JP2012530486A - インフルエンザウイルスに由来する抗原ペプチド、及び抗インフルエンザウイルス抗体を選択する方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図5
Description
(1)上方領域をコードするヌクレオチド配列
(i)AAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGG(配列番号173)(GenBankアクセッション番号EU501486のヌクレオチド配列中の517〜543)
(ii)AAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGG(配列番号173)(GenBankアクセッション番号AY531033のヌクレオチド配列中の565〜591)
(iii)AAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGG(配列番号173)(GenBankアクセッション番号D49963のヌクレオチド配列中の537〜563)
(iv)AAATTTGACAAATTGTACATTTGGGGG(配列番号173)(GenBankアクセッション番号EU501660のヌクレオチド配列中の517〜543)
(2)下方領域をコードするヌクレオチド配列
(i)TCCAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCG(配列番号174)(GenBankアクセッション番号AY531033のヌクレオチド配列中の727〜765)
(ii)TCTAGTAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCG(配列番号175)(GenBankアクセッション番号D49963のヌクレオチド配列中の699〜737)
(iii)CCCAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCG(配列番号176)(GenBankアクセッション番号EU501660のヌクレオチド配列中の679〜717)
(iv)CCCAGCAGAATAAGCATCTATTGGACAATAGTAAAACCG(配列番号176)(GenBankアクセッション番号EU501486のヌクレオチド配列中の679〜717)
ヒト由来、ブタ由来及びトリ由来のA型インフルエンザウイルスH1N1(H1N1 pdmを含む)、H3N2及びH5N1のHAの完全長タンパク質配列を、米国立生物工学情報センターのインフルエンザウイルスリソース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)(Bao et al., 2008)から入手した。次いで、HA配列をmafft v6.240を用いてアラインメントした(Katoh, K., Toh, H., 2008, "Recent developments in the MAFFTmultiple sequence alignment program," Brief. Bioinform. 9, 286-298)。HA1領域を決定するために、切断点の直後のパリンドローム配列を同定した(n’−GLFGAIAGFI−c’の位置が確認された、パリンドローム領域に下線を引いた)(Skehel, J.J., Waterfield, M.D., 1975, "Studies on the primarystructure of the influenza virus hemagglutinin," Proc. Nat. Acad. Sci. USA72, 93-97)。
B−1及びD−1によって認識されるエピトープ配列、並びにヒト由来、ブタ由来及びトリ由来のウイルスにおける対応配列についての配列ロゴをweblogoを用いて構築した(Crooks, G.E., Hon, G., Chandonia, J.M., Brenner, S.E., 2004,"WebLogo: A sequence logo generator," Genome Res. 14, 1188-1190)。
