートを用いることができる。
この態様は、例えば、ウェル内に蛍光プローブ分子(8-oxo-dG選択的)が固定された微粒子の水性懸濁液を入れ、加温して水分を蒸発させて該微粒子をウェルの表面に乾着させ、次に水性検体溶液を入れて加温する。
微粒子の使用量は、1ウェル当り、10ないし500ng、好ましくは、20ないし400ng、40ないし200ngであり、前記水性懸濁液は、例えば、1μL当り、前記微粒子1ないし100ng、好ましくは5ないし60ngを懸濁させたものであり、水分を蒸発させるための加温温度は、40ないし60℃の範囲、好ましくは、45ないし55℃、例えば、50℃であり、加温時間は30分ないし4時間の範囲、好ましくは、1時間ないし3時間、例えば、2時間である。
使用する水性検体溶液の量は、1ウェル当り、2ないし10μL、好ましくは2ないし4μLであり、加温温度は、40ないし60℃の範囲、好ましくは、45ないし55℃、例えば、50℃であり、加温時間は30分ないし4時間の範囲、好ましくは、1時間ないし2時間、例えば、1時間である。
加温しながら微粒子の蛍光強度を、例えば、マイクロプレートリーダー等で測定することにより、微粒子の蛍光消光の程度から微粒子に蓄積された8-oxo-dG量が判り、これから検体溶液中の8-oxo-dGの初期濃度を逆算することができるため、微量の8-oxo-dGを含む検体溶液の定量において有利である。
この発明の態様の概略図を図2に示した。
図2に示されるように、蛍光プローブ分子(8-oxo-dG選択的)が固定された微粒子16は、カラム17に充填されるものであり、カラム17に検体溶液11を流した後、微粒子16の蛍光消光の程度から検体溶液中の8-oxo-dGを定量検出するものである。
この態様は、検体溶液中の8-oxo-dGの量が極めて微量である場合に、一定量の検体溶液を流して、微粒子16に8-oxo-dGを蓄積させた後に、微粒子16における蛍光消光の程度を測定すれば、微粒子16に蓄積された8-oxo-dG量が判り、これから検体溶液中の8-oxo-dGの初期濃度を逆算することができるため、上記のように極めて微量の8-oxo-dGを含む検体溶液の定量において有利である。
また、図2で示されるような、蛍光プローブ分子(8-oxo-dG選択的)が固定された微粒子16を充填材として使用するカラムは、8-oxo-dGを溶離することができる溶離液を使用することにより、8-oxo-dGを分離するための分離カラムとして使用することもできる。
使用するシリカゲル粒子の平均粒径は、例えば、0.001ないし100μmの範囲が挙げられ。0.1ないし10μmの範囲(高感度測定用)、また、10ないし100μm(分離カラム用)の範囲が好ましい。
炭素原子数6ないし16のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、ビフェニリル基、アントラセニル基、フェナンスレニル基、ピレニル基等が挙げられる。
ヒドロキシ基の保護基としては、トリメチルシリル基、第3ブチルジメチルシリル基、第3ブチルジエチルシリル基、第3ブチルジフェニルシリル基、メトキシメチル基、エトキシメチル基、エトキシエチル基、メトキシエトキシメチル基、第3ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等が挙げられる。
スペーサーユニットとしては、有機化学に分野で使用されるスペーサーユニットであれば特に限定されないが、具体的には、例えば、−(CH2CH2O)j−CH2CH2−、−(CH2CH2O)j−CH2CH2CO−、−(CH2CH2O)j−CCH2CH2SCO−、−(CH2CH2O)j−CH2CH2NHCO−、−(CH2CH2O)j−CO−、−(CH2CH2O)j−CS−、−(CH2)k−、−(CH2)k−CO−、−(CH2)k−OCO−、−(CH2)k−SCO−、−(CH2)k−NHCO−等が挙げられる。
尚、上記式のjは、1ないし10の整数、好ましくは、1ないし4の整数を表し、kは2ないし30の整数、好ましくは2ないし12の整数を表す。
また、スペーサーユニットは、上記微粒子の表面に、炭素原子、硫黄原子、酸素原子、窒素原子等による物理的吸着や共有結合により固定され得る。
以下のスキーム1に、スペーサーユニットが―(CH2)m−NHCO−である式(1)で表される分子を固定したシリカゲル粒子(1−A)の製造方法を示した(尚、式中、R1、Y及びmは前記と同じ意味を表す)。
