ES2566361T3 - Composiciones y métodos para diagnosticar y/o tratar una infección gripal - Google Patents

Composiciones y métodos para diagnosticar y/o tratar una infección gripal Download PDF

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Abstract

Una variante del polipéptido de hemaglutinina ("HA") de la gripe H1 HA obtenida por ingeniería genética cuya secuencia de aminoácidos muestra al menos un 90 % de identidad con un polipéptido HA de H1 de tipo silvestre de referencia que es el HA de la cepa A/California/04/2009, cuya secuencia de aminoácidos incluye: un resto en una posición correspondiente al resto 186 de HA de H3 de tipo silvestre, siendo dicho resto Pro; un resto en una posición correspondiente al resto 189 de HA de H3 de tipo silvestre, siendo dicho resto Thr; y un resto en una posición correspondiente al resto 227 de HA de H3 de tipo silvestre, siendo dicho resto Ala.

Description

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la unión a glicano. En algunas realizaciones, la unión es específica ya que un agente de unión discrimina entre su compañero de unión diana y otros compañeros de unión potenciales en su entorno.
Agente de unión: En general, la expresión “agente de unión” se usa en el presente documento para hacer referencia a cualquier entidad que se una a un agente de interés. Por ejemplo, un agente de unión a HA se une a uno o más polipéptidos HA (y/o a variantes, fragmentos, y/o partes características de los mismos), como se describe en el presente documento. Los agentes de unión pueden ser de cualquier tipo químico. En algunas realizaciones, los agentes de unión son polipéptidos (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo). En algunas realizaciones, los agentes de unión son moléculas pequeñas. En algunas realizaciones, los agentes de unión son ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, los agentes de unión son aptámeros. En algunas realizaciones, los agentes de unión son polímeros; en algunas realizaciones, los agentes de unión son no poliméricos. En algunas realizaciones, los agentes de unión son carbohidratos. En algunas realizaciones, los agentes de unión son lectinas. En algunas realizaciones, los agentes de unión de HA de H1 se unen a polipéptidos HA de H1. En algunas realizaciones, los agentes de unión se unen a variantes del polipéptido HA de H1 con mayor unión y/o infectividad en seres humanos. En algunos anticuerpos, un agente de unión proporcionado en el presente documento es un agente bloqueante de topología de tipo sombrilla. En algunas realizaciones, un agente de unión proporcionado en el presente documento es un agente bloqueante especifico de topología de tipo sombrilla.
Biológicamente activo: Como se usa en el presente documento, la frase “biológicamente activo” se refiere a una característica de cualquier agente que tiene actividad en un sistema biológico, y particularmente en un organismo. Por ejemplo, un agente que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico sobre ese organismo, se considera biológicamente activo. En realizaciones particulares, cuando una proteína o polipéptido es biológicamente activo, un aparte de esa proteína o polipéptido que comparte al menos una actividad biológica de la proteína o polipéptido típicamente se denomina como una parte “biológicamente activa”.
Parte característica: Como se usa en el presente documento, la frase “parte característica” de una proteína o polipéptido es una que contiene un tramo continuo de aminoácidos, o una colección de tramos continuos de aminoácidos, que conjuntamente son característicos de una proteína o polipéptido. Cada uno de dichos tramos continuos generalmente contendrá al menos dos aminoácidos. Además, los expertos habituales en la técnica apreciarán que típicamente se necesitan al menos 5, 10, 15, 20 o más aminoácidos que sean característicos de una proteína. En general, una parte característica es una que, además de la identidad de secuencia especificada anteriormente, comparte al menos una característica funcional con la proteína intacta relevante.
Secuencia característica: Una “secuencia característica” es una secuencia que se encuentra en todos los miembros de una familia de polipéptidos o ácidos nucleicos, y por lo tanto puede usarse por los expertos habituales en la técnica para definir miembros de la familia.
Topología de cono: La frase “topología de cono” se usa en el presente documento para hacer referencia a una disposición tridimensional adoptada por ciertos glicanos y, en particular, por glicanos en receptores HA. Como se ilustra en las Figuras 5 y 7, la topología de tipo cono puede adoptarse por glicanos α2-3 sialilados o por glicanos α26 sialilados, y es típica de cadenas oligonucleotídicas cortas, aunque algunos oligonucleótidos largos también pueden adoptar esta conformación. La topología de tipo cono se caracteriza por los ángulos de torsión glicosídicos del enlace Neu5Acα2-3Gal que representa tres regiones de conformaciones de energía mínima proporcionadas por un valor φ (C1-C2-O-C3/C6) de aproximadamente -60, 60 o 180 y ψ (C2-O-C3/C6-H3/C5) representa -60 a 60. La Figura 7 presenta ciertos ejemplos representativos (aunque no exhaustivos) de glicanos que adoptan una topología de tipo cono.