合計4人の健常ボランティアを、合成ペプチド(配列番号4(上方領域を含む上方部分)及び配列番号5(下方領域を含む下方部分))で刺激したヒトPBMCの培養上清による中和を試験するためのPBMCを得るために選択した。10ミリリットル又は20ミリリットルの血液を個々のボランティアから採取した。PBMCを、520×gで40分間のFicoll Pack Plus(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)による遠心分離によって調製した。細胞を無血清RPMI1640培養培地で洗浄し、10%ウシ胎仔血清を添加したRPMI1640培地中に懸濁した。細胞を37℃、5%CO2環境で1日インキュベートした。細胞を10%ウシ胎仔血清を添加したRPMI1640培地中に2×106細胞/mLの濃度で懸濁し、マイトジェンPWM(1ミリリットル当たり5マイクログラム)を添加した。細胞を37℃、5%CO2環境で1日インキュベートした。刺激した細胞を無血清RPMI1640培養培地で洗浄し、10%ウシ胎仔血清を添加したRPMI1640培地中に懸濁し、合成ペプチド(1ミリリットル当たり10マイクログラム)又は混合ペプチド(それぞれ1ミリリットル当たり5マイクログラム)を添加した。細胞を37℃、5%CO2環境で7日間インキュベートした。刺激した細胞の培養上清を回収し、RDE(II)(デンカ生研株式会社、日本)で処理した後、PBS(−)で10倍に希釈した。希釈した培養上清をマイクロウイルス中和(VN)試験(Y. Okuno, K. Tanaka, K. Baba, A. Maeda, N. Kunita, S. Ueda, Rapidfocus reduction neutralization test of influenza A and B viruses in microtitersystem, J. Clin. Microbiol. 28 (1990) 1308-1313)に使用した。ウイルスはA/Hiroshima/52/2005(H3N2)株であった。VN活性はフォーカス減少率(%)及びN比によって示した。N比は、(合成ペプチドで刺激したPBMCの培養上清のVN活性)/(合成ペプチドを用いずに刺激したPBMCの培養上清のVN活性)に等しい。
マウスの免疫付与
ヒトH1N1、H3N2及びH5N1のHAにおいて高度に保存される上方領域及び下方領域に対応するペプチドを、下記に記載されるように合成した。
(a)H1N1、上方ペプチド:CKEVLVLWG(配列番号177)、配列番号34のN末端にアミノ酸を1つ欠く配列のN末端にシステインを付加する。
(b)H1N1、下方ペプチド:CGRINYYWTLLEP(配列番号178)、配列番号51のN末端にアミノ酸を1つ欠く配列のN末端にシステインを付加する。
(c)H3N2、上方ペプチド:CFDKLYIWG(配列番号179)、配列番号1のaa174〜181のN末端にシステインを付加する(aa174〜181の配列は、配列番号2のN末端にアミノ酸を1つ欠いている)。
(d)H3N2、下方ペプチド:CSRISIYWTIVKP(配列番号180)、配列番号1のaa228〜239のN末端にシステインを付加する(aa228〜239の配列は、配列番号3のN末端にアミノ酸を1つ欠いている)。
(e)H5N1、上方ペプチド:QEDLLVLWGC(配列番号181)、aa173〜181(配列番号71)のC末端にシステインを付加する。
(f)H5N1、下方ペプチド:SGRMEFFWTILKPC(配列番号182)、aa227〜239(配列番号82)のC末端にシステインを付加する。
キャリアをペプチドに結合させるためにシステインを付加した。これらのペプチドをKLHと結合し、免疫原として混合した。ペプチドとフロイント完全アジュバント(1:1)との混合物25マイクロリットルの懸濁液を、1日目、7日目及び14日目にマウスに注射した。最後の注射の1週間後に、マウスから血液を採取した。
マイクロタイタープレートを、PBS1ミリリットル当たり1マイクログラムのペプチドで4℃で一晩コーティングし、5%のBSAを含有するPBSで4℃で一晩ブロッキングした。ブロッキング溶液を捨てた後、PBSで幾つかの濃度に血清を希釈し、各ウェルに添加し、室温で1時間置いた。次いで、プレートを0.05%Tween20−PBSで3回洗浄し、HRP結合ヤギ抗マウスIgG(MBL、コードNo.330)を各ウェルに添加し、室温で1時間反応させた。0.05%Tween20−PBSで3回洗浄した後、基質試薬を各ウェルに添加した。2N H2SO4を用いて反応を停止した。最後に、吸光度を測定した。図6A〜図6Cは、H1N1、H3N2及びH5N1の上方ペプチド又は下方ペプチドに対する抗血清の反応を示す。結果として、各々の血清が下方ペプチドよりも上方ペプチドと強く反応したことが確認された。
ウサギの免疫付与
上方部分のペプチド(TMPNNEKFDKLYIWGVHHPGT)(配列番号4)又は下方部分のペプチド(NIPSRISIYWTIVKPGD)(配列番号5)をKLHと結合するか、又は8分岐MAP(多重抗原性ペプチド)形態として合成した。ニュージランドホワイトウサギを、以下のようにして皮下免疫した:1)KLHと結合した上方部分及び下方部分のペプチドを含むカクテルによって免疫付与した;2)MAP形態の上方部分及び下方部分のペプチドを含むカクテルによって免疫付与した;並びに3)KLHと結合した上方部分又は下方部分のペプチドで免疫付与した。各々のプロトコルについて2匹のウサギを免疫付与した。最初の免疫付与(ウサギ1匹当たり1mgのペプチド)については、抗原をフロイント完全アジュバントと共に投与し、その後1ヶ月間、2週間に一度の割合で3回追加免疫(ウサギ1匹当たり0.5mgのペプチド)をフロイント不完全アジュバントを用いて行った。最後の免疫付与の1週間後に血液を採取し、抗血清を調製した。