即ち、化合物(3)の一級ヒドロキシ基にカルボニルジイミダゾールを反応させて化合物(4)とし、これにアルキルアミノ基で修飾されたシリカゲル粒子(6)を反応させるか又は式(5)で示される試薬を反応させた後、シリカゲルと反応させることにより、シリカゲル粒子(1−A)を製造することができる。
また、上記の方法を利用することにより、種々のスペーサーユニット、例えば、−(CH2CH2O)j−CH2CH2−、−(CH2CH2O)j−CH2CH2CO−、−(CH2CH2O)j−CCH2CH2SCO−、−(CH2CH2O)j−CH2CH2NHCO−、−(CH2CH2O)j−CO−、−(CH2CH2O)j−CS−、−(CH2)k−、−(CH2)k−CO−、−(CH2)k−OCO−、−(CH2)k−SCO−、−(CH2)k−NHCO−等(式中、j及びkは前記と同じ意味を表す。)を介して、式(1)で表される分子が、例えば、炭素原子、硫黄原子、酸素原子、窒素原子等による物理的吸着や共有結合により固定された他の無機粒子又はポリマー樹脂粒子を製造することができる。
即ち、化合物(9)にイミダゾール化合物(10)を反応させて、基、−CO2(CH2)lR2を導入して化合物(11)とし、脱保護によりYを除去してジオール(12)とし、その後、一級ヒドロキシ基をY2で保護し、続いて2級ヒドロキシ基をYで保護して化合物(13)とし、Y2のみを選択的に脱保護することにより、化合物(3−A)を製造することができる。
即ち、5−ブロモ−2´−デオキシウリジンのジアセテート(16)と2−アミノレゾルシノールを反応させて化合物(17)とし、これに、(2−ヒドロキシエチル)カルバミン酸ベンジルエステルを反応させて化合物(18)とし、これにアンモニアを作用させて環化と同時に脱アセチル化を行って、化合物(19)とし、これに、YX2を反応させてYを導入して化合物(20)とし、化合物(20)を加水素分解条件下CO2Bnを除去することにより、化合物(9)を製造することができる。
即ち、スキーム3に示される化合物(17)を出発物質とし、これに2−ブロモエタノールを反応させて化合物(22)とし、これに2,6−ジアミノピリジンを反応させて化合物(23)とし、これにアンモニアを作用させて環化と同時に脱アセチル化を行って、化合物(24)とし、スキーム2で示される方法により、2級ヒドロキシ基のみがYで保護された化合物(3−B)を製造することができる。
加えて、プローブ分子をシリカゲル粒子表面上に固定することにより、感度が飛躍的に向上し、例えば、尿中の8-oxo-dGの定量検出が可能となるまで感度を向上させ得ることができる。
そしてこれにより、8-oxo-dGを微量にしか含んでいない検体溶液においても十分な精度で、定量検定が可能となる。
従って、式(1)で表される分子を固定したシリカゲル粒子は、それ自体で定量検定用のデバイスとなり得るものである。
また、式(1)で表される分子を固定したシリカゲル粒子は、分離カラムの充填材として使用することもできる。
上記の式(1)で表される分子を固定したシリカゲル粒子を充填した分離カラムは、8-oxo-dGを溶離することができる溶離液を使用することにより、8-oxo-dGを分離するための分離カラムとして有利に使用することができる。
即ち、上記分離カラムは、8-oxo-dGに対して選択的な親和性を有するシリカゲル粒子を使用するものであるため、検体溶液に含まれる成分の中で8-oxo-dGの保持時間のみを変更することができ、これにより、検体溶液に、8-oxo-dGと同じ保持時間を有する成分や8-oxo-dGと極めて近い保持時間を有する成分が含まれ、8-oxo-dGの定量が困難となる場合であっても、8-oxo-dGの保持時間のみを変更し、それにより8-oxo-dGの正確な定量を行うことができる。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δppm: 8.46 (1H, s), 7.87 (1H, s), 6.27 (1H, dd,J = 3.6 Hz, 5.9 Hz), 5.22-5.21 (1H, m), 4.41-4.10 (3H, m), 2.56-2.50 (1H, m), 2.18-2.13 (1H,m), 2.16 (3H, s), 2.10 (3H, s).
