KR101745472B1 - 조류인플루엔자 바이러스의 세포 감염을 저해하는 물질을 선별하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 조류인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 유전자를 포함하는 플라스미드, 뉴라미니다아제 유전자를 포함하는 플라스미드, 렌티바이러스(lentivirus)로부터 유래한 gag 유전자 및 역전사효소 유전자를 포함하는 플라스미드, 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드를 동물세포에 공동-형질주입(co-transfection)하는 단계; (b) 공동-형질주입된 동물세포를 배양하는 단계; (c) 배양액으로부터 조류인플루엔자 바이러스 유사체(virus like particle, VLP)를 회수하는 단계; (d) 상기 조류인플루엔자 바이러스 유사체 및 후보 물질을 세포에 처리하는 단계; 및 (e) 상기 세포에서 리포터 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 조류인플루엔자의 세포 감염을 저해하는 물질을 선별하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명은 상기 바이러스 유사체가 인플루엔자 바이러스의 8개의 유전자 대신 리포터 유전자를 가지므로 숙주세포에 감염된 후에도 증식하지 않으며, 병원성이 낮아 BSL-2에서도 실시할 수 있다.

Description

조류인플루엔자 바이러스의 세포 감염을 저해하는 물질을 선별하는 방법{Method for screening material inhibiting cell infection of avian influenza virus}

본 발명은 인플루엔자의 세포 감염을 저해하는 물질을 선별하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 조류인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 및 뉴라미니다아제 유전자를 포함하는 플라스미드, 렌티바이러스(lentivirus)로부터 유래한 gag 유전자를 포함하는 플라스미드, 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드 및 역전사효소 유전자를 포함하는 플라스미드를 포함하는 조류인플루엔자 바이러스 유사체(Virus Like Particle, VLP)를 이용한 조류인플루엔자의 세포 감염을 저해하는 물질을 선별하는 방법에 관한 것이다.

가금류에 대한 H5N1 타입 조류인플루엔자 바이러스의 감염은 2003년 이후 아시아, 유럽, 아프리카 등을 포함한 넓은 지역에서 발생하고 있다. 조류인플루엔자 바이러스는 일반적으로 인간에게 직접 전파되지 않는 것으로 알려져 있으나, 1997년 H5N1 타입 조류인플루엔자 바이러스에 의한 인체 감염 사례가 홍콩에서 발견된 이후, H5N1, H7N7, H7N9, H9N2, H10N8의 다양한 아형의 조류인플루엔자 바이러스의 인체 감염 사례가 지속적으로 보고되고 있다. 조류인플루엔자 바이러스는 인간으로 직접 전파되거나 돼지 등의 중간 매개에 의해 감염될 수 있으며, 감염 후 유전적 변이나 여러 환경적 요소에 의해 인간에서 높은 감염 능력을 가질 수 있어, 세계보건기구(WHO)는 대유행 가능성이 큰 바이러스로 보고 지속적으로 감시하고 있다.

국내에는 조류인플루엔자의 인체 감염 사례는 아직 없으나, 양계장 등의 가금류 및 야생조류에서의 고 병원성 조류인플루엔자 H5N1의 발생은 2003년 이후 지속적으로 발생하고 있다. 2014년에는 H5N8이 전국 대부분 지역의 가금류에서 발생하여 축산 농가가 막대한 경제적 손해를 입었다.

인플루엔자의 대유행에 대응하기 위한 주된 치료제는 인플루엔자 바이러스 NA 저해제 및 M2 이온 채널 저해제이다. 그러나, 이에 대한 치료제에 대한 내성 변이 바이러스가 출현하면 대응이 어려울 수 있다. 이러한 상황 하에서, 다양한 인플루엔자 치료제의 개발이 요구되고 있다.

