ES2294834T3 - Proteinas codificadas por acidos polinucleicos del virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino (prrsv). - Google Patents
Proteinas codificadas por acidos polinucleicos del virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino (prrsv). Download PDFInfo
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Abstract
Una secuencia de ADN aislada que codifica un virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) constituida por la secuencia de nucleótidos del ISU-55 de alto pasaje representado en la Figura 10.
Description
Proteínas codificadas por ácidos polinucleicos
del virus del síndorme reproductivo y respiratorio
porcino(PRRSV).
La presente invención se refiere a ácidos
polinucleicos aislados a partir de un virus del síndrome
respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV), a polipéptidos
codificados por los ácidos polinucleicos, al uso de esos
polipéptidos en la fabricación de vacunas que protejan a los cerdos
del PRRSV y a procedimientos de preparación de los polipéptidos y
los ácidos polinucleicos.
Se informó por primera vez del síndrome
respiratorio y reproductivo porcino (PRRS), una nueva y grave
enfermedad en cerdos, en EE.UU. en 1987, y fue reconocida
rápidamente en muchos países de Europa occidental (revisado por
Goyal, J. Vet. Diagn. Invest., 1993, 5:656-664; y en
la solicitud de EE.UU. Nº de serie 08/131.625 y 08/301.435). La
enfermedad se caracteriza por un fallo reproductivo en cerdas y
puercas jóvenes, neumonía en garrapos, y un incremento en la
mortalidad antes del destete (Wensvoort y col., Vet. Q.,
13:121-130, 1991; Christianson y col., 1992, Am. J.
Vet. Res. 53:485-488; solicitud de EE.UU. Nº de
serie 08/131.625 y 08/301.435).
El agente causante del PRRS, el virus del
síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV), se identificó
primero en Europa y posteriormente en EE.UU. (Collins y col., 1992,
J. Vet. Diagn. Invest., 4:117-126). La capa europea
del PRRSV, denominada virus Lelystad (LV), ha sido clonada y
secuenciada (Meulenberg y col., 1993, Virology,
192:62-72 y J. Gen. Virol.
74:1697-1701; Conzelmann y col., 1993, Virology,
193:329-339).
El PRRSV se clasificó provisionalmente dentro de
los arterivirus de un solo género en la nueva familia de virus de
los Arteriviridae, que incluye el virus de la arteritis
equina (EAV), el virus elevador de la lactato deshidrogenasa (LDV) y
el virus de la fiebre hemorrágica en simios (SHFV) (Plagemann y
Moennig, 1992, Adv. Virus. Res., 41:99-192; Godeny
y col., 1993, Virology, 194:585-596; solicitud de
EE.UU. Nº de serie 08/131.625 y 08/301.435). Este grupo de virus de
ARN de una sola cadena + comparte muchas características tales como
la organización del genoma, la estrategia de replicación, la
morfología y el tropismo de macrófagos (Meulenberg y col., 1993;
solicitud de EE.UU. Nº de serie 08/131.62.5 y 08/301.435). Las
infecciones subclínicas y la viremia persistente con la producción
simultánea de anticuerpos también son propiedades histopatológicas
características de los arterivirus.
Se ha informado de variaciones antigénicas,
genéticas y patogénicas entre aislados del PRRSV (Wensvoort y col.,
1992, J. Vet. Diagn. Invest., 4:134-138; Mardassi y
col., 1994, J. Gen. Virol., 75:681-685; solicitud de
EE.UU. Nº de serie 08/131.625 y 08/301.435). Además, el PRRSV de
EE.UU. y de Europa presenta dos genotipos distintos (solicitud de
EE.UU. Nº de serie 08/131.625 y 08/301.435). También existe
variabilidad antigénica entre diferentes aislados de Norteamérica
(Wensvoort y col., 1992). Se han demostrado marcadas diferencias en
la patogenicidad no sólo entre aislados de EE.UU. y de Europa,
sirio también entre diferentes aislados de EE.UU. (solicitud de
EE.UU. Nº de serie 08/131.625 y el documento WO 96/06619A1).
La organización genómica de los arterivirus se
asemeja a los coronavirus y los torovirus en que su replicación
supone la formación de un grupo anidado
3'-coterminal de ARNm subgenómicos (ARNm sg) (Chen y
col., 19E13, J. Gen. Virol. 74:643-660; Den Boon y
col., 1990, J. Virol., 65:2910-2920; De Vries y
col., 1990, Nucleic Acids Res., 18:3241-3247; Kuo y
col., 1991, J. Virol., 65:5118-5123; Kuo y col.,
1992; solicitud de EE.UU. Nº de serie 08/131.625 y 08/301.435).
También se han determinado secuencias parciales de varios aislados
de Norteamérica (solicitud de EE.UU. Nº de serie 08/131.625 y
08/301.435; Mardassi y col, 1994, J. Gen. Virol.,
75:681-685).
El genoma del PRRSV está poliadenilado en una
extensión de 15 kb aproximadamente y contiene ocho marcos de
lectura abiertos (ORF; Meulenberg y col., 1993; solicitud de EE.UU.
Nº de serie 08/131.625 y 08/301.435). Los ORF 1a y 1b probablemente
codifican la ARN polimerasa virica (Meulenberg y col., 1993). Se
encontró que los ORF 5, 6 y 7 codifican una proteína de membrana
glicosilada (E), una proteína de membrana no glicosilada (M) y una
proteína de la nucleocápsida (N), respectivamente (Meulenberg y
col., 1995). Los ORF 2 a 4 parecen tener las características de las
proteínas asociadas a membrana (Meulenberg y col., 1993; solicitud
de EE.UU. Nº de serie 08/301.435). Los ORF 2 a 4 del LV codifican
proteínas asociadas al virión denominadas GP_{2}, GP_{3} y
GP_{4}, respectivamente (Van Nieuwstadt y col., 1996,
70:4767-4772).
La glucoproteína de la envuelta principal del
EAV codificada por el ORF 5 puede ser la proteína de unión del
virus, y los anticuerpos monoclonales neutralizantes (MAbs) están
dirigidos a esta proteína (de Vries, J. Virol, 1992;
66:6294-6303; Faaberg, J. Virol, 1995;
69:613-617). La glucoproteína de la envuelta
principal del LDV, un miembro estrechamente relacionado del PRRSV,
también está codificada por el ORF 5, y se han encontrado varios
MAbs neutralizantes diferentes para inmunoprecipitar
específicamente la proteína ORF 5 (Cafruny y col., Vir. Res., 1986;
5:357-375). Por tanto, es probable que la proteína
de la envuelta principal del PRRSV codificada por el ORF 5 pueda
inducir anticuerpos neutralizantes contra el PRRSV.
Se identificaron varias regiones hípervariables
dentro del ORF 5 y se predijo que serían antigénicas (solicitud de
EE.UU. Nº de serie 08/131.625 y 08/301.435). Se ha propuesto que la
variación antigénica de los virus es el resultado de la selección
directa de variantes por las respuestas inmunitarias del hospedador
(revisado por Domingo y col., J. Gen. Virol, 1993,
74:2039-2045). Así, estas regiones hípervariables
son debidas probablemente a la presión por la selección inmunitaria
del hospedador y pueden explicar la diversidad antigénica observada
entre los aislados del PRRSV.
Las proteínas M y N de los aislados del PRRSV de
EE.UU. están muy conservadas (solicitud de EE.UU. Nº de serie
08/301.435). Las prol:eínas M y N son integrales para preservar la
estructura de los viriones del PRRSV, y la proteína N puede estar
bajo restricciones funcionales estrictas. Por tanto, es improbable
que (a) las proteínas M y N estén sometidas a una presión de
selección por anticuerpos importante o que (b) los ORF 6 y 7, que
es probable que codifiquen las proteínas M y N, sean responsables o
estén correlacionados con la virulencia del virus. No obstante,
curiosamente se observó una mayor variación de la secuencia de la
proteína M del LDV entre aislados del LDV con diferente
neurovirulencia (Kuo y col., 1992, Vir. Res.
23:55-72).
Se predijo que los ORF 1a y 1b se traducirían
en una sola proteína (polimerasa vírica) por desplazamiento del
marco de lectura. Los ORF 2 a 6 es posible que codifiquen las
proteínas víricas asociadas a la membrana.
Se siguen caracterizando las diversas cepas del
PRRSV (Halbur y col., J. Vet. Diagn. Invest.
8:11-20 (1996); Meng y col., J. Vet. Diagn. Invest.
8:374-381 (1996); Meng y col., J. Gen. Virol.
77:1265-1270 (1996); Meng y col., J. Gen. Virol.
76:3181-3188 (1995); Meng y col., Arch. Virol.
140:745-755 (1995); Halbur y col., Vet. Pathol.
32:200 204 (1995); Morozov y col., Arch. Virol.
140:1313-1319 (1995); Meng y col., J. Gen Virol.
75:1795-1801 (1994); Halbur y col., J. Vet. Diagn.
Invest. 6:254-257 (1994), incorporándose todas
ellas su totalidad en el presente documento mediante
referencia).
Los aislados del PRRSV ISU-12
(purificados en placa tres veces) e ISU-55 se
depositaron en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn
Drive, Rockville, Maryland 20852, EE.UU. el 30 de octubre de 1992 y
el 29 de septiembre de 1993, con los números de acceso
VR-2385 y VR-2430. El
ISU-55 es de baja patogenicidad y sólo produce una
consolidación del 10-25% de los tejidos
pulmonares.