SuperBlock T20 Blocking Buffer(Thermo)1ミリリットル当たり1マイクログラムまで希釈したN末端ビオチン化エピトープペプチドを、96ウェルストレプトアビジンプレコートマイクロプレート(Nunc)のウェル(50マイクロリットル)に添加した。マイクロプレートを室温で30分間インキュベートした後、ビオチン化ペプチド溶液を捨てた。3%スキムミルクを含有するPBS(−)溶液を室温で少なくとも1時間それに添加した。マイクロプレートを水で3回洗浄した。3%スキムミルクを含有するPBS(−)溶液で希釈した抗血清をウェルに添加し、室温で1.5時間インキュベートした。マイクロプレートを0.05%Tween20を含有するPBS(−)で洗浄し、Superblock T20で4000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG(CELL LAB)50uLをウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。マイクロプレートを0.05%Tween20を含有するPBS(−)で洗浄し、100マイクロリットルのペルオキシダーゼ基質溶液(SUMILON)をウェルに添加し、室温で20分間インキュベートした。その後、100マイクロリットルの反応停止液(SUMILON)をウェルに添加し、490nmでの吸光度をプレートリーダーを用いて測定した。抗血清の吸光度から免疫前血清の吸光度を差し引いて、特異反応性を求めた。
A/Brisbene/59/2007(H1N1)、A/Uruguay/716/2007(H3N2)及びB/Florida/4/2006を含有するHAワクチンを、PBS(−)中に溶解し(各々1ミリリットル当たり30マイクログラム超)、PBS(−)で30倍に希釈した。希釈したHAワクチン溶液を96ウェルマイクロプレート(Maxisorp、Nunc)のウェル(50マイクロリットル)に添加した。マイクロプレートを5℃で一晩インキュベートした後、HA溶液を捨てた。3%スキムミルクを含有するPBS(−)溶液を室温で少なくとも1時間それに添加した。マイクロプレートを水で3回洗浄した。3%スキムミルクを含有するPBS(−)溶液で希釈した抗血清をウェルに添加し、室温で1.5時間インキュベートした。マイクロプレートを0.05%Tween20を含有するPBS(−)で洗浄し、Superblock T20で4000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG(CELL LAB)50マイクロリットルをウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。マイクロプレートを0.05%Tween20を含有するPBS(−)で洗浄し、100マイクロリットルのペルオキシダーゼ基質溶液(SUMILON)を各々のウェルに添加し、室温で20分間インキュベートした。その後、100マイクロリットルの反応停止液(SUMILON)をウェルに添加し、490nmでの吸光度をプレートリーダーを用いて測定した。抗血清の吸光度から免疫前血清の吸光度を差し引いて、特異反応性を求めた。
図7A及び図7Bに示されるように、上方領域及び下方領域のペプチドの両方が、ウサギにおいて抗体を惹起することができた。上方領域ペプチドは下方領域ペプチドと比べて高い抗原性を示した。KLH−ペプチド複合体、及びKLHと結合した上方領域ペプチドでのカクテル免疫によって惹起された抗体は、図7Cに示されるようにHAと確かに反応した。この結果から、エピトープペプチドでの免疫付与がHA反応性抗体を惹起することができるという可能性が示された。図7A〜図7C中で使用される略号は、以下のように理解されたい:KLH−U−1:KLH−上方部分ペプチドで免疫付与したウサギ1;KLH−U−2:KLH−上方部分ペプチドで免疫付与したウサギ2;KLH−L−1:KLH−下方部分ペプチドで免疫付与したウサギ1;KLH−L−2:KLH−下方部分ペプチドで免疫付与したウサギ2;MAP−C−1:MAP−上方部分ペプチド及びMAP−下方部分ペプチドのカクテルで免疫付与したウサギ1;MAP−C−2:MAP−上方部分ペプチド及びMAP−下方部分ペプチドのカクテルで免疫付与したウサギ2;KLH−C−1:KLH−上方部分ペプチド及びKLH−下方部分ペプチドのカクテルで免疫付与したウサギ1;KLH−C−2:KLH−上方部分ペプチド及びKLH−下方部分ペプチドのカクテルで免疫付与したウサギ2。