Correspondiente a: Como se usa en el presente documento, la expresión “correspondiente a” se usa con frecuencia para designar la posición/identidad de un resto de aminoácido en un polipéptido HA. Los expertos habituales apreciarán que, por simplicidad, en el presente documento se utiliza un sistema de numeración canónico (basado en HA de H3 de tipo silvestre) como se ilustra, por ejemplo, en las Figuras 1-4), de forma que un aminoácido “correspondiente a” un resto en la posición 190, por ejemplo, no necesariamente es el 190º aminoácido en una cadena de aminoácidos particular, sino que más bien corresponde al resto encontrado en la posición 190 en el HA de H3 de tipo silvestre; los expertos habituales en la materia apreciarán fácilmente cómo identificar los aminoácidos correspondientes. Grado de separación separados: Como se usa en el presente documento, los aminoácidos que están un “grado de separación separados” son aminoácidos de HA que tienen efectos indirectos sobre la unión al glicano. Por ejemplo, los aminoácidos un grado de separación separados pueden: (1) interaccionar con los aminoácidos de unión directa; y/o (2) afectar de otra manera a la capacidad de los aminoácidos de unión directa de interaccionar con el glicano que está asociado con receptores de HA de la célula hospedadora; dichos aminoácidos separados un grado de separación pueden unirse directamente o no a los propios glicanos. Los aminoácidos separados dos grados de separación (1) interaccionan con los aminoácidos separados un grado de separación y/o (2) afectan de otra manera a la capacidad de los aminoácidos separados un grado de separación de interaccionar con los aminoácidos de unión directa, etc.
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Polipéptidos: Un “polipéptido”, en términos generales, es una tira de al menos dos aminoácidos unidos entre sí por un enlace peptídico. En algunas realizaciones, un polipéptido puede incluir al menos 3-5 aminoácidos, de los que cada uno está unido a otros por medio de al menos un enlace peptídico. Los expertos habituales en la materia apreciarán que los polipéptidos algunas veces incluyen aminoácidos “no naturales” u otras entidades que, sin embargo, son capaces de integrarse en una cadena polipeptídica, opcionalmente.
Preferentemente: Como se usa en el presente documento, una primera entidad “preferentemente” se une a una segunda entidad en comparación con una entidad de referencia si la primera entidad demuestra una mayor unión a la segunda entidad que la entidad de referencia. En algunas realizaciones, una primera entidad se unirá a una segunda entidad con una afinidad de unión que es aproximadamente 1,5 veces, aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 6 veces, aproximadamente 7 veces, aproximadamente 8 veces, aproximadamente 9 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 50 veces, aproximadamente 100 veces, aproximadamente 500 veces, o aproximadamente 1000 veces mayor que la de la identidad de referencia.
Puro: Como se usa en el presente documento, un agente o identidad es “puro” si está básicamente libre de otros componentes. Por ejemplo, una preparación que contiene más de aproximadamente un 90 % de un agente o entidad particular típicamente se considera una preparación pura. En algunas realizaciones, un agente o entidad tiene una pureza de al menos un 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.
Oligosacárido corto: Para los fines de la presente divulgación, un oligosacárido típicamente se considera “corto” si tiene menos de 4, o con toda seguridad menos de 3 restos en cualquier cadena lineal.
Especificidad: Como se muestra en la materia, “especificidad” es una medida de la capacidad de un ligando particular (por ejemplo, un polipéptido HA) de distinguir su compañero de unión (por ejemplo, un receptor de HA humano, y particularmente un receptor de HA del tracto respiratorio superior humano) de otros posibles compañeros de unión (por ejemplo, un receptor de HA aviar).
Homología sustancial: La frase “homología sustancial” se usa en el presente documento para hacer referencia a una comparación entre secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico. Como apreciarán los expertos habituales en la materia, dos secuencias generalmente se consideran “sustancialmente homólogas” si contienen restos homólogos en posiciones correspondientes. Los restos homólogos pueden ser restos idénticos. Como alternativa, los restos homólogos pueden ser restos no idénticos con características estructurales y/o funcionales apropiadamente similares. Por ejemplo, como es bien conocido por los expertos habituales en la materia, ciertos aminoácidos se clasifican típicamente como aminoácidos “hidrófobos” o “hidrófilos”, y/o como que tienen cadenas laterales “polares”
o “no polares”. La sustitución de un aminoácido por otro del mismo tipo a menudo puede considerarse una sustitución “homóloga”. A continuación se resumen las categorías típicas de aminoácidos:
Alanina Ala A no polar Neutro 1,8 Arginina Arg R polar Positivo -4,5 Asparagina Asn N polar Neutro -3,5 Ácido aspártico Asp D polar Negativo -3,5 Cisteína Cys C no polar Neutro 2,5 Acido glutámico Glu E polar Negativo -3,5 Glutamina Gln Q polar Neutro -3,5 Glicina Gly G no polar Neutro -0,4 Histidina His H polar Positivo -3,2 Isoleucina Ile I no polar Neutro 4,5 Leucina Leu L no polar Neutro 3,8 Lisina Lys K polar Positivo -3,9 Metionina Met M no polar Neutro 1,9 Fenilalanina Phe F no polar Neutro 2,8 Prolina Pro P no polar Neutro -1,6 Serina Ser S polar Neutro -0,8 Treonina Thr T polar Neutro -0,7 Triptófano Trp W no polar Neutro -0,9 Tirosina Tyr Y polar Neutro -1,3 Valina Val V no polar Neutro 4,2
Aminoácidos Ambiguos 3-Letras 1-Letra Asparagina o ácido aspártico Asx B Glutamina o ácido glutámico Glx Z Leucina o Isoleucina Xle J Aminoácido no especificado o desconocido Xaa X
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Como es bien conocido en este campo, las secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico pueden compararse usando cualquiera de una diversidad de algoritmos, incluyendo los disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, BLAST con huecos y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Se describen estos programas como ejemplo en Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs," Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods y Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999; todos ellos incorporados en el presente documento por referencia. Además de identificar secuencias homólogas, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan una indicación del grado de homología. En algunas realizaciones, dos secuencias se consideran sustancialmente homólogas si al menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % o más de sus restos correspondientes son homólogos en un tramo relevante de restos. En algunas realizaciones, el tramo relevante es una secuencia completa. En algunas realizaciones, el tramo relevante tiene al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más restos.
