CN109022617A - 鱼呼吸道与肠道病毒、感染性胰脏坏死病毒、鲑鱼甲病毒、感染性鲑鱼贫血病毒检测方法 - Google Patents

鱼呼吸道与肠道病毒、感染性胰脏坏死病毒、鲑鱼甲病毒、感染性鲑鱼贫血病毒检测方法 Download PDF

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Abstract

一种鱼呼吸道与肠道病毒、感染性胰脏坏死病毒、鲑鱼甲病毒、感染性鲑鱼贫血病毒检测方法。本发明涉及一种检测冷水鱼中病原菌的方法。此外，本发明并涉及用于检测冷水鱼中病原菌的寡核苷酸对。

Description

鱼呼吸道与肠道病毒、感染性胰脏坏死病毒、鲑鱼甲病毒、感 染性鲑鱼贫血病毒检测方法
此案是中国专利201510183810.X案的分案申请。
技术领域
本发明涉及在冷水鱼中检测病原菌的方法，特别是涉及使用寡核苷酸对检测冷水鱼病原菌的方法。
背景技术
冷水鱼的经济价值已达到数十亿美金，其中大西洋鲑鱼为最大的单一养殖种类，且其数量于2013年已超过150万吨。冷水鱼疾病可造成高达超过90％的死亡率，但一般较常见的死亡率为10-30％，这样的死亡率对于水产养殖业仍是巨大的负面经济因素，造成一年数亿美金的损失。这些疾病可能在生产周期的早期与晚期发生，其中发生在晚期对经济的冲击最大。
解决上述问题的关键在于，诊断冷水鱼之病原菌且采取必要措施以避免高死亡率。由于冷水鱼养殖业通常分散在偏远的沿海地区，因此本发明即提供了快速、分散的冷水鱼病原菌检测方法以供产业利用。
发明内容
于一方面，本发明涉及一种冷水鱼病原菌检测方法，包含提供一可能含有在冷水鱼中的病原菌的一或多个核苷酸序列的样本；提供一寡核苷酸引子对，所述寡核苷酸引子对定义在所述病原菌的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5’端；提供一聚合酶；在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引子对、所述聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphates,dATPs)、脱氧胞核苷三磷酸(deoxycytidinetriphosphates,dCTPs)、脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphates,dGTPs)，以及脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphates,dTTPs)，以形成一聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction,PCR)混合物；透过在一固定温度下加热所述容器的底部，使所述PCR混合物进行隔绝恒温聚合酶连锁反应(insulated isothermal polymerase chainreaction,iiPCR)，以形成一PCR产物；以及侦测所述PCR产物以辨识所述双股目标序列。
在某些具体实施例中，所述聚合酶连锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一与所述双股目标序列的一区段互补的序列、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子，当所述寡核苷酸探针未杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光抑制分子大体上抑制所述荧光分子，且当所述寡核苷酸探针杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光分子大体上未被抑制。
在某些具体实施例中，所述病原菌为Candidatus Branchiomonas cysticola，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列如SEQ ID NO:1所示，所述第二引子的序列如SEQ ID NO:2所示。在某些具体实施例中，所述聚合酶连锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，其为一介于所述病原菌CandidatusBranchiomonas cysticola的16S核糖体RNA基因(GenBank accession No.JQ723599)的第136至第225个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸。在某些较佳具体实施例中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:3所示。
在某些具体实施例中，所述病原菌为Candidatus Branchiomonas cysticola，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列选自于由SEQ IDNOs:23,25以及27所组成的群组，所述第二引子的序列选自于由SEQ ID NOs:24,26以及28所组成的群组。在某些具体实施例中，所述聚合酶连锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，其为一介于所述病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola的16S核糖体RNA基因(GenBank accession No.JQ723599)的第968至第1068个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸。在某些较佳具体实施例中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:29所示。
在某些具体实施例中，所述病原菌为鱼呼吸道与肠道病毒(piscine reovirus,PRV)，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列选自于由SEQ ID NOs:4,30,32,33以及35所组成的群组，所述第二引子的序列选自于由SEQ IDNOs:5,31,34以及36所组成的群组。在某些具体实施例中，所述聚合酶连锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，其为一介于所述病原菌PRV的L1区段基因(GenBankaccession No.GU994013)的第3178至第3287个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸。在某些较佳具体实施例中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NOs:6或37所示。
在某些具体实施例中，所述病原菌为感染性胰脏坏死病毒(infectiouspancreatic necrosis virus,IPNV)，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列如SEQ ID NO:7所示，所述第二引子的序列如SEQ ID NO:8或9所示。在某些具体实施例中，所述聚合酶连锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，其为一介于所述病原菌IPNV的A区段基因(GenBank accession No.AY379740)的第432至第519个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸。在某些较佳具体实施例中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:10所示。
