WO2016204107A1 - 核酸架橋体、二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物及び二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法 - Google Patents

核酸架橋体、二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物及び二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2016204107A1
WO2016204107A1 PCT/JP2016/067494 JP2016067494W WO2016204107A1 WO 2016204107 A1 WO2016204107 A1 WO 2016204107A1 JP 2016067494 W JP2016067494 W JP 2016067494W WO 2016204107 A1 WO2016204107 A1 WO 2016204107A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
nucleic acid
reactive functional
double
amino group
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/067494
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
小松　康雄
直 小島
Original Assignee
国立研究開発法人産業技術総合研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立研究開発法人産業技術総合研究所 filed Critical 国立研究開発法人産業技術総合研究所
Priority to JP2017525213A priority Critical patent/JPWO2016204107A1/ja
Publication of WO2016204107A1 publication Critical patent/WO2016204107A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/46—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with hetero atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor

Definitions

  • the present invention relates to a cross-linked nucleic acid, a compound for binding a target molecule to a double-stranded nucleic acid, and a method for binding a target molecule to a double-stranded nucleic acid.
  • Composite molecules obtained by organically linking a functional compound such as a fluorescent dye to a synthetic nucleic acid are widely used for gene detection and the like in the field of molecular biology.
  • synthetic nucleic acids include proteins (enzymes, antibodies, etc.), peptides, sugars, from the viewpoint of improving the retention of nucleic acids in blood, suppressing biodegradability, and improving the arrival to specific cells. Research and development of complex molecules in which biological molecules such as chains are linked has been actively promoted.
  • double-stranded nucleic acids that form double strands with complementary base pair sequences control various functions such as gene expression and transcriptional repression by interacting with proteins in vivo. It is known. Therefore, research to develop double-stranded nucleic acid as a pharmaceutical molecule has been actively reported, and as a technique for improving the above-mentioned retention in blood, suppressing biodegradability, and reaching a specific cell, a functional component Many studies on the synthesis of complexes with biomolecules have been reported.
  • Non-patent Document 1 a double-stranded nucleic acid chemically linked with a functional molecule and an unmodified nucleic acid having a complementary sequence. It is adjusted by forming a double strand.
  • Non-patent Document 2 double-stranded nucleic acids that are associated by complementary base pair formation are easily dissociated into single strands by heating or addition of a hydrogen bond inhibitor or the like. Therefore, in order to accurately analyze the function as a double-stranded nucleic acid, it is necessary to link with a different molecule in a state where the dissociation of the double strand is suppressed.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and reduces the possibility of dissociation of a double-stranded nucleic acid, and can stably bind a double-stranded nucleic acid to a target molecule. It is an object to provide a compound for binding a molecule and a method for binding a target molecule to a double-stranded nucleic acid.
  • the nucleic acid cross-linked product according to the first aspect of the present invention comprises: A double-stranded nucleic acid comprising a first nucleic acid strand and a second nucleic acid strand comprising a base sequence that is completely or sufficiently complementary to the first nucleic acid strand, wherein an amino group is introduced;
  • General formula 1 A compound represented by The amino acid introduced into the double-stranded nucleic acid is covalently bonded to R 1 and R 2 so that the double-stranded nucleic acid is bonded to the compound.
  • Ar represents a trivalent aromatic group, and L 1 , L 2, and L 3 may each independently be a single bond or a branched group having 1 to 30 carbon atoms;
  • R 2 represents a second reactive functional group that forms a covalent bond with the amino group
  • R 3 is shared with the amino group, thiol group, azido group, or ethynyl group.
  • Represents a third reactive functional group forming a bond, L 1 , L 2 and L 3 may each independently be the same or different, R 1 , R 2 and R 3 are Each may be the same or different.
  • one amino group is introduced at the 3 ′ end of the first nucleic acid strand and one amino group is introduced at the 5 ′ end of the second nucleic acid strand, or 5 of the first nucleic acid strand.
  • One amino group is introduced at the 'end and one amino group is introduced at the 3' end of the second nucleic acid strand.
  • Ar is benzene, naphthalene, anthracene, phenanthrene, pyrene, chrysene, azulene, acenaphthene, fluorene, fluoranthene, tetracene or triphenylene.
  • Ar is benzene
  • L 1 and L 2 are single bonds
  • L 3 is an alkylamide group having 0 to 15 carbon atoms.
  • L 3 is a pentylamide group.
  • Ar represents a trivalent aromatic group, and L 1 , L 2, and L 3 may each independently be a single bond or a branched group having 1 to 30 carbon atoms;
  • R 2 represents a second reactive functional group that forms a covalent bond with the amino group
  • R 3 is shared with the amino group, thiol group, azido group, or ethynyl group.
  • Represents a third reactive functional group forming a bond, L 1 , L 2 and L 3 may each independently be the same or different, R 1 , R 2 and R 3 are Each may be the same or different.
  • one amino group is introduced at the 3 ′ end of the first nucleic acid strand and one amino group is introduced at the 5 ′ end of the second nucleic acid strand, or 5 of the first nucleic acid strand.
  • One amino group is introduced at the 'end and one amino group is introduced at the 3' end of the second nucleic acid strand.
  • the third reactive functional group includes maleimide group, thiol group, carboxyl group, aldehyde group, N-hydroxysuccinimide ester group, isothiocyanate group, ethynyl group, azide group, vinyl group, hydrazine group, epoxy group Or it is an isocyanate group.
  • Ar is benzene, naphthalene, anthracene, phenanthrene, pyrene, chrysene, azulene, acenaphthene, fluorene, fluoranthene, tetracene, or triphenylene.
  • Ar is benzene
  • the first reactive functional group and the second reactive functional group are N-hydroxysuccinimide ester groups.
  • the third reactive functional group is a maleimide group or a thiol group.
  • L 1 and L 2 are single bonds
  • L 3 is an alkylamide group having 0 to 15 carbon atoms.
  • L 3 is a pentylamide group.
  • L 1 , L 2 and L 3 are single bonds, and the first reactive functional group, the second reactive functional group, and the third reactive functional group are N-hydroxysuccinimide ester group.
  • a method for binding a target molecule to a double-stranded nucleic acid includes: (A) a double-stranded nucleic acid comprising a first nucleic acid strand and a second nucleic acid strand comprising a base sequence that is completely or sufficiently complementary to the first nucleic acid strand, wherein an amino group is introduced;
  • General formula 3 A compound represented by By mixing, the amino group introduced into the double-stranded nucleic acid by the covalent attachment of R 1 and R 2, by coupling the compound to the double-stranded nucleic acid, and obtaining a nucleic acid crosslinked,
  • (B) The nucleic acid cross-linked product obtained in the step (a) is mixed with a target molecule having an amino group, a thiol group, an azide group or an ethynyl group, and the amino group, thiol group of the target molecule, Binding R 3 to an azide group or ethynyl group to bind
  • Ar represents a trivalent aromatic group, and L 1 , L 2, and L 3 may each independently be a single bond or a branched group having 1 to 30 carbon atoms;
  • R 2 represents a second reactive functional group that forms a covalent bond with the amino group
  • R 3 is shared with the amino group, thiol group, azido group, or ethynyl group.
  • Represents a third reactive functional group forming a bond, L 1 , L 2 and L 3 may each independently be the same or different, R 1 , R 2 and R 3 are Each may be the same or different.
  • (A) is a double-stranded nucleic acid in which an amino group is introduced at the 3 ′ end of the first nucleic acid strand and the 5 ′ end of the second nucleic acid strand
  • (b) is a double strand of the second nucleic acid strand.
  • An amino group is introduced into the 5 ′ end of one nucleic acid strand and the 3 ′ end of the other nucleic acid strand of the second nucleic acid strand, and no amino group is introduced into the first nucleic acid strand.
  • the form of double stranded nucleic acid, (c), has an amino group introduced at the 3 ′ end of the first nucleic acid strand and the 5 ′ end of the second nucleic acid strand, and the 5 ′ end of the first nucleic acid strand and It is a figure explaining the double stranded nucleic acid of the form into which the amino group was introduce
  • FIG. 3 is a diagram schematically illustrating a process of crosslinking a double-stranded nucleic acid (double-stranded DNA) using bis-NHS-MI as a crosslinking reagent.
  • (A) is a diagram showing a graph of a nucleic acid cross-linked product of bis-NHS-MI of double-stranded DNA, and (b) 20% denaturation of the cross-linking reaction of bis-NHS-MI of double-stranded DNA. It is a figure which shows the analysis result by PAGE.
  • (A) is a diagram showing a graph of a nucleic acid cross-linked product of bis-NHS-MI of double-stranded RNA, and (b) 20% denaturation of the cross-linking reaction of bis-NHS-MI of double-stranded RNA. It is a figure which shows the analysis result by PAGE.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of analysis by reversed-phase column HPLC with 6-mercapto-1-hexanol (target molecule) bound to a nucleic acid cross-linked product of double-stranded DNA cross-linked by bis-NHS-MI.
  • A is a figure which shows the analysis result before reaction
  • (b) is a figure which shows the analysis result after reaction.
  • the compound according to the present invention is used for binding a target molecule (described below) to a double-stranded nucleic acid. More specifically, the compound according to the present invention can crosslink a double-stranded nucleic acid to form a nucleic acid cross-linked product, and further bind a target molecule to the nucleic acid cross-linked product.
  • the compound according to the present invention By using the compound according to the present invention, the possibility of dissociation of the double-stranded nucleic acid can be reduced, and the target molecule can be stably bound to the double-stranded nucleic acid.
  • nucleic acid-target molecule complex A compound in which a double-stranded nucleic acid is cross-linked with a compound according to the present invention to form a nucleic acid cross-linked product and a target molecule is bound to the nucleic acid cross-linked product (hereinafter referred to as “nucleic acid-target molecule complex”) is molecular biology. In this field, it is used for gene detection and the like, and in the field of medicine, by using a nucleic acid-target molecule complex, the retention of double-stranded nucleic acid in blood, suppression of biodegradability, suppression to specific cells, Effects such as reachability improvement can be obtained.
