JP2007529997A - 機能的インフルエンザウイルス様粒子(vlp) - Google Patents
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Abstract
Description
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科の1属である(総説について、MurphyおよびWebster、1996を参照のこと)。A、BおよびCと命名された3種のサブタイプのインフルエンザウイルスが存在する。そのインフルエンザビリオンは、分節されたマイナスセンスRNAゲノムを含有する。インフルエンザビリオンは、以下のタンパク質:ヘマグルチニン(HA)、ノイラミニダーゼ(NA),マトリックス(M1),プロトンイオンチャネルタンパク質(M2),核タンパク質(NP)、ポリメラーゼ塩基性タンパク質1(PB1)、ポリメラーゼ塩基性タンパク質2(PB2)、ポリメラーゼ酸性タンパク質(PA)、および非構造タンパク質2(NS2)を含む。上記HA、NA、M1およびM2は、膜結合型タンパク質であり、一方NP、PB1、PB2、PAおよびNS2は、ヌクレオキャプシド関連タンパク質である。上記NS1は、ビリオン粒子と関連しないが、インフルエンザ感染細胞に特異的である、唯一の非構造タンパク質である。上記M1タンパク質は、インフルエンザ粒子に最も豊富に存在するタンパク質である。上記HAタンパク質およびNAタンパク質は、エンベロープ糖タンパク質であり、そのウイルス粒子が細胞へ付着し、そして侵入する役割を果たし、ウイルス中和および防御免疫のための主要抗原エピトープの供給源である。HAタンパク質およびNAタンパク質の両方は、予防的インフルエンザワクチンにとって最も重要な成分であると考えられる。
本発明によると、トリインフルエンザウイルスA型H9N2のHAタンパク質コード配列(GenBank登録番号AJ404626)、NAタンパク質コード配列(GenBank登録番号AJ404629)、M1タンパク質コード配列(GenBank登録番号AJ278646タンパク質)、M2タンパク質コード配列(GenBank登録番号AF255363)およびNPタンパク質コード配列(GenBank登録番号AF255742)を含む高分子タンパク質構造物、ならびにヒトインフルエンザウイルスA型H3N2のHA配列コード(GenBank登録番号AJ311466)およびNA配列コード(GenBank登録番号AJ291403)を含む高分子タンパク質構造物が提供される。これらのインフルエンザウイルス遺伝子をコードするゲノムRNAは、インフルエンザウイルス単離物から、またはインフルエンザ感染生物体の組織から単離され得る。同じまたは異なる株あるいは型のインフルエンザウイルス由来のこれらコード配列の各々は、発現ベクター内で転写プロモーターの下流にクローン化されそして細胞において発現される。
本明細書で使用される場合、用語「バキュロウイルス」とは、バキュロウイルス科としてもまた知られており、エンベロープを有する節足動物のDNAウイルスの一族を指しそのメンバーは、挿入細胞培養において組換えタンパク質を産生する発現ベクターとして使用され得る。そのビリオンは、環状スーパーコイルの2本鎖DNAの分子(Mr54x106〜154x106)を含有する、1以上の桿状ヌクレオキャプシドを含有する。ベクターとして使用される上記ウイルスは、一般にAutographa califonica核多角体病ウイルス(NPV)である。導入遺伝子の発現は、感染細胞においてウイルスが包埋される大核封入体のポリヘドリンタンパク質成分の発現を通常制御する強力なプロモーターの調節下である。
(実施例1)
(材料および方法)