在某些具体实施例中，所述病原菌为鲑鱼甲病毒(salmonid alphavirus,SAV)，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列选自于由SEQ IDNOs:11,12以及13所组成的群组，所述第二引子的序列选自于由SEQ ID NOs:14,15以及16所组成的群组。在某些具体实施例中，所述聚合酶连锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，其为一介于所述病原菌SAV的完整基因组(GenBank accession No.KC122926)的第446至第534个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸。在某些较佳具体实施例中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:17所示。
在某些具体实施例中，所述病原菌为感染性鲑鱼贫血病毒(infectious salmonanemia virus,ISAV)，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列如SEQ ID NOs:18或19所示，所述第二引子的序列如SEQ ID NO:20或21所示。在某些具体实施例中，所述聚合酶连锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，其为一介于所述病原菌ISAV的非结构蛋白与基质蛋白的基因(GenBank accession No.DQ785286)的第178至第305个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸。在某些较佳具体实施例中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NOs:22或38所示。
于一方面，本发明涉及一种用于侦测冷水鱼病原菌的寡核苷酸对。
在某些具体实施例中，所述病原菌为Candidatus Branchiomonas cysticola，且所述寡核苷酸对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列如SEQ ID NO:1所示，所述第二引子的序列如SEQ ID NO:2所示。在某些具体实施例中，所述寡核苷酸对进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述病原菌Candidatus Branchiomonascysticola的16S核糖体RNA基因(GenBank accession No.JQ723599)的第136至第225个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子。在某些较佳具体实施例中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:3所示。
在某些具体实施例中，所述病原菌为Candidatus Branchiomonas cysticola，且所述寡核苷酸对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列选自于由SEQ IDNOs:23,25以及27所组成的群组，所述第二引子的序列选自于由SEQ ID NOs:24,26以及28所组成的群组。在某些具体实施例中，所述寡核苷酸对进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola的16S核糖体RNA基因(GenBank accession No.JQ723599)的第968至第1068个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子。在某些较佳具体实施例中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:29所示。
在某些具体实施例中，所述病原菌为鱼呼吸道与肠道病毒(piscine reovirus,PRV)，且所述寡核苷酸对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列选自于由SEQID NOs:4,30,32,33以及35所组成的群组，所述第二引子的序列选自于由SEQ ID NOs:5,31,34以及36所组成的群组。在某些具体实施例中，所述寡核苷酸对进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述病原菌PRV的L1区段基因(GenBank accessionNo.GU994013)的第3178至第3287个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子。在某些较佳具体实施例中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NOs:6或37所示。
在某些具体实施例中，所述病原菌为感染性胰脏坏死病毒(infectiouspancreatic necrosis virus,IPNV)，且所述寡核苷酸对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列如SEQ ID NO:7所示，所述第二引子的序列如SEQ ID NO:8或9所示。在某些具体实施例中，所述寡核苷酸对进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述病原菌IPNV的A区段基因(GenBank accession No.AY379740)的第432至第519个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子。在某些较佳具体实施例中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:10所示。
在某些具体实施例中，所述病原菌为鲑鱼甲病毒(salmonid alphavirus,SAV)，且所述寡核苷酸对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列选自于由SEQ IDNOs:11,12以及13所组成的群组，所述第二引子的序列选自于由SEQ ID NOs:14,15以及16所组成的群组。在某些具体实施例中，所述寡核苷酸对进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述病原菌SAV的完整基因组(GenBank accession No.KC122926)的第446至第534个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子。在某些较佳具体实施例中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:17所示。