Identidad sustancial: La frase “identidad sustancial” se usa en el presente documento para hacer referencia a una comparación entre secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico. Como apreciarán los expertos habituales en la materia, dos secuencias se consideran en general “sustancialmente idénticas” si contienen restos idénticos en posiciones correspondientes. Como es bien conocido en este campo, las secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico pueden compararse usando cualquiera de una diversidad de algoritmos, incluyendo los disponibles en programas informáticos comerciales tales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, BLAST con huecos y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Se describen estos programas como ejemplo en Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999; todos ellos incorporados en el presente documento por referencia. Además de identificar secuencias idénticas, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan una indicación del grado de identidad. En algunas realizaciones, dos secuencias se consideran sustancialmente idénticas si al menos un 50%, 55%, 60%, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de sus restos correspondientes son idénticos en un tramo relevante de restos. En algunas realizaciones, el tramo relevante es una secuencia completa. En algunas realizaciones, el tramo relevante tiene al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más restos.
Padece: Un individuo que “padece” una enfermedad, trastorno y/o afección (por ejemplo, infección gripal) es uno al que se le ha diagnosticado y/o presenta uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno y/o afección.
Susceptible de padecer: Un individuo que es “susceptible de padecer” una enfermedad, trastorno y/o afección (por ejemplo, infección gripal) es un individuo al que no se le ha diagnosticado una enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible de padecer una enfermedad, trastorno y/o afección puede presentar síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible de padecer una enfermedad, trastorno y/o afección puede no presentar síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible de padecer una enfermedad, trastorno y/o afección desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, un individuo que es susceptible de padecer una enfermedad, trastorno y/o afección no desarrollará la enfermedad, trastorno y/o afección.
Agente terapéutico: Como se usa en el presente documento, la frase “agente terapéutico” se refiere a cualquier agente que, cuando se administra a un sujeto, tiene un efecto terapéutico y/o induce un efecto biológico y/o farmacológico deseado. En algunas realizaciones, un agente terapéutico es cualquier sustancia que puede usarse para aliviar, mejorar, mitigar, inhibir, prevenir, retrasar el inicio de, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de la infección gripal.
Cantidad terapéuticamente eficaz: Como se usa en el presente documento, la expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” significa una cantidad de composición de la invención que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que padece o es susceptible de padecer una enfermedad, trastorno y/o afección (por ejemplo, infección gripal) para tratar, diagnosticar, prevenir y /o retrasar el inicio de la enfermedad, trastorno y/o afección.
Tratamiento: Como se usa en el presente documento, el término “tratar” o “tratamiento” se refiere a cualquier método usado para aliviar, mejorar, mitigar, inhibir, prevenir, retrasar el inicio de, reducir la gravedad de y/o reducir la incidencia, parcial o completamente, de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o afección (por ejemplo, infección gripal). El tratamiento puede administrarse a un sujeto que no presenta signos de una enfermedad, trastorno y/o afección. En algunas realizaciones, el tratamiento puede administrarse a un sujeto
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HA adaptados humanos tales como SC18, Mos99, Tx91, etc., y lectinas vegetales de unión a α2-6 tales como SNA-
I. La afinidad de unión de UTSBA medida por ensayo de unión directa dependiente de la dosis típicamente sería de al menos 1 nM. Típicamente la afinidad de un UTSBA por un glicano con topología de tipo cono es como máximo de 1 a 3 órdenes de magnitud menor que la afinidad de unión de los glicanos con topología de tipo cono a HA aviares tales como Viet0405, Av18, etc. En algunas realizaciones, un UTSBA inhibe selectivamente la unión de una partícula de virus de la gripe (por ejemplo, un virus de la gripe humana o aviar) al receptor de HA (por ejemplo, un H1, H2 o H3 o un H5, H7 o H9 adaptado a humanos) basándose en la topología de glicano (por ejemplo, de tipo sombrilla o de tipo cono). En algunas realizaciones, un UTSBA es un polipéptido. En algunas de estas realizaciones, un polipéptido UTSBA tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica o sustancialmente homóloga a la de un polipéptido natural. En algunas realizaciones, un polipéptido UTSBA es un polipéptido HA. En algunas realizaciones, un polipéptido UTSBA es un polipéptido HA natural, o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, un polipéptido UTSBA tiene una secuencia de aminoácidos que no está relacionada con la de un polipéptido HA. En algunas realizaciones, un polipéptido UTSBA es un anticuerpo o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, un polipéptido UTSBA es una lectina (por ejemplo, SNA-1). En algunas realizaciones, un UTSBA no es un polipéptido. En algunas realizaciones, un UTSBA es una molécula pequeña. En algunas realizaciones, un UTSBA es un ácido nucleico.