トリインフルエンザA/Hong Kong/1073/99(H9N2)ウイルスのHA遺伝子、NA遺伝子、およびM1遺伝子を、バキュロウイルスbacmid発現系を使用して、Spodoptera frugiperda細胞(Sf−9S細胞株;ATCC PTA−4047)において発現した。上記HA遺伝子、NA遺伝子およびM1遺伝子を、トリインフルエンザA/Hong Kong/1073/99(H9N2)ウイルスから単離されたRNAを使用して、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により合成した(図1、図2および図3)。逆転写およびPCRのために、トリインフルエンザA/Hong Kong/1073/99(H9N2)ウイルスのHA遺伝子、NA遺伝子およびM1遺伝子に特異なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した(表1)。これらの遺伝子のcDNAコピーを、細菌サブクローニングベクターであるpCR2.1TOPOへ最初にクロ−ニングした。得られた3種のpCR2.1TOPOベースのプラスミドから、上記のHA遺伝子、NA遺伝子およびM1遺伝子をバキュロウイルス転移ベクターpFastBac1(InVitrogen)のAcMNPVポリヘドリンプロモーターの下流に挿入し、3種のpFastBac1ベースのプラスミド(それぞれこれらのインフルエンザウイルス遺伝子を発現するpHA、pNAおよびpM1)を得た。次いで、単一のpFastBac1ベースのプラスミドpHAMを、別個のポリへドリンプロモーターの下流に、HA遺伝子およびM1遺伝子の両方を、各々コードするよう構築した(図4)。上記pNAプラスミド内に隣接する5’および3’領域を有するNA遺伝子のヌクレオチド配列を決定した(配列番号1)(図1)。同時に、上記の隣接領域を有するHA遺伝子およびM1遺伝子のヌクレオチド配列をまた、pHAMプラスミドを使用して決定した(配列番号2および3)(図2および3)。
感染Sf−9S細胞における発現産物を、感染後(p.i.)72時間目で、HA特異抗体およびM1特異抗体を使用して、SDS−PAGE分析、クーマシーブルータンパク質染色およびウェスタン免疫ブロット分析により特性分析をした(図5)。ウェスタン免疫ブロット分析をインフルエンザウイルスA型/Hong Kong/1073/99(H9N2)(CDC、Atlanta、Georgia、USA)に対して惹起させたウサギ抗体またはインフルエンザM1タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体(Serotec、UK)を使用して実施した。予想される分子量(それぞれ64kd、60kdおよび31kd)の上記HAタンパク質、NAタンパク質およびM1タンパク質を、ウェスタン免疫ブロット分析により検出した。このアッセイで検出したHAタンパク質の量と比較して、上記NAタンパク質は、インフルエンザA/Hong Kong/1073/99(H9N2)ウイルスに対するウサギ血清との反応性がより低かった。検出可能なNAタンパク質の量に対する説明としては、上記HAタンパク質と比較して、組換えバキュロウイルスで感染させたSf−9S細胞からのNAタンパク質の発現量が低いこと、ウェスタン免疫ブロットアッセイにおける変性条件下でのこの血清との上記NAの反応性がより低かったこと(膜結合のゲル電気泳動の間での重要なNAエピトープの消失に起因する)、HA抗体と比較してNA抗体のより低いアビディティーまたは上記血清中においてNA抗体の存在量がより低いことが挙げられた。
組換えインフルエンザウイルスタンパク質の産生を指向することができる合成核酸配列を提供することが、本発明の目的である。そのような合成核酸配列を、インフルエンザウイルスから単離されたインフルエンザウイルスの天然ゲノムRNAを使用して、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により得た。この適用のために、核酸配列とは、RNA、DNA、cDNAまたはそのタンパク質をコードするいかなる合成改変体をもいう。
インフルエンザA/Sydney/5/94(H3N2)ウイルスは、M.Massare博士(Novavax,Inc.、Rockville、MD)から得た。ウイルスゲノムRNAを、BSL2封じ込め条件下で、Novavax、 Inc.においてTrizol LS試薬(Invitrogen)を使用して、酸フェノール抽出法により単離した。上記ウイルスRNAのcDNA分子を、逆転写、ならびにHAタンパク質、NAタンパク質、M1タンパク質、M2タンパク質およびNPタンパク質に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するPCRにより、得た(表2)。上記PCR断片を、細菌サブクローニングベクターpCR2.1TOPOのEco RI部位の間に、クロ−ニングし、HAクローン、NAクローン、M1クローン、M2クローンおよびNP cDNAクローンを含有する5種の組換えプラスミドを得た。