在某些具体实施例中，所述病原菌为感染性鲑鱼贫血病毒(infectious salmonanemia virus,ISAV)，且所述寡核苷酸对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列如SEQ ID NOs:18或19所示，所述第二引子的序列如SEQ ID NO:20或21所示。在某些具体实施例中，所述寡核苷酸对进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述病原菌ISAV的非结构蛋白与基质蛋白的基因(GenBank accession No.DQ785286)的第178至第305个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子。在某些较佳具体实施例中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NOs:22或38所示。
本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。
本发明系以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
附图说明
图1A所示为使用引子BCF1与BCR1进行传统PCR检测鲑鱼病原菌CandidatusBranchiomonas cysticola的结果；第1至11道：分别以1010,109,108,107,106,105,104,103,102,101,100个拷贝数的pUC57-BC质粒进行传统PCR的结果；第12道：不含DNA模板所进行之传统PCR的结果(阴性对照组)。图1B所示为使用引子BCF1、BCR1与探针BCP1进行iiPCR检测的结果；第1道：不含DNA模板所进行之iiPCR的结果(阴性对照组)；第2至7道：分别以101,102,103,104,105,106个拷贝数的pUC57-BC质粒进行iiPCR的结果。图1C所示为以iiPCR分析引子BCF1、BCR1与探针BCP1的专一性的结果；第1道：不含DNA模板所进行之iiPCR的结果(阴性对照组)；第2至8道：分别以鲑鱼鳃、SAV、IPNV、ISAV、NNV、PRV以及pUC57-BC质粒的DNA/RNA模板进行iiPCR的结果。图1D所示为使用不同引子与探针BCP2进行iiPCR检测的结果；第1与2道：以引子BCF2、BCR2与探针BCP2在不含DNA模板(第1道，阴性对照组)以及含DNA模板(第2道)下进行iiPCR的结果；第3与4道：以引子BCF3、BCR3与探针BCP2在不含DNA模板(第3道，阴性对照组)以及含DNA模板(第4道)下进行iiPCR的结果；第5与6道：以引子BCF4、BCR4与探针BCP2在不含DNA模板(第5道，阴性对照组)以及含DNA模板(第6道)下进行iiPCR的结果。图1E所示为以iiPCR分析引子BCF3、BCR3与探针BCP2的敏感度的结果；第1道：不含DNA模板所进行之iiPCR的结果(阴性对照组)；第2至8道：分别以100,101,102,103,104,105,106个拷贝数的pUC57-BC质粒进行iiPCR的结果。图1F所示为使用引子BCF3与BCR3进行实时PCR(real-time PCR)检测鲑鱼病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola，pUC57-BC质粒的结果。“M”代表分子量标记；箭头指示目标PCR产物；“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。
图2A所示为使用引子PRVF1与PRVR1进行传统PCR检测鱼呼吸道与肠道病毒(piscine reovirus,PRV)的结果；第1至6道：分别以106,105,104,103,102,101个拷贝数的pUC57-PRV质粒进行传统PCR的结果；第7道：不含DNA模板所进行之传统PCR的结果(阴性对照组)。图2B所示为使用引子PRVF1、PRVR1与探针PRVP1进行iiPCR检测的结果；第1与3道：以pUC57-PRV质粒进行之iiPCR的结果；第2与4道：在不含DNA模板下进行之iiPCR的结果(阴性对照组)。图2C所示为使用不同引子与探针PRVP1进行iiPCR检测的结果；第1与3道：以引子PRVF2、PRVR2与探针PRVP1在不含DNA模板下进行之iiPCR的结果(阴性对照组)；第2与4道：以引子PRVF2、PRVR2与探针PRVP1在含有pUC57-PRV质粒下进行之iiPCR的结果；第5与7道：以引子PRVF3、PRVR2与探针PRVP1在不含DNA模板下进行之iiPCR的结果(阴性对照组)；第6与8道：以引子PRVF3、PRVR2与探针PRVP1在含有pUC57-PRV质粒下进行之iiPCR的结果；第9与11道：以引子PRVF4、PRVR4与探针PRVP1在不含DNA模板下进行之iiPCR的结果(阴性对照组)；第10与12道：以引子PRVF4、PRVR4与探针PRVP1在含有pUC57-PRV质粒下进行之iiPCR的结果。图2D所示为以iiPCR分析引子PRVF2、PRVR2与探针PRVP1的敏感度的结果；第1道：不含DNA模板所进行之iiPCR的结果(阴性对照组)；第2至7道：分别以101,102,103,104,105,106个拷贝数的PRV体外转录RNA(in vitro transcriptional RNA)进行iiPCR的结果。图2E所示为以iiPCR分析引子PRVF3、PRVR2与探针PRVP1的敏感度的结果；第1道：不含DNA模板所进行之iiPCR的结果(阴性对照组)；第2至7道：分别以101,102,103,104,105,106个拷贝数的PRV体外转录RNA进行iiPCR的结果。图2F所示为以iiPCR分析引子PRVF5、PRVR5与探针PRVP2的敏感度的结果；第1道：不含DNA模板所进行之iiPCR的结果(阴性对照组)；第2至7道：分别以101,102,103,104,105,106个拷贝数的pUC57-PRV质粒进行iiPCR的结果。图2G所示为以iiPCR分析引子PRVF5、PRVR5与探针PRVP2的敏感度的结果；第1道：不含DNA模板所进行之iiPCR的结果(阴性对照组)；第2至7道：分别以101,102,103,104,105,106个拷贝数的PRV体外转录RNA进行iiPCR的结果。“M”代表分子量标记；箭头指示目标PCR产物；“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。
图3A所示为使用引子IPNVF1与IPNVR1进行传统PCR检测感染性胰脏坏死病毒(infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)的结果；第1至5道：分别以105,104,103,102,101个拷贝数的pTA-IPNV质粒进行传统PCR的结果；第6道：不含DNA模板所进行之传统PCR的结果(阴性对照组)。图3B所示为使用引子IPNVF1与IPNVR1进行反转录PCR(reversetranscription PCR,RT-PCR)检测IPNV的结果；第1至6道：分别以102,103,104,105,106,107稀释倍数的总RNA进行RT-PCR的结果；第7道：不含RNA样本所进行之RT-PCR的结果(阴性对照组)。图3C所示为使用不同引子进行iiPCR检测IPNV的结果；第1道：以引子IPNVF1、IPNVR1与探针IPNVP1与pTA-IPNV质粒进行iiPCR的结果；第2道：以引子IPNVF1、IPNVR1与探针IPNVP1在不含DNA模板下进行iiPCR的结果(阴性对照组)；第3道：以引子IPNVF1、IPNVR2与探针IPNVP1与pTA-IPNV质粒进行iiPCR的结果；第4道：以引子IPNVF1、IPNVR2与探针IPNVP1在不含DNA模板下进行iiPCR的结果(阴性对照组)。