  • the compound according to the present invention may be referred to as a “crosslinking reagent”.
  • a reaction for crosslinking a double-stranded nucleic acid with the compound (crosslinking reagent) according to the present invention may be referred to as a “crosslinking reaction”.
  • the compound according to the present invention is represented by the following general formula.
  • Ar represents a trivalent aromatic group, and examples thereof include benzene, naphthalene, anthracene, phenanthrene, pyrene, chrysene, azulene, acenaphthene, fluorene, fluoranthene, tetracene, and triphenylene.
  • Ar is preferably benzene.
  • L 1 , L 2 and L 3 are each independently a single bond or a branched group having 1 to 30 carbon atoms, may contain an alicyclic group, and may contain 1 or 2 or more. It represents a divalent linking group composed of a substituted or unsubstituted aliphatic hydrocarbon which may contain a hetero atom.
  • L 1 , L 2 and L 3 preferably have 1 to 20 carbon atoms.
  • L 1 , L 2 and L 3 may be the same or different independently.
  • L 1 and L 2 may be a single bond and L 3 may be an alkylamide group having 0 to 15 carbon atoms; L 1 and L 2 may be a single bond, and L 3 may be a pentylamide group.
  • L 1 , L 2 and L 3 may be a single bond.
  • R 1 represents a first reactive functional group that forms a covalent bond with the amino group introduced into the double-stranded nucleic acid
  • R 2 is shared with the amino group introduced into the double-stranded nucleic acid
  • R 3 represents a second reactive functional group that forms a bond
  • R 3 represents a third reactive functional group that forms a covalent bond with the amino group, thiol group, azide group, or ethynyl group of the target molecule.
  • R 1 (first reactive functional group) and R 2 (second reactive functional group) are each independently, for example, carboxyl group, aldehyde group, N-hydroxysuccinimide ester group or derivative thereof, active ester group
  • An epoxy group, a haloalkyl group, or the like may be used.
  • the active ester group include an isothiocyanate group, a pentafluorophenyl ester group, a pentachlorophenyl ester group, and a paranitrophenyl group.
  • the haloalkyl group represents an optionally branched alkyl group having 1 to 5 carbon atoms and having a halogen atom selected from the group consisting of fluorine, chlorine, bromine and iodine.
  • R 3 (third reactive functional group) is, for example, maleimide group, thiol group, carboxyl group, aldehyde group, N-hydroxysuccinimide ester group, isothiocyanate group, ethynyl group, azide group, vinyl group, hydrazine group
  • An epoxy group, an isocyanate group, or the like may be used.
  • R 1 (first reactive functional group) and R 2 (second reactive functional group) are preferably N-hydroxysuccinimide ester groups.
  • R 3 (third reactive functional group) is preferably a maleimide group or a thiol group. All of R 1 (first reactive functional group), R 2 (second reactive functional group) and R 3 (third reactive functional group) may be N-hydroxysuccinimide ester groups.
  • Ar is benzene
  • L 1 , L 2 and L 3 are single bonds
  • R Examples include the following compounds in which 2 (second reactive functional group) and R 3 (third reactive functional group) are N-hydroxysuccinimide ester groups.
  • the cross-linked nucleic acid according to the present invention comprises a double-stranded nucleic acid and the same compound according to the present invention (crosslinking reagent, the following general formula), and the amino group introduced into the double-stranded nucleic acid is R 1 and R By covalently binding to 2 , the double-stranded nucleic acid is bound to the compound (crosslinking reagent).
  • R 3 is represented by the following general formula, by forming a covalent bond amino group of the target molecule, a thiol group, an azide group, or an ethynyl group can be attached to a target molecule to a nucleic acid crosslinked body.
  • nucleic acid-target molecule complex a nucleic acid cross-linked product in which a target molecule is bound may be referred to as a “nucleic acid-target molecule complex”.
  • the nucleic acid-target molecule complex is used for gene detection in the field of molecular biology, and in the field of medicine, the nucleic acid-target molecule complex is used to improve the retention of double-stranded nucleic acid in blood. In addition, effects such as suppression of biodegradability and improvement of ability to reach specific cells can be obtained.
  • Two nucleic acid strands (namely, the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand) in the double-stranded nucleic acid are DNA; RNA; 2′-O-methylated RNA (hereinafter referred to as 2′-OMe RNA), Locked Modified nucleic acid derivatized with the sugar moiety of nucleic acid such as nucleic acid (hereinafter referred to as LNA); modified nucleic acid derivatized with phosphodiester bond (for example, phosphate thioester bond in which oxygen atom is converted to sulfur atom); other It may be a modified nucleic acid; or a mixture thereof.
  • LNA lockeded Modified nucleic acid derivatized with the sugar moiety of nucleic acid
  • LNA lockeded Modified nucleic acid derivatized with phosphodiester bond (for example, phosphate thioester bond in which oxygen atom is converted to sulfur atom); other It may be a modified nucleic
  • the “base sequence completely complementary to the first nucleic acid strand” refers to a base sequence that can pair with all the bases of the base sequence of the first nucleic acid strand.
  • the “base sequence sufficiently complementary to the first nucleic acid strand” means 50% or more and less than 100%, preferably 60% or more and less than 100%, more preferably the first nucleic acid strand. Means a base sequence capable of pairing with 70% or more and less than 100%, more preferably 80% or more and less than 100%, and even more preferably 90% or more and less than 100%.
  • FIG. 1 (a) shows a form in which amino groups are introduced into the 3 'end of the first nucleic acid strand and the 5' end of the second nucleic acid strand.
  • An amino group may be introduced at the 5 'end of the first nucleic acid strand and the 3' end of the second nucleic acid strand.
  • the double-stranded nucleic acid may form a hairpin loop structure at the end opposite to the end where the amino group is introduced.
  • the lengths of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand are not particularly limited, and can be appropriately set within a range of, for example, several tens mer, several hundred mer, and several thousand mer (for example, an amino group is
  • the combined synthetic nucleic acid is made into a long chain of about several thousand mer using an enzyme or the like (including a PCR method), which can be used as a first nucleic acid chain and a second nucleic acid chain.
  • the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand may have the same length or different lengths. The case where the lengths of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand are different are, for example, in FIG.
  • the second nucleic acid strand is composed of two nucleic acid strands, and an amino group is introduced into the 5 ′ end of one nucleic acid strand and the 3 ′ end of the other nucleic acid strand of the second nucleic acid strand.
  • the first nucleic acid strand no amino group is introduced.
  • the first nucleic acid strand is composed of two nucleic acid strands, an amino group is introduced into the 3 ′ end of one nucleic acid strand of the first nucleic acid strand and the 5 ′ end of the other nucleic acid strand, and the second nucleic acid strand
  • the chain may be in a form in which no amino group is introduced.
  • both the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand are composed of two nucleic acid strands, and an amino group is present at the 3 ′ end of one nucleic acid strand of the first nucleic acid strand and the 5 ′ end of the other nucleic acid strand. May be introduced, and an amino group may be introduced into the 5 ′ end of one nucleic acid strand and the 3 ′ end of the other nucleic acid strand of the second nucleic acid strand.
  • the double-stranded nucleic acid may form a hairpin loop structure at at least one end.
  • One second nucleic acid strand” and “the other second nucleic acid strand” may have the same length or different lengths. Further, for example, in FIG. 1B, at least one of the 5 ′ end side and the 3 ′ end side of the first nucleic acid strand has a chain length of about 0.1 to 10% of the chain length of the first nucleic acid strand. A base sequence having (not complementary to the second nucleic acid strand) may be additionally bonded.
  • FIG. 1C shows an amino group introduced at the 5 ′ end of the first nucleic acid strand and the 3 ′ end of the second nucleic acid strand, and the 3 ′ end of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand. This is a form in which an amino group is introduced at the 5 ′ end.
  • the lengths of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand are not particularly limited, and can be appropriately set within a range of, for example, several tens mer, several hundred mer, and several thousand mer (for example, an amino group is
  • the combined synthetic nucleic acid is made into a long chain of about several thousand mer using an enzyme or the like (including a PCR method), which can be used as a first nucleic acid chain and a second nucleic acid chain.
  • the method for introducing an amino group into a double-stranded nucleic acid is not particularly limited as long as it is a method in which an amino group is introduced into a predetermined position of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand.
  • SSH-linker Sigma-Aldrich, “SSH” in the figure below
  • 3′-CA-amino-linker revH-linker, Gene Design, “revH” in the figure below
  • C6 C6
  • the compound for binding a target molecule to a double-stranded nucleic acid according to the present invention relates to the use of the compound according to the present invention for binding a target molecule to a double-stranded nucleic acid.
  • the details of the double-stranded nucleic acid and the target molecule are the same as described above.
  • the compound for binding the target molecule to the double-stranded nucleic acid according to the present invention is: The following general formula In expressed, duplexes amino group introduced into the nucleic acid is covalently bound R 1 and R 2, by the covalent attachment of R 3 to an amino group, a thiol group, an azide group or an ethynyl group having the target molecule, A target molecule is bound to a double-stranded nucleic acid.
  • the method is also a method for producing the nucleic acid-target molecule complex described above.