Vacunación: como se usa en el presente documento, el término “vacunación” se refiere a la administración de una composición destinada a generar una respuesta inmunitaria, por ejemplo a un agente causante de una enfermedad. Para los fines de la presente invención, la vacunación puede administrarse antes, durante y/o después de la exposición a un agente causante de una enfermedad, y en ciertas realizaciones, antes, durante y/o poco después de la exposición al agente. En algunas realizaciones, la vacunación incluye múltiples administraciones, separadas de forma apropiada en el tiempo, de una composición de vacunación.
Variante: como se usa en el presente documento, el término “variante” es un término relativo que describe la relación entre un polipéptido particular (por ejemplo polipéptido HA) de interés y un polipéptido “parental” con el que se está comparando su secuencia. Un polipéptido de interés se considera una “variante” de un polipéptido parental si el polipéptido de interés tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la del parental excepto por un pequeño número de alteraciones de secuencia en posiciones particulares. Típicamente, menos de un 20 %, 15 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % de los restos en la variante están sustituidos en comparación con el parental. En algunas realizaciones, una variante tiene 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 restos sustituidos en comparación con el parental. A menudo, una variante tiene un número muy pequeño (por ejemplo, menor de 5, 4, 3, 2 o 1) de restos funcionales sustituidos (es decir, restos que participan en una actividad biológica particular). Además, una variante típicamente no tiene más de 5, 4, 3, 2 o 1 adiciones o deleciones, y a menudo no tiene adiciones o deleciones en comparación con el parental. Además, cualquier adición o deleción típicamente es menor de aproximadamente 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 10, 9, 8, 7, 6 y comúnmente son menores de aproximadamente 5, 4, 3 o 2 restos. En algunas realizaciones, el polipéptido parental es uno que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido HA parental puede ser uno encontrado en un aislado natural (por ejemplo de tipo silvestre) de un virus de la gripe (por ejemplo, una HA de tipo silvestre). En algunas realizaciones, un polipéptido parental HA de H1 puede corresponder al polipéptido H1 característico de cualquiera de las cepas de la gripe presentadas en la Tabla 1. En algunas realizaciones, un polipéptido HA de H1 variante tiene al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50, 100 o más de 100 sustituciones, deleciones y/o adiciones con respecto a uno o más de los polipéptidos H1 característicos de cualquiera de las cepas de la gripe presentadas en la Tabla 1.
Vector: como se usa en el presente documento, “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. En algunas realizaciones, los vectores son capaces de realizar una replicación extracromosómica y/o de expresar ácidos nucleicos a los que están unidos en una célula hospedadora tal como una célula eucariota o procariota. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes unidos operativamente se denominan en el presente documento “vectores de expresión”.
Tipo silvestre: como se entiende en la técnica, la frase “tipo silvestre” generalmente se refiere a una forma normal de una proteína o ácido nucleico, como se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, se encuentran polipéptidos HA de tipo silvestre en aislados naturales del virus de la gripe. Puede encontrarse una diversidad de secuencias de HA de tipo silvestre diferentes en la base de datos de secuencias de virus de la gripe NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html.
Descripción detallada de ciertas realizaciones particulares de la invención
Entre otras cosas, la presente invención define variantes de HA de H1N1 con mayor unión y/o infectividad en humanos en comparación con un polipéptido H1 encontrado en cepas de la gripe H1N1 (véase, por ejemplo, la Tabla 1). Dichas variantes pueden utilizarse, entre otras cosas, como componentes de vacunas y/o agentes terapéuticos para tratar, reducir y/o prevenir la infección humana por el virus H1N1, y particularmente por una variante con mayor unión y/o infectividad humana. Como alternativa o adicionalmente, dichas variantes pueden utilizarse como patrones en sistemas para detectar la aparición de y/o la infección con una variante de H1N1 con mayor infectividad humana.
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En algunos aspectos, la presente invención proporciona agentes que se unen específicamente a un polipéptido HA de H1N1, por ejemplo para usarse en detectar una infección por H1N1. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes que se unen específicamente a una variante H1N1 con mayor infectividad humana. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes que distinguen entre variantes H1N1 con mayor infectividad humana y variantes H1N1 sin mayor infectividad humana.
En algunos aspectos, la presente invención proporciona agentes que interfieren (y/o compiten) con interacciones de unión entre un polipéptido HA de H1N1 y uno o más glicanos, por ejemplo, glicanos con topología de tipo sombrilla. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes que interfieren (y/o compiten con) interacciones de unión entre un polipéptido HA de H1N1 y uno o más glicanos α2-6 sialilados. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona agentes que interfieren (y/o compiten) con interacciones de unión entre un polipéptido HA de H1N1 y uno o más glicanos 6’SLN-LN. En algunas realizaciones, el polipéptido HA de H1N1 cuya interacción de unión se ve interferida es una variante H1N1 con mayor infectividad humana.