El PRRSV es una causa importante de neumonía en
cerdos de criadero y lactantes. El PRRSV provoca pérdidas
económicas importantes por neumonía en cerdos de criadero (el grado
exacto de las cuales no se conoce completamente). La enfermedad
reproductiva fue el resultado clínico predominante de infecciones
por PRRSV durante los pasados últimos años, debido a la prevalencia
temprana de cepas del PRRSV de virulencia relativamente baja. La
enfermedad respiratoria ahora se ha convertido en el problema
principal asociado al PRRSV, debido a la prevalencia creciente de
cepas del PRRSV de virulencia relativamente elevada. Existe la
necesidad de una vacuna para proteger de las enfermedades provocadas
por las diversas cepas del PRRSV.
Sorprendentemente, el mercado para vacunas
animales en EE.UU. y en el resto del mundo es mayor que el mercado
para vacunas humanas. Así, existe un incentivo económico para
desarrollar nuevas vacunas veterinarias, además del beneficio
sustancial de salud pública que se desprende de proteger de
enfermedades a los animales de granja.
Según un aspecto de la presente invención se
proporciona una secuencia de ADN aislada que incluye un virus del
síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) que consiste
en una secuencia de nucleótidos del ISU-55 de alto
pasaje representada en la Figura 10.
En otro aspecto de la presente invención se
proporciona una secuencia de ADN aislada que comprende un marco de
lectura abierto del PRRSV de la reivindicación 1, cuyo marco de
lectura abierto se selecciona entre los nucleótidos
191-7699 de la secuencia del ISU-55
de alto pasaje representada en la Figura 10 (ORF 1a), los
nucleótidos 7687-12.069 de la secuencia del
ISU-55 de alto pasaje representada en la Figura 10
(ORF 1b), los nucleótidos 12.074-12.841 de la
secuencia del ISU-55 de alto pasaje representada en
la Figura 10 (ORF 2), los nucleótidos 12.697-13.458
de la secuencia del ISU-55 de alto pasaje
representada en la Figura 10 (ORF 3), los nucleótidos
13.242-13.775 de la secuencia del
ISU-55 de alto pasaje representada en la Figura 10
(ORF 4) y los nucleótidos 13.789-14.388 de la
secuencia del ISU-55 de alto pasaje representada en
la Figura 10 (ORF 5).
La presente invención proporciona adicionalmente
una composición para inducir anticuerpos contra el PRRSV que
comprende una cantidad del PRRSV codificada por la secuencia de
nucleótidos del ISU-55 de alto pasaje representada
en la Figura 10 (ISU-55) eficaz para inducir dichos
anticuerpos er un cerdo y un vehículo fisiológicamente
aceptable.
En un aspecto diferente, la presente invención
proporciona un procedimiento de distinción de una cepa
ISU-55 del PRRSV de otras cepas del PRRSV que
comprende:
(a) la amplificación de una secuencia de ADN del
PRRSV usando los siguientes dos cebadores:
- 55F 5'-CGTACGGCGATAGGGACACC-3' y
- 3RFLP 5'-GGCATATATCATCACTGGCG-3'
(b) la digestión de la secuencia amplificada de
la etapa (a) con Dral; y
(c) la correlación de la presencia de tres
fragmentos de restricción de 626 pb, 187 pb y 135 pb con una cepa
ISU-55 del PRRSV.
A continuación hay una descripción a modo
ejemplo sólo en referencia a los dibujos acompañantes de formas de
realización de la presente invención.
En los dibujos:
La Figura 1 muestra 20 clones de ADNc que se
solapan secuenciados a partir de la librería de ADNc del VR
2385.
La Figura 2 muestra el alineamiento del ADN de
la secuencia líder del VR 2385 y el LV.
La Figura 3 muestra los alineamientos del ORF 1
del VR 2385 y el LV.
La Figura 3A muestra el alineamiento del extremo
5'.
La Figura 3B muestra el alineamiento del ADN
central.
La Figura 3C muestra el alineamiento del extremo
3'.
La Figura 4 muestra los resultados de la PCR RT
anidada con cebadores específicos para la secuencia líder y el ORF
para amplificar los productos de la PCR correspondientes a los ARNm
4a, 5a y 7a.
La Figura 5 muestra el alineamiento de la
secuencia de ADN del ISU-55 de bajo pasaje y de alto
pasaje.
La Figura 6 muestra los mapas de los ORF de
cepas ISU-55 de bajo pasaje y de alto pasaje.
La Figura 7 es un mapa de restricción que
muestra la adición del sitio Dral en la secuencia de la cepa
ISU-55 de alto pasaje.
La Figura 8 muestra los resultados de una prueba
RFLP sobre el ARN total aislado de cepas ISU-55 de
alto pasaje, ISU-12 de bajo pasaje e
ISU-12 de alto pasaje y usado en PCR RT con los
cebadores 55F y 3RFLP.
La Figura 9 muestra un mapa genómico y una lista
de los ORF del ISU-55 de alto pasaje.
La Figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos
del ISU-55.
En la presente invención, un "virus del
síndrome respiratorio y reproductivo porcino" o "PRRSV" se
refiere a un virus que causa las enfermedades PRRS, PEARS, SIRS,
MSD y/o PIP (el término "PIP" ahora parece estar en desuso),
incluyendo la cepa Iowa del PRRSV, otras cepas del PRRSV encontradas
en Estados Unidos, cepas del PRRSV encontradas en Canadá (por
ejemplo, IAF-exp9l), cepas del PRRSV encontradas en
Europa (por ejemplo, virus Lelystad, PRRSV-10), y
variantes de estos virus estrechamente relacionadas que pueden
haber aparecido y que aparecerán en el futuro.
La "cepa Iowa" del PRRSV incluye (a)
aislados del PRRSV depositados en la American Type Culture
Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo) por los presentes
inventores y/o descritos en esta solicitud y/o en cualquiera de las
solicitudes de EE.UU. Nº de serie 08/131625 y 08/301.435
previas.
Una vacuna es eficaz si protege al cerdo contra
la infección por un virus del síndrome respiratorio y reproductivo
porcino (PRRSV). Una vacuna protege a un cerdo contra la infección
por un PRRSV si, después de la admnistración de la vacuna a uno o
más cerdos no afectados, una exposición posterior a aislados del
virus biológicamente puros (por ejemplo, VR 2385) da como resultado
una disminución de la gravedad de cualquier cambio masivo o
histopatológico (por ejemplo, lesiones en el pulmón) y/o de los
síntomas de la enfermedad, comparados con aquellos cambios o
síntomas causados normalmente por el aislado en cerdos similares
que están sin proteger (es decir, en relación a un control
apropiado). Más particularmente, una vacuna se puede demostrar que
es eficaz administrando la vacuna a uno o más cerdos adecuados que
lo necesiten, y posteriormente después de un periodo de tiempo
apropiado (por ejemplo, 1-4 semanas), exponiendo a
una muestra grande (10^{3-7} TCID_{50}) de un
aislado del PRRSV biológicamente puro. A continuación se extrae una
muestra de sangre del cerdo expuesto después de una semana
aproximadamente, y se lleva a cabo un intento de aislar el virus a
partir de la muestra de sangre.
El aislamiento del virus es una indicación de
que la vacuna puede no ser eficaz, y el fracaso en el aislamiento
del virus es una indicación de que la vacuna puede ser eficaz.
Así, la eficacia de una vacuna se puede evaluar
cuantitativamente (es decir, un descenso en el porcentaje de tejido
pulmonar consolidado comparado con un grupo control apropiado) o
cualitativamente (por ejemplo, el aislamiento del PRRSV a partir de
sangre, la detección de un antígeno del PRRSV en una muestra de
tejido pulmonar, tensil o nodo linfático mediante un procedimiento
de ensayo de la inmunoperoxidasa, etc.). Los síntomas de la
enfermedad respiratoria y reproductiva porcina se pueden evaluar
cuantitativamente (por ejemplo, temperatura/fiebre),
semi-cuantitativamente (por ejemplo, gravedad de la
dificultad respiratoria) o cualitativamente (por ejemplo, la
presencia o ausencia de uno o más síntomas o una reducción en la
gravedad de uno o más síntomas, tal como ciaiosis, neumonía,
lesiones cardiacas y/o cerebrales, etc.).
Un cerdo no afectado es un cerdo que no ha sido
expuesto a un agente infeccioso de la enfermedad respiratoria y
reproductiva porcina, o que se ha expuesto a un agente infeccioso
de la enfermedad respiratoria y reproductiva porcina pero que no
presenta los síntomas de la enfermedad. Un cerdo afectado es aquel
que muestra los síntomas del PRRS o a partir del cual se puede
aislar el PRRSV.
Los signos y síntomas clínicos del PRRS pueden
incluir letargo, dificultad respiratoria, "thumping"
(expiración forzada), fiebres, piel áspera, estornudos, tos, edema
ocular y ocasionalmente conjuntivitis. Las lesiones pueden incluir
lesiones pulmonares masivas y/o microscópicas, miocarditis,
linfadenitis, encefalitis y rinitis. Además, se han encontrado
formas menos virulentas y no virulentas del PRRSV y de la cepa
Iowa, que pueden provocar un subgrupo de los síntomas anteriores o
ninguno de los síntomas. No obstante, las formas menos virulentas o
no virulentas del PRRSV se pueden usar según la presente invención
para proporcionar protección frente a enfermedades respiratorias y
reproductivas porcinas.