pCR2.1TOPOベースプラスミドから、HA遺伝子、NA遺伝子またはM1遺伝子を、ポリヘドリン(polyhedron)遺伝子座内のTn7 att部位であって、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの下流、かつポリアデニル化シグナル配列の上流にpFastBac1バキュロウイルス転移ベクター(InVitorgen)中にサブクローニングした。上記ウイルス遺伝子を、T4 DNAリガーゼで連結した。HA遺伝子については,pCR2.1TOPO−HA由来のBam HI−Kpn I DNA断片を、Bam HI−Kpn I消化pFastBac1プラスミドDNAに挿入した。NA遺伝子については、pCR2.1TOPO−NA由来のEco RI DNA断片を、Eco RI消化pFastBac1プラスミドDNAに挿入した。M1遺伝子に関しては、pCR2.1TOPO−M1からのEco RI DNA断片を、Eco RI消化pFastBac1プラスミドDNAに挿入した。コンピテントE.coli DH5α細菌(InVitrogen)を、これらのDNA連結反応で形質転換し、形質転換されたコロニーが得られ、そして細菌クローンが単離された。得られたpFastBac1ベースのプラスミドであるpFastBac1−HA、pFastBac1−NA、およびpFastBac1−M1を、アガロースゲル上で、制限酵素マッピング(図4A)により特性分析した。クローン化された遺伝子の図1〜3に示されるヌクレオチド配列を、自動化されたDNA配列決定により決定した。DNA配列分析は、クローン化されたインフルエンザHA遺伝子、NA遺伝子およびM1遺伝子が、以前に公開されたこれらの遺伝子のヌクレオチド配列[インフルエンザA/Hong Kong/1073/99(H9N2)のNA遺伝子、HA遺伝子およびM1遺伝子(それぞれ、GenBank登録番号AJ404629、AJ404626およびAJ278646)]と同一であったことを示した。
pCR2.1TOPOベースプラスミドから、HA遺伝子、NA遺伝子、M1遺伝子、M2遺伝子またはNP遺伝子を、ポリヘドリン(polyhedron)遺伝子座内のTn7 att部位であって、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの下流、かつポリアデニル化シグナル配列の上流においてpFastBac1バキュロウイルス転移ベクターにサブクローニングした。ウイルス遺伝子をT4 DNAリガーゼで連結した。HA遺伝子については,pCR2.1TOPO−hHA3由来のBam HI−Kpn I DNA断片を、Bam HI−Kpn I消化pFastBac1プラスミドDNAに挿入した。NA遺伝子については、pCR2.1TOPO−hNA由来のEco RI DNA断片を、Eco RI消化pFastBac1プラスミドDNAに挿入した。M1遺伝子については、pCR2.1TOPO−hM1由来のEco RI DNA断片を、Eco RI消化pFastBac1プラスミドDNAに挿入した。M2遺伝子については、pCR2.1TOPO−hM2由来のEco RI DNA断片を、Eco RI消化pFastBac1プラスミドDNAに挿入した。NP遺伝子については、pCR2.1TOPO−hNP由来のEco RI DNA断片を、Eco RI消化pFastBac1プラスミドDNAに挿入した。コンピテントE.coli DH5α細菌を、これらのDNA連結反応で形質転換し、形質転換されたコロニーが得られ、そして細菌クローンが単離された。得られたpFastBac1ベースのプラスミドであるpFastBac1−hHA3、pFastBac1−hNA2、pFastBac1−hM1、pFASTBAC1−hM2およびpFASTBAC1−hNPを、アガロースゲル上で、制限酵素マッピングにより特性分析した。クローン化された遺伝子のヌクレオチド配列を、自動化されたDNA配列決定により決定した。DNA配列分析は、クローン化されたインフルエンザHA遺伝子、NA遺伝子、M1遺伝子、M2遺伝子およびNP遺伝子が、以前に公開されたこれらの遺伝子のヌクレオチド配列と同一であることを示した。