图3D所示为以pTA-IPNV质粒进行iiPCR分析引子IPNVF1、IPNVR1与探针IPNVP1的敏感度的结果；第1至5道：分别以105,104,103,102,101拷贝数的pTA-IPNV质粒进行iiPCR的结果；第6道：不含DNA模板所进行之iiPCR的结果(阴性对照组)。图3E所示为以体外转录RNA进行iiPCR分析引子IPNVF1、IPNVR1与探针IPNVP1的敏感度的结果；第1道：不含DNA模板所进行之iiPCR的结果(阴性对照组)；第2至7道：分别以101,102,103,104,105,106个拷贝数的IPNV体外转录RNA进行iiPCR的结果。图3F所示为以连续稀释的RNA进行iiPCR分析引子IPNVF1、IPNVR1与探针IPNVP1的敏感度的结果；第1至6道：分别以原液(100),103,104,105,106,107稀释倍数的IPNV总RNA进行iiPCR的结果；第7道：不含RNA模板所进行之iiPCR的结果(阴性对照组)。图3G所示为以iiPCR分析引子IPNVF1、IPNVR1与探针IPNVP1的专一性的结果；第6道：不含RNA模板所进行之iiPCR的结果(阴性对照组)；第1至5与7道：分别以ISAV、SAV、NNV、PRV、鲑鱼肌肉组织以及pTA-IPNV质粒的DNA/RNA模板进行iiPCR的结果。图3H所示为使用引子IPNVF1、IPNVR1进行real-time PCR检测IPNV，pTA-IPNV质粒的结果。“M”代表分子量标记；箭头指示目标PCR产物；“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。
图4A所示为使用不同引子进行iiPCR检测鲑鱼甲病毒(salmonid alphavirus,SAV)的结果；第1、3与5道：分别以引子SAVF1与SAVR1、引子SAVF2与SAVR2、以及引子SAVF3与SAVR3在不含pTA-SAV质粒下进行iiPCR的结果(阴性对照组)；第2、4与6道：分别以引子SAVF1与SAVR1、引子SAVF2与SAVR2、以及引子SAVF3与SAVR3在含有pTA-SAV质粒下进行iiPCR的结果。图4B所示为以pTA-SAV质粒进行iiPCR分析引子SAVF1、SAVR1与探针SAVP1的敏感度的结果；第1至5道：分别以105,104,103,102,101个拷贝数的pTA-SAV质粒进行iiPCR的结果；第6道：不含DNA模板所进行之iiPCR的结果(阴性对照组)。图4C所示为以SAV的体外转录RNA进行iiPCR分析引子SAVF1、SAVR1与探针SAVP1的敏感度的结果；第1道：不含DNA模板所进行之iiPCR的结果(阴性对照组)；第2至7道：分别以101,102,103,104,105,106个拷贝数的SAV的体外转录RNA进行iiPCR的结果。图4D所示为以连续稀释的SAV总RNA进行iiPCR分析引子SAVF1、SAVR1与探针SAVP1的敏感度的结果；第1道：含有DNA模板所进行之iiPCR的结果(阳性对照组)；第2至6道：分别以101,103,104,105,106稀释倍数的SAV RNA进行iiPCR的结果；第7道：不含RNA模板所进行之iiPCR的结果(阴性对照组)。图4E所示为使用引子SAVF1、SAVR1进行real-time PCR检测SAV，pTA-SAV质粒的结果。“M”代表分子量标记；箭头指示目标PCR产物；“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。
图5A所示为使用引子ISAVF1与ISAVR1进行传统PCR检测感染性鲑鱼贫血病毒(infectious salmon anemia virus,ISAV)的结果；第1至5道：分别以105,104,103,102,101个拷贝数的pTA-ISAV质粒进行传统PCR的结果；第6道：不含DNA模板所进行之传统PCR的结果(阴性对照组)。图5B所示为使用不同引子与探针ISAVP1进行iiPCR检测的结果；第1、3、5与7道：分别以引子ISAVF1与ISAVR1、引子ISAVF1与ISAVR2、引子ISAVF2与ISAVR2，以及引子ISAVF2与ISAVR1在含有pTA-ISAV质粒下进行iiPCR的结果；第2、4、6与8道：分别以引子ISAVF1与ISAVR1、引子ISAVF1与ISAVR2、引子ISAVF2与ISAVR2，以及引子ISAVF2与ISAVR1在不含pTA-ISAV质粒下进行iiPCR的结果(阴性对照组)。图5C所示为以pTA-ISAV质粒进行iiPCR分析引子ISAVF1、ISAVR1与探针ISAVP2的敏感度的结果；第1道：不含DNA模板所进行之iiPCR的结果(阴性对照组)；第2至7道：分别以101,102,103,104,105,106个拷贝数的pTA-ISAV质粒进行iiPCR的结果。图5D所示为以连续稀释的SAV总RNA进行iiPCR分析引子ISAVF1、ISAVR1与探针ISAVP2的敏感度的结果；第1道：不含RNA模板所进行之iiPCR的结果(阴性对照组)；第2至7道：分别以107,106,105,104,103,102稀释倍数的ISAV总RNA进行iiPCR的结果。图5E所示为以iiPCR分析引子ISAVF1、ISAVR1与探针ISAVP2的专一性的结果；第1道：不含RNA模板所进行之iiPCR的结果(阴性对照组)；第2至7道：分别以SAV、IPNV、NNV、PRV、鲑鱼肌肉组织，以及pTA-ISAV质粒的DNA/RNA模板进行iiPCR的结果。图5F所示为使用引子ISAVF1、ISAVR1进行real-time PCR检测ISAV，pTA-ISAV质粒的结果。“M”代表分子量标记；箭头指示目标PCR产物；“+”表示在所述样本中侦测到荧光讯号，而“-”表示在所述样本中未侦测到荧光讯号。
具体实施方式
于一方面，本发明涉及一种冷水鱼病原菌检测方法。在某些具体实施例中，所述方法为聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction,PCR)。在某些具体实施例中，所述方法为反转录聚合酶连锁反应(reverse-transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)。在某些具体实施例中，所述方法为隔绝恒温聚合酶连锁反应(insulated isothermalpolymerase chain reaction,iiPCR)。在某些具体实施例中，所述方法为实时聚合酶连锁反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)。
于一方面，本发明涉及一种冷水鱼病原菌检测方法，包含:
提供一可能含有在冷水鱼中的病原菌的一或多个核苷酸序列的样本；
提供一寡核苷酸引子对，所述寡核苷酸引子对定义在所述病原菌的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5’端；
提供一聚合酶；
在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引子对、所述聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(dATPs)、脱氧胞核苷三磷酸(dCTPs)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTPs)，以及脱氧胸苷三磷酸(dTTPs)，以形成一聚合酶连锁反应(PCR)混合物；
透过在一固定温度下加热所述容器的底部，使所述PCR混合物进行隔绝恒温聚合酶连锁反应(iiPCR)，以形成一PCR产物；以及