ESI-MS (m/z): 413.02 (M+Na)+
IR (cm-1): 3013, 2824, 1744, 1710, 1687
m.p.℃: 151.8 - 152.8 ℃
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δppm: 8.01 (1H, s), 6.90 (1H, t, J = 8.1 Hz), 6.35 (2H, d, J = 8.1 Hz), 6.12 (1H, t, J = 6.7 Hz), 5.18-5.17 (1H, m), 4.27-4.20 (1H, t, J = 5.8 Hz), 5.19 (1H, m), 4.37 (3H, m), 2.43-2.32 (2H, m), 2.08 (3H, s), 2.05 (3H, s).
ESI-MS (m/z) : 4.98.04 (M+H)+
IR (cm-1): 3390, 3301
m.p.℃: 249.6 - 250.0 ℃
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δppm: 7.92 (1H, s), 7.33 (5H, m), 7.05 (1H, t, J = 8.2 Hz), 6.71 (1H, d, J = 8.4 Hz), 6.42 (1H, t, J = 8.2 Hz), 6.24 (1H, t, J = 7.1 Hz), 5.20 (1H,m), 5.10 (2H, s), 4.36 (2H, m), 4.31 (1H, m), 4.13 (2H, m), 3.66 (2H, m), 2.69 (1H, m) 2.12 (3H, s), 2.09 (4H, m).
ESI-MS (m/z) : 675.68 (M+H)+
IR (cm-1): 3339, 1741, 1671, 1230, 1093
1H-NMR (400MHz, CD3OD) δppm:7.70 (1H, s), 7.29 (5H, m), 6.81 (1H, t, J = 8.2 Hz), 6.58 (1H, t, J = 7.9 Hz), 6.41 (1H, d, J = 8.2 Hz), 6.41 (1H, d, J = 8.2 Hz), 5.11 (2H, s), 4.37 (1H, m), 4.05 (2H,m), 3.92 (1H, m), 3.81 (1H, dd, J = 3.1 Hz, 12.0 Hz), 3.73 (1H, dd, J = 3.7 Hz, 12.0 Hz), 3.53 (2H, m), 2.33 (1H, m), 2.12 (1H, m).