고 병원성 조류인플루엔자의 치료제 개발은 높은 수준의 생물학적 봉쇄(biocontainment) 하에서 진행되어야 한다. 그러나, 이러한 시설을 확보하고 유지하기 위해서는 많은 비용이 필요하다. 따라서, 낮은 수준의 생물학적 봉쇄 하에서 고 병원성 신 변종 인플루엔자 바이러스에 대한 치료제 개발 시스템 개발이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 낮은 생물학적 안전 수준(Bio Safety Level)에서 조류인플루엔자 세포 감염을 저해하는 물질을 선별하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, (a) 조류인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 유전자를 포함하는 플라스미드, 뉴라미니다아제 유전자를 포함하는 플라스미드, 렌티바이러스(lentivirus)로부터 유래한 gag 유전자 및 역전사효소 유전자를 포함하는 플라스미드 및 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드를 동물세포에 공동-형질주입(co-transfection)하는 단계; (b) 공동-형질 주입된 동물세포를 배양하는 단계; (c) 배양액으로부터 조류인플루엔자 바이러스 유사체(virus like particle, VLP)를 회수하는 단계; (d) 상기 조류인플루엔자 바이러스 유사체 및 후보 물질을 세포에 처리하는 단계; 및 (e) 상기 세포에서 리포터 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 조류인플루엔자의 세포 감염을 저해하는 물질을 선별하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (f) 조류인플루엔자 바이러스 및 제 1항에 따른 방법에 의해 선별된 물질을 세포에 처리하는 단계 및 (g) 상기 세포에서 조류인플루엔자 바이러스의 핵단백질(nucleoprotein, NP)의 발현 양을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 조류인플루엔자의 세포 감염을 저해하는 물질을 선별하는 방법을 제공한다. VLP를 이용하여 선별된 후보 물질이 세포 독성을 갖는 경우나, VLP 내에 포함되어 있는 리포터 유전자의 발현 자체가 저해될 수 있으므로, 본 발명은 VLP를 이용하여 발굴된 후보 물질에 대해 실제 조류인플루엔자 바이러스를 이용한 검증 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 조류인플루엔자 바이러스는 H5N1, H7N7, H7N9, H9N2 또는 H10N8 타입일 수 있으며, 바람직하게는 H5N1 타입일 수 있다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드는 렌티바이러스의 패키징(packaging) 서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체 예에서, 상기 리포터 유전자는 루시퍼라아제(Luciferase) 또는 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent protein, GFP)를 엔코딩하는 유전자일 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 생물학적 안전 수준-2(Bio Safety Level-2)에서 수행될 수 있다. 고 병원성 조류인플루엔자 바이러스는 생물학적 안전 수준-3(Bio Safety Level-3, BSL-3)에서 취급해야 하나, 본 발명의 조류인플루엔자 바이러스 유사체가 인플루엔자 바이러스의 8개의 유전자 대신 리포터 유전자를 가지므로 숙주세포에 감염된 후에도 증식하지 않으며, 병원성이 낮아 BSL-2에서도 실시할 수 있다.

본 발명의 조류인플루엔자 바이러스 유사체를 이용한 조류인플루엔자의 세포 감염을 저해하는 물질을 선별하는 방법은 상기 바이러스 유사체가 인플루엔자 바이러스의 8개의 유전자 대신 리포터 유전자를 가지므로 숙주세포에 감염된 후에도 증식하지 않으며, 병원성이 낮아 BSL-2에서도 실시할 수 있다.

도 1은 조류인플루엔자 바이러스 유사체(Virus Like Particle)을 제작하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 조류인플루엔자 바이러스 유사체를 이용하여 후보 물질을 탐색하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3a는 조류인플루엔자 바이러스 유사체를 이용하여 FDA로부터 승인 받은 약물 라이브러리에 대한 1차 스크리닝을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 조류인플루엔자 바이러스 유사체를 이용하여 천연 화합물 라이브러리에 대한 1차 스크리닝을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 조류인플루엔자 바이러스를 이용하여 1차 선별된 FDA 승인 약물에 대해 2차 스크리닝을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 조류인플루엔자 바이러스를 이용하여 1차 선별된 천연 화합물에 대해 2차 스크리닝을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 A/Chicken/Korea/IS/2006의 HA(XhoI-NotI) 및 NA(EcoRI-XhoI)를 포함하는 각각의 pCAGEN의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다. 도 6은 psPAX2의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.
도 7은 루시퍼라아제 유전자(BamHI-SalI)를 포함하는 pLV-luciferase의 플라스미드 지도를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 인플루엔자 바이러스 유사체( virus like particle , VLP )의 제작