La frase "ácido polinucleico" se refiere a
ARN o ADN, así como ARNm y ADNc que corresponden a o son
complementarios al ARN o al ADN aislados a partir del virus o del
agente infeccioso. Un "ORF" se refiere a un marco de lectura
abierto o un segmento que codifica un polipéptido, aislado a partir
de un genoma vírico, incluyendo el genoma de un PRRSV. En el
presente ácido polinucleico, puede estar incluido un ORF en parte
(como un fragmento) o completamente, y se puede solapar con la
secuencia 5' o 3' de un ORF adyacente.
Un "polinucleótido" es equivalente a un
ácido polinucleico, pero puede definir una molécula o grupo de
moléculas distinto (por ejemplo, en forma de subgrupo de un grupo
de ácidos polinucleicos).
Las características de la invención se harán
evidentes en el transcurso de las siguientes descripciones de
formas de realización ejemplares, que se dan para la ilustración de
la invención, y no están destinadas a ser limitantes de la
misma.
Se preparó la vacuna del virus vivo modificado
del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV)
en forma de una torta viral liofilizada y reconstituida con agua
estéril y se administró por vía subcutánea (SC) o intramuscular
(IM). El objetivo de este estudio era confirmar la inmunogenicidad
de una vacuna del PRRSV en cerdos de tres semanas de edad
vacunándolos IM o SC con una dosis de 2 ml. También se debía
determinar si la vacuna del PRRSV era segura y eficaz en cerdos de
tres semanas de edad vacunados con una sola dosis de 2 ml,
administrada IM o SC, en la protección de cerdos a la exposición a
una cepa virulenta del PRRSV, la ISU-12.
Se adquirieron setenta cerdos híbridos PRRSV
seronegativos (muestra IDEXX ELISA a una relación positiva de <
0,4) de Evergreen Partners, Morris, MN y se utilizaron en este
estudio. Todos los cerdos tenían tres semanas de edad en el momento
de la vacuna.
La vacuna del PRRSV que comprende la cepa
ISU-55 del virus se produjo a un nivel de pasaje
del virus de X+5. La vacuna se almacenó entre 2-7ºC
antes de su uso. La vacuna se tituló en cinco réplicas.
La vacuna madre se preparó reconstituyendo la
porción del virus liofilizada con agua estéril. La vacuna madre se
diluyó hasta el nivel de dosificación protector mínimo
(aproximadamente 10^{4} TCID_{50} por dosis) en medio de
cultivo. Una alícuota representativa de la vacuna preparada se
mantuvo a -70ºC para la cuantificación del antígeno viral. Los 70
cerdos susceptibles PRRSV seronegativos usados en este estudio se
distribuyeron aleatoriamente en cuatro grupos de tratamiento y se
vacunaron como sigue:
Los lugares de la inyección fueron en la parte
derecha del cuello (IM) o en un pliegue del costado derecho (SC).
Los cerdos control (Grupos C y D) no se vacunaron ni con vacuna ni
con placebo.
Antes de la vacunación, se obtuvo una muestra de
sangre de todos los cerdos para una serología previa a la
vacunación. Se obtuvo una muestra de los animales control antes de
la exposición para asegurarse de que seguían siendo seronegativos
para el PRRSV (IDEXX ELISA SIP relación < 0,4).
Treinta y seis días (36) después de la
vacunación, cada uno de los 20 cerdos de los Grupos A, B y C se
mezclaron en un recinto de aislamiento común y se expusieron al
PRRSV virulento. Los animales del Grupo D se dejaron como controles
no expuestos. El virus de exposición PRRSV ISU-12
virulento se obtuvo de la Universidad del estado de Iowa, Arnes,
Iowa. El virus de exposición PRRSV ISU-12 virulento
se mantuvo una muestra madre congelada (-70ºC) después de su
expansión en células PSP36. Los cerdos individuales se expusieron
por vía intranasal con 2 ml del virus de exposición. La muestra
madre de exposición del PRRSV se descongeló y se diluyó hasta
10^{4} TCID_{50} por 2 ml justo antes de la exposición. El
virus de exposición se mantuvo en hielo durante la exposición. Se
retuvo una alícuota de la preparación del virus de exposición y se
mantuvo a -70ºC para su titulación posterior en células PSP36. Los
animales se sometieron a observación los días -1 y 0 después de la
exposición (DPC) para establecer una línea basal y 1 a 10 DPC para
diversos signos clínicos.
Los cerdos se evaluaron cada día respecto a
signos clínicos después de la exposición tales como inapetencia,
letargo, depresión, diarrea, síntomas neurológicos, disnea,
cianosis y muerte.
Los pulmones de cada cerdo individual se
examinaron respecto a lesiones masivas por necropsia 10 días
después de la exposición. El examinador de las lesiones pulmonares
masivas desconocía la identidad del grupo de tratamiento al cual
pertenecía cada cerdo. Resumiendo, la puntuación para las lesiones
pulmonares en cada lóbulo se registró estimando el porcentaje del
lóbulo que presenta lesiones del tipo PRRSV (basado en el color y
la textura) y multiplicado por el número de puntos posibles para
ese lóbulo. La puntuación máxima para cada lóbulo se determinó
mediante el porcentaje relativo del volumen pulmonar total ocupado
por el lóbulo. A continuación se añadieron las puntuaciones de los
aspectos dorsales y ventrales de todos los lóbulos para obtener la
puntuación total para cada cerdo. La puntuación total máxima
posible para cada animal era 100.
Los signos clínicos y las puntuaciones de las
lesiones pulmonares masivas para los vacunados y los controles se
compararon usando el análisis de la varianza (modelo lineal
general). El uso de modelos de análisis de la varianza usando
puntuaciones de la lesión pulmonar masiva sin clasificar estaba
justificado por el ajuste de las puntuaciones dentro de una
distribución de probabilidad normal. Una comparación de los
residuales del análisis paramétrico indicó que estaban distribuidos
normalmente, confirmando las suposiciones principales para el
análisis de la varianza. Por tanto, no fue necesario el análisis de
los datos usando las puntuaciones de la lesión pulmonar masiva
clasificadas. Todas los análisis estadísticos se llevaron a cabo en
un ordenador IBM usando el software SAS.
Los resultados de la titulación de antígeno de
la vacuna del PRRSV se muestran en la Tabla 1. Los títulos del
PRRSV medios por dosis de vacuna de cinco titulaciones replicadas
fue de 10^{3,92} TCID_{50}.
Después de la vacunación, no hubo signos
clínicos observados en ninguno de los cerdos vacunados. Después de
la exposición al PRRSV virulento ISU-12 de pasaje
6, los cerdos vacunados y control no presentaron signos clínicos
significativos de enfermedad respiratoria o neurológica durante el
periodo de observación de 10 días posterior a la exposición.
Los resultados de la puntuación de la lesión
pulmonar masiva se dan en la Tabla 2. Después de la exposición al
PRRSV, las puntuaciones de la lesión pulmonar masiva abarcan entre
0-29 con una puntuación media de 14,15 en los
cerdos vacunados IM (Grupo A), entre 1-27 con una
puntuación media de 11,20 en los cerdos vacunados SC (Grupo B),
entre 7-57 con una puntuación media de
25-80 en los cerdos control expuestos no vacunados
(Grupos C), y entre 1-28 con una puntuación media
de 10,90 en los cerdos control no expuestos no vacunados (Grupo D).
Ambos cerdos vacunados IM y SC presentaban significativamente menos
lesiones pulmonares que los cerdos control expuestos no vacunados (p
< 0,05). Los cerdos vacunados no presentaban puntuaciones de
lesión pulmonar masiva significativamente diferentes que las
puntuaciones de lesión pulmonar masiva de los cerdos no expuestos
no vacunados (p > 0,05). Los cerdos control expuestos no
vacunados presentaban significativamente mayores lesiones
pulmonares masivas que los cerdos control no expuestos no vacunados
(p < 0,05).
Los resultados del estudio demuestran que la
vacuna del virus vivo modificado del virus del síndrome
respiratorio y reproductivo porcina es eficaz para su uso en cerdos
sanos de tres semanas de edad o mayores como ayuda en la prevención
de la enfermedad respiratoria provocada por la exposición a un PRRSV
virulento. El 100% de los cerdos de tres semanas de edad vacunados
con la vacuna viva modificada no presentaron ningún efecto clínico
local o sistémico adverso después de la vacunación. Estos cerdos
permanecieron sanos y activos durante todo el periodo de
observación de 36 días después de la vacunación. Los cerdos
vacunados con una dosis de vacuna de 10^{3,92} TCID_{50}
intramuscular o subcutáneamente presentaron una reducción
significativa (p < 0,05) en el desarrollo de la lesión pulmonar
masiva sobre cerdos control expuestos no vacunados después de la
exposición a una cepa del PRRSV virulenta heteróloga,
ISU-12. Las puntuaciones de la lesión pulmonar
masiva después de la exposición de cerdos vacunados eran
estadísticamente indistinguibles de los controles no expuestos no
vacunados (p> 0,05). El análisis de los residuales de los
análisis paramétricos de la varianza indicaban que estaban
distribuidos normalmente, corroborando las suposiciones principales
para el análisis de la varianza. El 100% de los cerdos vacunados
permanecieron exentos de signos clínicos durante el periodo
posterior a la exposición.