  • a method for binding a target molecule to a double-stranded nucleic acid comprises: (A) a double-stranded nucleic acid; The following general formula A compound represented by Are mixed, by the covalent attachment of R 1 and R 2 the amino group introduced into the double-stranded nucleic acid, by coupling the compound to double-stranded nucleic acid, and obtaining a nucleic acid crosslinked, (B) The nucleic acid cross-linked product obtained in step (a) is mixed with a target molecule having an amino group, thiol group, azide group or ethynyl group, and the amino group, thiol group or azide group possessed by the target molecule Or a step of covalently bonding R 3 to an ethynyl group to bind a target molecule to a nucleic acid cross-linked product, including.
  • a phosphate buffer and / or water is added to a mixture of the first nucleic acid strand and the second nucleic acid strand, and the mixture is heated at a high temperature (eg, 90 ° C.) and cooled. Then, a solution of a crosslinking reagent (for example, one dissolved in N, N-dimethylformamide (DMF)) is added and reacted at, for example, 27 ° C. to obtain a nucleic acid crosslinked product.
  • a crosslinking reagent for example, one dissolved in N, N-dimethylformamide (DMF)
  • nucleic acid-target molecule complex since the possibility that the double strand is dissociated in the process of producing the nucleic acid-target molecule complex is reduced, the nucleic acid-target molecule complex can be easily synthesized. Further, since the possibility of dissociating double strands during the purification process of the nucleic acid-target molecule complex is reduced, handling of the nucleic acid-target molecule complex can be greatly simplified. For this reason, it is used as a “double-stranded nucleic acid-protein complex” (target molecule: protein) in pharmaceuticals, biosensors, etc., and “double-stranded nucleic acid-nucleic acid complex” (target molecule: nucleic acid) or “double-stranded”. Application to biosensors and the like is expected as “nucleic acid-double-stranded nucleic acid complex” (target molecule: double-stranded nucleic acid).
  • the obtained residue was purified by silica gel column chromatography (eluent: ethyl acetate-hexane) to give 316 mg of the title compound as a pale red foam.
  • the obtained compound was purified again by silica gel column chromatography (neutral silica gel, elution solvent: ethanol-chloroform) to obtain 268 mg (39%) of the title compound (bis-NHS-MI, compound 3) as a white foam. It was.
  • Sp25-revH / ssH-as25 A double-stranded DNA consisting of a revH-linker linked to the 3 ′ end of Sp25 (SEQ ID NO: 1) and a ssH-linker linked to the 5 ′ end of as25 (SEQ ID NO: 2) .
  • Sp25-C6 / C6-as25 It is a double-stranded DNA consisting of a C25-linker linked to the 3 ′ end of Sp25 (SEQ ID NO: 1) and a C6-linker linked to the 5 ′ end of as25 (SEQ ID NO: 2). .
  • a DMF solution of a crosslinking reagent (2 mM bis-NHS-MI / DMF, 10 ⁇ L) was added (total amount 50 ⁇ L) to start the reaction.
  • the reaction was carried out at 27 ° C., a part of the reaction solution was sampled at regular intervals, and the product (crosslinked nucleic acid) was analyzed by 20% denaturing polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the nucleic acid cross-linked product of the double-stranded DNA of Sp25-revH / ssH-as25 is shown below.
  • FIG. 3 (a) a graph of the nucleic acid cross-linked product is shown in FIG. 3 (a), and the analysis result by 20% denatured PAGE is shown in FIG. 3 (b).
  • Sp25-revH / ssH-as25 bis CL represents a nucleic acid cross-linked product of Sp25-revH / ssH-as25 (double-stranded DNA) and bis-NHS-MI.
  • C6 / C6-as25 bis CL represents a nucleic acid cross-linked product of Sp25-C6 / C6-as25 (double-stranded DNA) and bis-NHS-MI.
  • RNA against luciferase mRNA having amino groups at the opposite 5 ′ and 3 ′ ends
  • a cross-linking reagent bis-NHS-MI
  • the same ssH-linker and revH-linker as in Example 2 were used for amino group introduction.
  • the crosslinking reaction with the crosslinking reagent (bis-NHS-MI) and the analysis with the modified PAGE were performed in the same manner as in Example 2.
  • the nucleic acid cross-linked product of this double-stranded RNA is shown below.
  • LH21-revH / LH21b It is a double-stranded RNA consisting of a revH-linker linked to the 3 ′ end of the RNA strand of SEQ ID NO: 3 and a ssH-linker linked to the 5 ′ end of the RNA strand of SEQ ID NO: 4. .
  • HPLC conditions are shown below. B%: 0-100% / 20 min (A buffer: 5% CH 3 CN, 0.1M TEAA, B buffer: 25% CH 3 CN, 0.1M TEAA) Column temperature: room temperature
  • HPLC conditions are shown below. B%: 30-100% / 20 min (A buffer: 5% CH 3 CN, 0.1M TEAA, B buffer: 25% CH 3 CN, 0.1M TEAA) Column temperature: room temperature
  • Fig. 5 (a) shows the analysis results before the reaction
  • Fig. 5 (b) shows the analysis results after the reaction.
  • the peak of the crosslinked nucleic acid due to the double-stranded DNA of the raw material disappeared, and the peak of the substance (nucleic acid-target molecule complex) to which 6-mercapto-1-hexanol was bound was confirmed.
  • a double-stranded nucleic acid comprising a first nucleic acid strand and a second nucleic acid strand comprising a base sequence that is completely or sufficiently complementary to the first nucleic acid strand, wherein an amino group is introduced;
  • General formula 1 A compound represented by A nucleic acid cross-linked product in which the double-stranded nucleic acid is bound to the compound by covalently bonding an amino group introduced into the double-stranded nucleic acid to R 1 and R 2 .
  • Ar represents a trivalent aromatic group, and L 1 , L 2, and L 3 may each independently be a single bond or a branched group having 1 to 30 carbon atoms;
  • R 2 represents a second reactive functional group that forms a covalent bond with the amino group
  • R 3 is shared with the amino group, thiol group, azido group, or ethynyl group.
  • Represents a third reactive functional group forming a bond, L 1 , L 2 and L 3 may each independently be the same or different, R 1 , R 2 and R 3 are Each may be the same or different.
  • the first reactive functional group and the second reactive functional group are each independently a carboxyl group, an aldehyde group, an N-hydroxysuccinimide ester group or a derivative thereof, an active ester group, an epoxy group, or a haloalkyl group.
  • the third reactive functional group includes maleimide group, thiol group, carboxyl group, aldehyde group, N-hydroxysuccinimide ester group, isothiocyanate group, ethynyl group, azide group, vinyl group, hydrazine group, epoxy group or isocyanate.
  • a nat group The nucleic acid cross-linked product according to any one of appendices 1 to 3, characterized in that:
  • Ar is benzene, naphthalene, anthracene, phenanthrene, pyrene, chrysene, azulene, acenaphthene, fluorene, fluoranthene, tetracene or triphenylene.
  • Ar is benzene.
  • the first reactive functional group and the second reactive functional group are N-hydroxysuccinimide ester groups.
  • the third reactive functional group is a maleimide group or a thiol group,
  • L 3 is a pentylamide group.
  • a compound for binding a target molecule to a double-stranded nucleic acid comprising a first nucleic acid strand and a second nucleic acid strand comprising a base sequence completely or sufficiently complementary to the first nucleic acid strand,
  • General formula 2 Represented by Wherein the amino group introduced into the double-stranded nucleic acid is covalently bound to R 1 and R 2, by the covalent attachment of R 3 to an amino group, a thiol group, an azide group or an ethynyl group having the target molecules, the two Binding the target molecule to a strand nucleic acid; A compound for binding a target molecule to a double-stranded nucleic acid.
  • Ar represents a trivalent aromatic group, and L 1 , L 2, and L 3 may each independently be a single bond or a branched group having 1 to 30 carbon atoms;
  • R 2 represents a second reactive functional group that forms a covalent bond with the amino group
  • R 3 is shared with the amino group, thiol group, azido group, or ethynyl group.
  • Represents a third reactive functional group forming a bond, L 1 , L 2 and L 3 may each independently be the same or different, R 1 , R 2 and R 3 are Each may be the same or different.
  • the first reactive functional group and the second reactive functional group are each independently a carboxyl group, an aldehyde group, an N-hydroxysuccinimide ester group or a derivative thereof, an active ester group, an epoxy group, or a haloalkyl group. , 14.
  • the third reactive functional group includes maleimide group, thiol group, carboxyl group, aldehyde group, N-hydroxysuccinimide ester group, isothiocyanate group, ethynyl group, azide group, vinyl group, hydrazine group, epoxy group or isocyanate.
  • a nat group, 15. The compound body according to any one of appendices 12 to 14, characterized in that:
  • the third reactive functional group is a maleimide group or a thiol group, 19.
  • (Appendix 23) (A) a double-stranded nucleic acid comprising a first nucleic acid strand and a second nucleic acid strand comprising a base sequence that is completely or sufficiently complementary to the first nucleic acid strand, wherein an amino group is introduced;
  • General formula 3 A compound represented by By mixing, the amino group introduced into the double-stranded nucleic acid by the covalent attachment of R 1 and R 2, by coupling the compound to the double-stranded nucleic acid, and obtaining a nucleic acid crosslinked,
  • (B) The nucleic acid cross-linked product obtained in the step (a) is mixed with a target molecule having an amino group, a thiol group, an azide group or an ethynyl group, and the amino group, thiol group of the target molecule, Binding R 3 to an azide group or ethynyl group to bind the target molecule to the nucleic acid cross-linked product;
  • the third reactive functional group includes maleimide group, thiol group, carboxyl group, aldehyde group, N-hydroxysuccinimide ester group, isothiocyanate group, ethynyl group, azide group, vinyl group, hydrazine group, epoxy group or isocyanate.
  • a nat group, 26. The method according to any one of appendices 23 to 25, wherein
  • the third reactive functional group is a maleimide group or a thiol group, 30.
  • L 1 and L 2 are a single bond
  • L 3 is an alkylamide group having 0 to 15 carbon atoms.
  • L 3 is a pentylamide group.
  • (Appendix 34) Formula 4 A compound represented by (In the formula, Ar represents a trivalent aromatic group, and L 1 , L 2, and L 3 may each independently be a single bond or a branched group having 1 to 30 carbon atoms; Represents a divalent linking group consisting of a substituted or unsubstituted aliphatic hydrocarbon which may contain 1 or 2 or more heteroatoms, and R 1 and R 2 are each independently Represents a carboxyl group, an aldehyde group, an N-hydroxysuccinimide ester group or a derivative thereof, an active ester group, an epoxy group or a haloalkyl group, and R 3 represents a maleimide group, a thiol group, a carboxyl group, an aldehyde group, an N-hydroxysuccinimide ester group , isothiocyanate group, an ethynyl group, an azide group, a vinyl group, a hydrazine group, .L
  • Ar is benzene, naphthalene, anthracene, phenanthrene, pyrene, chrysene, azulene, acenaphthene, fluorene, fluoranthene, tetracene or triphenylene. 35. The compound according to appendix 34, wherein
  • Ar is benzene.
  • R 1 and R 2 are N-hydroxysuccinimide ester groups. 37. The compound according to any one of appendices 34 to 36, wherein

