WO2007096517A1 - Presentation de motifs de reconnaissance par une matrice multivalente greffee sur un support solide - Google Patents

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WO2007096517A1
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solid support
molecular
recognition
chassis
pattern
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Eric Defrancq
Pascal Dumy
Olivier Renaudet
Françoise Vinet
Antoine Hoang
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Universite Joseph Fourier
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    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
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    • C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links

Definitions

  • the present invention relates to the immobilization of recognition patterns on solid supports.
  • the immobilization of molecules on solid supports can in particular enable the manufacture of biomolecule chips, in particular of sugar chips. These can especially be useful in methods of detection, analysis or screening.
  • non-covalent immobilization methods which consist in adsorbing molecules on a surface via non-covalent interactions, in particular of the hydrophobic type, hydrogen bonds or ionic bonds.
  • the surface used may in particular be glass covered with nitrocellulose or a polystyrene resin.
  • covalently immobilized methods which consist in reacting a function present on the solid support with a function present on the molecule to form a covalent bond between the molecule and the support.
  • Structures recognizing recognition patterns may be parts of molecules or compounds, molecules or compounds, or superstructures comprising such molecules, compounds, parts of molecules or compounds, including molecules or target compounds. These superstructures may be, for example, cells or microorganisms, such as bacteria or viruses.
  • the inventors have discovered that a solid support on which the recognition motifs are fixed via a specific molecular chassis could make it possible to improve the detection threshold for certain structures, such as molecules or target compounds.
  • the present invention relates to a solid support linked to at least one molecular chassis for multivalently binding at least one recognition pattern or having at least one pattern of recognition in a multivalent manner.
  • the term “molecular chassis” is intended to mean a molecule that can be bound to a solid support and that it is bonded, in particular covalently, to at least one recognition unit.
  • the term “multivalently bound” means a plurality of bonds, each connected to at least one recognition motif.
  • the molecular chassis is “multivalently linked” is meant in the sense of the present invention that the molecular chassis is linked to several recognition patterns, in particular several times to the same pattern of recognition, in particular via several links.
  • each recognition pattern is linked by a link to the molecular chassis.
  • the term "recognition motif” is intended to mean any type of molecule or compound that can be recognized by, or form a complex with, at least one other molecule or compound, part of a molecule or compound.
  • recognition motif is intended to mean any type of molecule or compound that can be recognized by, or form a complex with, at least one other molecule or compound, part of a molecule or compound.
  • the compounds there may be mentioned especially the receptors, proteins, enzymes and molecules present on or in cells.
  • this solid support or chip has an excellent detection threshold, in particular compounds or entities having an affinity with the recognition patterns, particularly with respect to the compounds or entities that can or must be detected by said support or chip.
  • This detection threshold may be less than or equal to 1 mM, in particular less than or equal to 0.5 mM, in particular less than or equal to 0.2 mM, more particularly less than or equal to 0.1 mM, or even less than or equal to 0.08 mM, or even less than or equal to 0.05 mM, or even more particularly less than or equal to 0.01 mM.
  • This detection threshold may also be less than or equal to 1000 microg / ml, in particular less than or equal to 500 microg / ml, in particular less than or equal to 200 microg / ml, more particularly less than or equal to 100 microg / ml, or even lower or equal to 50 microg / ml, or even less than or equal to 20 microg / ml, or even more particularly less than or equal to 10 microg / ml, by weight of compound or entity to be detected with respect to the volume of composition, such as a solution or a suspension in which it is present.
  • Figure 1 shows schematically the plate obtained in Example 1.
  • FIG. 2 is the image of a lactose-specific lectin-FITC direct labeling obtained in Example 2.
  • FIG. 3 is the image of a direct lectin-FITC labeling specific for N-acetylgalactose.
  • FIG. 4 schematically represents the plate obtained in example 4.
  • FIG. 5 is the image of the plate obtained in Example 4 after specific Lectin-FITC labeling of N-acetylgalactose on the scanner.
  • FIG. 6 shows the functionalization of a glass plate by a molecular chassis, the oxidation, the deposition of ligands (respectively N-acetylgalactose and mannose), and then the revelation by labeling.
  • the molecular chassis can have several links with recognition patterns, it can in particular be linked several times with several identical recognition patterns, or with several different recognition patterns.
  • a molecular chassis that is multivalently linked to at least one recognition pattern can be represented as follows:
  • CM represents a molecular chassis
  • MR 1 , MR 2 , MR 3 , ..., MR n each represent a pattern of recognition identical or different, n representing an integer greater than 1, in particular greater than or equal to 2, in particular greater than or equal to 3, or even greater than or equal to
  • a multivalent grafting by the ratio of number of links or links between the molecular chassis and recognition patterns / number of links or links between the molecular chassis and the solid support. In this case it is greater than 1, especially greater than or equal to 2, in particular greater than or equal to 3, or even greater than or equal to 4.
  • the molecular chassis has at least two faces, in particular it has two faces.
  • this molecular chassis may be a cyclopeptide, in particular defining two faces, an upper face and a lower face.
  • the molecular chassis may have several recognition patterns grafted on its upper face, in particular several times the same pattern or different recognition patterns each grafted one or more times.
  • the solid support is bonded to the molecular chassis, in particular by the lower face thereof, in particular by at least one covalent bond, more particularly by an oxime bond.
  • the molecular chassis may be a cyclopeptide formed from 5, 10 or 14 amino acid residues, in particular 10 amino acids forming a cyclodecapeptide.
  • This cyclopeptide may have at least one elbow, in particular two elbows, in particular to form the (L) PrO- (D) AA or (D) Pro-
  • This cyclopeptide may also have a central symmetry.
  • the cyclopeptide may have 10 or 14 amino acid residues and form two elbows, each elbow being formed by a combination (L) Pro- (D) AA or (D) Pro- (L) AA, wherein AA is an amino acid and preferably glycine, the two elbows being separated by three and / or five amino acid residues.
  • amino acid residue of the elbow shown above by the acronym AA may be an amino acid residue other than proline and of opposite stereochemistry, it may be in particular the glycine residue.
  • the elbows are separated by amino acid residues, in particular by an odd number of amino acid residues and in particular by three and / or five amino acids for a cyclodecapeptide and a cyclotetradecapeptide, respectively.
  • the three and / or five amino acid residues may each have a chemical function protected orthogonally by a protecting group.
  • the side chain protecting groups of these amino acids move alternately on either side of the median plane of said frame and define a so-called lower and upper face relative to this plane.
  • the molecular chassis is a cyclodecapeptide of formula (I) below:
  • Protected chemical entity means a chemical entity bearing a protective group. These groups are conventionally known to those skilled in the art and are described in reference works, especially T. Green's Protective Groups in Organic Synthesis, P.G. M. Wuts, Wiley-Interscience, New York, 1999.