複数のインフルエンザA/Hong Kong/1073/99(H9N2)ウイルス遺伝子を発現するpFastBac1ベースのbacmid転移ベクターを構築するために、最初にM1遺伝子を含有するpFastBac1−M1プラスミド由来のSna BI−Hpa I DNA断片をpFastBac1−HAのHpa I部位へクローン化した。この結果、独立した発現カセット内に別個のポリヘドリンプロモーターの制御下で発現するHA遺伝子およびM1遺伝子の両方をコードするpFastBac1−HAMプラスミドが得られた。
上記で得られた多重bacmid転移ベクターpFastBac1−NAHAMを、昆虫細胞において発現させるためのトリインフルエンザA/Hong Kong/1073/99(H9N2)HA遺伝子、NA遺伝子およびM1遺伝子をコードする多重組換えバキュロウイルスを生成するために、使用した。組換えbacmid DNAを、コンピテントE.coli DH10BAC細胞(InVitrogen)に含まれているpFastBac1−NAHAM DNAおよびAcMNPCバキュロウイルスゲノムとの間のポリヘドリン配列およびTn7 att DNA配列における部位特異的組換えにより産生した(図4B)。組換えbacmidDNAを、mini−prepプラスミドDNA法により単離し、カチオン性脂質CELLFECTIN(InVitrogen)を使用してSf−9S細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションに続き、組換えバキュロウイルスを単離し、プラークを精製し、そしてSf−9S昆虫細胞において増幅した。ウイルスストックをSf−9S昆虫細胞において調製し、トリインフルエンザウイルスHA遺伝子産物、NA遺伝子産物およびM1遺伝子産物の発現を特性分析した。得られた組換えバキュロウイルスを、bNAHAM−H9N2と命名した。
無血清培地(HyQ SFM、HyClone、Ogden、UT)中で28℃にて振盪フラスコにおいて懸濁培養物として維持されたSf−9S昆虫細胞を、細胞密度2x106細胞/mlで、組換えバキュロウイルス、bNAHAM−H9N2で、感染多重度(MOI)3pfu/細胞で、感染させた。上記ウイルス感染を、インフルエンザタンパク質の発現が可能なように72時間続けた。感染昆虫細胞におけるトリインフルエンザA/Hong Kong/1073/99(H9N2)HAタンパク質およびM1タンパク質の発現を、SDS−PAGEおよびウェスタン免疫ブロット分析により確認した。SDS−PAGE分析を、還元および変性条件下で4〜12%直線勾配NuPAGEゲル(InVitrogen)で実施した。ウェスタン免疫ブロット分析における一次抗体は、CDCから得られたトリインフルエンザA/Hong Kong/1073/99(H9N2)に対して惹起されたポリクローナルウサギ抗血清、およびインフルエンザM1タンパク質に対するモノクローナルマウス抗血清(Serotec,UK)であった。ウェスタン免疫ブロット分析のための2次抗体は、ウサギまたはマウスIgG(H+L)に対して惹起されたアルカリホスファターゼ結合体化ヤギIgG抗血清(KirkegaardおよびPerry Laboratories、Gaithersburg、MD、USA)であった。これらの分析の結果(図5)は、HAタンパク質およびM1タンパク質が、バキュロウイルス感染昆虫細胞において発現されることを示した。
インフルエンザA/Hong Kong/1073/99(H9N2)HA、NAおよびM1遺伝子産物を発現する組換えバキュロウイルスbNAHAM−H9N2で感染したSf−9S昆虫細胞からの培養上清(200ml)を、低速遠心分離により、収穫した。培養上清とはSorval RC−5B超高速遠心分離機で、GS−3ローターを使用して、10,000x gおよび4℃で、1時間の遠心分離により清澄化した。ウイルスおよびVLPを、Sorval TH−641スイングローターを使用して、Sorval ODT−65超遠心分離機における27,000rpmおよび4℃で3時間の遠心分離により、清澄にした培養上清から単離した。上記ウイルスペレットを1mlのPBS(pH7.2)に再懸濁し、20〜60%(重量/容量)の不連続ショ糖段階勾配にローディングし、Sorval TH−641ローターを使用して、Sorval OTD−65超遠心分離機で、27,000rpm、4℃で16時間、遠心分離をして溶解した。画分(0.5ml)を、ショ糖勾配の上部から収集した。