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pyrrole Compounds (AREA)

Abstract

核酸架橋体は、第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなり、アミノ基が導入された二本鎖核酸と、一般式で表される化合物と、からなり、前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基がＲ１及びＲ２に共有結合することで、前記二本鎖核酸が前記化合物に結合している。（式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）

Description

核酸架橋体、二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物及び二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法
　本発明は、核酸架橋体、二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物及び二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法に関する。
　合成核酸（オリゴヌクレオチド）に蛍光色素等の機能性化合物を有機化学的に連結させた複合分子は、分子生物学の分野では、遺伝子検出等、広く利用されている。特に、医薬開発の分野においては、核酸の血中滞留性の向上、生分解性の抑制、特定細胞への到達を向上させる観点から、合成核酸に、タンパク質（酵素、抗体等）、ペプチド、糖鎖等の生体関連分子を連結させた複合分子の研究開発が活発に進められている。
　一方で、相補的な塩基対の配列により二本鎖を形成した二本鎖核酸は、生体内においてタンパク質と相互作用することで、遺伝子の発現、転写抑制等の様々な機能を制御していることが知られている。そのため、二本鎖核酸を医薬分子として開発する研究も盛んに報告されており、上述した血中滞留性の向上、生分解性の抑制、特定細胞への到達を向上させる技術として、機能成分子や生体関連分子との複合体の合成研究が数多く報告されている。
　通常、このような二本鎖核酸と異分子との複合体の調製は、機能性分子を化学的に連結させた一本鎖の核酸と、相補的配列を有する未修飾の核酸と、の間で二本鎖を形成させることにより調整されている（非特許文献１）。しかしながら、相補的な塩基対形成により会合している二本鎖核酸は、加熱や水素結合阻害剤等の添加により容易に一本鎖へと解離してしまう。そのため、二本鎖核酸としての機能を正確に解析するためには、二本鎖の解離を抑制した状態で異分子と連結させる必要がある（非特許文献２）。
　非特許文献３には、ヘアピン構造により二本鎖を形成している核酸に、異分子（シグナルペプチド）を連結させる手法が報告されている。非特許文献４でも同様に、ヘアピン構造により二本鎖を形成している核酸と第３の分子との複合体を合成したことが報告されている。
Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ　４３２，２００４，１７３，Ｃｚａｕｄｅｒｎａ，Ｆ．ｅｔ　ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．３１，２００３，２７０５ Ｄｅｆｒａｎｃｑ，Ｅ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９，２００９，６５３４ Ｚａｎｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９６，１９９９，９１ Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｓ．，Ｕｅｎｏ，Ｈ．，Ｓｕｎａｄｏｍｅ，Ｔ．，Ｓａｔｏ，Ｋ．ａｎｄ　Ｍａｔｓｕｄａ，Ａ．Ｔｒｉｓ（ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；ａ　ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｆｏｒ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ　ｄｕｍｂｂｅｌｌ　ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｌｅｔｔ．２０１３，　１５，６９４－６９７．
　しかしながら、非特許文献３、４の方法は、複合体の作製にあたってヘアピン構造を有する長鎖のオリゴヌクレオチドを要するため、コストが高くなる傾向にあり、その利用が限定的なものとならざるを得ない点で課題を残していた。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、二本鎖核酸の解離の可能性を低減して、二本鎖核酸を標的分子に安定的に結合させることができる核酸架橋体、標的分子を結合させるための化合物、及び二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る核酸架橋体は、
　第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなり、アミノ基が導入された二本鎖核酸と、
　一般式１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　で表される化合物と、
　からなり、前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基がＲ１及びＲ２に共有結合することで、前記二本鎖核酸が前記化合物に結合している。
（式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）
　例えば、前記第一の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入されている、又は前記第一の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入されている。
　例えば、前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、それぞれ独立に、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基若しくはその誘導体、活性エステル基、エポキシ基又はハロアルキル基である。
　例えば、前記第三の反応性官能基は、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアナート基、エチニル基、アジド基、ビニル基、ヒドラジン基、エポキシ基又はイソシアナート基である。
　例えば、前記一般式１において、Ａｒは、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、クリセン、アズレン、アセナフテン、フルオレン、フルオランテン、テトラセン又はトリフェニレンである。
　例えば、前記一般式１において、Ａｒは、ベンゼンである。
　例えば、前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である。
　例えば、前記第三の反応性官能基は、マレイミド基又はチオール基である。
　例えば、前記一般式１において、Ｌ１及びＬ２は、単結合であり、Ｌ３は、炭素数０～１５のアルキルアミド基である。
　例えば、前記一般式１において、Ｌ３は、ペンチルアミド基である。
　例えば、前記一般式１において、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、単結合であり、前記第一の反応性官能基、前記第二の反応性官能基及び前記第三の反応性官能基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である。
　本発明の第２の観点に係る二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物は、
　第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなる二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物であって、
　一般式２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 　で表され、
　前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基にＲ１及びＲ２を共有結合させ、標的分子が有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基にＲ３を共有結合させることで、前記二本鎖核酸に前記標的分子を結合させる、
　ことを特徴とする。
（式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）
　例えば、前記第一の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入されている、又は前記第一の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入されている。
　例えば、前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、それぞれ独立に、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基若しくはその誘導体、活性エステル基、エポキシ基又はハロアルキル基である。
　例えば、前記第三の反応性官能基は、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアナート基、エチニル基、アジド基、ビニル基、ヒドラジン基、エポキシ基又はイソシアナート基である。
　例えば、前記一般式２において、Ａｒは、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、クリセン、アズレン、アセナフテン、フルオレン、フルオランテン、テトラセン又はトリフェニレンである。
　例えば、前記一般式２において、Ａｒは、ベンゼンである。
　例えば、前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である。
　例えば、前記第三の反応性官能基は、マレイミド基又はチオール基である。
　例えば、前記一般式２において、Ｌ１及びＬ２は、単結合であり、Ｌ３は、炭素数０～１５のアルキルアミド基である。
　例えば、前記一般式２において、Ｌ３は、ペンチルアミド基である。
　例えば、前記一般式２において、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、単結合であり、前記第一の反応性官能基、前記第二の反応性官能基及び前記第三の反応性官能基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である。
　本発明の第３の観点に係る二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法は、
　（ａ）第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなり、アミノ基が導入された二本鎖核酸と、
　一般式３
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　で表される化合物と、
　を混合して、前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基にＲ１及びＲ２を共有結合させることで、前記二本鎖核酸に前記化合物を結合させて、核酸架橋体を得る工程と、
　（ｂ）前記工程（ａ）で得られた核酸架橋体と、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基を有する標的分子と、を混合して、前記標的分子が有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基にＲ３を共有結合させることで、前記核酸架橋体に前記標的分子を結合させる工程と、
　を含む。
（式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）
　本発明によれば、二本鎖核酸の解離の可能性を低減して、二本鎖核酸を標的分子に安定的に結合させることができる核酸架橋体、標的分子を結合させるための化合物、及び二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法を提供することができる。
二本鎖核酸に、本発明による化合物（架橋化試薬）を介して、標的分子を結合させる過程を模式的に説明する図である。（ａ）は第一の核酸鎖の３’末端及び第二の核酸鎖の５’末端にアミノ基が導入された形態の二本鎖核酸、（ｂ）は第二の核酸鎖が２本の核酸鎖からなり、第二の核酸鎖の一方の核酸鎖の５’末端及び他方の核酸鎖の３’末端にアミノ基が導入され、第一の核酸鎖には、アミノ基が導入されていない形態の二本鎖核酸、（ｃ）は、第一の核酸鎖の３’末端及び第二の核酸鎖の５’末端にアミノ基が導入され、かつ、第一の核酸鎖の５’末端及び第二の核酸鎖の３’末端にアミノ基が導入された形態の二本鎖核酸を説明する図である。 二本鎖核酸（２本鎖ＤＮＡ）を、架橋化試薬としてｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩを用いて架橋化する過程を模式的に説明する図である。 （ａ）は、２本鎖ＤＮＡのｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩによる核酸架橋体のグラフを示す図であり、（ｂ）は、２本鎖ＤＮＡのｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩによる架橋化反応の２０％変性ＰＡＧＥによる分析結果を示す図である。 （ａ）は、２本鎖ＲＮＡのｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩによる核酸架橋体のグラフを示す図であり、（ｂ）は、２本鎖ＲＮＡのｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩによる架橋化反応の２０％変性ＰＡＧＥによる分析結果を示す図である。 ｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩによって架橋化された２本鎖ＤＮＡによる核酸架橋体に、６－ｍｅｒｃａｐｔｏ－１－ｈｅｘａｎｏｌ（標的分子）を結合させて逆相カラムＨＰＬＣによって分析した結果を示す図である。（ａ）は、反応前の分析結果、（ｂ）は、反応後の分析結果を示す図である。
　まず、本発明による化合物について詳細に説明する。
　本発明による化合物は、二本鎖核酸に標的分子（下述）を結合させるために用いられる。より具体的には、本発明による化合物は、二本鎖核酸を架橋化させて核酸架橋体とし、さらに該核酸架橋体に標的分子を結合させることができる。本発明による化合物を用いることで、二本鎖核酸の解離の可能性を低減して、二本鎖核酸に標的分子を安定的に結合させることができる。本発明による化合物によって、二本鎖核酸を架橋化させて核酸架橋体とし、さらに該核酸架橋体に標的分子を結合させたもの（後述する「核酸－標的分子複合体」）は、分子生物学の分野では、遺伝子検出等に用いられ、医薬の分野においては、核酸－標的分子複合体を用いることで、二本鎖核酸の血中滞留性の向上、生分解性の抑制、特定細胞への到達能向上等の効果を得ることができる。なお、本願明細書において、本発明による化合物を「架橋化試薬」という場合がある。また、本願明細書において、本発明による化合物（架橋化試薬）によって二本鎖核酸を架橋化させる反応を「架橋化反応」という場合がある。