ESI-MS: 511.29 [M+H]+
IR (cm-1): 3408, 3199, 1722, 1681, 776
m.p. ℃: 131.2 - 132.0 ℃
無水ピリジンにて共沸した化合物(19)(655 mg, 1.28 mmol) の無水ピリジン (11.5 mL) の溶液に、アルゴン気流下、ジメトキシトリチルクロライド (652 mg, 1.92 mmol) を加え、室温にて攪拌した。1.5時間後、反応液をCHCl3 (30 mL) にて希釈し、飽和重曹水で清浄、有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下溶媒を留去、得られた粗精製物をシリカゲルカラムクロマトグラフイー(関東化学60N;クロロホルム→クロロホルム:メタノール=50:1→メタノール)にて精製した。得られた褐色固体の無水N,N-ジメチルホルムアミド (3.7 mL) 溶液に、イミダゾール (206 mg, 3.023 mmol)、第3(tert-)ブチルジメチルシランクロライド (373 mg, 2.015 mmol)を加え、室温にて攪拌した。3時間後、反応液をクロロホルム (20 mL) にて希釈し、飽和重曹水で清浄、有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥した後、減圧下溶媒を留去、得られた粗精製物に3%トリクロロ酢酸 (30 mL) を加え、室温にて攪拌した。1時間後、反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (15 mL) にて希釈し、酢酸エチルにて抽出、有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥した。減圧下溶媒留去した後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフイー(関東化学60N;クロロホルム/メタノール=50/1)にて精製し、化合物(26)を540 mg、収率73%で得た。
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δppm:7.42 (1H, s), 7.27 (5H, m), 6.77 (1H, t, J = 8 Hz), 6.36 (2H, m), 6.12 (1H,t, J = 6 Hz), 5.08 (2H, m),4.45 (1H, m), 3.97 (2H, m), 3.91 (2H,m), 3.73 (1H, m), 3.56 (1H, Br), 2.30 (2H, m), 0.86 (9H, s), 0.06 (3H, s), 0.05 (3H, s).
ESI-MS:625.3524 [M+H]+
1H-NMR (400MHz, CD3OD) δppm: 7.67 (1H, s), 6.83 (1H, t, J = 8 Hz), 6.61 (1H, d, J = 8 Hz), 6.43 (1H, d J = 8 Hz, ), 6.20 (1H, t, J = 6 Hz), 4.49 (1H, m), 4.07 (2H, t, J = 5 Hz ), 3.90 (1H, m), 3.79 (1H, dd, J = 3 Hz, 12 Hz), 3.70 (1H, dd, J = 3 Hz, 12 Hz), 3.09 (2H, t, J = 5 Hz), 2.28 (1H, m), 2.13 (1H, m), 0.92 (9H, s), 0.12 (6H, s).
IR vmax (film): 3275, 1672, 1563, 1261.
ESI-MS (m/z): 491.2 (M+H)+ .
Yellow carame
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ(ppm): 8.07 (1H, d, J = 8 Hz, ), 7.89 (1H, s), 7.79 (1H, d, J = 8 Hz), 7.67 (1H, m ), 7.45 (2H, m), 7.33 (2H,m ), 7.15 (1H, Br ), 6.89 (1H, t, J = 8 Hz), 6.46 (1H, d J = 9 Hz), 6.33 (1H, d, J = 8 Hz), 6.17 (1H, t, J = 6 Hz), 4.50 (1H, m), 4.38 (2H, t ,J = 7 Hz), 3.96 (4H, m), 3.79 (1H,m), 3.61 (2H, m), 3.41 (2H, t, J = 8 Hz), 2.35 (1H, m), 2.18 (1H,m), 0.88 (9H, s), 0.07 (6H, s)
IR vmax (film): 3275, 1709, 1473, 1087.
ESI-MS (m/z): 689.3 (M+H)+ .
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ(ppm): 824 (1H, d J = 9 Hz, ), 7.96 (8H, m), 7.54 (1H,s), 6.77 (1H, Br ), 6.61 (1H, m), 6.20 (1H, d J = 8 Hz, ), 6.13 (1H, d, J = 9 Hz ), 6.07 (1H, m), 4.50 (3H, m), 3.92 (2H, m), 3.79 (3H, m), 3.63 (2H, m), 3.53 (2H, m), 2.24 (1H, m), 2.17 (1H, m), 0.87 (9H, s), 0.07 (6H, s).
IR vmax (film): 3230, 1710, 1473, 1088.
ESI-MS (m/z): 763.4 (M+H)+ .