VLPおよびモノマータンパク質のようなタンパク質高分子は、それらの質量サイズおよび形状の基づいてゲル濾過またはサイズ排除クロマトグラフィーカラム上で、別々に移動する。ショ糖勾配画分からの組換えインフルエンザタンパク質が、モノマータンパク質であるかVLPのような高分子タンパク質複合体であるかを決定するために、樹脂床容量14mlのSepharose CL−4B(Amersham)を有するクロマトグラフィーカラム(7mm x 140mm)を調製した。サイズ排除カラムをPBSで平衡化し、見かけ分子量が、それぞれ2,000,000;20,000;および1,357であるデキストランブルー2000、デキストランイエローおよびビタミンB12(Amersham Pharmacia)で較正し、カラムのボイドボリュームを確認した。デキストランブルー2000は、そのボイドボリューム(6ml画分)でカラムから溶出した。予想されたように、組換えインフルエンザタンパク質複合体もまた、そのボイドボリューム(6ml)でカラムから溶出した。この結果は、VLPのような高分子量の高分子タンパク質複合体に特徴的であった。カラム画分におけるウイルスタンパク質を、実施例6で上記されたようにウェスタン免疫ブロット分析により検出した。上記M1タンパク質を、ボイドボリューム画分で検出した(図7)。予想されたように、バキュロウイルスタンパク質もまたそのボイドボリューム中にあった。
ショ糖勾配で単離され、組換えトリインフルエンザタンパク質を含有する高分子タンパク質複合体が、インフルエンザビリオンと類似する形態を有するか否かを決定するために、陰性染色サンプルの電子顕微鏡試験を実施した。組換えトリインフルエンザA/Hong Kong/1073/99(H9N2)タンパク質複合体を濃縮し、そして実施例7に記載されているように不連続ショ糖勾配上での超遠心分離により培養上清から精製した。ショ糖勾配画分のアリコートを、pH7.2のPBS中2%グルタルアルデヒドで処理し、新たな放出されたプラスチック/カーボンコートされたグリッドに吸収させ、蒸留水で洗浄した。上記サンプルを2%リンタングステン酸ナトリウム、pH6.5で染色し、透過型電子顕微鏡(Philips)を使用して観察した。2つのショ糖勾配画分からの組換えトリインフルエンザH9N2タンパク質複合体の陰性染色サンプルの電子顕微鏡写真は、2つのショ糖勾配画分からの球状粒子および桿状粒子を示した(図8)。上記粒子は、異なるサイズ(60および80nm)および形態を有する。両方の型の粒子の、より大きな複合体ならびに桿状粒子もまた検出された(図8)。観察された全てのタンパク質複合体構造物は、インフルエンザウイルスのHAペプロマーおよびNAペプロマーに類似するスパイク様表面突起を示した。上記80nm粒子の野生型インフルエンザウイルス粒子のサイズおよび外観に類似していたので、これらの構造は、おそらくエンベロープインフルエンザVLPを示していた。ほぼ60nmの小さい方の粒子は、上記のVLPとは形態学的にも構造的にも異なるサブウイルス粒子を、おそらく示した。
精製したインフルエンザVLPおよびタンパク質が、インフルエンザウイルスに特徴的な血球凝集反応活性およびノイラミニダーゼ活性のような機能的特性を有するか否かを決定するために、精製されたインフルエンザVLPおよびタンパク質を、血球凝集反応アッセイおよびノイラミニダーゼアッセイについて試験した。
インフルエンザVLP含有ショ糖勾配画分におけるノイラミニダーゼ活性の量を、ノイラミニダーゼアッセイにより決定した。このアッセイにおいて、NA(酵素)は、基質(フェチュイン)に作用し、そしてシアル酸を遊離させた。酵素活性を停止させるために、亜ヒ酸塩試薬を添加した。遊離したシアル酸の量を、遊離のシアル酸の量に比例してピンク色を生じるチオバルビツール酸で化学的に決定した。色(発色団)の量を、波長594nmで、分光光学計において測定した。図8に示されるデータは、ショ糖勾配のVLP含有画分によリ、顕著な量のシアル酸が産生され、そしてこれらの画分が血球凝集反応活性を示す画分に対応することを示した。