Hemaglutinina (HA)
Los virus de la gripe son virus de ARN que se caracterizan por una envoltura de membrana lipídica que contiene dos glicoproteínas, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA), incluidas en la membrana del virus particular. Hay 16 subtipos de HA conocidos y 9 subtipos de NA, y las diferentes cepas de la gripe se denominan basándose en el número de subtipos de HA y NA de la cepa. Basándose en comparaciones de identidades de secuencias de aminoácidos y de estructuras cristalinas, los subtipos de HA se han dividido en dos grupos principales y cuatro clados más pequeñas. Los diferentes subtipos de HA no necesariamente comparten una fuerte identidad en la secuencia de aminoácidos, pero las estructuras 3D generales de los diferentes subtipos de HA son similares entre sí, con varias diferencias sutiles que pueden usarse con fines de clasificación. Por ejemplo, la orientación particular de los subdominios distales de la membrana en relación con la α hélice central es una característica estructural usada comúnmente para determinar el subtipo de HA (Russell et al., Virology, 325: 287, 2004).
HA existe en la membrana como un homotrímero de uno de 16 subtipos, denominados H1-H16. Solo tres de estos subtipos (H1, H2 y H3) se han adaptado hasta ahora para la infección humana. Una característica indicada de HA que se han adaptado a infectar a seres humanos (por ejemplo, de HA de los subtipos de la gripe pandémicos H1N1 (1918) y H3N2 (1967-68)) es su capacidad de unirse preferentemente a glicanos α2-6 sialilados en comparación con sus progenitores aviares que preferentemente se unen a glicanos α2-3 sialilados (Skehel y Wiley, Annu Rev Biochem, 69: 531, 2000; Rogers y Paulson, Virology, 127: 361, 1983; Rogers et al., Nature, 304: 76, 1983; Sauter et al., Biochemistry, 31: 9609, 1992; Connor et al., Virology, 205: 17, 1994; Tumpey et al., Science, 310: 77, 2005; todos ellos se incorporan en el presente documento por referencia). Los presentes inventores, sin embargo, han descubierto que la capacidad de infectar a hospedadores humanos se correlaciona menos con la unión a glicanos de un enlace particular, y más con la unión a glicanos de una topología particular (véanse, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos 2009/0269342, 2010/0004195 y 2010/0125043, todas ellas se incorporan en el presente documento por referencia). De esta manera, los presentes inventores han demostrado que los HA que median en la infección de seres humanos se unen a glicanos con topología de tipo sombrilla, mostrando con frecuencia preferencia por glicanos con topología de tipo sombrilla con respecto a los glicanos con topología de tipo cono (aunque los glicanos con topología de tipo cono pueden ser o comprender glicanos α2-6 sialilados).
Se dispone de varias estructuras cristalinas de HA de los subtipos H1 (humano y porcino), H3 (aviar) y H5 (aviar) unidos a oligosacáridos sialilados (de enlaces α2-3 y α2-6) y proporcionan perspectivas moleculares de los aminoácidos específicos que están implicados en distintas interacciones de los HA con estos glicanos (Eisen et al., Virology, 232: 19, 1997; Ha et al., Proc Natl Acad Sci USA, 98: 11181, 2001; Ha et al., Virology, 309: 209, 2003; Gamblin et al., Science, 303: 1838, 2004; Stevens et al., Science, 303: 1866, 2004; Russell et al., Glycocortj J 23: 85, 2006; Stevens et al., Science, 312: 404, 2006; todos ellos se incorporan en el presente documento por referencia).
Por ejemplo, las estructuras cristalinas de H5 (A/duck/Singapore/3/97) solo o unido a un oligosacárido α2-3 o α2-6 sialilado identifican ciertos aminoácidos que interaccionan directamente con glicanos unidos, y también aminoácidos que están separados uno o más grados de separación (Stevens et al., Proc Natl Acad Sci USA 98: 11181, 2001; incorporado en el presente documento por referencia). En algunos casos, la conformación de estos restos es diferente en estados unidos frente a no unidos. Por ejemplo, Glu190, Lys193 y Gln226 participan en interacciones de unión directa y tienen diferentes conformaciones en el estado unido frente al estado no unido. La conformación de Asn186, que está próxima a Glu190, también es significativamente diferente en el estado unido frente al estado no unido.
Polipéptidos HA
La presente invención proporciona polipéptidos HA. Como se usa en el presente documento, se entiende que la expresión “polipéptidos HA” incluye fragmentos de polipéptidos HA, partes (por ejemplo, partes características) de polipéptidos HA y/o variantes de polipéptidos HA. Los fragmentos de polipéptidos HA, partes de polipéptidos HA y
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En la Tabla 2 se pueden encontrar secuencias de polipéptidos HA de H1 encontrados en las cepas de la gripe A/South Carolina/1/1918 y A/Swine/Iowa/15/1930.
Tabla 2: secuencias de polipéptidos HA de H1 ejemplares de cepas de gripe H1 pandémicas
Cepa
Secuencia de HA de H1
A/South Carolina/1/1918
A/Swine/IA/15/1930
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En algunas realizaciones, los polipéptidos HA (por ejemplo polipéptidos H1) son útiles para desarrollar y/o preparar vacunas de la gripe. En algunas realizaciones, los polipéptidos HA (por ejemplo polipéptidos H1) son útiles para desarrollar y/o preparar agentes terapéuticos para la gripe. En algunas realizaciones, los polipéptidos HA (por ejemplo polipéptidos H1) son útiles para desarrollar y/o preparar reactivos útiles para diagnosticar la gripe y/o determinar si un paciente se ha infectado con un virus de la gripe HA de H1. En algunas realizaciones, los polipéptidos HA (por ejemplo polipéptidos H1), son útiles para la vigilancia de la aparición de un virus de la gripe HA de H1 pandémico potencial. En las secciones tituladas “Detección de Gripes que Contienen H1” y “Tratamiento” se describen con más detalle los métodos terapéuticos, profilácticos y de diagnóstico.