  • masked chemical entity means a chemical entity carrying a group or a residue that makes it possible to hide the said chemical entity.
  • a residue may be an amino acid residue, for example serine.
  • X 1 , X 2 , X 3 , X 4 and Y may represent entities carrying at least one functional group chosen from the group comprising the amine, hydroxyl, thiol and hydrazide functions, and in particular aldehyde and oxyamine.
  • the solid support may in particular be in the form of a plate, in particular well plates, ball plates, in particular porous plates, in particular microbeads, capillaries or chambers, such as closed cavities constituting micro-components with micro-structured surfaces, nanostructures including carbon nanotubes.
  • the solid support may in particular comprise, or consist of, at least one material selected from the group consisting of glass, silicon, semiconductor oxides, for example silicon oxide, plastic, gold, metal oxides , such as indium and tin oxide, soils-gels, rare earths, as well as organic assemblies (carbon-based), such as carbon nanotubes.
  • the solid support can be linked directly or indirectly to the molecular chassis.
  • directly linked is meant that a spacer is connected to each of the entities mentioned or that the connection is via at least one spacer.
  • a spacer can be any type of molecule that can bind with the entities to which it must be attached.
  • they may be molecules separating the two entities by 1 to 20 atoms, in particular by 2 to 15 atoms, in particular by 4 to 10 atoms.
  • the spacer has a carbon skeleton, optionally comprising at least one heteroatom, for example oxygen, sulfur, nitrogen or phosphorus.
  • the molecular chassis is bound to the solid support by at least one bond, in particular a covalent linkage, which may be chosen from the group comprising the ether, ester, amine, amide, thioether, oxime, phosphate, alkene, alkyne, hydrazide and disulfide linkages. .
  • a covalent linkage which may be chosen from the group comprising the ether, ester, amine, amide, thioether, oxime, phosphate, alkene, alkyne, hydrazide and disulfide linkages.
  • the solid support is linked to the molecular chassis via an oxime bond.
  • the reasons for recognition may be different Among the recognition patterns that can be used according to the invention, mention may be made of the molecules of interest, in particular of biological interest.
  • recognition motifs mention may be made of the molecules chosen from the group comprising sugars, and in particular mono- or oligosaccharides, nucleic acids, peptides, proteins, as well as “mixed” molecules, such as glycopeptides, glycoproteins or phospholipids, or organic molecules, particularly those of therapeutic or diagnostic value, and a mixture thereof.
  • Glucose Fructose, Galactose, Mannose, Rhamnose, Fucose, Glucosamine, Galactosamine, Mannosamine, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, N-acetylmannosamine, and glucuronic acid.
  • Galacturonic acid Mannuronic acid, N-acetylneuraminic acid, 3-deoxy-D-ma.m2 ⁇ -2-octulosonic acid.
  • Recognition patterns may be related to the molecular chassis directly or indirectly.
  • the recognition units may be linked to the molecular framework by at least one covalent bond, which may be chosen from ether, ester, amine, amide, thioether, oxime, phosphate, alkene, alkyne, hydrazide and disulfide linkages.
  • the recognition motifs are linked to the molecular chassis via an oxime bond.
  • the subject of the invention is also a method of manufacturing a solid support comprising at least one molecular chassis enabling presenting or having at least one pattern of recognition in a multivalent manner, comprising at least the step of grafting on the solid support at least one molecular chassis for presenting or having patterns of recognition multivalently on a support.
  • grafted is intended to mean that a bond, in particular of covalent type, is formed between two chemical entities.
  • the molecular chassis-recognition pattern complexes are grafted onto the solid support.
  • This strategy consists of individually synthesizing and purifying the molecular chassis-recognition pattern complexes, in particular the molecular-sugar chassis, and then grafting them onto the solid support.
  • the recognition patterns can be grafted onto the molecular chassis by a chemical bond resulting from the condensation of a function carried by the molecular chassis and a function carried by the recognition pattern.
  • bonds making it possible to graft recognition motifs on the molecular frameworks mention may be made of the amide, ester, ether, amine, oxime, phosphate, alkene, alkyne, hydrazide and disulphide linkages.
  • the molecular chassis comprises at least one oxyamine or aldehyde bond capable of reacting with at least one function present on the solid support, in particular to form an oxime bond.
  • Recognition patterns can be grafted onto the molecular chassis, especially when the latter includes amino acid residues, using oxyamine chemistry, especially in the case where the recognition motifs are sugars.
  • the molecular chassis may carry a carbonyl derivative group (aldehyde or ketone) and the sugar may be modified in the anomeric position by an oxyamine function (-ONH 2 ), or vice versa the sugar may carry a carbonyl function, in particular on its reducing end, and the molecular chassis can carry an oxyamine function (-ONH 2 ).
  • At least one reactive function carried by the molecular chassis is protected or masked, in particular by a serine residue.
  • the upper face of the molecular chassis carries one or more serines
  • these can be oxidized, in particular by sodium periodate, so as to obtain glyoxylic aldehyde functions (-CO-CHO).
  • the recognition motifs may in particular be sugars carrying an oxyamine function capable of reacting with the aldehyde functions of the molecular frameworks to form oximes bonds.
  • the recognition motifs can be grafted onto the molecular chassis via a spacer.
  • a spacer Among the types of possible grafting, mention may be made of the reaction of an aldehyde function present on the solid support with an oxyamine function present on the lower face of the molecular chassis. This reaction is, in general, effective and selective, it leads to the formation of an oxime bond.
  • the solid support is bonded to the molecular chassis via an oxime bond.
  • the grafting step of the molecular chassis carrying the recognition patterns on the solid support may be carried out by the deposition of solution drops comprising the molecules molecular chassis-recognition patterns, either manually, which gives a diameter of pads of about 1 mm, or by an automaton, which reduces the size of the pad, for example to 180 microns.
  • the molecular chassis is grafted onto the solid support, and then the recognition motifs are then grafted onto the molecular chassis.
  • This method of manufacturing a solid support allowing a multivalent presentation of recognition patterns may comprise at least the following steps: grafting the molecular frame onto the solid support, graft the recognition patterns to the molecular chassis.
  • This method may further comprise at least one of the following steps:
  • This embodiment is particularly interesting insofar as it can make it possible to produce a support having a large variety of recognition patterns from a single molecular chassis.
  • the functions intended to react with the recognition patterns do not react with the functions present on the solid support, either by their very nature or because they are protected or masked.
  • the immobilization of the molecular chassis on the solid support can be done by the reaction of a function carried by the solid support with at least one function carried by the molecular chassis, in particular located on the underside of the molecular chassis.
  • the function carried by the solid support is an aldehyde function
  • the function carried by the molecular chassis is an oxyamine, which leads to the formation of an oxime bond.