組換えインフルエンザVLPの免疫原性を、マウスを免疫して、次いで免疫血清のウェスタンブロット分析により確認した。トリインフルエンザウイルスA型/Hong Kong/1073/99由来のHAタンパク質、NAタンパク質およびM1タンパク質を含みショ糖勾配で精製された組換えVLP(1μg/注射)を、0日目と28日目に十匹(10)の雌性BALB/cマウスの三角筋部に皮下接種した(図11)。PBS(pH7.2)を、五匹(5)のマウスに陰性対照として投与した。それらのマウスの眼窩上腔から、−1日目(予備採血)、27日目(1次採血)および54日目(2次採血)に採血した。一晩凝固させそして遠心分離した後、血液サンプルから血清を収集した。
当業者は、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識するかまたは慣用的にすぎない実験しか使用せずに、確認し得る。そのような等価物は、特許請求の範囲に包含されるよう意図されている。
Claims (33)
- 高分子タンパク質構造物であって、
(a)第1インフルエンザウイルスM1タンパク質および
(b)付加的構造タンパク質
を含み、該付加的構造タンパク質は、
(i)第2インフルエンザウイルスM1タンパク質;
(ii)(a)第1インフルエンザウイルスHAタンパク質、
(b)第1インフルエンザウイルスHAタンパク質;
(iii)(a)第1インフルエンザウイルスNAタンパク質、
(b)第2インフルエンザウイルスNAタンパク質;および
(iv)(a)第1インフルエンザウイルスM2タンパク質、
(b)第2インフルエンザウイルスM2タンパク質;
からなる群より選択され、
ここで該付加的構造タンパク質が、サブグループ(i)からではない場合、(ii)、(iii)および(iv)のうちの少なくとも1つのサブグループの両方のメンバーが含まれる、高分子タンパク質構造物。 - 前記高分子タンパク質構造物が、サブウイルス粒子、ウイルス様粒子(VLP)、キャプソメア構造物またはそれらの部分、ワクチン、多価ワクチンおよびその混合物からなる群より選択される、請求項1に記載の高分子タンパク質構造物。
- 前記付加的構造タンパク質が、非インフルエンザウイルスより以外の株由来の核タンパク質(NP)および膜タンパク質からなる群より選択される、請求項1に記載の高分子タンパク質構造物。
- 前記付加的構造タンパク質が、非インフルエンザ源由来の膜タンパク質である、請求項3に記載の高分子タンパク質構造物。
- 前記タンパク質構造物が、宿主細胞において組換え構築物から自己会合する、請求項1に記載の高分子タンパク質構造物。
- 少なくとも1つの構造タンパク質が、鳥類起源または哺乳動物起源に由来する、請求項1に記載の高分子タンパク質構造物。
- 前記構造タンパク質が、異なるサブタイプのインフルエンザウイルスに由来する、請求項1に記載の高分子タンパク質構造物。
- 前記インフルエンザウイルスのサブタイプが、サブタイプAのインフルエンザウイルスおよびサブタイプBのインフルエンザウイルスからなる群より選択される、請求項7に記載の高分子タンパク質構造物。
- 前記インフルエンザウイルスが、野生型インフルエンザウイルスを含む、請求項7に記載の高分子タンパク質構造物。
- 前記高分子タンパク質構造物が、異型のウイルス様粒子(VPL)へと自己会合する能力を有する、少なくとも1つの構造タンパク質を含む、請求項1に記載の高分子タンパク質構造物。
- 少なくとも1つのタンパク質の部分が、インフルエンザウイルスにより産生されない部分を有するキメラタンパク質構造物を含む、請求項2に記載の高分子タンパク質構造物。
- 請求項2に記載の高分子タンパク質構造物とキャリアまたは希釈剤とを含む、組成物。
- アジュバントをさらに含む、請求項12記載の組成物。
- 前記構造物が、ヘマグルチニン活性を示す組成物から選択される、請求項2に記載の高分子タンパク質構造物。
- 前記構造物が、ノイラミニダーゼ活性を示す組成物から選択される、請求項2に記載の高分子タンパク質構造物。
- インフルエンザウイルス中和抗体を誘導するインフルエンザVLPの立体配座エピトープを含む、請求項2に記載の高分子タンパク質構造物。
- 請求項16に記載のタンパク質構造物とキャリアまたは希釈剤とを含む、ワクチン組成物。
- インフルエンザ由来のVLPを産生する方法であって、該方法は、
(a)インフルエンザ構造遺伝子をコードする構築物を構築する工程であって、組換えバキュロウイルスが、M1、HAおよびインフルエンザウイルス由来の少なくとも1つの第1構造タンパク質をコードする、工程;