Polipéptidos HA variantes
En ciertas realizaciones, un polipéptido HA proporcionado (por ejemplo, polipéptido H1) es una variante de un polipéptido HA parental ya que su secuencia de aminoácidos es idéntica a la del HA parental excepto por un pequeño número de alteraciones de secuencia particulares. En algunas realizaciones, el HA parental es un polipéptido HA encontrado en un aislado natural de un virus de la gripe (por ejemplo, un polipéptido HA de tipo silvestre). En algunas realizaciones, el HA parental es uno de los HA indicados en la Tabla 1. Cualquiera de las partes y/o fragmentos descritos en el presente documento puede ser fragmentos y/o partes características de polipéptidos HA, como se describe en la sección presentada más adelante titulada
"Partes y/o Fragmentos de Polipéptidos HA”
En algunas realizaciones, las variantes de polipéptidos HA tienen características de unión de glicano diferentes que sus polipéptidos HA parentales correspondientes. En algunas realizaciones, los polipéptidos variantes de HA tienen mayor afinidad y/o especificidad por glicanos de tipo sombrilla (por ejemplo, en comparación con glicanos de tipo cono) que sus polipéptidos HA parentales afines. En ciertas realizaciones, dichas variantes de polipéptidos HA son variantes obtenidas por ingeniería genética.
En algunas realizaciones, los polipéptidos variantes de HA tienen una afinidad y/o especificidad por glicanos de tipo sombrilla (por ejemplo en comparación con glicanos de tipo cono) 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 500 veces, 1000 veces o más de 1000 veces mayor que sus polipéptidos HA parentales afines. En algunas realizaciones, virus de la gripe que expresan polipéptidos variantes de HA tienen 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 500 veces, 1000 veces o más de 1000 veces más infectividad humana que un virus de la gripe que expresa sus polipéptidos HA parentales afines.
En algunas realizaciones, las variantes de polipéptidos HA con características de unión de glicano alteradas tienen alternancias de secuencia en restos dentro o que afectan al sitio de unión al glicano. En algunas realizaciones, dichas sustituciones son de aminoácidos que interaccionan directamente con el glicano unido; en otras realizaciones, dichas sustituciones son de aminoácidos que se han separado un grado de separación de los que interaccionan con el glicano unido, ya que los aminoácidos separados un grado de separación (1) interaccionan con los aminoácidos de unión directa; (2) afectan de otra manera a la capacidad de los aminoácidos de unión directa de interaccionar con el glicano, pero no interaccionan directamente con el glicano por sí mismos; o (3) afectan de otra manera la capacidad de los aminoácidos de unión directa de interaccionar con el glicano, y también interaccionar directamente con el glicano por sí mismos. Las variantes de polipéptido HA contienen sustituciones de uno o más aminoácidos de unión directa, uno o más aminoácidos de primer grado de separación, uno o más aminoácidos de segundo grado de separación o cualquier combinación de estos. En algunas realizaciones, las variantes de polipéptidos HA pueden contener sustituciones de uno o más aminoácidos con incluso mayores grados de separación.
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En algunas realizaciones, las variantes de polipéptidos HA con características de unión a glicano alteradas tienen alteraciones de secuencias en restos que hacen contacto con azúcares más allá de Neu5Ac y Gal (véase, por ejemplo, la Figura 6).
En algunas realizaciones, las variantes del polipéptido HA tienen al menos una sustitución de aminoácidos, en comparación con una HA parental de tipo silvestre. En ciertas realizaciones, las variantes del polipéptido HA tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más de 20 sustituciones de aminoácidos en comparación con un HA parental de tipo silvestre afín. En algunas realizaciones, las variantes del polipéptido HA tienen una o más sustituciones de aminoácidos separadas por al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400 o al menos 500 restos de aminoácido de tipo silvestre. En algunas realizaciones, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 % de dichas sustituciones de aminoácido están localizadas dentro del sitio de unión a glicano. En algunas realizaciones, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de dichas sustituciones de aminoácido están localizadas dentro del sitio de unión a glicano.
En algunas realizaciones, las variantes del polipéptido HA tienen al menos una adición y/o deleción de aminoácido en comparación con un HA parental de tipo silvestre. En algunas realizaciones, las variantes del polipéptido HA tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más de 20 adiciones y/o deleciones de restos. En algunas realizaciones, las variantes del polipéptido HA tienen una o más adiciones y/o deleciones de restos separadas por al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400 o al menos 500 restos de aminoácido de tipo silvestre. En algunas realizaciones, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 100 % de dichas adiciones y/o deleciones de aminoácido están localizadas dentro del sitio de unión al glicano. En algunas realizaciones, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de dichas adiciones y/o deleciones de aminoácido están localizadas dentro del sitio de unión al glicano.
En algunas realizaciones, las variantes del polipéptido HA tienen una identidad de aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 91 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 93 %, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 % o aproximadamente el 99 % con un HA parental de tipo silvestre afín.
En algunas realizaciones, las variantes del polipéptido HA tienen una identidad de aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 91 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 93 %, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 % o aproximadamente el 99 % con un tramo contiguo de aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 350, aproximadamente 400, aproximadamente 450, aproximadamente 500 o aproximadamente 550 aminoácidos de un HA parental de tipo silvestre afín.