侦测所述PCR产物以辨识所述双股目标序列。
于另一方面，本发明涉及一种冷水鱼病原菌检测方法，包含:
提供一可能含有在冷水鱼中的病原菌的一或多个核苷酸序列的样本；
提供一寡核苷酸引子对，所述寡核苷酸引子对定义在所述病原菌的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5’端；
提供一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一与所述双股目标序列的一区段互补的序列、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子，当所述寡核苷酸探针未杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光抑制分子大体上抑制所述荧光分子，且当所述寡核苷酸探针杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光分子大体上未被抑制；
提供一聚合酶；
在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引子对、所述聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(dATPs)、脱氧胞核苷三磷酸(dCTPs)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTPs)，以及脱氧胸苷三磷酸(dTTPs)，以形成一聚合酶连锁反应(PCR)混合物；
透过在一固定温度下加热所述容器的底部，使所述PCR混合物进行隔绝恒温聚合酶连锁反应(iiPCR)，以形成一PCR产物；以及
侦测所述PCR产物以辨识所述双股目标序列。
于又一方面，本发明涉及一种用于侦测冷水鱼病原菌的寡核苷酸对。
于再一方面，本发明涉及一种用于侦测冷水鱼病原菌的寡核苷酸对与寡核苷酸探针。
应当进一步理解的是，在某些具体实施例中，本文揭露的寡核苷酸对及/或寡核苷酸探针可用于各种基础PCR技术之变异，例如但不限于，反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR)、隔绝恒温聚合酶连锁反应(iiPCR)、实时聚合酶连锁反应(real-time PCR)、巢式聚合酶连锁反应(nested PCR)，以及热不对称性交错聚合酶连锁反应(thermal asymmetricinterlaced PCR,TAIL-PCR)。
如本文所用，术语「冷水」意指在北半球及南半球水温介于冬天为冰冻且夏天最高达15-20℃之间的水域。冷水鱼包含鲑鱼，例如但不限于，大西洋鲑鱼、银鲑鱼、帝王鲑(Chinook salmon)以及虹鳟鱼，此外海洋物种例如大比目鱼、鳕鱼及比目鱼。在某些具体实施例中，所述冷水鱼为鲑鱼。
如本文所用，术语「冷水鱼病原菌」意指在冷水鱼中发现的病毒性、细菌性及寄生性病原菌。冷水鱼病原菌的例子如，但不限于：a)病毒：感染性胰脏坏死病毒(infectiouspancreatic necrosis virus,IPNV)、鲑鱼胰腺病病毒(Salmon pancreas disease virus,SPDV)、感染性鲑鱼贫血病毒(infectious salmon anemia virus,ISAV)、鱼呼吸道与肠道病毒(piscine reovirus,PRV，造成心脏及骨骼肌炎症heart and muscle inflammation,HSMI)、感染性造血器官坏死病毒(infectious haematopoietic necrosis virus,IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV)、神经坏死病毒(viral nervous necrosis virus,VNNV)；b)细菌：鲑鱼肾菌(Renibacteriumsalmoninarum，造成细菌性肾病bacterial kidney disease,BKD)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、鲑弧菌(Vibrio salmonicida)、鲑产气单胞菌(Aeromonas salmonicida)、柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、鳟鱼红嘴病耶氏杆菌(Yersinia ruckeri)、鲑鱼病原菌(Candidatus Branchiomonas cysticola)；c)寄生虫：佩鲁兰新副变形虫(Neoparamoeba perurans，造成阿米巴鳃病amoebic gill disease,AGD)、脑黏体虫(Myxosoma cerebralis)，以及海虱(sea lice)。
如本文所用，术语「隔绝恒温聚合酶连锁反应(iiPCR)」意指一种聚合酶连锁反应，其中，在一试管中的自发性液体对流是受到温度梯度所驱动，所述温度梯度是单纯透过自所述试管底部以一固定温度加热而形成。因此，反应成分循环经过温度梯度的各区域，而PCR的变性、黏合，以及延伸步骤分别发生于所述试管的底部、顶部及中间区域。隔绝恒温聚合酶连锁反应(iiPCR)的详细描述请参见如，Chang et al.,Biotech J.(2012)7:662-666；Tsai et al.,J.Virol.Methods(2012)181:134-137；美国专利号8,187,813以及8,574,516；美国公开专利申请案号2012/0094373、2012/0309083、2013/0023010，以及2013/0217112皆以引用的方式将其整体并入本文。
如本文所用，术语「荧光分子」意指一物质或其一部份，其系能够在可侦测的范围内显示荧光。如本文所用，术语「荧光抑制分子」意指一物质或其一部份，其系能够抑制当由一光源激发时由所述荧光分子所发射的荧光。在某些具体实施例中，术语「荧光分子」与「荧光抑制分子」为TaqManTM分析试剂盒(Applied Biosystems Inc.，加州，美国)的荧光分子与荧光抑制分子。TaqManTM分析试剂盒的详细描述请参见如，Holland et al.,Proc.Natl.Acad.Sci,U.S.A.(1991)88:7276-7280；美国专利号5,538,848、5,723,591、5,876,930，以及7,413,708皆以引用的方式将其整体并入本文。
所述荧光分子的例子包括，但不限于，3-(ε-羧)-3'-乙基-5,5'-二甲基己羰花青(3-(ε-carboxypentyl)-3'-ethyl-5,5'-dimethyloxa-carbocyanine,CYA)、6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein,FAM)、5,6-羧基罗丹明-L LO(5,6-carboxyrhodamine-l lO,R110)、6羧基罗丹明-6G(6-carboxyrhodamine-6G,R6G)、N'，N'，N'，N'-四甲基-6-羧基罗丹明(N’,N’,N’,N’-tetramethyl-6-carboxyrhodamine,TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(6-carboxy-X-rhodamine,ROX)、2'，4'，5'，T，-四氯4-7-二氯荧光素(2’,4’,5’,T,-tetrachloro-4-7-dichlorofluorescein,TET)、2'，7-二甲氧基-4'，5'-6羧基罗丹明(2’,7-dimethoxy-4’,5’-6carboxyrhodamine,JOE)、6-羧基-2'，4,4'，5'，7,7'-六氯荧光素(6-carboxy-2’,4,4’,5’,7,7’-hexachlorofluorescein,HEX)、ALEXA荧光、Cy3荧光与Cy5荧光。