  • This grafting step can be done by depositing a solution comprising the molecular frame on the solid support.
  • the deposit can take place on the entire surface of this support or only in certain places.
  • This step of grafting the molecular chassis may be followed by a step which makes it possible to mask the reactive functions of the unreacted solid support with the molecular chassis, for example by bringing the solid support into contact with a solution of hydroxylamine for hide the unreacted aldehyde functions.
  • At least one recognition pattern is grafted onto the molecular chassis by reaction with at least one reactive function of said molecular chassis
  • the method according to the invention may furthermore comprise a saturation step which may consist of absorbing a protein which does not specifically recognize the recognition motif, such as, for example, bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • This step may in particular make it possible to avoid the non-specific absorption of proteins or targets on the surface during the step of recognizing the recognition pattern, for example by the protein to be detected.
  • This saturation step can make it possible to reduce the background noise.
  • the invention also relates to a chip comprising at least one solid support as defined above or obtained by a method as defined above.
  • residues likely to act as a recognition motif mention may be made of the osidic residues involved in numerous pathologies, such as cancer (presence of tumor markers based on sugars), AIDS, or from pathogenic aggressions. and bacterial, pathogenic or bacterial agents may have on their surfaces recognition patterns, such as receptors, saccharide pattern.
  • recognition patterns such as receptors, saccharide pattern.
  • the invention can also be used in the context of the detection of pathogens in water or in air.
  • the invention may also be useful in drug discovery, by recognizing antagonists or cell receptor agonists based on the recognition of sugars in the context of high throughput screening.
  • the invention can also be used for studying the specificity and affinity of natural but also synthetic sugars.
  • the typing of the cells and / or proteins involved in the recognition within the organism and a correlation with the structure of the sugar can also be envisaged.
  • the present invention further relates to the use of molecular chassis for multivalently binding at least one recognition pattern or having at least one recognition pattern in a multivalent manner to functionalize a surface, particularly with sugars.
  • Example 1 Preparation of a chip for detecting lectin
  • an aqueous solution (A) comprising 30 ⁇ M of compound (A) of the following formula (II) z
  • line A represents the spots obtained with solution (A)
  • line B represents the spots obtained with solution (B)
  • the line C represents the spots obtained with the solution (C)
  • the line D represents the spots obtained with the solution (D).
  • Direct labeling of a chip of Example 1 is then carried out with lectin-FITC specific for lactose. Specific detection of said lectin is then observed by the part of the chip presenting in a multivalent manner, in this case tetravalent, the lactose recognition pattern. The result is shown in FIG. 2. It can be observed in FIG. 2 that only the spots obtained with the molecular frameworks bearing four lactose units detect lactose-specific FITC lectins at 30 ⁇ M.
  • Example 3 detection of lectin-FITC specific for N-acetylgalactose by a chip of Example 1
  • Example 4 Preparation of a solid support on which is grafted a molecular chassis and then patterns of recognition
  • An aqueous solution (E) comprising 50 ⁇ M of a molecular chassis (E) having the formula (II) in which X 1 , X 2 , X 3 and X 4 each represents a serine residue, and Z represents -NHCOCH 2 ONH 2 .
  • a glass plate carrying aldehyde groups is functionalized by dipping it into the molecular chassis solution (E).
  • a so-called saturation step is then performed by reacting the aldehyde functions of the unreacted glass plate with hydroxylamine, by dipping said plate in a 10 mM hydroxylamine solution.
  • the serines are then oxidized to aldehydes by soaking the plate in a solution of 10 mM sodium periodate for 60 minutes.
  • the resulting plate is shown schematically in FIG.
  • Example 5 Preparation of a solid support on which is grafted a molecular chassis and recognition patterns
  • An aqueous solution (E) comprising 50 ⁇ M of a molecular chassis (E) having the formula (II) in which X 1 , X 2 , X 3 and X 4 each represents a serine residue, and Z represents -NHCOCH 2 ONH 2 .
  • a glass plate carrying aldehyde groups is functionalized by dipping it into the molecular chassis solution (E) for 30 minutes.
  • a so-called saturation step is then performed by reacting the aldehyde functions of the unreacted glass plate with hydroxylamine by dipping said plate in a 10 mM hydroxylamine solution.
  • the serines are then oxidized to aldehydes by soaking the plate in a solution of 10 mM sodium periodate for 60 minutes.
  • FIG. 6 represents:
  • Step 1 Functionalization of the glass plate by the molecular chassis (E) and saturation by NH 2 OH - Step 2: Oxidation of the serine residues into aldehyde
  • Step 3 Deposit of drops of a 50 ⁇ M solution of N-acetylgalactose (line 1) or of mannose (line 2) carrying a -O-NH 2 function
  • Step 4 Indirect labeling, Line 1 biotinylated lectin specific for N-acetylgalactose followed by CY3 streptavidin and line 2 biotinylated lectin specific for mannose and streptavidin CY3 (concentration 10 ⁇ g / ml).

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Abstract

La présente invention concerne un support solide lié à au moins un châssis moléculaire permettant de lier de manière multivalente au moins un motif de reconnaissance ou présentant au moins un motif de reconnaissance de manière multivalente, un procédé de fabrication d'un support solide et une puce, notamment à sucre, comprenant au moins un support solide.

Description

PRESENTATION DE MOTIFS DE RECONNAISSANCE PAR UNE MATRICE MULTIVALENTE GREFFÉE SUR UN SUPPORT SOLIDE
La présente invention concerne l'immobilisation de motifs de reconnaissance sur des supports solides. L'immobilisation de molécules sur des supports solides peut notamment permettre la fabrication de puces à biomolécules, notamment de puces à sucres. Celles-ci peuvent notamment être utile dans des méthodes de détection, d'analyses ou de criblage.
Un grand nombre de méthodes d'immobilisation de molécules sur un support solide sont connues. Elles peuvent être classées en deux groupes :
- les méthodes à immobilisation non covalente, qui consistent à adsorber des molécules sur une surface via des interactions non covalentes, notamment de type hydrophobes, liaisons hydrogènes ou liaisons ioniques. La surface utilisée peut notamment être du verre recouvert de nitrocellulose ou une résine polystyrène. - les méthodes à immobilisation covalente, qui consistent à faire réagir une fonction présente sur le support solide avec une fonction présente sur la molécule pour former une liaison covalente entre la molécule et le support. Ces méthodes d'immobilisation de molécules sur support solide peuvent être utilisées pour fabriquer des « puces à motifs de reconnaissance » pouvant permettre l'analyse haut-débit de molécules impliquées dans la reconnaissance de ces motifs de reconnaissance, notamment des sucres. À titre d 'exemple on peut citer des « puces à sucres » permettant l'analyse haut débit de protéines. Les « puces à motifs de reconnaissance » obtenues par les méthodes classiques peuvent présenter un niveau de détection insuffisant par rapport à certaines molécules, comme des protéines à faible affinité. On peut par exemple citer le cas de certaines puces à sucres vis-à-vis de lectines .