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Virus y células. En este estudio se usó el
pasaje 7 del aislado del PRRSV VR 2385. Se usó una línea celular
continua, la ATCC CRL 11171, para el crecimiento del virus y el
aislamiento del ARN vírico y el ARN total procedente del cultivo
celular infectado con el virus.
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Clonación de ADNc y amplificación por PCR. Para
la caracterización de la región ORF 1 del genoma del VR 2385 se
construyó una librería \lambda de ADNc aleatoria usando el kit de
clonación de ADNc Uni-Zap (Stratagene, La Jolla,
CA). Resumiendo, las células CRL 11171 se infectaron con el virus
VR 2385 a una M.O.I. de 0,1 y el ARN total procedente de células
infectadas se aisló a las 24 horas después de la infección usando
el procedimiento de tiocianato de guanidinio. Inicialmente, se usó
una sonda específica para el extremo 5' del ORF 2 para seleccionar
la librería de ADNc aleatoria. Las placas que se hibridaron con la
sonda se aislaron y se purificaron. Los fagómidos que contienen los
insertos de ADNc vírico se rescataron por escisión in vitro
usando el fago ayudante ExAssist y células SOLR de E. coli
(Stratagene, La Jolla, CA). Después de las hibridaciones con
fragmentos que se solapan específicamente con el
ORF-1, se seleccionaron diversos fagómidos
recombinantes con insertos de ADNc específicos para el virus con
tamaños que abarcan entre 2 y 6 kb. Los plásmidos que contienen los
insertos de ADNc del virus se purificaron posteriormente y se
secuenciaron mediante el procedimiento de terminación de la cadena
de didesoxinucleótidos de Sanger con un secuenciador de ADN
automatizado (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se usaron
cebadores universales, inversos e internos específicos del PRRSV
para determinar la secuencia. Se secuenciaron al menos 2 clones de
ADNc independientes que representan la secuencia de los ORF 1a y
1b. Se amplificó por PCR una región, no representada en la librería
(nucleótidos 1950-2050) con los cebadores IM687
(5'-CCCCATTGTTGGACCTCTCC-3') e
IM2500 (5'-GTCACAACAGGGACCGAGC-3')
usando la ADN polimerasa Tag con la adición del corrector de
pruebas Tag Extender (Stratagene). Los datos de secuenciación se
ensamblaron y se analizaron usando los programas de ordenador
MacVector (International Biotechnologies, Inc., CT) y GeneWorks
(IntelliGenetics, CA).
Experimentos de extensión del cebador y
secuenciación del ARN. Los experimentos de extensión del cebador se
llevaron a cabo usando el SureScript Preamplification System for
First Strand cDNA Synthesis (Gibco BRL). El oligonucleótido RNS
marcado con ^{32}P (5'-CCAAGCTCCCCTGAASGAGGCTGTC
AC-3') se mezcló con 0,5 \mug de ARN vírico del VR
2385 en un volumen total de 12 \mul y el ARN se desnaturalizó
durante 10 minutos a 90ºC. La mezcla se ajustó hasta un volumen
total de 19 \mul con el tampón de ADNc de la primera cadena y se
incubó durante 5 minutos a 42ºC para la hibridación del cebador. A
continuación se añadió la transcriptasa inversa Super Script II a
la reacción y la mezcla de reacción se incubó a 42ºC o 50ºC durante
unos minutos. Las muestras se analizaron en gel de poliacrilamida
al 40%. Los productos de extensión del cebador se corrieron
próximos a las reacciones de secuenciación del clon pPR59, que
contiene parte de la secuencia del líder. El oligonucleótido RNS
sirvió como cebador para la reacción de secuenciación.
La secuenciación directa del ARN vírico
purificado se llevó a cabo usando el RT RNA Sequencing Kit (USB,
Cleveland, Ohio) con el oligcnucleótido RNS marcado con
\gamma-^{32}P
(5'-CCAAGCTCCCCTGAAGGAGGCTGTCAC-3')
y 151 Ext
(5'-AGCATCCCAGACATGGTTAAAGGGG-3').
La secuenciación se llevó a cabo según las instrucciones del
fabricante usando 0,5 \mug de ARN vírico purificado por reacción
de secuenciación.
Secuencia líder del PRRSV VR 2385. Previamente,
se determinaron el oligo dT y las librerías de ADNc aleatorias del
PRRSV VR 2385 en el vector \lambda Zap y se construyó la
secuencia para la porción del ORF 1b y los ORF 2-7
completos. Se obtuvo la secuencia líder parcial del VR 2385, 161
nucleótidos aguas arriba del codón de iniciación ATG del ORF 1 a
partir del clon pPR59. Se ha mostrado previamente que la secuencia
líder del LDV tiene 156 nucleótidos, y que la secuencia líder del
LV (un aislado europeo del PRRSV) tenía 221 nucleótidos. Para
determinar la secuencia líder completa del PRRSV de EE.UU., se
llevaron a cabo experimentos de extensión del cebador. En un
experimento se sintetizó ADNc usando la transcriptasa inversa
SuperScript II a 42ºC y 50ºC. En ctro experimento se usó la
polimerasa de ADN rTth en presencia de Mn para la síntesis de ADNc a
60ºC para minimizar el potencial de estructuras secundarias en el
ARN líder durante la síntesis del ADNc. En todos los experimentos
la ongitud de los fragmentos de ADNc generados fue la misma, 190
nucleótidos aproximadamente. Para detectar la secuencia líder
completa del PRRSV VR 2385, se llevó a cabo la secuenciación
directa del ARN vírico. Se usó el ARN aislado del virión procedente
del virus purificado mediante un gradiente de sacarosa en una
reacción de secuenciación directa de ARN. La secuenciación directa
de ARN se llevó a cabo con un cebador complementario a la secuencia
líder en las posiciones entre 10 y 67 nucleótidos aguas arriba del
codón de iniciación AUG del ORF 1a. Además de los 161 nucleótidos
de la secuencia líder detectados previamente por selección de la
librería de ADNc con una sonda específica para la secuencia líder,
se identificaron 27 nucleótidos adicionales de la secuencia líder.
Los dos nucleótidos en el extremo 5' de la secuencia líder no se
pudieron identificar debido a las bandas fuertes observadas en los
cuatro carriles en el gel de secuenciación. El tamaño de la
secuencia líder determinado por secuenciación directa de ARN se
correlaciona con los resultados de los experimentos de extensión
del cebador. Para confirmar adicionalmente los datos obtenidos por
secuenciación directa de ARN, se llevó a cabo una PCR RT con un
cebador de 16 pb, correspondiente al extremo 5' de la secuencia
líder, y un cebador antisentido localizado 10 nucleótidos aguas
arriba del extremo 3' de la secuencia líder. Se amplificó un
fragmento de la PCR de 180 pb esperado que está de acuerdo con los
resultados obtenidos por secuenciación directa de ARN. Por tanto,
el tamaño putativo de la secuencia líder del PRRSV VR 2385 era de
190 nucleótidos, que es más pequeño que aquellos presentados para
el LV (221 nucleótidos), EAV (212 nucleótidos) y SHFV (208
nucleótidos), pero mayor que la secuencia líder presentada para el
LDV (156 nucleótidos). La secuencia de la región de unión en el
extremo 3' de la secuencia líder era TTTAACC. El codón de
iniciación ATG del ORF 1a está localizado inmediatamente aguas
abajo de esta secuencia. También se presentaron resultados similares
para LV, LDV y SHFV, en los que el codón de iniciación del ORF 1a
también está localizado después de la secuencia de unión. No
obstante, se informó de que la secuencia de unión líder del genoma
del EAV estaba 13 nucleótidos aguas arriba del codón de iniciación
del ORF 1a. Los porcentajes de identidad de secuencia de
nucleótidos entre la secuencia líder del VR 2385 y aquellos del LV,
LDV y SHFV fueron del 55%, 47% y 38%, respectivamente. De manera
sorprendente, sólo los últimos 44 nucleótidos en el extremo 3' de
la secuencia líder del VR 2385 poseen una homología significativa
con la secuencia líder del LV (una identidad del 86% en esta
región). También se encontró una homología relativamente superior en
esta región de 44 nucleótidos entre el VR 2385 y el LDV (64%) y
SHFV (63%). No se encontró una homología significativa entre las
secuencias líder del VR 2385 y el EAV.
Clonación y secuenciación del genoma del PRRSV.
Para analizar el ORF 1 del PRRSV VR 2385, se construyó una librería
de ADNc cebada aleatoriamente en un vector \lambda Zap procedente
del ARN total de las células infectadas con el virus. De la
librería de ADNc se seleccionaron más de veinte clones de ADNc que
se solapan y se secuenciaron (Figura 1). Para la mayoría de las
regiones, la secuencia se determinó a partir de al menos dos clones
independientes. La región correspondiente a los nucleótidos
1900-2050 no estaba representada en la librería de
ADNc, y esta región genómica se amplificó por PCR y se secuenció. El
análisis de la secuencia mostró que el ARN genómico del PRRSV
(aislado de EE.UU. VR 2385), excluyendo la secuencia poliA, es de
15.100 nucleótidos de longitud.