　本願明細書において、「標的分子」とは、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基を有するタンパク質、核酸（二本鎖状を含む）、有機分子等を表す。標的分子は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基を有するが、標的分子がこれらの基を元々有していてもよく、標的分子にこれらの基が有機化学的に導入されてもよい。
　本発明による化合物は、下記の一般式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　上記式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、クリセン、アズレン、アセナフテン、フルオレン、フルオランテン、テトラセン、トリフェニレン等が挙げられる。Ａｒは、好ましくはベンゼンである。
　上記式中、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の炭素数は、好ましくは１～２０である。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。例えば、Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が炭素数０～１５のアルキルアミド基であってもよく；Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３がペンチルアミド基であってもよく；Ｌ１、Ｌ２及びＬ３が単結合であってもよい。
　上記式中、Ｒ１は、二本鎖核酸に導入されたアミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、二本鎖核酸に導入されたアミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、標的分子が有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。このように、Ｒ１（第一の反応性官能基）及びＲ２（第二の反応性官能基）が二本鎖核酸に結合し、Ｒ３（第三の反応性官能基）が標的分子に結合することで、本発明による化合物（架橋化試薬）を介して、二本鎖核酸に標的分子を連結させることができる。なお、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。
　Ｒ１（第一の反応性官能基）及びＲ２（第二の反応性官能基）は、それぞれ独立に、例えば、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基又はその誘導体、活性エステル基、エポキシ基、ハロアルキル基等であってもよい。活性エステル基として、例えば、イソチオシアナート基、ペンタフルオロフェニルエステル基、ペンタクロロフェニルエステル基、パラニトロフェニル基等を挙げることができる。ハロアルキル基は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素からなる群より少なくとも１つ選択されたハロゲン原子を有する、分岐していてもよい炭素数１～５のアルキル基を表す。
　Ｒ３（第三の反応性官能基）は、例えば、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアナート基、エチニル基、アジド基、ビニル基、ヒドラジン基、エポキシ基、イソシアナート基等であってもよい。
　Ｒ１（第一の反応性官能基）及びＲ２（第二の反応性官能基）は、好ましくは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である。Ｒ３（第三の反応性官能基）は、好ましくは、マレイミド基又はチオール基である。Ｒ１（第一の反応性官能基）、Ｒ２（第二の反応性官能基）及びＲ３（第三の反応性官能基）のすべてがＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基であってもよい。
　本発明による化合物（架橋化試薬）として、上記式中、Ａｒがベンゼンであり、Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３がペンチルアミド基であり、Ｒ１（第一の反応性官能基）及びＲ２（第二の反応性官能基）がＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基であり、Ｒ３（第三の反応性官能基）がマレイミド基である、下記化合物（ｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩ）を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　また、本発明による化合物（架橋化試薬）として、上記式中、Ａｒがベンゼンであり、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３が単結合であり、Ｒ１（第一の反応性官能基）、Ｒ２（第二の反応性官能基）及びＲ３（第三の反応性官能基）がＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、下記化合物を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　次に、本発明による核酸架橋体について詳細に説明する。
　本発明による核酸架橋体は、二本鎖核酸と、上記同様の本発明による化合物（架橋化試薬、下記一般式）と、からなり、二本鎖核酸に導入されたアミノ基がＲ１及びＲ２に共有結合することで、二本鎖核酸が化合物（架橋化試薬）に結合しているものである。なお、下記一般式のＲ３が、標的分子の有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成することで、核酸架橋体に標的分子を結合させることができる。本願明細書において、核酸架橋体に標的分子を結合させたものを「核酸－標的分子複合体」と称する場合がある。核酸－標的分子複合体は、分子生物学の分野では、遺伝子検出等に用いられ、医薬の分野においては、核酸－標的分子複合体を用いることで、二本鎖核酸の血中滞留性の向上、生分解性の抑制、特定細胞への到達能向上等の効果を得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　上記式中、Ａｒ、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３、並びにＲ１（第一の反応性官能基）、Ｒ２（第二の反応性官能基）及びＲ３（第三の反応性官能基）の詳細については、前述同様である。
　本発明による核酸架橋体を構成する二本鎖核酸は、第一の核酸鎖と、第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖と、からなり、アミノ基が導入されたものである。
　二本鎖核酸における２本の核酸鎖（すなわち第一の核酸鎖及び第二の核酸鎖）は、ＤＮＡ；ＲＮＡ；２’－Ｏ－メチル化ＲＮＡ（以下、２’－ＯＭｅ　ＲＮＡという）、Ｌｏｃｋｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（以下、ＬＮＡという）等の核酸の糖部を誘導体化した修飾核酸；リン酸ジエステル結合を誘導体化した修飾核酸（例えば、酸素原子を硫黄原子に変換したリン酸チオエステル結合）；その他の修飾核酸；又はそれらの混合物であってもよい。なお、これらの修飾核酸については、例えば、Ｄｅｌｅａｖｅｙ，Ｇ．Ｆ．ａｎｄ　Ｄａｍｈａ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９，９３７－９５４，２０１２に開示される。　
　本明細書において、“第一の核酸鎖に完全に相補的な塩基配列”とは、第一の核酸鎖の塩基配列のすべての塩基と対合し得る塩基配列をいう。
　本明細書において、“第一の核酸鎖に十分に相補的な塩基配列”とは、第一の核酸鎖の塩基配列の５０％以上１００％未満、好ましくは６０％以上１００％未満、より好ましくは７０％以上１００％未満、さらに好ましくは８０％以上１００％未満、さらにより好ましくは９０％以上１００％未満の塩基と対合し得る塩基配列をいう。より具体的には、第一の核酸鎖の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列において、例えば、１又は２～４の塩基を他の塩基に置換した結果、その置換した位置におけるヌクレオチド残基が対合できなくなった場合（この場合、他の塩基に置換した位置を“ミスマッチ部位”という）；第一の核酸鎖の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列において、例えば、１又は２～４の塩基を欠失した結果、その欠失した位置におけるヌクレオチド残基が対合できなくなった場合等を挙げることができる。
　本発明による核酸架橋体を構成する二本鎖核酸には、アミノ基が導入されている。二本鎖核酸へのアミノ基の導入箇所について、図１に３つの例を挙げて説明する。
　図１（ａ）は、第一の核酸鎖の３’末端及び第二の核酸鎖の５’末端にアミノ基が導入された形態である。なお、第一の核酸鎖の５’末端及び第二の核酸鎖の３’末端にアミノ基が導入されていてもよい。また、この場合、二本鎖核酸は、アミノ基が導入された末端とは反対側の末端において、ヘアピンループ構造を形成していてもよい。第一核酸鎖及び第二核酸鎖の長さは、特に限定されるものではなく、例えば、数十ｍｅｒ、数百ｍｅｒ、数千ｍｅｒの範囲であれば適宜設定され得る（例えば、アミノ基が結合した合成核酸を、酵素など（ＰＣＲ法を含む）を用いて数千ｍｅｒ程度の長鎖とし、それを第一核酸鎖及び第二核酸鎖として用いることができる）。また、第一核酸鎖と第二核酸鎖とは、長さが同じでもよく、長さが異なっていてもよい。第一核酸鎖と第二核酸鎖との長さが異なっている場合とは、例えば、図１（ａ）において、第一の核酸鎖の５’末端側に、第一の核酸鎖の鎖長の０．１～１０％程度の鎖長を有する（第二の核酸鎖とは相補的ではない）塩基配列が付加的に結合している形態が挙げられる。
　図１（ｂ）は、第二の核酸鎖が２本の核酸鎖からなり、第二の核酸鎖の一方の核酸鎖の５’末端及び他方の核酸鎖の３’末端にアミノ基が導入され、第一の核酸鎖には、アミノ基が導入されていない形態である。なお、第一の核酸鎖が２本の核酸鎖からなり、第一の核酸鎖の一方の核酸鎖の３’末端及び他方の核酸鎖の５’末端にアミノ基が導入され、第二の核酸鎖には、アミノ基が導入されていない形態であってもよい。また、第一の核酸鎖及び第二の核酸鎖の双方が２本の核酸鎖からなり、第一の核酸鎖の一方の核酸鎖の３’末端及び他方の核酸鎖の５’末端にアミノ基が導入され、第二の核酸鎖の一方の核酸鎖の５’末端及び他方の核酸鎖の３’末端にアミノ基が導入された形態であってもよい。また、この場合、二本鎖核酸は、少なくとも一方の末端において、ヘアピンループ構造を形成していてもよい。第一核酸鎖及び第二核酸鎖の長さは、特に限定されるものではなく、例えば、数十ｍｅｒ、数百ｍｅｒ、数千ｍｅｒの範囲であれば適宜設定され得る（例えば、アミノ基が結合した合成核酸を、酵素など（ＰＣＲ法を含む）を用いて数千ｍｅｒ程度の長鎖とし、それを第一核酸鎖及び第二核酸鎖として用いることができる）。なお、例えば図１（ｂ）の場合、“一方の第二の核酸鎖の長さ”と“他方の第二の核酸鎖の長さ”との和は、“第一の核酸鎖の長さ”と略同じとなり、“一方の第二の核酸鎖”と“他方の第二の核酸鎖”とは、長さが同じでもよく、長さが異なっていてもよい。また、例えば図１（ｂ）において、第一の核酸鎖の５’末端側及び３’末端側の少なくとも一方に、第一の核酸鎖の鎖長の０．１～１０％程度の鎖長を有する（第二の核酸鎖とは相補的ではない）塩基配列が付加的に結合していてもよい。
　図１（ｃ）は、第一の核酸鎖の５’末端及び第二の核酸鎖の３’末端にアミノ基が導入され、かつ、第一の核酸鎖の３’末端及び第二の核酸鎖の５’末端にアミノ基が導入された形態である。第一核酸鎖及び第二核酸鎖の長さは、特に限定されるものではなく、例えば、数十ｍｅｒ、数百ｍｅｒ、数千ｍｅｒの範囲であれば適宜設定され得る（例えば、アミノ基が結合した合成核酸を、酵素など（ＰＣＲ法を含む）を用いて数千ｍｅｒ程度の長鎖とし、それを第一核酸鎖及び第二核酸鎖として用いることができる）。
　二本鎖核酸へのアミノ基の導入方法については、第一の核酸鎖及び第二の核酸鎖の所定の位置にアミノ基が導入される方法であれば特に限定されることなく用いられ、例えば、下記に示すカルバメート構造を有するＳＳＨ－ｌｉｎｋｅｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、下図において「ＳＳＨ」）、３’－ＣＡ－ａｍｉｎｏ－ｌｉｎｋｅｒ（ｒｅｖＨ－ｌｉｎｋｅｒ、Ｇｅｎｅ　Ｄｅｓｉｇｎ社、下図において「ｒｅｖＨ」）、６つの炭素原子により構成されるＣ６－ｌｉｎｋｅｒ（下図において「Ｃ６」）を導入する方法等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　次に、本発明による二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物について説明する。
　本発明による二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物は、前述した本発明による化合物の、二本鎖核酸に標的分子を結合させる用途に関するものである。なお、二本鎖核酸及び標的分子の詳細については、前述同様である。
　本発明による二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物は、
　下記一般式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 　で表され、二本鎖核酸に導入されたアミノ基にＲ１及びＲ２を共有結合させ、標的分子が有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基にＲ３を共有結合させることで、二本鎖核酸に標的分子を結合させる。
　上記式中、Ａｒ、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３、並びにＲ１（第一の反応性官能基）、Ｒ２（第二の反応性官能基）及びＲ３（第三の反応性官能基）の詳細については、前述同様である。
　次に、本発明による二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法について説明する。なお、該方法は、前述の核酸－標的分子複合体を製造するための方法でもある。
　本発明による二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法は、
　（ａ）二本鎖核酸と、
　下記一般式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　で表される化合物と、
　を混合して、二本鎖核酸に導入されたアミノ基にＲ１及びＲ２を共有結合させることで、二本鎖核酸に該化合物を結合させて、核酸架橋体を得る工程と、
　（ｂ）工程（ａ）で得られた核酸架橋体と、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基を有する標的分子と、を混合して、標的分子が有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基にＲ３を共有結合させることで、核酸架橋体に標的分子を結合させる工程と、
　を含む。
　なお、二本鎖核酸及び標的分子の詳細については、前述同様である。また、上記式中、Ａｒ、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３、並びにＲ１（第一の反応性官能基）、Ｒ２（第二の反応性官能基）及びＲ３（第三の反応性官能基）の詳細については、前述同様である。