Il existe donc un besoin pour des supports solides présentant des motifs de reconnaissance dans lesquels l'affinité de ces motifs de reconnaissance avec des structures les reconnaissant est améliorée.
Les structures reconnaissant les motifs de reconnaissance peuvent être des parties de molécules ou de composés, des molécules ou des composés, ou des superstructures comprenant ces molécules, composés, parties de molécules ou de composés, notamment des molécules ou des composés cibles. Ces superstructures peuvent être par exemple des cellules ou des microorganismes, comme des bactéries ou des virus.
Ainsi les inventeurs ont découvert qu'un support solide sur lequel les motifs de reconnaissance sont fixés via un châssis moléculaire spécifique pouvait permettre d'améliorer le seuil de détection à certaines structures, comme des molécules ou composés cibles.
Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un support solide lié à au moins un châssis moléculaire permettant de lier de manière multivalente au moins un motif de reconnaissance ou présentant au moins un motif de reconnaissance de manière multivalente.
Par « châssis moléculaire », on entend au sens de la présente invention une molécule pouvant d'une part être liée à un support solide et d'autre part être liée, notamment de manière covalente, à au moins un motif de reconnaissance. Par « lié de manière multivalente », on entend au sens de la présente invention plusieurs liaisons, chacune reliée à au moins un motif de reconnaissance.
Par le châssis moléculaire est « lié de manière multivalente » , on entend au sens de la présente invention que le châssis moléculaire est lié à plusieurs motifs de reconnaissance, en particulier plusieurs fois au même motif de reconnaissance, en particulier via plusieurs liaisons.
Tout particulièrement chaque motif de reconnaissance est lié par une liaison au châssis moléculaire.
Par « motif de reconnaissance » , on entend au sens de la présente invention tout type de molécule ou de composé pouvant être reconnu par, ou former un complexe avec, au moins une autre molécule ou composé, partie de molécule ou composé. Parmi les composés, on peut tout particulièrement citer les récepteurs, protéines, enzymes et molécules présentes sur ou dans des cellules.
En particulier, ce support solide ou puce présente un excellent seuil de détection, en particulier des composés ou entités présentant une affinité avec les motifs de reconnaissance, tout particulièrement par rapport aux composés ou entités qui peuvent ou doivent être détectés par ledit support ou puce .
Ce seuil de détection peut être inférieur ou égal à 1 mM, en particulier inférieur ou égal à 0,5 mM, notamment inférieur ou égal à 0,2 mM, tout particulièrement inférieur ou égal à 0,1 mM, voire inférieur ou égal à 0,08 mM, ou encore inférieur ou égal à 0,05 mM, voire encore plus particulièrement inférieur ou égal à 0,01 mM. Ce seuil de détection peut également être inférieur ou égal à 1000 microg/ml, en particulier inférieur ou égal à 500 microg/ml, notamment inférieur ou égal à 200 microg/ml, tout particulièrement inférieur ou égal à 100 microg/ml, voire inférieur ou égal à 50 microg/ml, ou encore inférieur ou égal à 20 microg/ml, voire encore plus particulièrement inférieur ou égal à 10 microg/ml, en poids de composé ou d'entité à détecter par rapport au volume de composition, comme une solution ou une suspension, dans lequel il est présent. La figure 1 représente schématiquement la plaque obtenue dans l'exemple 1.
La figure 2 est l'image d'un marquage direct par lectine- FITC spécifique du lactose obtenu dans l'exemple 2. La figure 3 est l'image d'un marquage direct par lectine- FITC spécifique du N-acétylgalactose.
La figure 4 représente schématiquement la plaque obtenue dans l ' exemple 4.
La figure 5 est l'image de la plaque obtenue dans l'exemple 4 après marquage Lectine-FITC spécifique du N- acétylgalactose au scanner.
La figure 6 représente la fonctionnalisation d'une plaque de verre par un châssis moléculaire, l'oxydation, le dépôt de ligands (respectivement N-acétylgalactose et mannose), puis la révélation par marquage.
Le châssis moléculaire peut présenter plusieurs liaisons avec des motifs de reconnaissance, il peut notamment être lié plusieurs fois avec plusieurs motifs de reconnaissance identiques, ou avec plusieurs motifs de reconnaissance différents.
Un châssis moléculaire lié de manière multivalente à au moins un motif de reconnaissance peut être représenté de la manière suivante :
Figure imgf000005_0001
où CM représente un châssis moléculaire, et MR1, MR2, MR3, ... , MRn représentent chacun un motif de reconnaissance identique ou différent, n représentant un nombre entier supérieur à 1, notamment supérieur ou égal à 2, en particulier supérieur ou égal à 3, voire supérieur ou égal à
4, et notamment inférieur ou égal à 32, en particulier inférieur ou égal à 24, tout particulièrement inférieur ou égal à 16, voire inférieur ou égal à 8.
On peut également définir un greffage multivalent par le ratio nombre de liens ou liaisons entre le châssis moléculaire et des motifs de reconnaissance / nombre de liens ou liaisons entre le châssis moléculaire et le support solide. En l'occurrence celui-ci est supérieur à 1, notamment supérieur ou égal à 2, en particulier supérieur ou égal à 3, voire supérieur ou égal à 4.
Selon un mode de réalisation particulier, le châssis moléculaire présente au moins deux faces, en particulier il présente deux faces. Tout particulièrement, ce châssis moléculaire peut être un cyclopeptide, notamment définissant deux faces, une face supérieure et une face inférieure.
Le châssis moléculaire peut présenter plusieurs motifs de reconnaissance greffés sur sa face supérieure, notamment plusieurs fois le même motif ou différents motifs de reconnaissance greffés chacun une ou plusieurs fois. Le support solide est lié au châssis moléculaire, notamment par la face inférieure de celui-ci, en particulier par au moins une liaison covalente, tout particulièrement par une liaison oxime.
Parmi les châssis moléculaires susceptibles d'être utilisés dans la présente invention, on peut citer ceux décrits dans la demande WO 2004/026894.
Le châssis moléculaire peut être un cyclopeptide formé de 5, 10 ou 14 résidus d'acides aminés, notamment de 10 acides aminés formant un cyclodécapeptide. Ce cyclopeptide peut présenter au moins un coude, notamment deux coudes notamment pour former l'enchaînement (L)PrO-(D)AA ou (D)Pro-
(L)AA. Ce cyclopeptide peut également présenter une symétrie centrale.