Dominios funcionales en los ORF 1a/1b y
homología con virus relacionados. El tamaño predicho del ORF 1a es
de 7197 nucleótidos. Se extiende desde los nucleótidos 191 a 7387
(excluyendo el codón de terminación TAG) y codifica una
poliproteína de 2399 aminoácidos. La región de unión
líder-genoma es similar a aquella del LV, y el
codón de iniciación ATG está localizado inmediatamente después de
la secuencia TTTAACC del líder. Se identificaron diferencias cuando
se comparan las secuencias del ORF1 del LV y el VR 2385. El ORF 1a
en el LV tiene 7188 nucleótidos de longitud y codifica 2396
aminoácidos, que solamente es 3 aminoácidos más corto que aquel del
VR 2385. La comparación por parejas de secuencias de nucleótidos
del VR 2385 y el LV indicaba que el extremo 5' del ORF 1a es más
divergente que el extremo 3'. Las identidades del 55% de la
secuencia de nucleótidos entre el VR 2385 y el LV es del 61% en el
extreme 3' del ORF 1a (entre los nucleótidos 3050 y 7387) en los
primeros 1500 nucleótidos del 55% del ORF 1a, y del 46% en una
región entre los nucleótidos 1500 y 2500. La región más variable
dentro del ORF 1a estaba localizada entre los nucleótidos 2500 y
3000, no había homología significativa entre el VR 2385 y el LV. La
identidad en aminoácidos fue del 49% para la región entre los
aminoácidos 1 y 530, del 55% para la región entre los aminoácidos
1100 y 2399, y sin homología significativa en la región que se
extiende entre los aminoácidos 530 y 1100. La comparación de las
secuencias del ORF 1a del VR 2385 y LDV reveló que hay un homología
del 52% en los primeros 2000 nucleótidos y un homología del 55% en
los últimos 3800 nucleótidos del ORF 1a (correspondientes a los
nucleótidos 3400-7197 en el VR 2385 y a los
nucleótidos 2850-6678 en el LDV). La región entre
los nucleótidos 2000 y 3400 del VR 2385 y entre los nucleótidos
2500 y 2850 del LDV es muy variable con una deleción de más de 500
nucleótidos en el genoma del LDV. La comparación de las secuencias
de aminoácidos predichas mostró que hay una homología del 36% para
la región que se extiende entre los aminoácidos 1 y 500, y del 39%
para la región que incluye los últimos 1300 aminoácidos de las
proteínas predichas (de 1120 a 2353 aminoácidos en el VR 2385 y de
940 a 2226 aminoácidos en el LDV).
El análisis de la proteína predicha codificada
por el ORF 1a del VR 2385 reveló la presencia de dos dominios
proteasa de cisteínas de tipo papaína (aminoácidos
63-165 y aminoácidos 261-347) y un
dominio proteasa de serinas de tipo 3C (aminoácidos
1542-1644), similares a aquellos descritos para
otros arterivirus y coronavirus. Los perfiles hidrófilos del ORF 1a
de las proteínas del VR 2385 eran similares a aquellos del LV y
LDV. La mitad 5' de las proteínas (primeros 1100 aminoácidos en VR
2385) era mayoritariamente hidrófilo, el extremo 3' (aminoácidos
2230-2399 en el VR 2385) era hidrófilo y la mitad 3'
de la proteína contiene 4 regiones hidrófobas (regiones con los
aminoácidos 1129-1207, aminoácidos
1240-1286, aminoácidos 1478-1643 y
aminoácidos 1356-2076 del VR 2385).
El ORF 1b del VR 2385 tiene 4389 nucleótidos de
longitud y se extiende desde el nucleótido 7369 al 11.757
(excluyendo el codón de terminación TGA), y codifica una proteína
de 1463 aminoácidos. La comparación del nucleótido y las secuencias
de aminoácidos predicha del ORF 1b del VR 2385 con aquellas del LV,
LDV y EAV confirmó que el ORF 1b está mucho más conservado que el
ORF 1a. La homología de nucleótidos y aminoácidos entre el VR 2385
y el LV era del 64 y el 67% en el ORF 1b y del 58 y el 53% en el
ORF 1a, respectivamente. La comparación de las proteínas predichas
del VR 2385 y el EAV mostró un homología del 36%. La proteína del
ORF 1b predicha del VR 2385 contiene un dominio polimerasa putativo
(aminoácidos 373-576), un dominio de dedos de cinc
putativo (aminoácidos 647-689), y un dominio
helicasa de ARN (aminoácidos 793-1015) similares a
aquellos descritos para LV, LDV, EAV y coronavirus.
La caracterización molecular de las regiones ORF
1b de coronavirus y arterivirus demostró que la poliproteina ORF 1
se expresa a través de dos ORF que se solapan, ORF 1a y ORF 1b. La
expresión del ORF 1b, que se solapa con el ORF 1a en un marco de
lectura -1, tiene lugar a través del denominado mecanismo de
desplazamiento del marco de lectura ribosomal que permite al
ribosoma evitar el codón de terminación del ORF 1a y traducir la
proteína codificada por ORF 1b. La región del desplazamiento del
marco de lectura consta de una "secuencia resbaladiza" seguida
de una estructura en pseudonudo. El análisis de la región de unión
del ORF 1a/ORF 1b del VR 2385 indica que la secuencia resbaladiza
potencial (5'-UUUAAAC-3') está
localizada 3 nucleótidos aguas arriba del codón de detención del
ORF 1a y la estructura en pseudonudo propuesta. La región está muy
conservada en coronavirus y arterivirus y la homología de secuencia
de nucleótidos en esta región entre el VR 2385 y el LV era del
86%.
La comparación de las secuencias líder del VR
2385 y el LV indicó que estos dos virus divergían entre sí mediante
mutaciones puntuales y posiblemente mediante recombinación. Las
diferencias de secuencia extensivas en las secuencias líder de estos
dos virus indicaban que la secuencia líder en el PRRSV no está
conservada, y está sometida a cambios mutacionales extensivos. La
región más conservada en la secuencia líder era los últimos 44
nucleótidos en el extremo 3', donde la identidad de secuencia de
nucleótidos era del 86% entre el VR 2385 y el LV, y del 68% entre
VR 2385 y el LDV. La secuencia líder putativa del VR 2385 tenía 190
nucleótidos, que es 31 nucleótidos más corta que aquella del LV, y
35 nucleótidos más larga que aquella del LDV. Como se muestra en la
Figura 2 hay una deleción de 20 nucleótidos en la secuencia líder
del VR 2385 (localizada después del nucleótido 145) comparada con
la secuencia líder del LV. La comparación de las secuencias líder
del VR 2385 y el LV indica que la puntuación de homología más alta
se obtiene cuando se introduce una separación de 20 nucleótidos en
la región correspondiente de la secuencia líder del LDV (Figura 2).
De manera similar, la puntuación de homología más alta se obtiene
cuando se introduce una separación de 50 nucleótidos en la
secuencia líder del LDV durante el alineamiento de las secuencias
líder del LV y el LDV. Este resultado sugiere que esta región de la
secuencia líder no es crítica para la replicación del virus, y se
pueden producir deleciones en esta región de la secuencia líder
durante la evolución del virus. Esta observación también podría
explicar las diferencias observadas en la longitud de las
secuencias líder entre el VR 2385, el LV y el LDV.
Para determinar la secuencia líder completa del
PRRSV VR 2385, se utilizaron diversas aproximaciones incluyendo la
selección de una librería de ADNc del oligo dT con una sonda de PCR
marcada con ^{32}P específica de la secuencia líder, la ligación
de ARN del ARN vírico (circularización de ARN) ion la ligasa de ARN
de T4 seguido de PCR RT con el ORF 7 y cebadores específicos de la
secuencia líder, y la secuenciación indirecta del extremo 5' del ARN
vírico (Ejemplo 2). Primero, se usó un fragmento de 100 pb de la
secuencia líder como sonda para detectar clones de ADNc que
contienen la secuencia líder a partir de una librería \lambda del
oligo dT. Se analizaron y se secuenciaron ocho clones de ADN, y se
encontró que estos clones representan las secuencias líder de los
ARNm 7 (5 clones), 6 (2 clones) y 2 (1 clon). El tamaño de la
secuencia líder variaba entre 160 y 163 nucleótidos en 6 de los 7
clones. En uno de los clones que representa el ARNm 6, la secuencia
líder específica tenía 172 nucleótidos. Es posible que una
estructura secundaria fuerte dentro de la secuencia líder del virus
previniese la síntesis completa del ADNc del ARN líder durante la
construcción de la librería \lambda Zap. En un segundo
experimento, los extremos 3' y 5' del ARN vírico se ligaron de
cabeza a cola usando la ligasa de ARN de T4. Después de la
extracción y la precipitación con fenol cloroformo, el ARN ligado
se sometió a una reacción de PCR RT con los cebadores IM 1003
(oligonucleótido antisentido, complementario al extremo 3' de la
secuencia líder) e IM 1004 (oligonucleótido, correspondiente a un
segmento de la región no codificante 3' del genoma, 100 nucleótidos
aguas arriba de la cola poli(A)). Se purificó una banda
difusa de los productos de la PCR en gel de agarosa con tamaños que
abarcan entre los 250 y 350 nucleótidos, y se clonó en el vector
pSK+. Se secuenciaron 7 clones independientes. El análisis de la
secuencia indicaba que la secuencia poliA en el extremo 3' del
genoma y la secuencia líder en el extremo 5' del genoma estaban
ligadas juntas en los 7 clones, pero sólo 95-96
nucleótidos del extremo 3' de la secuencia líder estaban ligados con
el extremo 3' del genoma vírico. Los tamaños de los clones
secuenciados de poliA variaban en cada clon abarcando entre 9 y 42
nucleótidos, que indica que los clones secuenciados eran
independientes. La secuencia líder de longitud completa putativa
del VR 2385 se determinó por secuenciación directa del extremo 5'
del ARN, del ARN del virión aislado a partir del virus purificado
en gradiente de sacarosa (Ejemplo 2).