　上記工程（ａ）において、例えば、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖を混合したものに、例えばリン酸バッファー及び／又水を加えて、高温（例えば９０℃）で加熱し、冷却後、架橋化試薬の溶液（例えばＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させたもの）を加えて、例えば２７℃で反応させることで、核酸架橋体を得ることができる。
　上記工程（ｂ）において、例えば、核酸架橋体と標的分子とを混合し、例えばリン酸バッファー存在下で、例えば２７℃で反応させることで、核酸架橋体に標的分子を結合させることができる。
　以上説明したように、本発明によれば、二本鎖核酸の解離の可能性を低減して、二本鎖核酸に標的分子を安定的に結合させることができる。本発明によって得られた核酸－標的分子複合体は、分子生物学の分野では、遺伝子検出等に用いられ、医薬の分野においては、核酸－標的分子複合体を用いることで、二本鎖核酸の血中滞留性の向上、生分解性の抑制、特定細胞への到達能向上等の効果を得ることができる。
　また、本発明によれば、核酸－標的分子複合体の作製過程において二本鎖が解離する可能性が低減されるため、核酸－標的分子複合体を容易に合成することが可能となる。また、核酸－標的分子複合体の精製過程において二本鎖が解離する可能性が低減されるため、核酸－標的分子複合体の取り扱いを著しく簡便化することが可能となる。このため、「二本鎖核酸－タンパク質複合体」（標的分子：タンパク質）として医薬品やバイオセンサー等に、また、「二本鎖核酸－核酸複合体」（標的分子：核酸）又は「二本鎖核酸－二本鎖核酸複合体」（標的分子：二本鎖核酸）としてバイオセンサー等への適用が期待される。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
　架橋化試薬の合成
　以下のスキームに従い、架橋化試薬（ｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩ）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
（５－アミノイソフタル酸ジ－Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミドエステル（化合物２）の合成）
　アルゴン雰囲気下、５－アミノイソフタル酸（化合物１）３６２ｍｇ（２.００ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド３０ｍＬに溶解し、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド９２０ｍｇ（４当量）および１－［３－（ジメチルアミノ）プロピル］－３－エチルカルボジイミド（ＷＳＣ）１.５３ｇ（４当量）を加えて室温で２０時間撹拌した。反応液に酢酸エチル（２００ｍＬ）を加え、水（５０ｍＬ）で４回、飽和食塩水（５０ｍＬ）で１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣を酢酸エチルとヘキサンの混合溶液（１：１、３０ｍＬ）にサスペンドした。得られた白色沈殿をろ取して標記化合物（化合物２）６９２ｍｇ（収率９２％）を白色固体状物質として得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ　Ｃ１６Ｈ１３Ｎ３Ｏ８Ｎａ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）３９８．０５９５，ｆｏｕｎｄ　３９８．０６０３．
１Ｈ　ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：７．７５（ｔ，１Ｈ，Ｐｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．６３（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ，Ｊ＝１，６Ｈｚ），６．２２（ｂｒ　ｓ，２　Ｈ，ＮＨ２），２．８９（ｂｒ　ｓ，８Ｈ，ＮＨＳ）．
１３Ｃ　ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１７２．５５（Ｃ），１６１．６４　（Ｃ），１５１．１０（Ｃ），１２６．６４（Ｃ），１２０．１７（ＣＨ），１１７．００（ＣＨ），２５．６４（ＣＨ２）．
（５－（６’－マレイミドヘキサノイル）アミノイソフタル酸ジ－Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミドエステル（ｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩ、化合物３）の合成）
　アルゴン雰囲気下、６－マレイミドヘキサン酸４２２ｍｇ（１．８ｍｍｏｌ）を塩化メチレン１５ｍＬに溶解し、塩化オキサリル０.１８ｍＬ（２．２ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１時間撹拌した。この溶液を５－アミノイソフタル酸ジ－Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミドエステル（化合物２）４５０ｍｇ（１.２ｍｍｏｌ）のピリジン（１５ｍＬ）溶液に滴下し、室温でさらに１時間撹拌した。エタノール３ｍＬを加えた後、減圧下溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル７０ｍＬに溶解し、水３０ｍＬで２回、飽和食塩水３０ｍＬで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をピリジンで２回共沸した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル－ヘキサン）により精製して標記化合物３１６ｍｇを淡赤色泡状物質として得た。得られた化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（中性シリカゲル、溶出溶媒：エタノール－クロロホルム）により再精製して標記化合物（ｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩ、化合物３）２６８ｍｇ（３９％）を白色泡状物質として得た。
ＥＳＩ－ＭＳ：ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ　Ｃ２６Ｈ２４Ｎ４Ｏ１１Ｎａ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）５９１．１３３４，ｆｏｕｎｄ　５９１．１３４８．
１Ｈ　ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１０．６１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．７６（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），８．２８（ｔ，１Ｈ，Ｐｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），６．９９（ｓ，２Ｈ，ｍａｌｅｉｍｉｄｏ）．３．４０（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２，Ｊ＝７．１Ｈｚ），２．９１（ｂｒ　ｓ，８Ｈ，ＮＨＳ），２．３６（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．６２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．５２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．２７　（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）．
１３Ｃ　ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ：１７２．６１（Ｃ），１７１．４５（Ｃ），１７０．４６（Ｃ），１６１．０７（Ｃ），１４１．７３（Ｃ），１３４．８１　（ＣＨ），１２６．６８（Ｃ），１２５．７２（ＣＨ），１２４．８１（ＣＨ），３７．３１（ＣＨ２），３６．５９（ＣＨ２），２８．０９（ＣＨ２），２６．０４（ＣＨ２），２５．９７（ＣＨ２），２４．６２（ＣＨ２）．
（実施例２）
　一級アミノ基を有する２本鎖ＤＮＡの架橋化反応
　対向する５’末端及び３’末端にアミノ基を有する相補的な配列の２５ｍｅｒの２本鎖ＤＮＡ（Ｓｐ２５：配列番号１、ａｓ２５：配列番号２）に対し、架橋化試薬（ｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩ）を作用させることで、架橋化反応を行い、２本鎖ＤＮＡの末端部位を連結させた（図２）。オリゴヌクレオチドへのアミノ基導入には、直鎖の炭素原子（Ｃ６）よりなるＣ６－ｌｉｎｋｅｒ、カルバメート構造を有するｓｓＨ－ｌｉｎｋｅｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び３’－ＣＡ－ａｍｉｎｏ－ｌｉｎｋｅｒ（以下、ｒｅｖＨ－ｌｉｎｋｅｒ；Ｇｅｎｅ　Ｄｅｓｉｇｎ）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　本実施例で調製した２本鎖ＤＮＡ（２種）について説明する。
　（ｉ）Ｓｐ２５－ｒｅｖＨ／ｓｓＨ－ａｓ２５：
　Ｓｐ２５（配列番号１）の３’末端にｒｅｖＨ－ｌｉｎｋｅｒを連結させたものと、ａｓ２５（配列番号２）の５’末端にｓｓＨ－ｌｉｎｋｅｒを連結させたもの、とからなる２本鎖ＤＮＡである。
（ｉｉ）Ｓｐ２５－Ｃ６／Ｃ６－ａｓ２５：
　Ｓｐ２５（配列番号１）の３’末端にＣ６－ｌｉｎｋｅｒを連結させたものと、ａｓ２５（配列番号２）の５’末端にＣ６－ｌｉｎｋｅｒを連結させたもの、とからなる２本鎖ＤＮＡである。
（２本鎖ＤＮＡの架橋化反応）
　上記に示す相補的な配列の２種の２本鎖ＤＮＡ（Ｓｐ２５－ｒｅｖＨ／ｓｓＨ－ａｓ２５、Ｓｐ２５－Ｃ６／Ｃ６－ａｓ２５）をそれぞれ同モル（２０ｐｍｏｌ）混合し、１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８）（６．２５μＬ）及び滅菌水を加えて全量４０μＬとした。反応溶液を９０℃、１分間加熱後、氷水中で５分間放置した。続いて、架橋化試薬のＤＭＦ溶液（２ｍＭ　ｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩ／ＤＭＦ、１０μＬ）を加え（全量５０μＬ）、反応を開始した。２７℃で反応を行い、一定時間ごとに反応液の一部をサンプリングし、２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって生成物（核酸架橋体）を分析した。Ｓｐ２５－ｒｅｖＨ／ｓｓＨ－ａｓ２５の２本鎖ＤＮＡによる核酸架橋体を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　２本鎖ＤＮＡのｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩによる架橋化反応について、核酸架橋体のグラフを図３（ａ）に、２０％変性ＰＡＧＥによる分析結果を図３（ｂ）に示す。図３（ａ）において、「Ｓｐ２５－ｒｅｖＨ／ｓｓＨ－ａｓ２５　ｂｉｓ　ＣＬ」は、Ｓｐ２５－ｒｅｖＨ／ｓｓＨ－ａｓ２５（２本鎖ＤＮＡ）とｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩとによる核酸架橋体を表し、「Ｓｐ２５－Ｃ６／Ｃ６－ａｓ２５　ｂｉｓ　ＣＬ」は、Ｓｐ２５－Ｃ６／Ｃ６－ａｓ２５（２本鎖ＤＮＡ）とｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩとによる核酸架橋体を表す。
　反応の結果、２本鎖ＤＮＡの対向する末端にアミノ基を有する場合、ｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩは２本鎖間を高効率で架橋化することが確認された。また、反応１０分後において、「Ｓｐ２５－Ｃ６／Ｃ６－ａｓ２５　ｂｉｓ　ＣＬ」では７７％の生成率であったのに対し、「Ｓｐ２５－ｒｅｖＨ／ｓｓＨ－ａｓ２５　ｂｉｓ　ＣＬ」では、９０％が架橋化されていた。このことから、ｓｓＨ－ｌｉｎｋｅｒ／ｒｅｖＨ－ｌｉｎｋｅｒの組み合わせによってアミノ基を導入した２本鎖ＤＮＡにおいて、架橋化効率が高いことが明らかとなった。
　得られた２本鎖ＤＮＡによる核酸架橋体については、下記のＨＰＬＣ条件で精製後に分子量測定を行い、目的物であることを確認した。
　ＥＳＩ　ｍａｓｓ：ｃａｌｃ．１６１８９．９４，ｆｏｕｎｄ　１６１９１．６８
　ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
　Ｂ％：３０－１００％／２０ｍｉｎ（Ａ　ｂｕｆｆｅｒ：５％ＣＨ３ＣＮ，０．１Ｍ　ＴＥＡＡ；Ｂ　ｂｕｆｆｅｒ：２５％ＣＨ３ＣＮ，０．１Ｍ　ＴＥＡＡ）
　カラム温度　５０℃
（実施例３）
　２本鎖ＲＮＡの架橋化反応
　対向する５’末端及び３’末端にアミノ基を有する相補的な配列の２１ｍｅｒの２本鎖ＲＮＡ（ＬＨ２１－ｒｅｖＨ：配列番号３、ＬＨ２１ｂ：配列番号４）（ルシフェラーゼのｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ）に対し、架橋化試薬（ｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩ）を作用させることで、架橋化反応を行い、２本鎖ＲＮＡの末端部位を連結させた。アミノ基導入には、実施例２と同様のｓｓＨ－ｌｉｎｋｅｒ及びｒｅｖＨ－ｌｉｎｋｅｒを用いた。架橋化試薬（ｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩ）による架橋化反応及び変性ＰＡＧＥによる分析については、実施例２と同様に行った。この２本鎖ＲＮＡによる核酸架橋体を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　本実施例で使用した２本鎖ＲＮＡについて説明する。
　ＬＨ２１－ｒｅｖＨ／ＬＨ２１ｂ：
　配列番号３のＲＮＡ鎖の３’末端にｒｅｖＨ－ｌｉｎｋｅｒを連結させたものと、配列番号４のＲＮＡ鎖の５’末端にｓｓＨ－ｌｉｎｋｅｒを連結させたもの、とからなる２本鎖ＲＮＡである。
　２本鎖ＲＮＡのｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩによる架橋化反応について、核酸架橋体のグラフを図４（ａ）に、２０％変性ＰＡＧＥによる分析結果を図４（ｂ）に示す。反応の結果、２本鎖ＤＮＡと同様に２本鎖ＲＮＡにおいても高効率で架橋化されることが明らかとなった。１０分後の反応収率は、９９％であり、２本鎖ＤＮＡよりも高い値となった。
　上記同様の反応を、３ｎｍｏｌの２本鎖ＲＮＡ鎖に対して３００ｎｍｏｌの架橋化試薬（ｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩ）を作用させて行い、３時間反応後に逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって２本鎖ＲＮＡによる核酸架橋体を精製した。
　得られた２本鎖ＲＮＡによる核酸架橋体については、分子量測定を行い、目的物であることを確認した。
　分子量ＥＳＩ　ｍａｓｓ．ｃａｌｃ．１４１５２．１４１，ｆｏｕｎｄ．１４１５３．５０
　ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