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ(ppm): 8.19 (1H, s), 7.44 (1H, s), 7.28 (1H, s), 7.08 (1H, s), 6.78 (1H, t, J = 7.9 Hz ), 6.44 (1H,d, J = 7.9 Hz), 6.40 (1H, d, J = 7.9 Hz), 6.14 (1H, t, J = 6.1Hz), 5.92 (1H, Br), 5.08 (2H, s), 4.67 (1H,dd, J = 3.1 Hz, 12.5 Hz ), 4.57 (1H, dd, J = 11.6 Hz), 4.33 (1H, m), 4.11 (1H, m), 4.04 (2H,m), 3.58 (2H, m), 2.42 (1H, m), 2.23 (1H, m), 0.87 (9H, s), 0.06 (6H,s).
ESI-MS (m/z): 719.40 (M+H)+ .
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ(ppm): 9.21 (1H, Br), 8.19 (1H, s), 8.00 (1H, d, J = 8 Hz, ), 7.79 (1H, m), 7.67 (1H, m ), 7.41 (7H, m), 6.78 (1H, t, J = 8 Hz), 6.40 (1H, t, J = 9 Hz), 6.29 (1H, m), 6.15 (1H,m), 4.66 (1H, dd, J = 12 Hz), 4.57 (1H, m), 4.39 (1H, m), 4.31 (2H, m), 4.12 (1H,m), 3.97 (1H, m), 3.53 (2H, m), 3.37 (1H, m), 3.31 (2H, t, J = 7 Hz),2.42 (1H,m), 2.22 (1H,m), 0.86 (9H, s), 0.05 (6H, s).
ESI-MS (m/z): 783.40 (M+H)+ .
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ(ppm): 7.29 (6H, m), 6.76 (1H, t, J = 7.9, 8.2 Hz), 6.44 (1H, d, J = 7.9 Hz), 6.39 (1H, d, J = 8.5 Hz), 6.19 (1H, m) 5.79 (1H, Br), 5.19 (1H, Br), 5.10 (2H, s), 4.25 (3H, m), 3.78 (6H, q, J = 7.0 Hz), 3.58 (2H, m), 3.20 (2H, m), 2.39 (1H, m), 2.12 (1H, m), 1.19 (9H, t, J = 7.0 Hz), 0.95 (2H, m), 0.86 (9H, s), 0.62 (2H, m), 0.04 (6H, s).
ESI-MS(m/z):827.7957(M+H)+
IR(cm-1): 3326, 2930, 1698, 1474, 1102
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δppm: 9.28 (1H, s), 8.00 (1H, d, J = 8 Hz, ), 7.80 (1H, m), 7.69 (1H, m ),7.39 (5H, m), 6.78 (1H, m), 6.40 (2H,m), 6.16 (1H, m), 4.45 (1H,m), 4.26 (4H, m), 4.01 (2H, m), 3.79 (6H, m), 3.58 (1H, m), 3.43 (2H,m), 3.34 (2H, m), 3.21 (2H, m), 2.41 (1H, m), 1.97 (1H, m),1.63 (2H,m), 1.18 (9H,m), 0.87 (9H, s), 0.62 (2H, s), 0.06 (3H, s).
IR vmax (film): 3320, 1704, 1473, 1102.
ESI-MS (m/z): 937.34 (M+H)+ .
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δppm: 8.10 (9H, m), 7.50 (1H,s ), 6.73 (1H, m), 6.32 (2H, m ), 6.14 (1H, t, J = 5.8 Hz), 4.43 (1H, m), 4.30 (2H,m), 4.25 (2H, m), 4.03 (1H,m), 4.30 (2H, m), 4.25 (2H, m), 4.03 (1H, m), 3.92 (2H, m), 3.78 (6H,m), 3.57 (2H, m), 3.49 (2H, m), 3.21 (2H, m), 2.34 (1H, m), 2.00 (1H,m), 1.64 (2H,m), 1.21 (9H,m), 0.87 (9H, s), 0.61 (2H, s), 0.05 (6H, s).
IR vmax (film): 3132, 1704, 1473, 1063.