Le cyclopeptide peut présenter 10 ou 14 résidus d'acides aminés et former deux coudes, chaque coude étant formé par une combinaison (L)Pro- (D)AA ou (D)Pro- (L)AA, AA étant un acide aminé et de préférence la glycine, les deux coudes étant séparés par trois et/ou cinq résidus d'acides aminés .
Le résidu d'acide aminé du coude représenté ci-dessus par le sigle AA peut être un résidu d'acide aminé autre que la proline et de stéréochimie opposée, il peut s'agir en particulier du résidu glycine.
Les coudes sont séparés par des résidus d'acides aminés, notamment par un nombre impair de résidu d'acides aminés et en particulier par trois et/ou cinq acides aminés pour un cyclodécapeptide et un cyclotétradecapeptide respectivement.
Les trois et/ou cinq résidus d'acides aminés peuvent chacun avoir une fonction chimique protégée orthogonalement par un groupe protecteur. Les groupes protecteurs des chaînes latérales de ces acides aminés se dirigent alternativement de part et d'autre du plan médian dudit châssis et définissent une face dite inférieure et supérieure par rapport à ce plan.
En particulier, le châssis moléculaire est un cyclodécapeptide de formule (I) suivante :
Figure imgf000008_0001
Formule ( I ) dans laquelle Y représente une entité chimique formant une liaison avec un support solide et X1, X2, X3 et X4 représentent chacun indépendamment les uns des autres une entité chimique, protégée, ou masquée, ou non, permettant de lier, ou liant, au moins un motif de reconnaissance.
On entend par « entité chimique protégée » une entité chimique portant un groupement protecteur. Ces groupements sont classiquement connus par l'Homme du Métier et décrits dans des ouvrages de référence, notamment « Protective Groups in Organic Synthesis « de T. W. Green, P. G. M. Wuts, Wiley- Interscience, New York, 1999.
On entend par « entité chimique masquée » une entité chimique portant un groupe ou un résidu permettant de cacher ladite entité chimique. Un tel résidu peut être un résidu acide aminé, par exemple de la serine.
Plus particulièrement, X1, X2, X3, X4 et Y peuvent représenter des entités portant au moins une fonction choisie dans le groupe comprenant les fonctions aminés, hydroxyles, thiols, hydrazides et en particulier aldéhyde et oxyamine.
Le support solide peut notamment être sous forme de plaque, notamment des plaques à puits, de bille, notamment poreuse, notamment de microbille, de canaux notamment des capillaires ou chambres, comme des cavités fermées constituant des micro-composants à surfaces micro- structurée, de nanostructures notamment des nanotubes de carbone. Le support solide peut notamment comprendre, ou être constitué de, au moins un matériau choisi dans le groupe comprenant le verre, le silicium, des oxydes de semiconducteurs, par exemple l'oxyde de silicium, le plastique, l'or, les oxydes métalliques, notamment tels que oxyde d'indium et d'étain, des sols-gels, des terres rares, ainsi que des assemblages organiques (à base de carbone), comme des nanotubes de carbones .
Le support solide peut être lié directement ou indirectement au châssis moléculaire. Par « lié indirectement » on entend qu'un espaceur est lié à chacune des entités citées ou encore que la liaison se fait via au moins un espaceur.
Un espaceur peut être tout type de molécule susceptible de se lier avec les entités auxquelles il doit être attaché. En particulier il peut s'agir de molécules séparant les deux entités par 1 à 20 atomes, notamment par 2 à 15 atomes, en particulier par 4 à 10 atomes. Tout particulièrement
1' espaceur présente un squelette carboné, comprenant éventuellement au moins un hétéroatome, par exemple l'oxygène, le soufre, l'azote, le phosphore.
Le châssis moléculaire est lié au support solide par au moins une liaison, notamment covalente, celle-ci peut être choisie dans le groupe comprenant les liaisons éther, ester, aminé, amide, thioéther, oxime, phosphate, alcène, alcyne, hydrazide et disulfure.
Selon un mode de réalisation particulier le support solide est lié au châssis moléculaire via une liaison oxime.
Les motifs de reconnaissance peuvent être de différent type, parmi les motifs de reconnaissance utilisable selon l'invention, on peut citer les molécules d'intérêt, en particulier d'intérêt biologique.
Parmi les motifs de reconnaissance, on peut citer les molécules choisies dans le groupe comprenant les sucres, et en particulier les mono- ou oligosaccharides, les acides nucléiques, les peptides, les protéines, ainsi que des molécules « mixtes », comme les glycopeptides, glyco- protéines ou les phospholipides, ou des molécules organiques, en particulier celles présentant un intérêt thérapeutique ou de diagnostic, et un mélange de celles-ci.
Parmi les monosaccharides, et en particulier ceux composant ou compris dans des oligosaccharides, on peut citer Glucose, Fructose, Galactose, Mannose, Rhamnose, Fucose, Glucosamine, Galactosamine, Mannosamine, N-acétylglucosamine, N-acétylgalactosamine, N-acétylmannosaminé, acide Glucuronique, acide Galacturonique, acide Mannuronique , acide N-acétylneuraminique , acide 3-désoxy-D-ma.m2σ-2- octulosonique .
Les motifs de reconnaissance peuvent être liés au châssis moléculaire directement ou indirectement.
Les motifs de reconnaissance peuvent être liés au châssis moléculaire par au moins une liaison covalente, celle-ci peut être choisie parmi les liaisons éther, ester, aminé, amide, thioéther, oxime, phosphate, alcène, alcyne, hydrazide et disulfure.
Selon un mode de réalisation particulier les motifs de reconnaissance sont liés au châssis moléculaire via une liaison oxime.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a également pour objet un procédé de fabrication de support solide comprenant au moins un châssis moléculaire permettant de présenter ou présentant, au moins un motif de reconnaissance de manière multivalente, comprenant au moins l'étape consistant à greffer sur le support solide au moins un châssis moléculaire permettant de présenter ou présentant des motifs de reconnaissance de manière multivalente sur un support.
Par « greffé » , on entend au sens de la présente invention qu'une liaison, notamment de type covalente, est formée entre deux entités chimiques.
Selon un premier mode de réalisation, les complexes châssis moléculaire-motifs de reconnaissance sont greffées sur le support solide.
Cette stratégie consiste à synthétiser et à purifier de manière individuelle les complexes châssis moléculaire-motifs de reconnaissance, en particulier châssis moléculaire-sucres, puis à les greffer sur le support solide.
Les motifs de reconnaissance peuvent être greffés sur le châssis moléculaire par une liaison chimique résultant de la condensation d'une fonction portée par le châssis moléculaire et une fonction portée par le motif de reconnaissance. Parmi les liaisons permettant de greffer des motifs de reconnaissance sur les châssis moléculaires, on peut citer les liaisons amide, ester, éther, aminé, oxime, phosphate, alcène, alcyne, hydrazide et disulfure.