所述荧光抑制分子的例子包括，但不限于，4-(4'-二甲基氨基-苯偶氮基)苯甲酸(4-(4’-dimethylamino-phenylazo)-benzoic acid,Dabcyl)、黑洞荧光抑制剂1(Black HoleQuencher 1,BHQ1)、黑洞荧光抑制剂2(Black Hole Quencher 2,BHQ2)、黑洞荧光抑制剂3(Black Hole Quencher 3,BHQ3)、四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine,TAMRA)。在某些具体实施例中，所述荧光分子为6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein,FAM)，且所述荧光抑制分子为二氢环吡咯并吲哚三肽小沟结合物(dihydro cyclo pyrrolo indoletripeptide minor groove binder,MGB)。
除非本文另有定义，否则用以与本文结合的科学与技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。本发明的方法与技术一般可根据本领域已知的常规方法进行。一般而言，本文所描述之用以连结以下技术的命名法，以及生物化学、酵素学、分子及细胞生物学、微生物学、遗传学与蛋白质及核酸化学及杂合反应的技术皆为本领域已知且经常使用者。除非另有说明，本发明的方法与技术一般可根据本领域已知的常规方法进行，且被描述于在本说明书中被引用且讨论的各种一般及更具体的参考文献中。
本发明进一步透过以下的实施例阐释，其不应以任何方式被解释为进一步的限缩。本申请案中引用的所有引用文件(包括参考文献、核准的专利、公开的专利申请，以及一同在申请中的专利申请案)的整体内容，在此透过引用的方式明确地并入本案中。
实施例
实施例1病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola的检测
病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola的16S核糖体RNA基因(GenBankaccession No.JQ723599)被插入pUC57选殖载体中(Thermo公司，麻州，美国)，以得到pUC57-BC质粒。
1.以引子BCF1与BCR1进行传统PCR
进行传统PCR所用的50μl PCR混合物含有：稀释的pUC57-BC质粒(分别为1010,109,108,107,106,105,104,103,102,101,100个拷贝数)、0.01-2μM前置引子BCF1(SEQ ID NO:1)、0.01-2μM后置引子BCR1(SEQ ID NO:2)、0.2μM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于PC818,Astec Co.Ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)在TAE缓冲液(40mM Tris,20mMacetic acid,1mM EDTA)中分析，并且以溴化乙锭(ethidium bromide)染色显现。
传统PCR的结果如图1A所示。如图1A所示，第1至9道的条带显示，本发明的引子BCF1与BCR1正确地扩增90-bp的目标序列，而在阴性对照组中则无目标序列被扩增(第12道)。所述结果表明，所述引子对可用于传统PCR扩增反应以检测CandidatusBranchiomonas cysticola的存在。
2.以引子BCF1、BCR1以及探针BCP1进行iiPCR
50μl的PCR混合物含有pUC57-BC质粒(分别为100,101,102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μM前置引子BCF1(SEQ ID NO:1)、0.01-2μM后置引子BCR1(SEQ ID NO:2)、0.01-2μM探针BCP1(5’FAM-CAGGCTTTCCTCTCCCA-MGB 3’,SEQ ID NO:3)、1X qPCR缓冲液以及1-5UTaq DNA聚合酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一iiPCR仪中一段指定的时间(约1小时)。以所述iiPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。此外，扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液中分析，并且以溴化乙锭染色显现。
iiPCR的结果如图1B所示。如图1B所示，第2至7道的条带显示，本发明的引子及探针正确地扩增90-bp的目标序列(如箭头所指)，而在阴性对照组中则无目标序列被扩增(第1道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在阴性对照组中则未侦测到荧光讯号。
此外，重复上述iiPCR分析试验6次(n＝6)以评估引子BCF1(SEQ ID NO:1)、BCR1(SEQ ID NO:2)与探针BCP1(SEQ ID NO:3)的敏感度。敏感度测试的结果如表1所示。
表1引子BCF1、BCR1与探针BCP1的敏感度测试结果(n＝6)
DNA拷贝数 阴性对照组 101 102 103 104 105 106
阳性率％ 0 17 50 100 100 100 100
以下列iiPCR分析引子BCF1(SEQ ID NO:1)、BCR1(SEQ ID NO:2)与探针BCP1(SEQID NO:3)的专一性。50μl的PCR混合物含有自鲑鱼鳃抽取的DNA样本或不同鱼类病原菌的DNA/RNA模板(分别为SAV、IPNV、ISAV、NNV、PRV以及pUC57-BC质粒)、0.01-2μM前置引子BCF1(SEQ ID NO:1)、0.01-2μM后置引子BCR1(SEQ ID NO:2)、0.01-2μM探针BCP1(5’FAM-CAGGCTTTCCTCTCCCA-MGB 3’,SEQ ID NO:3)、1X qPCR缓冲液以及1-5U Taq DNA聚合酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一iiPCR仪中一段指定的时间(约1小时)。以所述iiPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。此外，扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液中分析，并且以溴化乙锭染色显现。
iiPCR的结果如图1C所示。如图1C所示，只有在含有Candidatus Branchiomonascysticola DNA模板的样本中(第8道)可以正确地扩增90-bp的目标序列(如箭头所指)，而含有鲑鱼鳃、SAV、IPNV、ISAV、NNV或PRV的DNA/RNA模板的样本中则无目标序列被扩增(第1至7道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在第1至7道中则未侦测到荧光讯号。
3.以引子BCF2、BCR2、BCF3、BCR3、BCF4、BCR4以及探针BCP2进行iiPCR