　Ｂ％：０－１００％／２０ｍｉｎ（Ａ　ｂｕｆｆｅｒ：５％ＣＨ３ＣＮ，０．１Ｍ　ＴＥＡＡ、Ｂ　ｂｕｆｆｅｒ：２５％ＣＨ３ＣＮ，０．１Ｍ　ＴＥＡＡ）
　カラム温度：室温
（実施例４）
　２本鎖ＤＮＡによる核酸架橋体の化学修飾
　２本鎖ＤＮＡによる核酸架橋体に対して、チオール基を有する物質（標的分子）が結合可能かどうかを調べた。
　実施例２で得られた、対向する末端がｂｉｓ－ＮＨＳ－ＭＩによって架橋化された２本鎖ＤＮＡによる核酸架橋体（ｓｓＨ－ａｓ２５／Ｓｐ２５－ｒｅｖＨ　ｂｉｓ－ＣＬ）（１００ｐｍｏｌ）と、６－ｍｅｒｃａｐｔｏ－１－ｈｅｘａｎｏｌ（１００ｎｍｏｌ）（標的分子）と、を混合し、１２５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）存在下、２７℃で反応を行った（反応溶液量１００μＬ）。反応溶液を逆相カラムＨＰＬＣによって分析した。
　ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
　Ｂ％：３０－１００％／２０ｍｉｎ（Ａ　ｂｕｆｆｅｒ：５％ＣＨ３ＣＮ，０．１Ｍ　ＴＥＡＡ、Ｂ　ｂｕｆｆｅｒ：２５％　ＣＨ３ＣＮ，０．１Ｍ　ＴＥＡＡ）
　カラム温度：室温
　反応前の分析結果を図５（ａ）に、反応後の分析結果を図５（ｂ）に示す。反応後、原料の２本鎖ＤＮＡによる核酸架橋体のピークが消失して、６－ｍｅｒｃａｐｔｏ－１－ｈｅｘａｎｏｌが結合した物質（核酸－標的分子複合体）のピークを確認した。
　以上より、本実施例による核酸架橋体に標的分子を安定的に結合させ得ることが示された。
　なお、本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。つまり、本発明の範囲は、実施形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
　本出願は、２０１５年６月１７日に出願された日本国特許出願２０１５－１２２４６７号に基づくものであり、その明細書、特許請求の範囲、図面および要約書を含むものである。上記日本国特許出願における開示は、その全体が本明細書中に参照として含まれる。
　（付記１）
　第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなり、アミノ基が導入された二本鎖核酸と、
　一般式１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 　で表される化合物と、
　からなり、前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基がＲ１及びＲ２に共有結合することで、前記二本鎖核酸が前記化合物に結合している核酸架橋体。
（式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）
　（付記２）
　前記第一の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入されている、又は前記第一の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入されている、
　ことを特徴とする付記１に記載の核酸架橋体。
　（付記３）
　前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、それぞれ独立に、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基若しくはその誘導体、活性エステル基、エポキシ基又はハロアルキル基である、
　ことを特徴とする付記１又は２に記載の核酸架橋体。
　（付記４）
　前記第三の反応性官能基は、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアナート基、エチニル基、アジド基、ビニル基、ヒドラジン基、エポキシ基又はイソシアナート基である、
　ことを特徴とする付記１乃至３のいずれか１つに記載の核酸架橋体。
　（付記５）
　前記一般式１において、Ａｒは、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、クリセン、アズレン、アセナフテン、フルオレン、フルオランテン、テトラセン又はトリフェニレンである、
　ことを特徴とする付記１乃至４のいずれか１つに記載の核酸架橋体。
　（付記６）
　前記一般式１において、Ａｒは、ベンゼンである、
　ことを特徴とする付記１乃至５のいずれか１つに記載の核酸架橋体。
　（付記７）
　前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
　ことを特徴とする付記１乃至６のいずれか１つに記載の核酸架橋体。
　（付記８）
　前記第三の反応性官能基は、マレイミド基又はチオール基である、
　ことを特徴とする付記１乃至７のいずれか１つに記載の核酸架橋体。
　（付記９）
　前記一般式１において、Ｌ１及びＬ２は、単結合であり、Ｌ３は、炭素数０～１５のアルキルアミド基である、
　ことを特徴とする付記８に記載の核酸架橋体。
　（付記１０）
　前記一般式１において、Ｌ３は、ペンチルアミド基である、
　ことを特徴とする付記９に記載の核酸架橋体。
　（付記１１）
　前記一般式１において、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、単結合であり、前記第一の反応性官能基、前記第二の反応性官能基及び前記第三の反応性官能基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
　ことを特徴とする付記６に記載の核酸架橋体。
　（付記１２）
　第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなる二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物であって、
　一般式２
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 　で表され、
　前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基にＲ１及びＲ２を共有結合させ、標的分子が有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基にＲ３を共有結合させることで、前記二本鎖核酸に前記標的分子を結合させる、
　ことを特徴とする二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物。
（式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）
　（付記１３）
　前記第一の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入されている、又は前記第一の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入されている、
　ことを特徴とする付記１２に記載の化合物。
　（付記１４）
　前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、それぞれ独立に、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基若しくはその誘導体、活性エステル基、エポキシ基又はハロアルキル基である、
　ことを特徴とする付記１２又は１３に記載の化合物。
　（付記１５）
　前記第三の反応性官能基は、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアナート基、エチニル基、アジド基、ビニル基、ヒドラジン基、エポキシ基又はイソシアナート基である、
　ことを特徴とする付記１２乃至１４のいずれか１つに記載の化合物体。
　（付記１６）
　前記一般式２において、Ａｒは、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、クリセン、アズレン、アセナフテン、フルオレン、フルオランテン、テトラセン又はトリフェニレンである、
　ことを特徴とする付記１２乃至１５のいずれか１つに記載の化合物。
　（付記１７）
　前記一般式２において、Ａｒは、ベンゼンである、
　ことを特徴とする付記１２乃至１６のいずれか１つに記載の化合物。
　（付記１８）
　前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
　ことを特徴とする付記１２乃至１７のいずれか１つに記載の化合物。
　（付記１９）
　前記第三の反応性官能基は、マレイミド基又はチオール基である、
　ことを特徴とする付記１２乃至１８のいずれか１つに記載の化合物。
　（付記２０）
　前記一般式２において、Ｌ１及びＬ２は、単結合であり、Ｌ３は、炭素数０～１５のアルキルアミド基である、
　ことを特徴とする付記１９に記載の化合物。
　（付記２１）
　前記一般式２において、Ｌ３は、ペンチルアミド基である、
　ことを特徴とする付記２０に記載の化合物。
　（付記２２）
　前記一般式２において、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、単結合であり、前記第一の反応性官能基、前記第二の反応性官能基及び前記第三の反応性官能基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
　ことを特徴とする付記１７に記載の化合物。
　（付記２３）
　（ａ）第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなり、アミノ基が導入された二本鎖核酸と、
　一般式３
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 　で表される化合物と、
　を混合して、前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基にＲ１及びＲ２を共有結合させることで、前記二本鎖核酸に前記化合物を結合させて、核酸架橋体を得る工程と、
　（ｂ）前記工程（ａ）で得られた核酸架橋体と、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基を有する標的分子と、を混合して、前記標的分子が有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基にＲ３を共有結合させることで、前記核酸架橋体に前記標的分子を結合させる工程と、
　を含む二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法。
（式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）
　（付記２４）
　前記第一の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入されている、又は前記第一の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入されている、
　ことを特徴とする付記２３に記載の方法。
　（付記２５）
　前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、それぞれ独立に、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基若しくはその誘導体、活性エステル基、エポキシ基又はハロアルキル基である、
　ことを特徴とする付記２３又は２４に記載の方法。
　（付記２６）
　前記第三の反応性官能基は、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアナート基、エチニル基、アジド基、ビニル基、ヒドラジン基、エポキシ基又はイソシアナート基である、
　ことを特徴とする付記２３乃至２５のいずれか１つに記載の方法。
　（付記２７）
　前記一般式３において、Ａｒは、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、クリセン、アズレン、アセナフテン、フルオレン、フルオランテン、テトラセン又はトリフェニレンである、
　ことを特徴とする付記２３乃至２６のいずれか１つに記載の方法。
　（付記２８）
　前記一般式３において、Ａｒは、ベンゼンである、
　ことを特徴とする付記２３乃至２７のいずれか１つに記載の方法。
　（付記２９）
　前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
　ことを特徴とする付記２３乃至２８のいずれか１つに記載の方法。
　（付記３０）
　前記第三の反応性官能基は、マレイミド基又はチオール基である、
　ことを特徴とする付記２３乃至２９のいずれか１つに記載の方法。
　（付記３１）
　前記一般式３において、Ｌ１及びＬ２は、単結合であり、Ｌ３は、炭素数０～１５のアルキルアミド基である、
　ことを特徴とする付記３０に記載の方法。
　（付記３２）
　前記一般式３において、Ｌ３は、ペンチルアミド基である、
　ことを特徴とする付記３１に記載の方法。
　（付記３３）
　前記一般式３において、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、単結合であり、前記第一の反応性官能基、前記第二の反応性官能基及び前記第三の反応性官能基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド
エステル基である、
　ことを特徴とする付記２８に記載の方法。
　（付記３４）
　一般式４
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 　で表される化合物。
（式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基若しくはその誘導体、活性エステル基、エポキシ基又はハロアルキル基を表し、Ｒ３は、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアナート基、エチニル基、アジド基、ビニル基、ヒドラジン基、エポキシ基又はイソシアナート基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）
　（付記３５）
　前記一般式４において、Ａｒは、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、クリセン、アズレン、アセナフテン、フルオレン、フルオランテン、テトラセン又はトリフェニレンである、
　ことを特徴とする付記３４に記載の化合物。
　（付記３６）
　前記一般式４において、Ａｒは、ベンゼンである、
　ことを特徴とする付記３４又は３５に記載の化合物。
　（付記３７）
　前記一般式４において、Ｒ１及びＲ２は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
　ことを特徴とする付記３４乃至３６のいずれか１つに記載の化合物。
　（付記３８）
　前記一般式４において、Ｒ３は、マレイミド基又はチオール基である、
　ことを特徴とする付記３４乃至３７のいずれか１つに記載の化合物。
　（付記３９）
　前記一般式４において、Ｌ１及びＬ２は、単結合であり、Ｌ３は、炭素数０～１５のアルキルアミド基である、
　ことを特徴とする付記３８に記載の化合物。
　（付記４０）
　前記一般式４において、Ｌ３は、ペンチルアミド基である、
　ことを特徴とする付記３９に記載の化合物。
　（付記４１）
　前記一般式４において、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、単結合であり、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
　ことを特徴とする付記３６に記載の化合物。