Selon une variante, le châssis moléculaire comprend au moins une liaison oxyamine ou aldéhyde susceptible de réagir avec au moins une fonction présente sur le support solide, en particulier pour former une liaison oxime.
Les motifs de reconnaissance peuvent être greffés sur le châssis moléculaire, notamment lorsque celui-ci comprend des résidus acides aminés, en utilisant la chimie des oxyamines, en particulier dans le cas où les motifs de reconnaissance sont des sucres. Dans ce cas, le châssis moléculaire peut porter un groupe dérivé carbonylé (aldéhyde ou cétone) et le sucre peut être modifié en position anomérique par une fonction oxyamine (-ONH2), ou vice-versa le sucre peut porter une fonction carbonylée, notamment sur son extrémité réductrice, et le châssis moléculaire peut porter une fonction oxyamine (-ONH2).
Tout particulièrement, au moins une fonction réactive portée par le châssis moléculaire est protégée ou masquée, notamment par un résidu serine.
Dans le cas où les fonctions réactives, c'est-à-dire destinées à réagir avec les motifs de reconnaissance, sont protégées ou masquées, il y a lieu de procéder à une étape de dëprotection ou de régénération pour libérer les fonctions réactives.
Par exemple lorsque la face supérieure du châssis moléculaire porte une ou des serines, celles-ci peuvent être oxydées, notamment par du périodate de sodium, de manière à obtenir des fonctions aldéhydes glyoxyliques ( -CO-CHO).
À l'issue de l'étape de déprotection, il est alors possible de greffer les motifs de reconnaissance sur les châssis moléculaires.
Les motifs de reconnaissance peuvent en particulier être des sucres portant une fonction oxyamine apte à réagir avec les fonctions aldéhydes des châssis moléculaires pour former des liaisons oximes.
Selon une variante, les motifs de reconnaissance peuvent être greffés sur le châssis moléculaire via un espaceur. Parmi les types de greffage possible, on peut citer la réaction d'une fonction aldéhyde présente sur le support solide avec une fonction oxyamine présente sur la face inférieure du châssis moléculaire. Cette réaction est, en général, efficace et sélective, elle conduit à la formation d'une liaison oxime. Ainsi, tout particulièrement, le support solide est lié au châssis moléculaire via une liaison oxime.
L'étape de greffage du châssis moléculaire portant les motifs de reconnaissance sur le support solide peut être réalisée par le dépôt de gouttes de solution comprenant les molécules châssis moléculaire-motifs de reconnaissance, soit manuellement, ce qui donne un diamètre de plots d'environ 1 mm, soit par un automate, ce qui permet de réduire la taille du plot, par exemple à 180 μm.
Selon un autre mode de réalisation, le châssis moléculaire est greffé sur le support solide, puis les motifs de reconnaissance sont ensuite greffés sur le châssis moléculaire.
Ce procédé de fabrication d'un support solide permettant une présentation multivalente de motifs de reconnaissance peut comprendre au moins les étapes suivantes consistant à : greffer le châssis moléculaire sur le support solide, greffer les motifs de reconnaissance au châssis moléculaire.
Ce procédé peut comprendre en outre au moins une des étapes suivantes consistant à :
- masquer et/ou protéger les fonctions réactives du support solide n'ayant pas réagi avec le châssis moléculaire et pouvant perturber des étapes ultérieures et
- déprotéger les fonctions réactives du châssis moléculaire destinées à réagir avec les motifs de reconnaissance.
Ce mode de réalisation est particulièrement intéressant dans la mesure où il peut permettre de réaliser un support présentant une grande variété de motifs de reconnaissance à partir d'un seul châssis moléculaire.
Dans ce cas, les fonctions destinées à réagir avec les motifs de reconnaissance, par exemple présentes sur la face supérieure du châssis moléculaire, ne réagissent pas avec les fonctions présentes sur le support solide, soit par leur nature même, soit parce qu'elles sont protégées ou masquées.
L'immobilisation du châssis moléculaire sur le support solide peut se faire par la réaction d'une fonction portée par le support solide avec au moins une fonction portée par le châssis moléculaire, en particulier située sur la face inférieure du châssis moléculaire. Tout particulièrement, la fonction portée par le support solide est une fonction aldéhyde, et la fonction portée par le châssis moléculaire est une oxyamine, ce qui conduit à la formation d'une liaison oxime .
Cette étape de greffage peut se faire par le dépôt d'une solution comprenant le châssis moléculaire sur le support solide. Le dépôt pouvant avoir lieu sur toute la surface de ce support ou uniquement à certains endroits.
Cette étape de greffage du châssis moléculaire peut être suivie d'une étape qui permet de masquer les fonctions réactives du support solide n'ayant pas réagi avec le châssis moléculaire, par exemple en mettant en contact le support solide avec une solution d'hydroxylamine pour masquer les fonctions aldéhydes n'ayant pas réagi.
Selon une variante, au moins un motif de reconnaissance est greffé sur le châssis moléculaire par réaction avec au moins une fonction réactive dudit châssis moléculaire
Le procédé selon l'invention peut comprendre en outre une étape de saturation qui peut consister à absorber une protéine ne reconnaissant pas de manière spécifique le motif de reconnaissance, comme par exemple de la sérum albumine bovine (BSA). Cette étape peut notamment permettre d'éviter l'absorption non spécifique de protéines, ou cibles, sur la surface lors de l'étape de reconnaissance du motif de reconnaissance, par exemple par la protéine à détecter. Cette étape de saturation peut permettre de diminuer le bruit de fond.
Selon un autre de ses aspects, l'invention a encore pour objet une puce comprenant au moins un support solide tel que défini ci-dessus ou obtenu par un procédé tel que défini ci- dessus .
Il peut en particulier s'agir d'une puce à sucres qui présentent un intérêt majeur notamment dans l'analyse haut- débit des protéines impliquées dans la reconnaissance des sucres. Parmi les résidus susceptibles de faire fonction de motif de reconnaissance on peut citer les résidus osidiques impliqués dans de nombreuses pathologies, comme le cancer (présence de marqueurs tumoraux à base de sucres), le SIDA, ou encore issus d'agressions par des agents pathogènes et bactériens, les agents pathogènes ou bactériens pouvant présenter à leurs surfaces des motifs de reconnaissance, comme des récepteurs, à motif saccharidiques . On peut également envisager la recherche d'antigène, de bactérie et virus dans des fluides biologiques à l'aide de ces puces.
L'invention peut encore être utilisée dans le cadre de la détection d'agents pathogènes dans l'eau ou dans l'air. L'invention peut être également utilisable dans la découverte de médicaments, par la reconnaissance d'antagonistes ou d'agonistes de récepteurs cellulaires basés sur la reconnaissance de sucres dans le cadre de criblage haut-débit .