50μl的PCR混合物含有pUC57-BC质粒(108个拷贝数)、0.01-2μM前置引子BCF2(SEQID NO:23)或BCF3(SEQ ID NO:25)或BCF4(SEQ ID NO:27)、0.01-2μM后置引子BCR2(SEQ IDNO:24)或BCR3(SEQ ID NO:26)或BCR4(SEQ ID NO:28)、0.01-2μM探针BCP2(5’FAM-CGGCGTGCCTGAGAA-MGB 3’,SEQ ID NO:29)、1X qPCR缓冲液以及1-5U Taq DNA聚合酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一iiPCR仪中一段指定的时间(约1小时)。以所述iiPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。此外，扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液中分析，并且以溴化乙锭染色显现。
iiPCR的结果如图1D所示。如图1D所示，第2、4、6道的条带显示，引子BCF2(SEQ IDNO:23)与BCR2(SEQ ID NO:24)、BCF3(SEQ ID NO:25)与BCR3(SEQ ID NO:26)、BCF4(SEQ IDNO:27)与BCR4(SEQ ID NO:28)分别正确地扩增100-bp、75-bp以及100-bp的目标序列(如箭头所指)，而在阴性对照组中则无目标序列被扩增(第1、3、5道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在阴性对照组中则未侦测到荧光讯号。所述结果表明，引子BCF2、BCR2、BCF3、BCR3、BCF4、BCR4以及探针BCP2可用于iiPCR扩增反应以检测Candidatus Branchiomonas cysticola的存在。
此外，以不同拷贝数(分别为100,101,102,103,104,105,106个拷贝数)的DNA模板pUC57-BC质粒重复上述iiPCR分析试验7次(n＝7)以评估引子BCF3(SEQ ID NO:25)、BCR3(SEQ ID NO:26)与探针BCP2(SEQ ID NO:29)的敏感度。敏感度测试的结果如表2及图1E所示。
表2引子BCF3、BCR3与探针BCP2的敏感度测试结果(n＝7)
DNA拷贝数 101 102 103 104 105 106
阳性率％ 42.9 100 100 100 100 100
如图1E所示，第3至8道的条带显示，所述引子可正确地扩增75-bp的目标序列(如箭头所指)，而在阴性对照组与100个拷贝数的pUC57-BC质粒样本中则无目标序列被扩增(第1与2道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在第1与2道中则未侦测到荧光讯号。
4.以引子BCF3、BCR3以及探针BCP2进行实时PCR
以稀释的pUC57-BC质粒(分别为101,102,103,104,105,106个拷贝数)于一实时PCR仪(例如，但不限于ABI StepOnePlusTM；Applied BioSystem,Life Technologies，加州，美国)中进行实时PCR分析。以含有2μl pUC57-BC质粒、0.01-2μM前置引子BCF3(SEQ ID NO:25)、0.01-2μM后置引子BCR3(SEQ ID NO:26)、0.01-2μM探针BCP2(5’FAM-CGGCGTGCCTGAGAA-MGB 3’,SEQ ID NO:29)总体积为20μl的商用RT-PCR试剂盒(例如，但不限于，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit；Takara Bio Inc.，日本)进行实时PCR分析。实时PCR的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果。
如图1F所示，计算连续稀释(10倍)的pUC57-BC质粒的实时PCR分析的标准曲线。至少10个拷贝数的pUC57-BC质粒可被侦测到。所述标准曲线的R2值为0.994，表示本发明的引子对与探针可以被用于实时PCR，并产生可信的结果。
所述结果表明，本发明的引子对与探针可用于iiPCR扩增反应以检测CandidatusBranchiomonas cysticola的存在，并且具有高度敏感度及专一性。
实施例2病原菌鱼呼吸道与肠道病毒(PRV)的检测
病原菌鱼呼吸道与肠道病毒(PRV)的L1区段基因(GenBank登录号GU994013)被插入pUC57选殖载体中(Thermo)，以得到pUC57-PRV质粒。
此外，透过使用一商用试剂盒(例如，但不限于， Kit；Thermo FisherScientific，麻州，美国)对PRV的L1区段基因的DNA序列进行转录，以制备PRV的体外转录RNA模板。
1.以引子PRVF1与PRVR1进行传统PCR
进行传统PCR所用的50μl PCR混合物含有：稀释的pUC57-PRV质粒(分别为106,105,104,103,102,101个拷贝数)、0.01-2μM前置引子PRVF1(SEQ ID NO:4)、0.01-2μM后置引子PRVR1(SEQ ID NO:5)、0.2μM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于PC818,Astec Co.Ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液中分析，并且以溴化乙锭(ethidium bromide)染色显现。
传统PCR的结果如图2A所示。如图2A所示，第1至3道的条带显示，本发明的引子PRVF1与PRVR1正确地扩增86-bp的目标序列，而在阴性对照组中则无目标序列被扩增(第7道)。所述结果表明，所述引子对可用于传统PCR扩增反应以检测鱼呼吸道与肠道病毒(PRV)的存在。
2.以引子PRVF1、PRVR1、PRVF2、PRVR2、PRVF3、PRVF4、PRVR4以及探针PRVP1进行iiPCR
50μl的PCR混合物含有pUC57-PRV质粒、0.01-2μM前置引子PRVF1(SEQ ID NO:4)或PRVF2(SEQ ID NO:30)或PRVF3(SEQ ID NO:32)或PRVF4(SEQ ID NO:33)、0.01-2μM后置引子PRVR1(SEQ ID NO:5)或PRVR2(SEQ ID NO:31)或PRVR4(SEQ ID NO:34)、0.01-2μM探针PRVP1(5’FAM-CTCCAGGAGTCATTGTC-MGB 3’,SEQ ID NO:6)、1X qPCR缓冲液以及1-5U TaqDNA聚合酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一iiPCR仪中一段指定的时间(约1小时)。以所述iiPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。此外，扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液中分析，并且以溴化乙锭染色显现。
iiPCR的结果如图2B所示。如图2B所示，第1及3道的条带显示，本发明的引子PRVF1(SEQ ID NO:4)及PRVR1(SEQ ID NO:5)正确地扩增86-bp的目标序列(如箭头所指)，而在阴性对照组中则无目标序列被扩增(第2及4道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在阴性对照组中则未侦测到荧光讯号。