H5N1 조류인플루엔자 바이러스(A/Chicken/Korea/IS/2006 (H5N1), 농림축산검역본부)의 단백질 발현을 위한 헤마글루티닌(haemagglutinin, HA), 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA) 유전자를 발현하기 위한 인플루엔자 표면항원 플라스미드(pCAGEN, Addgene plasmid#11160, 벡터에 멀티 클로닝 사이트에 위치한 XhoI과 NotI 부위를 잘라 A/Chicken/Korea/IS/2006 (H5N1) 조류 인플루엔자 바이러스 HA의 코딩 부위를 삽입하고(서열번호 1), 동 벡터의 멀티 클로닝 사이트에 위치하는 EcoRI과 XhoI을 잘라 A/Chicken/Korea/IS/2006 (H5N1) 조류 인플루엔자 바이러스의 NA의 코딩부위를 삽입하여(서열번호 2) 각각 제작), 바이러스 유사체(VLP)의 생성을 유도하는 렌티바이러스(lentivirus)로부터 유래한 gag 유전자를 발현하여 렌티바이러스의 패키징(packaging)과 VLP 상에 렌티바이러스 형태의 RNA 상태로 패키징되어 있는 리포터 유전자를 세포 내에서 발현할 수 있도록 해주는 역전사효소 유전자(RNA-의존성 DNA 폴리머라아제)를 엔코딩하는 플라스미드 요소를 갖는 플라스미드(psPAX2, Addgene plasmid#12260, 서열번호 3), VLP가 세포 내에 침투하여 감염 되었는지의 확인을 위한 리포터(reporter) 유전자를 엔코딩하는 플라스미드(pLV-eGFP, Addgene plasmid#36083, 벡터의 BamHI과 SalI부위를 잘라 eGFP발현유전자를 제거한 후, firefly luciferase발현 유전자를 삽입하여 제작, 서열번호 4)를 진핵 세포인 293T 세포(ATCC, CAT#CRL-3216)에 공동-형질주입(co-transfection)하였다. 상기 세포를 배양하여 리포터 유전자를 갖는 기능성의 인플루엔자 바이러스 유사체를 생성하였다(도 1).

실시예 2. 조류인플루엔자 H5N1 VLP 를 이용한 인플루엔자 치료제 후보물질의 1차 선별

조류인플루엔자 H5N1 VLP를 이용한 인플루엔자 치료제 후보물질을 선별하기 위하여, 미국 식품의약국(FDA)가 승인하는 약물 라이브러리 중 640종(Enzo Life Science Inc., BML-2843-0100) 및 천연 화합물 라이브러리(Enzo Life Science Inc., BML-2865-0100) 중 502종을 스크리닝하였다.

상기 약물 및 천연 화합물을 1㎍/ml 농도로 293T 세포에 30분간 처리하고, H5N1 VLP를 50,000 내지 100,000RLU(relative light unit, 루시퍼라아제 활성 단위)/웰(well)의 농도로 균일하게 세포를 감염시켰다.

감염된 세포를 20시간 배양 후 VLP의 감염 정도를 나타내는 리포터 유전자인 루시퍼라아제의 활성을 측정하고, 상기 약물 및 천연 화합물을 녹이는데 사용한 용매인 DMSO(dimethyl sulfoxide)만을 처리한 대조군 293T 세포에서 나타난 루시퍼라아제 활성 값을 100%로 하여 치료제 후보 군으로 처리한 물질들의 루시퍼라아제 활성 값을 상태적으로 환산하여 치료제/화합물의 처리에 의한 H5N1 VLP의 세포 감염 율을 측정하였다(도 2).

H5N1 VLP를 감염시켰을 때 세포 내 감염이 DMSO 대조 군과 비교하여 80% 이상 세포 감염을 억제하는 물질을 1차로 선별하였다. 그 결과, 22종의 FDA 승인 약물 및 57종의 천연 화합물을 선별하였다.

실시예 3. 조류 인플루엔자 H5N1 및 H1N1 바이러스 세포감염 억제 물질의 2차 선별

H5N1 VLP를 이용한 1차 선별과정을 통해 선별된 치료제 후보물질 중 78종(FDA 승인 치료제 22종 및 천연 화합물 57종)이 실제 인플루엔자 바이러스의 세포 감염을 억제할 수 있는지 확인하기 위하여 2차 선별을 수행하였다.

상기 실시 예 2에서 1차 선별한 치료제 후보물질 78종을 1㎍/ml의 농도로 MDCK(Madin-Darby canine kidney, ATCC, CAT#PTA-7909) 세포에 30분간 처리하고, 실제 인플루엔자 바이러스 A/Chicken/Korea/IS/2006(H5N1 IS) (농림축산검역본부로부터 제공받음), A/Vietnam/1194/2004(H5N1 VN)(미국 CDC로부터 제공받음), A/Puerto Rico/8/1934(H1N1 PR8)(미국 CDC로부터 제공받음)를 각각 50×TCID₅₀/웰(well)의 농도로 세포에 감염시킨 후, 20시간 배양하였다. 배양 후, MDCK 세포 내에서 인플루엔자 바이러스의 핵단백질(nucleoprotein, NP)의 발현 양을 ELISA 방법을 통해 확인하고 이를 인플루엔자바이러스의 세포 감염의 척도로 사용하였다.