L ' invention peut également servir pour l ' étude de la spécificité et de l'affinité de sucres naturels mais également synthétiques. Le typage des cellules et/ou des protéines impliquées dans la reconnaissance au sein de l'organisme et une corrélation avec la structure du sucre peut également être envisagée.
La présente invention concerne encore l'utilisation de châssis moléculaire permettant de lier de manière multivalente au moins un motif de reconnaissance ou présentant au moins un motif de reconnaissance de manière multivalente pour fonctionnaliser une surface, en particulier avec des sucres.
Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et ne peuvent en aucun cas conduire à limiter l'invention.
Exemples
Exemple 1 ; Préparation d'une puce permettant la détection de lectine
On prépare :
- une solution aqueuse (A) comprenant 30 μM de composé (A) de formule (II) suivante
Figure imgf000017_0001
z
Formule ( II ) dans laquelle X1, X2, X3 et X4 représentent chacun - NHCOCH=NOR, R représente un lactose et Z représente NHCOCH2ONH2, une solution aqueuse (B) comprenant 30 μM de R-ONH2, R représente un lactose,
- une solution aqueuse (C) comprenant 30 μM d'un composé (C) de formule (II) ci-dessus dans laquelle X1, X2, X3 et X4 représentent chacun -NHCOCH=NOR, R représente un -N- acétylgalactose, et Z représente -NHCOCH2ONH2, et une solution aqueuse (D) comprenant 30 μM de R-ONH2, R représente un N-acétylgalactose.
On dépose manuellement ou à l'aide d'un robot (par exemple doté de pipettes piézo-électriques comme le BioChip Arrayer 1 de Packard Instrument) , une goutte de chacune de ces compositions sur une partie d'une plaque de verre fonctionnalisé par un aldéhyde, par exemple fabriquées selon un procédé décrit dans le document EN 0016940.
La plaque obtenue est représentée schématiquement en figure 1 : la ligne A représente les spots obtenus avec la solution (A), la ligne B représente les spots obtenus avec la solution (B), - la ligne C représente les spots obtenus avec la solution (C), la ligne D représente les spots obtenus avec la solution (D) .
Exemple 2 : détection de lectine-FITC spécifique du lactose par une puce de l ' exemple 1
On effectue ensuite un marquage direct d'une puce de l'exemple 1 avec de la lectine-FITC spécifique du lactose. On observe alors une détection spécifique de ladite lectine par la partie de la puce présentant de manière multivalente , en l'occurrence tétravalente , le motif de reconnaissance lactose. Le résultat est montré en figure 2. On observe sur la figure 2 que seuls les spots obtenus avec les châssis moléculaires portant quatre motifs lactose détectent les lectines-FITC spécifiques du lactose à 30 μM.
Exemple 3 ; détection de lectine-FITC spécifique du N- acétylqalactose par une puce de l'exemple 1
On effectue un marquage direct d'une puce de l'exemple 1, avec la lectine-FITC spécifique du N-acétylgalactose. On observe alors une détection spécifique de ladite lectine par la partie de la plaque présentant de manière multivalente, en l'occurrence tétravalente, le motif de reconnaissance N- acétylgalactose. Le résultat est montré en figure 3.
On observe sur la figure 3 que seuls les spots obtenus avec les châssis moléculaires portant quatre motifs N- acétylgalactose détectent les lectines-FITC spécifiques du N- acétylgalactose à 30 μM.
Exemple 4 ; Préparation d'un support solide sur lequel est greffé un châssis moléculaires puis des motifs de reconnaissance
On prépare une solution aqueuse (E) comprenant 50 μM d'un châssis moléculaire (E) répondant à la formule (II) dans laquelle X1, X2, X3 et X4 représentent chacun un résidu serine, et Z représente -NHCOCH2ONH2.
On fonctionnalise une plaque de verre portant des groupements aldéhydes en la trempant dans la solution de châssis moléculaire (E).
On effectue ensuite une étape dite de saturation consistant à faire réagir les fonctions aldéhydiques de la plaque de verre n'ayant pas réagi avec de l'hydroxylamine, en trempant ladite plaque dans une solution d'hydroxylamine à 10 mM.
On effectue ensuite l'oxydation des serines en aldéhydes en trempant la plaque dans une solution de périodate de sodium à 10 mM pendant 60 minutes.
On dépose ensuite une goutte d'une solution de N- acétylgalactose portant une fonction —O-NH2 sur le carbone anomérique . Puis on effectue une étape de saturation avec une solution de Sérum Albumine Bovine (BSA) •
La plaque obtenue est représentée schématiquement en figure 4.
Enfin, on effectue une révélation par un marquage lectine-FITC spécifique de la N-acétylgalactose, et passage au scanner. Le résultat est montré en figure 5.
On observe sur la figure 5 que les spots obtenus avec les châssis moléculaires portant quatre motifs N-acétylgalactose obtenus tels que décrits ci-dessus permettent la détection des lectines-FITC spécifiques du N-acétylgalactose à 30 μM.
Exemple 5 : Préparation d'un support solide sur lequel est greffé un châssis moléculaire puis des motifs de reconnaissance On prépare une solution aqueuse (E) comprenant 50 μM d'un châssis moléculaire (E) répondant à la formule (II) dans laquelle X1, X2, X3 et X4 représentent chacun un résidu serine, et Z représente -NHCOCH2ONH2. On fonctionnalise une plaque de verre portant des groupements aldéhydes en la trempant dans la solution de châssis moléculaire (E) pendant 30 minutes.
On effectue ensuite une étape dite de saturation consistant à faire réagir les fonctions aldéhydiques de la plaque de verre n'ayant pas réagi avec de l ' hydroxylamine , en trempant ladite plaque dans une solution d'hydroxylamine à 10 mM.
On effectue ensuite l'oxydation des serines en aldéhydes en trempant la plaque dans une solution de périodate de sodium à 10 mM pendant 60 minutes.
On dépose ensuite une goutte d'une solution à 50 μM de N- acétylgalactose ou de mannose portant une fonction —O-NH2 sur le carbone anomérique. On laisse incuber pendant 30 minutes et on lave à l'eau, puis SDS 0,2% puis de nouveau à l'eau. Puis on effectue une étape de saturation avec une solution de Sérum Albumine Bovine (BSA) .
Enfin, on effectue une révélation par un marquage indirect : On trempe la plaque dans une solution de lectine spécifique de la N-acétylgalactose ou du mannose (concentration 10 μg/mL) et on révèle avec la streptavidine CY3, et passage au scanner. Le résultat est montré en figure 1.