Claims (23)

  1. 　第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなり、アミノ基が導入された二本鎖核酸と、
    　一般式１
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　で表される化合物と、
    　からなり、前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基がＲ１及びＲ２に共有結合することで、前記二本鎖核酸が前記化合物に結合している核酸架橋体。
    （式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）
  2. 　前記第一の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入されている、又は前記第一の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入されている、
    　ことを特徴とする請求項１に記載の核酸架橋体。
  3. 　前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、それぞれ独立に、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基若しくはその誘導体、活性エステル基、エポキシ基又はハロアルキル基である、
    　ことを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸架橋体。
  4. 　前記第三の反応性官能基は、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアナート基、エチニル基、アジド基、ビニル基、ヒドラジン基、エポキシ基又はイソシアナート基である、
    　ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の核酸架橋体。
  5. 　前記一般式１において、Ａｒは、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、クリセン、アズレン、アセナフテン、フルオレン、フルオランテン、テトラセン又はトリフェニレンである、
    　ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の核酸架橋体。
  6. 　前記一般式１において、Ａｒは、ベンゼンである、
    　ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の核酸架橋体。
  7. 　前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
    　ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の核酸架橋体。
  8. 　前記第三の反応性官能基は、マレイミド基又はチオール基である、
    　ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の核酸架橋体。
  9. 　前記一般式１において、Ｌ１及びＬ２は、単結合であり、Ｌ３は、炭素数０～１５のアルキルアミド基である、
    　ことを特徴とする請求項８に記載の核酸架橋体。
  10. 　前記一般式１において、Ｌ３は、ペンチルアミド基である、
    　ことを特徴とする請求項９に記載の核酸架橋体。
  11. 　前記一般式１において、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、単結合であり、前記第一の反応性官能基、前記第二の反応性官能基及び前記第三の反応性官能基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
    　ことを特徴とする請求項６に記載の核酸架橋体。
  12. 　第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなる二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物であって、
    　一般式２
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　で表され、
    　前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基にＲ１及びＲ２を共有結合させ、標的分子が有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基にＲ３を共有結合させることで、前記二本鎖核酸に前記標的分子を結合させる、
    　ことを特徴とする二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物。
    （式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）
  13. 　前記第一の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入されている、又は前記第一の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入されている、
    　ことを特徴とする請求項１２に記載の化合物。
  14. 　前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、それぞれ独立に、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基若しくはその誘導体、活性エステル基、エポキシ基又はハロアルキル基である、
    　ことを特徴とする請求項１２又は１３に記載の化合物。
  15. 　前記第三の反応性官能基は、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアナート基、エチニル基、アジド基、ビニル基、ヒドラジン基、エポキシ基又はイソシアナート基である、
    　ことを特徴とする請求項１２乃至１４のいずれか１つに記載の化合物体。
  16. 　前記一般式２において、Ａｒは、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、クリセン、アズレン、アセナフテン、フルオレン、フルオランテン、テトラセン又はトリフェニレンである、
    　ことを特徴とする請求項１２乃至１５のいずれか１つに記載の化合物。
  17. 　前記一般式２において、Ａｒは、ベンゼンである、
    　ことを特徴とする請求項１２乃至１６のいずれか１つに記載の化合物。
  18. 　前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
    　ことを特徴とする請求項１２乃至１７のいずれか１つに記載の化合物。
  19. 　前記第三の反応性官能基は、マレイミド基又はチオール基である、
    　ことを特徴とする請求項１２乃至１８のいずれか１つに記載の化合物。
  20. 　前記一般式２において、Ｌ１及びＬ２は、単結合であり、Ｌ３は、炭素数０～１５のアルキルアミド基である、
    　ことを特徴とする請求項１９に記載の化合物。
  21. 　前記一般式２において、Ｌ３は、ペンチルアミド基である、
    　ことを特徴とする請求項２０に記載の化合物。
  22. 　前記一般式２において、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、単結合であり、前記第一の反応性官能基、前記第二の反応性官能基及び前記第三の反応性官能基は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
    　ことを特徴とする請求項１７に記載の化合物。
  23. 　（ａ）第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなり、アミノ基が導入された二本鎖核酸と、
    　一般式３
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　で表される化合物と、
    　を混合して、前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基にＲ１及びＲ２を共有結合させることで、前記二本鎖核酸に前記化合物を結合させて、核酸架橋体を得る工程と、
    　（ｂ）前記工程（ａ）で得られた核酸架橋体と、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基を有する標的分子と、を混合して、前記標的分子が有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基にＲ３を共有結合させることで、前記核酸架橋体に前記標的分子を結合させる工程と、
    　を含む二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法。
    （式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１～３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）
PCT/JP2016/067494 2015-06-17 2016-06-13 核酸架橋体、二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物及び二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法 WO2016204107A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017525213A JPWO2016204107A1 (ja) 2015-06-17 2016-06-13 核酸架橋体、二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物及び二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015-122467 2015-06-17
JP2015122467 2015-06-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016204107A1 true WO2016204107A1 (ja) 2016-12-22

Family

ID=57546638

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2016/067494 WO2016204107A1 (ja) 2015-06-17 2016-06-13 核酸架橋体、二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物及び二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2016204107A1 (ja)
WO (1) WO2016204107A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040086866A1 (en) * 2002-10-30 2004-05-06 Boris Chernov Double stranded nucleic acid biochips
WO2005030695A1 (en) * 2003-09-25 2005-04-07 Solexa Limited Conversion of amine- to carboxyl groups on solid surfaces

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040086866A1 (en) * 2002-10-30 2004-05-06 Boris Chernov Double stranded nucleic acid biochips
WO2005030695A1 (en) * 2003-09-25 2005-04-07 Solexa Limited Conversion of amine- to carboxyl groups on solid surfaces

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEE JUNGKYU K. ET AL.: "Syntheses of Organic Molecule-DNA Hybrid Structures", ACS NANO, vol. 5, no. 3, 2011, pages 2067 - 2074, XP055338766 *
MEGENS RIK P. ET AL.: "Multinuclear Non-Heme Iron Complexes for Double-Strand DNA Cleavage", CHEM. EUR. J., vol. 15, no. 7, 2009, pages 1723 - 1733, XP055338768 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2016204107A1 (ja) 2018-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7097627B2 (ja) 核酸エンコーディングを使用した巨大分子解析
US20200123534A1 (en) Production of encoded chemical libraries
US10233442B2 (en) Method for affinity purification
Asamitsu et al. Sequence-specific DNA alkylation and transcriptional inhibition by long-chain hairpin pyrrole–imidazole polyamide–chlorambucil conjugates targeting CAG/CTG trinucleotide repeats
US8940879B2 (en) Functional molecule, functional molecule synthesizing amidite and target substance analysis method
JP4061819B2 (ja) インターストランドクロスリンク剤の合成方法
García et al. Cyclodextrin–peptide conjugates for sequence specific DNA binding
WO2011105071A1 (en) Method for screening nucleic acid ligand
TWI464402B (zh) 將核酸接上小分子的方法
WO2016204107A1 (ja) 核酸架橋体、二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物及び二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法
Ben Gaied et al. Potent triple helix stabilization by 5′, 3′‐modified triplex‐forming oligonucleotides
Halby et al. Functionalized head-to-head hairpin polyamides: Synthesis, double-stranded DNA-binding activity and affinity
Qiu et al. Reversible photo-cross-linking of the GCN4 peptide containing 3-cyanovinylcarbazole amino acid to double-stranded DNA
JP7448239B2 (ja) 核酸配列等の簡便検出法
Tona et al. Crosslinking of diene-modified DNA with bis-maleimides
JP6491233B2 (ja) ハイブリダイゼーション安定化用核酸複合体、核酸ハイブリダイゼーションの安定化方法、アンチセンス核酸医薬品及びｍｉｃｒｏＲＮＡ抑制剤
Englert et al. Aptamer-based proximity labeling guides covalent RNA modification
Printz et al. Optimizing the Stacking Moiety and Linker of 2 ‘-Acylamido Caps of DNA Duplexes with 3 ‘-Terminal Adenine Residues
JP2018138012A (ja) 核酸の液中固定化剤
Class et al. Patent application title: Method For Affinity Purification Inventors: Maxim V. Berezovski (Ottawa, CA) Mohamed Wehbe (Ottawa, CA) Mahmoud Aziz Mahmoud Labib (Ottawa, CA) Darija Muharemagic (Gatineau, CA) Anna S. Zamay (Krasnoyarsk, RU) Shahrokh Ghobadloo (Ottawa, CA) Assignees: UNIVERSITY OF OTTAWA
CA3200390A1 (en) Dna-encoded compound library and screening method thereof
JP2020096579A (ja) 転写因子対を模倣する協同性と多様性をＤＮＡバインダーに与えるオルソゴナルなγＰＮＡ二量体化ドメイン
JP2005027569A (ja) 新規ｄｎａコンジュゲート及びそれを有効成分とするアンチセンス剤
JP2015093853A (ja) ボラノホスフェート化合物、及び核酸オリゴマー
Phillips Biological Activity of a Py-Im Polyamide Androgen Receptor Antagonist

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16811581

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017525213

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16811581

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1