En algunas realizaciones, las variantes del polipéptido HA tienen sustituciones, adiciones y/o deleciones de secuencia en posiciones correspondientes a uno o más de los restos 98, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 159, 183, 186, 187, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 215, 219, 222, 225, 226, 227 y 228. En algunas realizaciones, las variantes del polipéptido HA tienen sustituciones, adiciones y/o deleciones de secuencia en posiciones correspondientes a uno o más de los restos 156, 159, 189, 192, 193 y 196; y/o en posiciones correspondientes a uno o más de los restos 186, 187, 189 y 190; y/o en posiciones correspondientes a uno o más de los restos 190, 222, 225 y 226; y/o en posiciones correspondientes a uno o más de los restos 137, 145, 190, 226 y 228. En algunas realizaciones, las variantes del polipéptido HA tienen sustituciones, adiciones y/o deleciones de secuencia en posiciones correspondientes a uno o más de los restos 190, 225, 226 y 228. En algunas realizaciones, las variantes del polipéptido HA, particularmente las variantes del polipéptido H1, tienen sustituciones, adiciones y/o deleciones de secuencia correspondientes a uno o más de los restos 145, 186, 189, 219 y/o 227.
En algunas realizaciones, las variantes del polipéptido HA, y particularmente las variantes del polipéptido H1, tienen una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos con respecto a un HA parental de tipo silvestre en restos seleccionados de aminoácidos localizados en la región del polipéptido que se une directamente al glicano, incluyendo pero sin limitación los restos 136, 145 (por ejemplo Lys145), 153, 155, 156, 183, 186, 189, 190, 192, 193, 194, 196, 215, 222, 225, 226 y/o 227. En algunas realizaciones, una variante del polipéptido HA, y particularmente una variante del polipéptido H1 tiene una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos con respecto a una HA parental de tipo silvestre en restos seleccionados de aminoácidos localizados adyacentes a la
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En algunas de estas realizaciones, un polipéptido HA tiene al menos una sustitución adicional en comparación con una HA de tipo silvestre, de tal forma que aumenta la afinidad y/o especificidad de la variante por glicanos de tipo sombrilla. En otras palabras, un polipéptido HA puede comprender una o más de cualquiera de las series de sustituciones de aminoácido indicadas en este párrafo y una o más sustituciones de aminoácido adicionales. Por citar solo algunos ejemplos específicos, un polipéptido HA puede comprender una o más de cualquiera de las series de sustituciones de aminoácido indicadas en este párrafo y una o más sustituciones de aminoácido adicionales, por ejemplo, en las posiciones 98, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 159, 183, 186, 187, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 215, 219, 222, 225, 226, 227 y 228, y/o combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, un polipéptido HA tiene al menos una adición y/o deleción de cualquiera de las posiciones de aminoácido y/o series de posiciones de aminoácido descritas en esta sección.
En algunas realizaciones, los polipéptidos HA (incluyendo variantes de polipéptidos HA) tienen secuencias que incluyen S145, N145, L219, P186, T189 y/o A227. En algunas realizaciones, los polipéptidos HA (incluyendo variantes de polipéptidos HA) tienen secuencias que incluyen D190, D225, L226 y/o S228. En algunas realizaciones, los polipéptidos HA tienen secuencias que incluyen D190 y D225; en algunas realizaciones, los polipéptidos HA tienen secuencias que incluyen L226 y S228.
En algunas realizaciones, las variantes de polipéptidos HA tienen un sitio de unión abierto en comparación con una HA parental y particularmente con una HA de tipo silvestre parental.
Partes y/o fragmentos de polipéptidos HA
La presente invención proporciona partes características de polipéptidos HA y ácidos nucleicos que los codifican. En general, una parte característica es una que contiene un tramo continuo de aminoácidos, o una colección de tramos continuos de aminoácidos, que conjuntamente son característicos del polipéptido HA. Cada uno de estos tramos continuos generalmente contendrá al menos dos aminoácidos. Además, los expertos habituales en la materia apreciarán que típicamente se requieren al menos 5, 10, 15, 20 o más aminoácidos que sean característicos de un polipéptido HA de H5. En general, una parte característica es una que, además de la identidad de secuencia especificada anteriormente, comparte al menos una característica funcional con el polipéptido HA intacto relevante. En algunas realizaciones, las partes características de polipéptidos HA comparten características de unión a glicano con los polipéptidos HA de longitud completa relevantes.
Cualquiera de las partes y/o fragmentos descritos en el presente documento pueden ser partes y/o fragmentos de polipéptidos HA variantes como se describe en la sección anterior titulada “Polipéptidos HA Variantes”.