ESI-MS (m/z): 1011.53 (M+H)+ .
シリカゲル粒子(33)〜(35)及び(39)〜(41)を元素分析に付し、得られた窒素含有%から、各粒子に含まれるプローブ分子の含有量を算出し、表1に纏めた。
25μMの8-oxo-dG水溶液2μLをシリカゲル粒子(33)〜(35)に添加し、室温にて水を蒸発させた試料及び25μMのdG水溶液2μLをシリカゲル粒子(33)〜(35)に添加し、室温にて水を蒸発させた試料において蛍光反応性がどのように変化するかを、蛍光顕微鏡を用いて観察した。
尚、励起波長345nm、蛍光波長455nmで測定した。
観察の結果得られた写真を図3に示した。
写真から明らかなように、8-oxo-dG水溶液を添加した試料は、何れも、対照(水)と比較して明らかな蛍光消光が観察されたのに対して、dG水溶液を添加した試料では、このような蛍光消光は観察されなかった。
上記で製造したシリカゲル粒子(33)〜(35)における8-oxo-dGの認識能の評価を以下の操作で行った。
測定プレートはボリスチレン製のブラックプレートを用いた。近紫外落射光源 (365 nm)、Y515フィルタ (Y515-Di) を用いて評価した。測定に用いた核酸塩基(8-oxoG、G)の10 mMの精製水溶液を調整し、これを希釈して5 mMのストック溶液を準備し、各シリカゲル粒子上にμL単位で添加していった。自然乾燥後、冨士フィルム株式会社製の冷却CCDカメラシステム LAS4000を用いてシリカゲル粒子の蛍光強度を測定した。
検出手法…Fluorescence DAPI、光源…UV (365 nm EPI)、フィルタ…Y515-Di、感度…Standard、露出タイプ…Precision、露光時間…AUTO、トレイ位置…NO.1
シリカゲル粒子(33)における8-oxo-dG及びdGの濃度に対する蛍光相対強度のグラフを図4の左に示し、この際の8-oxo-dG濃度に対する消光率をhillプロットに変換したグラフを図4の右に示し、シリカゲル粒子(34)における8-oxo-dG及びdGの濃度に対する蛍光相対強度のグラフを図5の左に示し、この際の8-oxo-dG濃度に対する消光率をhillプロットに変換したグラフを図5の右に示し、シリカゲル粒子(35)における8-oxo-dG及びdGの濃度に対する蛍光相対強度のグラフを図6の左に示し、この際の8-oxo-dG濃度に対する消光率をhillプロットに変換したグラフを図6の右に示した。
図10〜12の左図から、シリカゲル粒子(33)〜(35)は、何れも8-oxo-dGの濃度が高くなるに従って、蛍光強度が減少し、一方、dGの濃度は、蛍光強度に殆ど影響しないことが判った。
また、シリカゲル粒子(33)〜(35)における8-oxo-dG濃度対蛍光消光率のhillプロットを示す図4〜6の右図は、何れも良好な直線性を示しており、8-oxo-dGに対して濃度依存的に蛍光消光することが実証された。
また、このことからグラフにおける8-oxo-dGの最低濃度である25nM以上であれば定量検定できることが判り、そのため、シリカゲル粒子(33)〜(35)は、一般に、8-oxo-dGの濃度が10−20ng/mL(35−70nM)程度と報告されている尿の定量検定においても十分に使用可能であることが判った。
上記で製造したシリカゲル粒子(33)〜(35)に、2.5pmolの8-oxo-dGと種々の異なる濃度(0、2.5、5、12、5、25、50、125、250pmol)のdGの両方を添加して、その際の蛍光強度を測定し、8-oxo-dGによる蛍光消光に対するdGの影響を評価した。
結果として得られたグラフを図7に示した。
図7から明らかなように、シリカゲル粒子(33)〜(35)における、8-oxo-dGによる蛍光消光は、dGの影響を殆ど受けないことが判った。