モノクローナル抗体D−1(Kubota-Koketsu et al.)及びA型インフルエンザウイルスを、合成ペプチド(ペプチド1(配列番号4)及びペプチド2(配列番号5))と共にインキュベートした。ペプチドによるD−1の中和活性の阻害を測定した。結果を図8A及び図8Bに示す。ペプチド1による中和阻害率は約50%、ペプチド2による阻害率は約20%であった。これらの結果から、ペプチド1及びペプチド2がD−1抗体との反応性を有することが示される。したがって、ペプチド1及びペプチド2はヒトの体内において免疫原として中和抗体を誘導することができる。
ヒトに由来するPBMCを、合成ペプチド(ペプチド1(P1)(配列番号4)及びペプチド2(P2)(配列番号5))と共にインキュベートした。培養上清のインフルエンザウイルスに対する中和活性を実施例2の方法に従って測定した。結果を図9及び図10に示す。HAワクチン(A/Hiroshima/52/2005株(大阪大学微生物病研究所)の精製HAワクチン抗原)を陽性対照として使用した。図9及び図10から、混合ペプチド(ペプチド1+ペプチド2(P1+P2))によって刺激したPBMCが、高いウイルス中和活性を有することが示された。これらの結果は、混合ペプチドでの免疫付与が、ヒトの体内において中和抗体を効果的に誘導することを示唆している。
Claims (25)
- A型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンHA1領域内のβシート構造の上方領域及び/又は下方領域のアミノ酸配列を少なくとも含む抗原ペプチド。
- 前記上方領域のアミノ酸配列が、A型インフルエンザウイルスH3N2のヘマグルチニンHA1領域内のアミノ酸残基173〜181(配列番号2)に対応し、前記下方領域のアミノ酸配列が、A型インフルエンザウイルスH3N2のヘマグルチニンHA1領域内のアミノ酸残基227〜239(配列番号3)に対応する、請求項1に記載の抗原ペプチド。
- 前記上方領域のアミノ酸配列が配列番号34(EKEVLVLWG)、配列番号2(KFDKLYIWG)、配列番号71(QEDLLVLWG)、並びに配列番号34、配列番号2又は配列番号71の1つ又は2つのアミノ酸の置換、挿入、付加及び/又は欠失によって修飾されたアミノ酸配列からなる群から選択され、前記下方領域のアミノ酸配列が配列番号51(EGRINYYWTLLEP)、配列番号3(PSRISIYWTIVKP)、配列番号82(SGRMEFFWTILKP)、並びに配列番号51、配列番号3又は配列番号82の1つ又は2つのアミノ酸の置換、挿入、付加及び/又は欠失によって修飾されたアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の抗原ペプチド。
- 前記上方領域及び/又は前記下方領域のアミノ酸配列がヒト、ブタ又はトリ宿主に由来する全てのA型インフルエンザウイルス亜型において保存されている、請求項1〜3のいずれか一項に記載の抗原ペプチド。
- A型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンHA1領域内のβシート構造の前記上方領域を含む上方部分、及び/又はA型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンHA1領域内のβシート構造の前記下方領域を含む下方部分のアミノ酸配列を少なくとも含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗原ペプチド。
- 前記上方部分がA型インフルエンザウイルスH3N2のヘマグルチニンHA1領域内のアミノ酸残基167〜187(配列番号4)に対応し、前記下方部分がA型インフルエンザウイルスH3N2のヘマグルチニンHA1領域内のアミノ酸残基225〜241(配列番号5)に対応する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗原ペプチド。
- 前記A型インフルエンザウイルスがH1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15及び/又はH16亜型を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗原ペプチド。