On observe sur la figure 6 que les spots obtenus avec les châssis moléculaires portant quatre motifs N-acétylgalactose obtenus tels que décrits ci-dessus permettent la détection des lectines correspondantes spécifiques du N-acétylgalactose et que les châssis moléculaires portant quatre motifs mannose obtenus tels que décrits ci-dessus permettent la détection des lectines correspondantes spécifiques du mannose à 50 μM. En outre, nous observons une bonne sélectivité de la reconnaissance : en effet, avec les châssis moléculaires portant quatre motifs N-acétylgalactose obtenus tels que décrits ci-dessus nous n'avons pas de signal avec des lectines correspondantes spécifiques du mannose et que les châssis moléculaires portant quatre motifs mannose obtenus tels que décrits ci-dessus nous n'avons pas de signal avec des lectines correspondantes spécifiques du N- acétylgalactose . Plus précisément, la figure 6 représente :
Etape 1 : Fonctionnalisation de la plaque de verre par le châssis moléculaire (E) puis saturation par NH2OH - Etape 2 : Oxydation des résidus serine en aldéhyde
Etape 3 : Dépôt de gouttes d'une solution à 50 μM de N- acétylgalactose (ligne 1) ou de mannose (ligne 2) portant une fonction -0-NH2
Etape 4 : Révélation par marquage indirect, Ligne 1 lectine biotinylée spécifique de la N-acétylgalactose puis streptavidine CY3 et ligne 2 lectine biotinylée spécifique du mannose puis streptavidine CY3 (concentration 10 μg/ml).

Claims

REVENDICATIONS
1. Support solide lié à au moins un châssis moléculaire permettant de lier de manière multivalente au moins un motif de reconnaissance ou présentant au moins un motif de reconnaissance de manière multivalente.
2. Support solide selon la revendication 1 caractérisé en ce que le châssis moléculaire présente au moins deux faces, et notamment deux faces.
3. Support solide selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que le châssis moléculaire est un cyclopeptide, notamment définissant deux faces.
4. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que le châssis moléculaire est un cyclopeptide présentant au moins un coude, notamment présentant deux coudes, notamment formés par l'enchaînement (L)PrO-(D)AA ou (D)PrO-(L)AA.
5. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 caractérisé en ce que le châssis moléculaire est un cyclopeptide comprenant 10 ou 14 résidus d'acides aminés.
6. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que le châssis moléculaire est un cyclopeptide de formule (I) suivante :
Figure imgf000023_0001
Formule ( I ) dans laquelle Y représente une entité chimique formant une liaison avec un support solide et X1, X2, X3 et X4 représentent chacun indépendamment les uns des autres une entité chimique, protégée, masquée, ou non, permettant de lier, ou liant, au moins un motif de reconnaissance.
7. Support solide selon l'une quelconque des revendications 2 à 6 caractérisé en ce que le châssis moléculaire présente plusieurs motifs de reconnaissance greffés sur sa face supérieure, notamment plusieurs fois le même motif.
8. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que le châssis moléculaire est lié au support solide par au moins une liaison covalente, par exemple du type liaison éther, ester, aminé, amide, thioéther, oxime, phosphate, sulfate, alcène, alcyne, hydrazide et disulfure, et en particulier une liaison oxime .
9. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisé en ce que le châssis moléculaire est lié indirectement au support solide, notamment via au moins un espaceur.
10. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé en ce que le support est sous forme de plaque, notamment des plaques à puits, de bille, notamment de microbille, de canaux notamment des capillaires ou chambres, de nanostructures notamment des nanotubes de carbone.
11. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que le support comprend du verre, du silicium, des oxides de semiconducteurs, par exemple l'oxide de silicium, du plastique, de l'or, des oxydes métalliques, notamment tels que oxyde d'indium et d'étain, des sols-gels, des terres rares, des assemblages organiques tels que des nanotubes de carbone.
12. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 caractérisé en ce que le motif de reconnaissance est une molécule d'intérêt, en particulier d'intérêt biologique, notamment choisi dans le groupe comprenant les sucres, acides nucléiques, peptides, protéines, molécules « mixtes », notamment glycopeptides, glycoprotéines, phospholipides, et un mélange de celles-ci.
13. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 caractérisé en ce que le motif de reconnaissance est lié au châssis moléculaire par au moins une liaison covalente, notamment une liaison éther, ester, aminé, amide, thioéther, oxime, phosphate, alcène, alcyne, hydrazide, disulfure et en particulier une liaison oxime.
14. Support solide selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 caractérisé en ce que le motif de reconnaissance est lié indirectement au châssis moléculaire.
15. Procédé de fabrication d'un support solide comprenant au moins un châssis moléculaire permettant de présenter ou présentant au moins un motif de reconnaissance de manière multivalente comprenant au moins l'étape consistant à greffer au moins un châssis moléculaire permettant de présenter ou présentant au moins un motif de reconnaissance de manière multivalente sur un support solide.
16. Procédé selon la revendication 15 caractérisé en ce que le support solide comprend au moins une fonction aldéhyde ou une liaison oxyamine.
17. Procédé selon la revendication 15 ou 16 caractérisé en ce que le châssis moléculaire comprend au moins une liaison oxyamine ou aldéhyde susceptible de réagir avec au moins une fonction présente sur le support solide.
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 17 caractérisé en ce que le support solide est lié au châssis moléculaire via une liaison oxime.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 18 caractérisé en ce que au moins une fonction réactive portée par le châssis moléculaire est protégée ou masquée, notamment par un résidu serine.
20. Procédé selon la revendication 19 caractérisé en ce que au moins une fonction réactive portée par le châssis moléculaire est déprotégée ou régénérée, et en particulier au moins un résidu serine est oxyde en aldéhyde glyoxylique.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications
15 à 20 caractérisé en ce que au moins un motif de reconnaissance est greffé sur le châssis moléculaire par réaction avec au moins une fonction réactive dudit châssis moléculaire.
22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 21 caractérisé en ce que le motif de reconnaissance est choisi parmi une molécule d'intérêt, en particulier d'intérêt biologique, notamment un sucre, acide nucléique, peptide, protéine, autre molécule organique ou un mélange de ceux-ci, notamment glycopeptide, glyco-protéine, phospholipide.
23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 à 22 caractérisé en ce que le motif de reconnaissance porte au moins une fonction aldéhyde ou oxyamine réagissant avec au moins une fonction oxyamine ou aldéhyde, et en particulier avec un groupe aldéhyde glyoxylique, portée par le châssis moléculaire pour former une liaison oxime.
24. Puce, notamment à sucre, comprenant au moins un support solide tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 ou obtenu par un procédé tel que défini selon l'une quelconque des revendications 15 à 23.
25. Utilisation de châssis moléculaire permettant de lier de manière multivalente au moins un motif de reconnaissance ou présentant au moins un motif de reconnaissance de manière multivalente pour fonctionnaliser une surface.
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