En algunas realizaciones, un fragmento de polipéptido HA y/o parte característica de un polipéptido HA corresponde a un tramo contiguo de aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 350, aproximadamente 400, aproximadamente 450, aproximadamente 500 o aproximadamente 550 aminoácidos de un HA parental de tipo silvestre afín. En algunas realizaciones, dicho tramo contiguo está presente dentro del contexto de secuencia de polipéptido que no es HA en el extremo 5’, en el extremo 3’, o tanto en el extremo 5’ como en el extremo 3’ del tramo contiguo. En algunas realizaciones, la secuencia del polipéptido que no es HA es de aproximadamente 1 aminoácido, aproximadamente 2 aminoácidos, aproximadamente 3 aminoácidos, aproximadamente 4 aminoácidos, aproximadamente 5 aminoácidos, aproximadamente 6 aminoácidos, aproximadamente 7 aminoácidos, aproximadamente 8 aminoácidos, aproximadamente 9 aminoácidos, aproximadamente 10 aminoácidos, aproximadamente 15 aminoácidos, aproximadamente 20 aminoácidos, aproximadamente 25 aminoácidos, aproximadamente 50 aminoácidos, aproximadamente 75 aminoácidos, aproximadamente 100 aminoácidos, aproximadamente 250 aminoácidos, aproximadamente 500 aminoácidos, aproximadamente 750 aminoácidos, aproximadamente 1000 aminoácidos, aproximadamente 2000 aminoácidos, aproximadamente 3000 aminoácidos, aproximadamente 4000 aminoácidos, aproximadamente 5000 aminoácidos, aproximadamente 6000 aminoácidos, aproximadamente 7000 aminoácidos, aproximadamente 8000 aminoácidos, aproximadamente 9000 aminoácidos, aproximadamente 10.000 aminoácidos
o más de aproximadamente 10.000 aminoácidos de longitud.
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por HA de CA04 a receptores aviares es coherente con el reciente análisis de micromatriz de glicano de HA de 2009 H1N1 (Hua et al., 2010, PLoS Currents: Influenza; incorporado en el presente documento por referencia) pero está en contraste con las observaciones en el informe por Childs et al. usando virus enteros. Sin desear limitarse por ninguna teoría particular, estas diferencias pueden atribuirse a las diferencias en la presentación de HA (por ejemplo, como una proteína recombinante frente a en un virus entero) y receptores de glicano en las diferentes plataformas de matriz (véase Childs et al.).
Ejemplo 2: Comparación de aislados de 2009 A/H1N1 con Aislados de la Cepa Pandémica de 1918 y 1930
En 1918 y 1930, aparecieron cepas de virus de la gripe H1 que mostraron una mayor infectividad humana en comparación con sus cepas parentales. Cada una de estas cepas condujo a una pandemia de infecciones de gripe en seres humanos.
Los presentes inventores han comparado la unión y/o características de secuencia de las cepas A/South Carolina/1/1918 y A/Swine/Iowa/15/1930 con una cepa 2009 A/H1N1 representativa, A/California/0409 (CA/04). La presente invención abarca el reconocimiento de que se obtendrían resultados similares para otras cepas 2009 A/H1N1. La presente invención demuestra que 2009 A/H1N1 comparte similitudes significativas tanto con la cepa A/South Carolina/1/1918 como con A/Swine/Iowa/15/1930, y particularmente con la cepa de 1918 (Figura 4A-C). Este descubrimiento implica, entre otras cosas, que (1) la inmunización contra las cepas A/South Carolina/1/1918 y A/Swine/Iowa/15/1930, y particularmente contra la cepa de 1918, podría proporcionar alguna protección de reacción cruzada contra 2009 A/H1N1; y/o (2) los individuos previamente expuestos a las cepas A/South Carolina/1/1918 y A/Swine/Iowa/15/1930, y particularmente a la cepa de 1918, (a) podrían ser menos susceptibles a la infección y, por lo tanto, podría demostrar una menor necesidad de vacunación y/o tratamiento que los individuos no expuestos previamente; (b) podrían requerir una dosificación de vacuna y/o composiciones terapéuticas menos concentradas, menos potentes y/o menos frecuentes; y/o (c) podrían sensibilizarse debido a la exposición previa y probablemente para conseguir una vacunación satisfactoria.
Ejemplo 3: Características de Unión de Polipéptidos HA de H1
Los expertos habituales en la materia, después de leer la presente memoria descriptiva, apreciarán que pueden usarse técnicas descritas en el presente documento para analizar o determinar las características de unión de polipéptidos H1 procedentes de cualquier fuente. La Tabla 4 mostrada a continuación proporciona secuencias de diversos polipéptidos HA de H1 procedentes de una diversidad de cepas. Algunas de las secuencias presentadas en la Tabla 4 corresponden a la región HA1 (por ejemplo, que contiene todo o parte del sitio de unión al receptor de glicano). Puede accederse a cualquier número de secuencias de polipéptidos HA de H1 adicionales a partir de bases de datos públicas, incluyendo, pero sin limitación, la base de datos del portal de la gripe GISAID (http://platform.gisaid.org/dante-cms/live/struktur.jdante?aid=1131) y/o la base de datos de gripe del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html).
Tabla 4: Secuencias de Polipéptidos HA de H1 Ejemplares
Cepa
Secuencia de HA de H1
A/Aichi/8/09 (HA1 solo)
imagen47
A/Aichi/9/2009 (HA1 solo)
imagen48
55
Cepa
Secuencia de HA de H1
A/Aichi/37/09 (HA1 solo)
imagen49
A/Brisbane/59/2007 (HA1 solo)
imagen50
A/Washington/1/09
imagen51
A/Canterbury/106/2004
imagen52
56
Cepa
Secuencia de HA de H1
A/New_York/212/2001
imagen53
A/New_York/307/2001
imagen54
A/Taiwan/117/1996
imagen55
57
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  1. imagen1
    imagen2
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