그 결과 값을 DMSO만을 처리하고 인플루엔자바이러스만을 처리한 대조군의 핵단백질의 ELISA의 결과 값(O.D.)을 100%의 세포가 인플루엔자 바이러스에 의해 감염된 것으로 간주하고, 1차 선별된 치료제 후보물질을 처리한 세포의 세포 감염 율을 상대적으로 수치화하였다.

H5N1 IS, H5N1 VN, H1N1 PR8 중 2종 이상의 바이러스에 의한 감염을 70% 이상 억제하는 물질을 최종 치료제 후보물질로 선정하였다(도 4a 및 도 4b).

<110> Republic of Korea <120> Method for screening material inhibiting cell infection of avian influenza virus <130> 54027 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 6540 <212> DNA <213> pCAGEN(Addgen plasmid#11160) - A/Chicken/Korea/IS/2006-HA (XhoI-NotI) <400> 1 gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggact atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300 cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360 tattagtcat cgctattacc atgggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc 420 atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca 480 gcgatggggg cggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg 540 gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt 600 tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg 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tccccgaaaa gtgccacctg 6540 6540 <210> 2 <211> 6177 <212> DNA <213> pCAGEN(Addgen plasmid#11160) - A/Chicken/Korea/IS/2006-NA (EcoRI-XhoI) <400> 2 gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggact atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300 cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360 tattagtcat cgctattacc atgggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc 420 atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca 480 gcgatggggg cggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg 540 gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt 600 tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc 660 gggagtcgct gcgttgcctt cgccccgtgc cccgctccgc gccgcctcgc gccgcccgcc 720 ccggctctga 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Claims (9)

1. (a) 조류인플루엔자 바이러스로부터 분리한 서열번호 1의 헤마글루티닌 유전자를 포함하는 플라스미드, 서열번호 2의 뉴라미니다아제 유전자를 포함하는 플라스미드, 렌티바이러스(lentivirus)로부터 유래한 gag 유전자 및 역전사효소 유전자를 포함하는 서열번호 3의 플라스미드 및 리포터 유전자를 포함하는 서열번호 4의 플라스미드를 동물세포에 공동-형질주입(co-transfection)하는 단계;
   (b) 공동-형질 주입된 동물세포를 배양하는 단계;
   (c) 배양액으로부터 조류인플루엔자 바이러스 유사체(virus like particle, VLP)를 회수하는 단계;
   (d) 상기 조류인플루엔자 바이러스 유사체 및 후보 물질을 세포에 처리하는 단계;
   (e) 상기 세포에서 리포터 활성을 측정하는 단계;
   (f) 조류인플루엔자 바이러스 및 상기 리포터 활성 측정으로 선별된 1차 후보물질을 세포에 처리하는 단계; 및
   (g) 상기 세포에서 조류인플루엔자 바이러스의 핵단백질(nucleoprotein, NP)의 발현 양을 측정하여 2차 후보물질을 선별하는 단계를 포함하고,
   상기 1차 후보물질은 조류인플루엔자 바이러스 유사체를 처리하지 않은 대조군에 비해 리포터 활성을 80% 이상 감소시키며,
   상기 2차 후보물질은 A/Chicken/Korea/IS/2006, A/Vietnam/1194/2004 및 A/Puerto Rico/8/1934 조류인플루엔자 바이러스 중 2종 이상의 조류인플루엔자 바이러스에서 핵단백질(nucleoprotein, NP)의 발현양을 조류인플루엔자 바이러스를 처리하지 않은 대조군에 비해 70% 이상 감소시키는 것으로 선별하는 것을 특징으로 하는,
   생물학적 안전 수준-2(Bio Safety Level-2)에서 조류인플루엔자 바이러스의 세포 감염을 저해하는 물질을 선별하는 방법.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 조류인플루엔자 바이러스가 H5N1, H7N7, H7N9, H9N2 또는 H10N8 타입인 방법.
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 상기 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드가 렌티바이러스의 패키징(packaging) 서열을 추가로 포함하는 방법.
6. 제 1항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 루시퍼라아제(Luciferase) 또는 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent protein, GFP)를 엔코딩하는 유전자인 방법.
7. 삭제
8. 제3항에 있어서, 상기 조류인플루엔자 바이러스가 A/Chicken/Korea/IS/2006, A/Vietnam/1194/2004 또는 A/Puerto Rico/8/1934인 방법.
9. 삭제

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