Secuencias de unión ARNm-líder y
regiones intergénicas dentro del genoma del VR 2385. Para
caracterizar las regiones de unión estructura-líder
de los ARN sg de la cepa VR 2385, se llevó a cabo una PCR RT con un
cebador líder específico y cebadores específicos para cada ARNm sg.
Los ARN totales aislados 24 horas después de la infección (hpi) se
usaron para la PCR RT. Las bandas predominantes se aislaron en gel
de agarosa, se clonaron y se secuenciaron. También se llevó a cabo
la secuenciación directa de los productos de la PCR. Para
identificar la región de unión estructura-líder en
el genoma del PRRSV, se usó una sonda específica marcada con
^{32}P para seleccionar una librería de ADNc aleatoria generada a
partir de ARN vírico, y se aislaron y se secuenciaron varios clones
que contienen las regiones de unión secuencia
líder-ORF 1a. Se caracterizaron las regiones de
unión estructura-líder de los
ARNm sg 2 a 7.
ARNm sg 2 a 7.
La Tabla 3 resume las regiones de unión
estructura-líder de iodos los ARNm sg y sus
regiones correspondientes en el genoma del virus. Sólo se detectó un
único sitio de unión para los ARNm sg 2, 3 y 6, mientras que se
detectaron dos sitios para los ARNm sg 4, 5 y 7, denominados 4a,
4b, 5a, 5b y 7a, 7b. La región de unión genoma-líder
en VR 2385 estaba representada por una secuencia CCACCCCTTTAACC,
que es similar a aquella de:
Las regiones de unión de ARNm
estructura-líder variaban en los ARNm sg 3, 4, 5b,
6 y 7a. La Tabla 4 compara las regiones intergénicas en genomas del
VR 2385, LV, LDV y EAV. Las regiones intergénicas del VR 2385, LV,
y LDV son muy similares. La mayoría de las variaciones fueron
encontradas en los primeros tres nucleótidos de estas regiones,
mientras que los últimos cuatro nucleótidos están conservados y en
la mayoría de regiones están representados por la secuencia MCC.
También se encontraron variaciones en los dos primeros nucleótidos
de esta secuencia de unión (GACC y CACC en la región intergénica
del ORF 4 del VR 2385, AGCC en la región intergénica del ORF 5b del
VR 2385, GACC en la región intergénica del ORF 3 del LV, y ACC en
la región intergénica del ORF 4 del LDV). La región intergénica
para el ARNm sg 5a del VR 2385 es GUCAACU, que es similar a aquella
del EAV.
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La posición de los sitios intergénicos aguas
arriba del codón de iniciación de los ORF correspondientes varía
entre 4 y 231 nucleótidos. La Tabla 5 compara la localización de
los sitios intergénicos en los genomas del VR 2385 y el LV (los
números representan la distancia en nucleótidos entre el sitios
intergénicos y el codón de iniciación AUG del ORF correspondiente).
La localización de estos sitios en el genoma del VR 2385 y el LV
difieren en los ARNm sg 3, 4, 5 y 6. También se identificaron tres
sitios intergénicos alternativos para la síntesis de los ARNm sg 4,
5 y 7 del genoma del VR 2385. Previamente, se detectaron esas únicas
seis bandas de ARNm sg en las células infectadas con el VR 2385
mediante el análisis de hibridación por transferencia Northern
blot. Para confirmar que realmente se sintetizan los ARNm sg
adicionales durante la replicación del VR 2385, se llevó a cabo una
PCR RT anidada usando cebadores específicos de la secuencia líder y
del ORF. Los productos amplificados de la PCR eran de tamaño similar
correspondiente a los ARNm 4a, 5a y 7a adicionales (Figura 4). Los
resultados indicaban que los sitios intergénicos 4b y 5b de los
ARNm sg 4 y 5 que están localizados más próximos al codón de
iniciación del ORF correspondiente se usan frecuentemente en la
síntesis de ARNm sg. Los ARNm sg 4 y 5 se generaban
predominantemente a partir de los sitios intergénicos 4b y 5b
mientras que sólo se generó una pequeña población usando los sitios
alternativos 4a y 5a. En el caso del ARNm sg 7 se usó
frecuentemente el sitio intergénico 7a localizados 123 nucleótidos
aguas arriba del codón de iniciación del ORF 7, mientras que el
sitio 7b localizado 9 nucleótidos aguas arriba del codón de
iniciación del ORF 7 estaba meno implicados en la síntesis del ARNm
sg 7.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La comparación de la secuencia de unión
genoma-líder con secuencias de las regiones
intergénicas y secuencias de las regiones de unión
estructura-líder en los ARNm sg indicaba que sólo
los últimos siete nucleótidos de la secuencia líder (TTTAACC)
poseen homología con las secuencias de las regiones intergénicas en
el genoma del VR 2385. La homología global varía entre 5 y 7
nucleótidos, y la excepción fue el ARNm sg 6 donde 11 de 12
nucleótidos en la región intergénica son similares al extremo 3' de
la secuencia líder. En las regiones de unión
estructura-líder del ARNm sg, la secuencia CCACCCC
está conservada y se genera a partir de la secuencia líder. No
obstante, la secuencia que sigue a CCACCCC varía para diferentes
ARNm sg, pero tiene un alto nivel de homología con la secuencia
TTTAACC en el extremo 3' de la secuencia líder. Las variaciones en
las secuencias de unión estructura-líder detectadas
para diferentes ARNm sg indican que la unión
estructura-líder es imprecisa. Las comparaciones de
la secuencia de nucleótidos entre el extremo 3' de la secuencia
líder, las regiones de unión estructura-líder de
los ARNm sg y las regiones intergénicas dentro del genoma del VR
2385 permitieron la detección de regiones de unión real entre la
secuencia líder y la estructura de los ARNm sg.
Conclusiones. El mecanismo de síntesis de ARNm
subgenómicos de los aislados de EE.UU. del PRRSV es similar a aquel
del LV, LDV y EAV. Las regiones intergénicas detectadas en el VR
2385 eran más viables y estaban localizadas en sitios diferentes
cuando se comparan al LV. Las variaciones en las secuencias de
unión estructura-líder indican que la unión
estructura-líder es imprecisa. Las localizaciones
de los sitios de unión estructura-líder real en los
ARNm sg sugiere que puede estar involucrado un mecanismo(s)
diferente al cebado de la secuencia líder en la síntesis de ARNm
sg. Sitios de unión estructura-líder alternativos en
el genoma de aislados de EE.UU. del PRRSV pueden dar como resultado
la variación del número de ARNm sg entre diferentes cepas del
PRRSV.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se proporciona una prueba fiable
para la identificación y diferenciación de una cepa
ISU-55 de alto pasaje del PRRSV a partir de aislados
de campo del PRRSV. En estudios previos se determinó la secuencia
de la cepa ISU-55 de bajo pasaje (pasaje 7) y está
secuencia se usó para desarrollar una prueba RFLP para la
diferenciación de una cepa ISU-55 de alto pasaje.
Como primera etapa, se analizó la secuencia del
ISU-55 de pasaje 7 para identificar regiones
variables que contienen sitios de restricción únicos. Después del
análisis de la secuencia por ordenador y la comparación con
secuencias de diferentes cepas del PRRSV, se identificó una región
específica que contiene sitios de restricción únicos en el extremo
3' del ORF 4. Estos dos sitios de restricción eran Dral (TTT/AAA) en
la posición 1510 y Ball (MscI) (TGG/CCA) en la posición 1697 en
relación a la localización aguas arriba del codón de iniciación ATG
del ORF 2 en la secuencia del ISU-55 (pasaje 7).
Estos dos sitios de restricción sólo estaban presentes en la región
correspondiente de la cepa ISU-55 pero no en las
otras cepas del PRRSV.
Para confirmar los resultados del análisis por
ordenador, se determinó la secuencia de la cepa
ISU-55 de alto pasaje. La región genómica que
incluye los ORF 3 a 7 (2696 pb) se amplificó por PCR y se
secuenció. La secuencia del ISU-55 de alto pasaje
se comparó con aquella del ISU-55 de pasaje 7. Los
resultados de esta comparación se muestran en la Figura 5
(alineamiento de ADNc), Figura 6 (mapas del ORF) y Figura 7 (patrón
de restricción con las enzimas de restricción Dral y Ball). Las
secuencias del ISU-55 del PRRSV de bajo pasaje y
alto pasaje estaban muy conservadas. Sólo había 15 sustituciones de
nucleólidos en la cepa ISU-55 de alto pasaje. Los
tamaños y las posiciones relativas de los ORF 3 a 7 permanecen
iguales. Un único cambio de nucleótido en el virus de alto pasaje
creó un sitio Dral adicional en la secuencia del virus de alto
pasaje comparada con el ISU-55 de bajo pasaje
(Figura 7). Este hallazgo da la oportunidad de distinguir el virus
de alto pasaje del virus ISU-55 de bajo pasaje. Se
llevó a cabo una búsqueda en BLAST para comparar regiones
específicas de la cepa ISU-55 de alto pasaje con
otras secuencias del PRRSV disponibles en la base de datos del
GenBank. Se usó el fragmento de 237 pb que incluye los sitios de
restricción únicos de la cepa ISU-55 de alto pasaje
(dos sitios Dral en la posición 966 y 1159 y un sitio Ball en la
posición 1157, mapa restricción del ISU-55 de alto
pasaje) como modelo para su comparación. Los resultados de la
búsqueda en BLAST indicaban que estos sitios eran únicos para la
cepa ISU-55 de alto pasaje y no están presentes en
otros 24 aislados del PRRSV disponibles en la base de datos.