このことから、シリカゲル粒子(33)〜(35)は、8-oxo-dGとdGの両方を含む水性の検体溶液から、dGの濃度に殆ど影響されることなく、8-oxo-dGを高感度で定量検定し得ることが明らかとなった。
1)実験操作
平均粒径10μmであるシリカゲル粒子(33)40ngの水性懸濁液4μLを、384ウェルタイプのマイクロプレート(コーニング社製)の各ウェルに添加した。
その後、50℃の乾熱オーブン(EYELA NDO-601SD)内に2時間静置し、水分を蒸散させることでシリカゲル粒子をウェル表面に乾着させた。
次に、水性の検体溶液(8-oxo-dGの標準品(和光純薬)の水溶液)2μL(8-oxo-dG濃度:0ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、各濃度4ウェル)を添加し、50℃の乾熱オーブン内に静置した。
検体溶液添加前の光学濃度(OD)の平均値(N=4)を基準として、添加後30分、1時間、2時間、3時間、4時間におけるODの平均値(N=4)から各時間の輝度の減衰率を導きだした。
2)測定条件
装置: マイクロプレートリーダー MTP-880 Lab (コロナ電気株式会社)
励起波長:365nm
測定波長:450nm
フラッシュ回数:100
測定感度: x1
ミキシング: 5秒、直線
8-oxo-dG濃度0〜500ng/mLでの各時間における測定結果のグラフを図8に示し、8-oxo-dG濃度0〜20ng/mLでの各時間における測定結果のグラフを図9に示した。
また、平均粒径10μmであるシリカゲル粒子(33)40ngの水性懸濁液4μLに代えて平均粒径100nmであるシリカゲル粒子(39)160ngの水性懸濁液4μLを用いた以外は上記と同様の操作を行い、その際の、8-oxo-dG濃度0〜500ng/mLでの各時間における測定結果のグラフを図10に示し、8-oxo-dG濃度0〜20ng/mLでの各時間における測定結果のグラフを図11に示した。
3)結果
平均粒径10μmであるシリカゲル粒子(33)を用いた場合、検体溶液添加後1時間で、8-oxo-dG濃度0〜500ng/mLにおいて、また、8-oxo-dG濃度0〜20ng/mLにおいても、輝度の減衰率と相関する(8-oxo-dG濃度が高くなるほどOD値が減少する)ことが判った(図8及び図9参照)。
このように、検体溶液添加後1時間でのOD値を測定することにより、例えば、8-oxo-dG濃度0〜20ng/mLという非常に低濃度の検体溶液においても、正確に8-oxo-dGを定量検出できることが判った。
平均粒径100nmであるシリカゲル粒子(39)を用いた場合、8-oxo-dG濃度100〜500ng/mLにおいては、輝度の減衰率と相関する(8-oxo-dG濃度が高くなるほどOD値が減少する)ことが判った(検体溶液添加後30分〜4時間)ものの、8-oxo-dG濃度20〜500ng/mLにおいては、輝度の減衰率と相関するというデータは得られなかった(図10及び図11参照)。
しかし、8-oxo-dG濃度0〜20ng/mLにおけるOD値の変化を示す図11から、1〜4ng/mLという低濃度においてそれぞれ異なる時間に発光する(OD値が100%を超える)という現象が観察され、即ち、1ng/mLでは1時間後に発光し、2ng/mLでは2時間後に発光し、4ng/mLでは、3時間後に発光するという現象が観察された。
従って、例えば、1〜4ng/mLという非常に低い濃度の検体溶液においても、発光時間を測定することにより、非常に高い感度で8-oxo-dGを定量検出できる可能性が示唆された。
4)まとめ
8-oxo-dGの認識分子を担持したシリカゲル粒子の輝度減衰は、標準8-oxo-dGの濃度と乾燥時間に依存して合理的に変化した。また、平均粒径が10μmであるシリカゲル粒子よりも平均粒径が100nmであるシリカゲル粒子の方が、高感度の測定に適する可能性が示唆された。