- 前記A型インフルエンザウイルスがH1N1、H1N1−pdm、H3N2及び/又はH5N1亜型を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗原ペプチド。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗原ペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗原ペプチドを少なくとも1つ含む、A型インフルエンザウイルスに対するワクチン。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗原ペプチドを少なくとも1つ含む、インフルエンザ試験用の試薬。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗原ペプチドを少なくとも1つ含む、インフルエンザ試験用の試薬キット。
- A型インフルエンザウイルス亜型のヘマグルチニンHA1領域内のβシート構造の上方領域及び/又は下方領域のアミノ酸配列を認識する抗体を選択する方法。
- 前記上方領域がA型インフルエンザウイルスH3N2のヘマグルチニンHA1領域内のアミノ酸残基173〜181(配列番号2)に対応し、前記下方領域がA型インフルエンザウイルスH3N2のヘマグルチニンHA1領域内のアミノ酸残基227〜239(配列番号3)に対応する、請求項13に記載の抗体を選択する方法。
- 前記上方領域のアミノ酸配列が配列番号34(EKEVLVLWG)、配列番号2(KFDKLYIWG)、配列番号71(QEDLLVLWG)、並びに配列番号34、配列番号2又は配列番号71の1つ又は2つのアミノ酸残基の置換、挿入、付加及び/又は欠失により修飾されたアミノ酸配列からなる群から選択され、前記下方領域のアミノ酸配列が配列番号51(EGRINYYWTLLEP)、配列番号3(PSRISIYWTIVKP)、配列番号82(SGRMEFFWTILKP)、並びに配列番号51、配列番号3又は配列番号82の1つ又は2つのアミノ酸残基の置換、挿入、付加及び/又は欠失により修飾されたアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項13又は14に記載の抗体を選択する方法。
- 前記上方領域及び/又は前記下方領域のアミノ酸配列がヒト、ブタ、又はトリ宿主に由来する全てのA型インフルエンザウイルス亜型において保存されている、請求項13〜15のいずれか一項に記載の抗体を選択する方法。
- 前記抗体がA型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンHA1領域内のβシート構造の前記上方領域を含む上方部分、及び/又はA型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンHA1領域内のβシート構造の前記下方領域を含む下方部分のアミノ酸配列を認識する、請求項13〜16のいずれか一項に記載の抗体を選択する方法。
- 前記上方部分がA型インフルエンザウイルスH3N2のヘマグルチニンHA1領域内のアミノ酸残基167〜187(配列番号4)に対応し、前記下方部分がA型インフルエンザウイルスH3N2のヘマグルチニンHA1領域内のアミノ酸残基225〜241(配列番号5)に対応する、請求項17に記載の抗体を選択する方法。
- 前記A型インフルエンザウイルスがH1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15又はH16亜型を含む、請求項13〜18のいずれか一項に記載の抗体(単数又は複数)を選択する方法。
- 前記A型インフルエンザウイルスがH1N1、H1N1 pdm、H3N2又はH5N1亜型を含む、請求項13〜19のいずれか一項に記載の抗体(単数又は複数)を選択する方法。
- 抗体を抗原ペプチドと共にインキュベートし、該抗体と該抗原ペプチドとの間の結合を検出することを含み、該抗原ペプチドがA型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンHA1領域内のβシート構造の前記上方領域及び/又は前記下方領域のアミノ酸配列を含む、請求項13〜20のいずれか一項に記載の抗体(単数又は複数)を選択する方法。
- 抗体を抗原ペプチドと共にインキュベートし、該抗体と該抗原ペプチドとの間の結合を検出することを含み、該抗原ペプチドがA型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンHA1領域内のβシート構造の前記上方部分及び/又は前記下方部分のアミノ酸配列を含む、請求項13〜21のいずれか一項に記載の抗体を選択する方法。
- 前記選択される抗体が前記抗原ペプチドの中和を示す、請求項13〜22のいずれか一項に記載の抗体を選択する方法。
- 前記選択される抗体が血球凝集の阻害活性(HI)を示す、請求項13〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載のペプチドを使用して抗体を作製する方法。
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