También se comparó el ORF 5 (603 pb) de la cepa
ISU-55 de alto pasaje con el ORF 5 de otras cepas
del PRRSV. Tal y como se esperaba, la cepa ISU-55
de pasaje 7 tiene la puntuación de homología más alta y sólo hay 3
sustituciones de nucleótidos. La cepa con la segunda puntuación de
homología más alta fue NADC8 que tiene 33 sustituciones de
nucleótidos en el ORF 5 comparada con el ORF 5 de la cepa
ISU-55 de alto pasaje. El resto de cepas del PRRSV
comparadas en la búsqueda en BLAST presentaron más variaciones
(hasta 63 cambios de nucleótidos) en el ORF 5. Estos datos indican
claramente que la cepa ISU-55 del PRRSV es
diferente de todas las otras cepas del PRRSV caracterizadas hasta
ahora.
Se llevó a cabo una PCR-RFLP
para diferenciar la cepa ISU-55 de alto pasaje del
virus ISU-55 de bajo pasaje y de otras cepas del
PRRSV. Para la prueba RFLP se sintetizaron dos cebadores: un
cebador sentido 55F 5'-CG
TACGGCGATAGGGACACC-3' (posición 823) y un cebador antisentido 3RFLP 5'-GGCATATATCATCACTGGCG-3' (posición 1838) (posiciones desde el extremo 5' del fragmento secuenciado de 2696 pb de la cepa ISU-55 de alto pasaje). El cebador antisentido para la prueba de PCR-RFLP era el mismo que aquel usado en una prueba de PCR-RFLP para diferenciar la cepa de la vacuna MLV ResPRRSV puesto que este cebador se ha usado en la PCR-RFLP con un gran número de aislados del PRRSV y ha demostrado ser específico (Wesley y col., J. Vet. Diagn. Invest. 10:140-144 (1998); Wesley y col., Amer. Assoc. Of Swine Practitioners, pp. 141-143 (1996); Andreyev y col., Arch. Virol. 142:993-1001 (1997); Mengeling, y col., 1997, todos los cuales se incorporan en su totalidad en el presente documento por referencia). Estos dos cebadores amplifican un fragmento de ADNc de 1026 pb de una cepa ISU-55 de alto pasaje del PRRSV. Después de la digestión con la enzima de restricción Dral se generarán tres fragmentos (626 pb, 187 pb y 135 pb). Después de la digestión con Ball, se formarán dos fragmentos con un tamaño de 626 y 322 pb. Después de la PCR y las digestiones con la enzima de restricción de otras cepas del PRRSV, se formará un fragmento de 1026 pb según el análisis de los datos por ordenador. Para validar la prueba de PCR-RFLP, se aisló el ARN total a partir de cepas ISU-55 de alto pasaje, ISU-12 de bajo pasaje, ISU-12 de alto pasaje y se sometió a PCR RT con los cebadores 55F y 3RFLP. Se amplificó un fragmento de 1026 pb a partir de todos los aislados. Estos fragmentos se purificaron y se dirigieron con las enzimas de restricción Dral y Ball. Los productos resultantes se analizaron en gel de agarosa al 1,5%. La Figura 8 muestra los resultados de la prueba. El carril uno muestra un fragmento de PCR de 1026 pb sin tratar de la cepa ISU-55 de alto pasaje. El carril 2 y 5 muestra los productos de la PCR del ISU-55 de alto pasaje digeridos con Dral (carril 2) y Ball (carril 5). Los fragmentos de 626 pb, 187 pb y 135 pb se formaron después de la digestión con Dral, y los fragmentos de 626 y 322 pb se formaron después de la digestión con Ball. Los carriles 3, 4, 6, y 7 resultan de la digestión con Dral (carriles 3 y 4) y la digestión con Ball (carriles 6 y 7) de los productos de la PCR de las cepas ISU-12 de bajo pasaje (carriles 3 y 6) e ISU-12 de alto pasaje (carriles 4 y 7). En todas las reacciones con las cepas ISU-12 de bajo pasaje y alto pasaje se detectó un fragmento de PCR de 1026 pb. Estos datos tienen una correlación con las predicciones de la prueba de diferenciación PCR-RFLP de la cepa ISU-55 de alto
pasaje.
TACGGCGATAGGGACACC-3' (posición 823) y un cebador antisentido 3RFLP 5'-GGCATATATCATCACTGGCG-3' (posición 1838) (posiciones desde el extremo 5' del fragmento secuenciado de 2696 pb de la cepa ISU-55 de alto pasaje). El cebador antisentido para la prueba de PCR-RFLP era el mismo que aquel usado en una prueba de PCR-RFLP para diferenciar la cepa de la vacuna MLV ResPRRSV puesto que este cebador se ha usado en la PCR-RFLP con un gran número de aislados del PRRSV y ha demostrado ser específico (Wesley y col., J. Vet. Diagn. Invest. 10:140-144 (1998); Wesley y col., Amer. Assoc. Of Swine Practitioners, pp. 141-143 (1996); Andreyev y col., Arch. Virol. 142:993-1001 (1997); Mengeling, y col., 1997, todos los cuales se incorporan en su totalidad en el presente documento por referencia). Estos dos cebadores amplifican un fragmento de ADNc de 1026 pb de una cepa ISU-55 de alto pasaje del PRRSV. Después de la digestión con la enzima de restricción Dral se generarán tres fragmentos (626 pb, 187 pb y 135 pb). Después de la digestión con Ball, se formarán dos fragmentos con un tamaño de 626 y 322 pb. Después de la PCR y las digestiones con la enzima de restricción de otras cepas del PRRSV, se formará un fragmento de 1026 pb según el análisis de los datos por ordenador. Para validar la prueba de PCR-RFLP, se aisló el ARN total a partir de cepas ISU-55 de alto pasaje, ISU-12 de bajo pasaje, ISU-12 de alto pasaje y se sometió a PCR RT con los cebadores 55F y 3RFLP. Se amplificó un fragmento de 1026 pb a partir de todos los aislados. Estos fragmentos se purificaron y se dirigieron con las enzimas de restricción Dral y Ball. Los productos resultantes se analizaron en gel de agarosa al 1,5%. La Figura 8 muestra los resultados de la prueba. El carril uno muestra un fragmento de PCR de 1026 pb sin tratar de la cepa ISU-55 de alto pasaje. El carril 2 y 5 muestra los productos de la PCR del ISU-55 de alto pasaje digeridos con Dral (carril 2) y Ball (carril 5). Los fragmentos de 626 pb, 187 pb y 135 pb se formaron después de la digestión con Dral, y los fragmentos de 626 y 322 pb se formaron después de la digestión con Ball. Los carriles 3, 4, 6, y 7 resultan de la digestión con Dral (carriles 3 y 4) y la digestión con Ball (carriles 6 y 7) de los productos de la PCR de las cepas ISU-12 de bajo pasaje (carriles 3 y 6) e ISU-12 de alto pasaje (carriles 4 y 7). En todas las reacciones con las cepas ISU-12 de bajo pasaje y alto pasaje se detectó un fragmento de PCR de 1026 pb. Estos datos tienen una correlación con las predicciones de la prueba de diferenciación PCR-RFLP de la cepa ISU-55 de alto
pasaje.
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Después de que se determinó la secuencia de la
cepa VR 2385, la información de la secuenciación generada se usó
para determinar la secuencia de la cepa del PRRSV de la vacuna
atenuada (cepa de la vacuna). Todo el genoma de la cepa de la
vacuna se amplificó en 21 fragmentos que se solapan y se secuenció.
Cuando se combinaron los datos de la secuenciación, el tamaño
completo del genoma era de 15.412 nucleótidos, que es 309
nucleótidos más largo comparado con la longitud del genoma de la
cepa VR 2385. El mapa de los ORF y sus localizaciones se muestran
en la Figura 9. La comparación del genoma de la cepa de la vacuna y
las cepas VR 2385 presentó los mismos tamaños y localizaciones
relativas de los ORF 1b a ORF 7. El ORF 1a era el más variable y se
encontró una deleción de 309 nucleótidos en el genoma del VR 2385
comparado con la secuencia de la cepa de la vacuna. Esta deleción
estaba en el marco de lectura y localizada en la región del ORF 1a
en la posición del nucleótido 3242 desde el extremo 5' del genoma
del PRRSV VR 2385. Otros tres nucleótidos estaban delecionados en
la región de los nucleótidos 2504-2515 del genoma
provocando una deleción de 1 aminoácido comparado con el genoma de
la cepa de la vacuna. Los resultados de la comparación del genoma
de diferentes ORF de la cepa de la vacuna y la cepa VR 2385 se
resumen en la Tabla 6. La homología global del ADN entre estas
cepas era del 91% aproximadamente con 14.094 nucleótidos idénticos
en ambas cepas. No incluyendo la deleción de 309 nucleótidos la
homología del ADN era del 93%. La secuencia líder se determinó sólo
para la cepa VR 2385 por secuenciación directa del ARN virico y se
usó un cebador específico de 17 pb para el extremo 5' de la
secuencia líder del VR 2385 para amplificar una porción de 170
nucleótidos de la secuencia líder de la cepa de la vacuna. La
comparación de estas secuencias mostró una homología global del 94%
con deleciones de nucleótidos únicas en ambas cepas: no están
presentes los nucleótidos A (posición 75) y G (posición 119) de la
secuencia líder del VR 2385 en la secuencia líder de la cepa de la
vacuna, y no están presentes los nucleótidos A (posición 87) y G
(posición 124) de la secuencia líder de la cepa de la vacuna en la
secuencia líder de la cepa VR 2385.