(b)適切な宿主細胞を該組換えバキュロウイルスでトランスフェクトするか、感染させるかまたは形質転換し、該宿主細胞を、M1、HA、およびインフルエンザウイルス由来の少なくとも1つの構造タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程;
(c)該宿主細胞においてVLPの形成を可能にする工程;
(d)機能性インフルエンザVLPを含有する感染細胞培地を収穫する工程;ならびに
(e)該VLPを精製する工程
を包含する、方法。 - インフルエンザウイルス由来の構造タンパク質が、NA、M2およびNPからなる群より選択される、請求項18に記載の方法。
- 少なくとも1つの構造タンパク質が、鳥類起源または哺乳動物起源に由来する、請求項18に記載の方法。
- 前記構造タンパク質が、サブタイプAのインフルエンザウイルスおよびサブタイプBのインフルエンザウイルスからなる群より選択される、請求項18に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、真核細胞である、請求項18に記載の方法。
- 前記VLPが、キメラVLPを含む、請求項18に記載の方法。
- 請求項18に記載の方法であって、該方法は、
(a)前記宿主細胞を、第2インフルエンザタンパク質をコードする第2組換え構築物で共トランスフェクトするか、共感染させるかまたは共形質転換、それにより該第2インフルエンザタンパク質が前記VLP内に取り込まれる、工程
をさらに包含する、請求項18に記載の方法。 - インフルエンザVLPを含有する薬物物質を処方する方法であって、該方法は、
(a)インフルエンザウイルス遺伝子をコードする組換え構築物を宿主細胞中に導入する工程;
(b)細胞において機能的な同型VLPまたは異型VLPへの組換えインフルエンザウイルスタンパク質の自己会合を可能にする工程;
(c)インフルエンザVLPを単離しそして精製する工程;および
(d)該インフルエンザVLPを含有する薬物物質を処方する工程
を包含する、方法。 - 前記薬物物質が、アジュバンドをさらに含む、請求項25に記載の方法。
- 薬物製品を処方する方法であって、該方法は、インフルエンザVLPを含有する請求項25に記載の薬物物質と脂質小胞とを混合する工程を包含する、方法。
- 前記脂質小胞が、非イオン性脂質小胞である、請求項27に記載の方法。
- 脊椎動物におけるインフルエンザウイルス感染に対する体液性免疫を検出する方法であって、該方法は
(a)インフルエンザウイルス高分子構造物の少なくとも1つの立体配座エピトープを有する抗体検出有効量のインフルエンザウイルスタンパク質を含む、試験試薬を提供する工程;
(b)該試験試薬と、インフルエンザウイルス感染に関して試験する脊椎動物由来の体液サンプルとを接触させる工程;
(c)該サンプル中に含まれるインフルエンザウイルス特異抗体を、インフルエンザウイルス高分子構造物の立体配座エピトープに結合させ抗原抗体複合体を形成させることを可能にする工程;
(d)非結合複合体から、該複合体を分離する工程;
(e)該複合体を、検出可能に標識された免疫グロブリン結合薬剤と接触させる工程;および
(f)該複合体に結合した該検出可能に標識された免疫グロブリン結合薬剤の量を決定する工程
を包含する、方法。 - 該ウイルスに感染したことが疑わしい動物またはヒトに由来する標本において、インフルエンザウイルスを検出する方法であって、該方法は、
(a)該インフルエンザウイルスの粒子の少なくとも1つの立体配座エピトープに対して特異性を有する抗体を提供する工程であって、該抗体は検出可能なシグナルを産生する標識を有するか、または検出可能に標識された試薬に結合されている;
(b)該標本を該抗体と接触させる工程;
(c)該抗体を、該インフルエンザウイルスに結合することを可能にする工程;および
(d)該検出可能な標識により該標本中に存在するインフルエンザウイルスの存在を決定する工程
を包含する、方法。 - 有効量の請求項13に記載の組成物を脊椎動物に投与する工程を包含する、処置方法。
- 有効量の請求項17に記載のワクチン処方物を脊椎動物に投与する工程を包含する、インフルエンザを予防する方法。
- 請求項13に記載の組成物を投与することを包含する、防御免疫応答を提供する方法。
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