1)実験操作
HPLCのプレカラムに平均粒径10μmであるシリカゲル粒子(33)10mgを装填し、HPLCにて8-oxo-dGの分離同定をした。
2)測定条件
機器: HTEC-500(エイコム社)(8-oxo-dGは電気化学的に検出)
ODSカラム: CA-5ODS, 2.1φ x 150mm
プレカラム: 分離用の ODS粒子(5μm)100mgに加え、シリカゲル粒子(33)10mgを充填
移動相: リン酸緩衝液(pH6.5-6.8)、メタノール 2%、SDS 90mg/L
試薬: 8-oxo-dG(和光純薬)、500ng/mLの10μLを注入
3)結果
8-oxo-dGの保持時間は、プレカラムにシリカゲル粒子(33)を使用しない場合には28.09分であったものが、プレカラムにシリカゲル粒子(33)を充填した場合には29.00分となり、3.2%遅延される(遅延率:3.2%)ことが判った。
また、8-oxo-dGのピーク値は、プレカラムにシリカゲル粒子(33)を使用しない場合には43.96mVであり、プレカラムにシリカゲル粒子(33)を使用した場合にも44.22mVであり、ピーク減衰は観察されなかった。
4)まとめ
8-oxo-dGの認識分子を化学的に担持させたシリカゲル粒子(33)をHPLCの流路中に配置することで、8-oxo-dGのピーク出現は遅延するが、ピーク値の減衰はなかった。HPLC+ECD(電気化学検出)で8-oxo-dGを検出する場合、移動相として今回使用したようなメタノール添加のリン酸緩衝液が一般的であるが、シリカゲル粒子(33)は、同緩衝液中の8-oxo-dGに対しても一定の親和性を示し、分離カラム用の充填剤としての有用性が示された。
2:8-oxo-dGに対して特異的な蛍光応答を示す蛍光プローブ分子
3:スペーサーユニット
4:8-oxo-dG
5:dG
6:微小疎水空間
7:水相
11:水性の検体溶液
16:8-oxo-dGに対して特異的な蛍光応答を示す蛍光プローブ分子が固定された微粒子
17:カラム
Claims (7)
- 水性検体溶液中の8−オキソ 2' −デオキシグアノシンを定量検出する方法であって、
1)表面にスペーサーユニットを介して8−オキソ 2' −デオキシグアノシンに対して特異的な蛍光応答を示す蛍光プローブ分子を固定したシリカゲル粒子に前記検体溶液を接触させる工程、及び
2)前記検体溶液との接触の前と後の前記シリカゲル粒子における物性変化を測定する工程を含み、
前記シリカゲル粒子の表面に固定されている、前記8−オキソ 2' −デオキシグアノシンに対して特異的な蛍光応答を示す蛍光プローブ分子と前記スペーサーユニットからなる基が、式(1)
- Xが前記スペーサーユニットを表し、Yが前記ヒドロキシ基の保護基を表す請求項1記載の方法。
- 前記シリカゲル粒子をマイクロプレートのウェルに入れて該ウェル内に乾着させ、該ウェル内に前記水性検体溶液を入れて加温しながらシリカゲル粒子の蛍光
強度を測定することにより前記定量検出を行う請求項1又は2記載の方法。 - 前記シリカゲル粒子をカラムに充填し、該カラムに前記水性検体溶液を流し、充填されたシリカゲル粒子の蛍光強度を測定することにより前記定量検出を行う請求項1又は2記載の方法。
- 表面に、式(1)
- Xが前記スペーサーユニットを表し、Yが前記ヒドロキシ基の保護基を表す請求項5記載のシリカゲル粒子。
- 8−オキソ 2' −デオキシグアノシンを分離するための分離カラムであって、請求項5又は6記載のシリカゲル粒子を充填材として使用する分離カラム。
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