El ORF 1a en la cepa de la vacuna se extiende
entre los nucleótidos 191 y 7699 y codifica una proteína de 2503
aminoácidos, que es 103 aminoácidos más larga comparada con la
proteína ORF 1a de la cepa VR 2385. La identidad de aminoácidos
global entre las proteínas predichas ORF 1a de la cepa de la vacuna
y el VR 2385 era del 88% (92% sin incluir la deleción en VR 2385).
La comparación con la proteína ORF 1a del LV mostró una identidad
de aminoácidos global del 47% aproximadamente, pero se pueden
identificar varias regiones con una similitud de proteínas
diferente. El extremo 5' relativamente conservado (aminoácidos 1 a
529 en la cepa de la vacuna y aminoácidos 1 a 521 en el LV,
identidad de aminoácidos del 50%), el extremo 3' relativamente
conservado (aminoácidos 1232 a 2503 de la cepa de la vacuna y
aminoácidos 1115 a 2396 en el LV, identidad de aminoácidos de 58%),
y la región hípervariable (HVR) entre medias (aminoácidos 530 a 1231
en la cepa de la vacuna y aminoácidos 522 a 1114 en el LV,
identidad de aminoácidos inferior al 40%). Cuando estudiamos la
homología en la HVR con más detalle, somos capaces de detectar una
región corta (94 aminoácidos), en la que la homología de los
aminoácidos era del 50% entre la cepa de la vacuna y el LV. Esta
región se extiende entre los aminoácidos 1015 a 1108 en la cepa de
la vacuna y los aminoácidos 929 a 1021 en el LV. Curiosamente, a
excepción de los cuatro primeros aminoácidos (ITRK) esta región
estaba delecionada en la cepa VR 2385. Para resumir, la homología
en la proteína predicha ORF 1a se puede presentar como sigue:
región conservada 1 (aminoácidos 1 a 529 en la cepa de la
vacuna/cepa VR 2385, aminoácidos 1 a 521 en el LV, identidad de
aminoácidos del 90% entre la cepa de la vacuna y VR 2385, identidad
de aminoácidos del 50% entre las cepas de la vacuna/VR 2385 y el
LV), región hípervariable (HVR) (aminoácidos 530 a 1231 en la cepa
de la vacuna, aminoácidos 520 a 1127 en la cepa VR 2385,
aminoácidos 522 a 1232 en el LV, identidad de aminoácidos del 84%
entre la cepa de la vacuna y VR 2385, deleción de 103 aminoácidos
en la proteína ORF 1a del VR 2385, identidad de aminoácidos inferior
al 40% entre las cepas de la vacuna/VR 2385 y el LV), y región
conservada 2 (aminoácidos 1232 a 2503 en la cepa de la vacuna,
aminoácidos 1128 a 2399 en la cepa VR 2385, aminoácidos 1128 a 2396
en el LV, identidad de aminoácidos del 96% entre la cepa de la
vacuna e identidad de aminoácidos del 57% entre las cepas de la
vacuna/VR 2385 y el LV). El fragmento de 94 aminoácidos
(aminoácidos 929 a 1021) en la HVR de la cepa de la vacuna posee
una homología de aminoácidos del 50% con el LV, y esta región está
delecionada en la cepa VR 2385.
El ORF 1b en la cepa de la vacuna se extiende
entre los nucleótidos 7687 y 12.069 y codifica una proteína de 1461
aminoácidos, que es similar en tamaño a aquella del VR 2385. La
comparación de nucleótidos y aminoácidos demostró que el ORF 1b
está mucho más conservado en comparación con el ORF 1a. La
homología de nucleótidos entre la cepa de la vacuna y VR 2385 era
del 93%, con una homología del 97% de sus proteínas predichas. La
comparación con el ORF 1b del LV (1462 aminoácidos) mostró una
identidad de aminoácidos del 67%. Se detectó una región variable en
el extremo 3' del ORF 1b (aminoácidos 1367-1461)
comparado con el LV.
La región del ORF 2 al ORF 7 de la cepa de la
vacuna mostró una organización del genoma similar a aquella del VR
2385, con tamaños y localizaciones relativas similares de los ORF.
Los datos de la comparación de la homología entre la cepa de la
vacuna y VR 2385 se presentan en la Tabla 6, la identidad de
nucleótidos (aminoácidos) de la cepa de la vacuna con el LV era del
66% (61%) para el ORF 2, 61% (55%) para el ORF 3, 66% (67%) para el
ORF 4, 63% (51%) para el ORF 5, 68% (79%) para el ORF 6, y 60%
(58%) para el ORF 7.
<110> IOWA STATE UNIVERSITY RESEARCH
FOUNDATION AMERICAN CYANAMID COMPANY
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<120> PROTEÍNAS CODIFICADAS POR ÁCIDOS
POLINUCLEICOS DEL VIRUS DE SÍNDROME REPRODUCTIVO Y RESPIRATORIO
PORCINO (PRRSV).
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<130>
8199-005-55XCIP WO
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US99/02630
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<141>
1999-02-06
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 09/019,793
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<151>
1998-02-06
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<150> US 08/478,316
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1995-06-07
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<151>
1992-10-30
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<160> 175
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 2352
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<212> ADN
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<213> Virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino
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<211> 1947
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: ADN sintético
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<212> ADN
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: ADN sintético
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: ADN sintético
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Artificial: ADN sintético
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\hskip-.1em\dddseqskipccaccccttt aacc
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: ADN sintético
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<210> 168
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: ADN sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: ADN sintético
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<400> 169
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<212> ADN
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: ADN sintético
Claims (10)
1. Una secuencia de ADN aislada que codifica un
virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV)
constituida por la secuencia de nucleótidos del
ISU-55 de alto pasaje representado en la Figura
10.
2. Una secuencia de ADN aislada que comprende
un marco de lectura abierto del PRRSV de la reivindicación 1,
seleccionada entre las que el marco de lectura abierto son los
nucleótidos 191-7699 de la secuencia de nucleótidos
del ISU-55 de alto pasaje representada en la Figura
10 (ORF 1a), los nucleótidos 7687-12.069 de la
secuencia de nucleótidos del ISU-55 de alto pasaje
representada en la Figura 10 (ORF 1b), los nucleótidos
12.074-12.841 de la secuencia de nucleótidos del
ISU-55 de alto pasaje representada en la Figura 10
(ORF 2), los nucleótidos 12.697-13.458 de la
secuencia de nucleótidos del ISU-55 de alto pasaje
representada en la Figura 10 (ORF 3), los nucleótidos
13.242-13.775 de la secuencia de nucleótidos del
ISU-55 de alto pasaje representada en la Figura 10
(ORF 4) y los nucleótidos 13.789-14.388 de la
secuencia de nucleótidos del ISU-55 de alto pasaje
representada en la Figura 10
(ORF 5).
(ORF 5).
3. Una composición que comprende los
polipéptidos codificados por la secuencia de ADN aislada de la
reivindicación 1.
4. Una composición para inducir anticuerpos
contra el PRRSV que comprende una cantidad del PRRSV codificada por
la secuencia de nucleótidos del ISU-55 de alto
pasaje representada en la Figura 10 (ISU-55) eficaz
para inducir dichos anticuerpos en un cerdo y un vehículo
fisiológicamente aceptable.
5. La composición de la reivindicación 4,
reduciendo dicha composición las lesiones pulmonares en cerdos
nacidos por cesárea privados de calostro de cinco semanas de edad
en una cantidad estadísticamente significativa en la que dicha
cantidad es un valor de p significativo inferior a 0,01, en relación
a lesiones pulmonares en cerdos nacidos por cesárea privados de
calostro de cinco semanas de edad sin inocular.
6. La composición de la reivindicación 4 que
comprende adicionalmente un adyuvante.
7. Uso de una cantidad eficaz de la composición
de la reivindicación 4 para la fabricación de una vacuna para la
protección de un cerdo de una enfermedad respiratoria y
reproductiva porcina.
8. El uso de la reivindicación 7,
caracterizado porque dicha vacuna se administra por vía oral
o parenteral.
9. El uso de la reivindicación 7,
caracterizado porque dicha vacuna se administra por vía
intramuscular, intradérmica, intravenosa, intraperitoneal,
subcutánea o intranasal.
10. Un procedimiento de distinción de la cepa
ISU-55 del PRRSV de otras cepas del PRRSV que
comprende:
(a) la amplificación de una secuencia de ADN del
PRRSV usando los siguientes dos cebadores:
- 55F 5'-CGTACGGCGATAGGGACACC-3' y
- 3RFLP 5'-GGCATATATCATCACTGGCG-3'
(b) la digestión de la secuencia amplificada de
la etapa (a) con DraI; y
(c) la correlación de la presencia de tres
fragmentos de restricción de 626 pb, 187 pb y 135 pb con una cepa
ISU-55 del PRRSV.
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