如图2C所示，第2、4、6、8、10及12道的条带显示，本发明的引子primers PRVF2(SEQID NO:30)与PRVR2(SEQ ID NO:31)、PRVF3(SEQ ID NO:32)与PRVR2(SEQ ID NO:31)、PRVF4(SEQ ID NO:33)与PRVR4(SEQ ID NO:34)分别正确地扩增89-bp、83-bp以及100-bp的目标序列(如箭头所指)，而在阴性对照组中则无目标序列被扩增(第1、3、5、7、9及11道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在阴性对照组中则未侦测到荧光讯号。
此外，以不同拷贝数(分别为101,102,103,104,105,106个拷贝数)的PRV体外转录RNA模板重复上述iiPCR分析试验，以评估引子PRVF2(SEQ ID NO:30)与PRVR2(SEQ ID NO:31)、PRVF3(SEQ ID NO:32)与PRVR2(SEQ ID NO:31)以及探针PRVP1(SEQ ID NO:6)的敏感度。敏感度测试的结果分别如图2D(针对引子PRVF2、PRVR2以及探针PRVP1)及表3与图2F(针对引子PRVF3、PRVR2以及探针PRVP1)所示。
如图2D所示，第4至7道的条带显示，所述引子PRVF2及PRVR2可正确地扩增89-bp的目标序列(如箭头所指)，而在阴性对照组与101及102个拷贝数的体外转录RNA中则无目标序列被扩增(第1、2与3道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在第1、2与3道中则未侦测到荧光讯号。
如图2E所示，第3至7道的条带显示，所述引子PRVF3及PRVR2可正确地扩增83-bp的目标序列(如箭头所指)，而在阴性对照组与101个拷贝数的体外转录RNA中则无目标序列被扩增(第1与2道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在第1与2道中则未侦测到荧光讯号。重复此敏感性试验8次(n＝8)的统计数据如表3所示。
表3引子PRVF3、PRVR2与探针PRVP1的敏感度测试结果(n＝8)
RNA拷贝数 101 102 103 104 105 106
阳性率％ 1.25 3.75 75 100 100 100
3.以引子PRVF5、PRVR5以及探针PRVP2进行iiPCR
50μl的PCR混合物含有pUC57-PRV质粒(分别为101,102,103,104,105,106个拷贝数)或PRV体外转录RNA模板(分别为101,102,103,104,105,106个拷贝数)、0.01-2μM前置引子PRVF5(SEQ ID NO:35)、0.01-2μM后置引子PRVR5(SEQ ID NO:36)、0.01-2μM探针PRVP2(5’FAM-CAATGGGATGCTAACACTC-MGB 3’,SEQ ID NO:37)、1X qPCR缓冲液以及1-5U Taq DNA聚合酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一iiPCR仪中一段指定的时间(约1小时)。以所述iiPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。此外，扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液中分析，并且以溴化乙锭染色显现。iiPCR的结果分别如图2F(针对DNA质粒)及表4与图2G(针对体外转录RNA)所示。
如图2F及图2G所示，第3至7道的条带显示，所述引子对可正确地扩增72-bp的目标序列(如箭头所指)，而在阴性对照组与101个拷贝数的pUC57-PRV质粒(图2F，第1与2道)或体外转录RNA(图2G，第1与2道)中则无目标序列被扩增。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在图2F或图2G中的第1与2道中则未侦测到荧光讯号。以PRV体外转录RNA模板重复此敏感性试验4次(n＝4)的统计数据如表4所示。
表4引子PRVF5、PRVR5与探针PRVP2的敏感度测试结果(n＝4)
RNA拷贝数 101 102 103 104 105 106
阳性率％ 0 75 100 100 100 100
所述结果表明，本发明的引子对与探针可用于iiPCR扩增反应以检测鱼呼吸道与肠道病毒(PRV)的存在，并且具有高度敏感度。
实施例3病原菌感染性胰脏坏死病毒(IPNV)的检测
病原菌感染性胰脏坏死病毒(IPNV)的A区段基因(GenBank登录号AY379740)被插入T&ATM选殖载体中(Yeastern biotech，台湾)，以得到pTA-IPNV质粒。
透过使用一商用试剂盒(例如，但不限于， Kit；Thermo FisherScientific，麻州，美国)对IPNV的A区段基因的DNA序列进行转录，以制备IPNV的体外转录RNA模板。
此外，收集来自养殖场的鲑鱼病毒样本，并进行测试以评估iiPCR与实时PCR用于野外样本上的表现。来自鲑鱼养殖场的鲑鱼被诊断得到感染性胰脏坏死病毒(IPNV)。藉由使用商业试剂盒(例如，但不限于FavorPrepTM病毒核酸萃取试剂盒；Favorgen BiotechCorp.，台湾)萃取来自组织的RNA萃取物。以在波长260/280nm下测量吸光率来评估总RNA的纯度。
1.传统PCR
进行传统PCR所用的50μl PCR混合物含有：稀释的pTA-IPNV质粒(分别为105,104,103,102,101个拷贝数)、0.01-2μM前置引子IPNVF1(SEQ ID NO:7)、0.01-2μM后置引子IPNVR1(SEQ ID NO:8)、0.2μM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于PC818,Astec Co.Ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液中分析，并且以溴化乙锭染色显现。
传统PCR的结果如图3A所示。如图3A所示，第1至4道的条带显示，本发明的引子IPNVF1与IPNVR1正确地扩增83-bp的目标序列，而在阴性对照组中则无目标序列被扩增(第6道)。所述结果表明，所述引子对可用于传统PCR扩增反应以检测感染性胰脏坏死病毒(IPNV)的存在。
2.反转录PCR(RT-PCR)
藉由使用商业试剂盒(例如，但不限于One step RT-PCR kit；LTK Biolab，台湾)以来自得到感染性胰脏坏死病毒(IPNV)的鱼类而来的总RNA萃取物、0.01-2μM前置引子IPNVF1(SEQ ID NO:7)、0.01-2μM后置引子IPNVR1(SEQ ID NO:8)进行反转录PCR。反转录PCR于42℃进行30分钟后，接着进行以下PCR程序：94℃10分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒，以及在72℃下延长30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液中分析，并且以溴化乙锭染色显现。
反转录PCR的结果如图3B所示。如图3B所示，第1至4道的条带显示，本发明的引子IPNVF1与IPNVR1正确地扩增83-bp的目标序列，而在阴性对照组中则无目标序列被扩增(第6道)。所述结果表明，所述引子对可用于传统PCR扩增反应以检测感染性胰脏坏死病毒(IPNV)的存在。
3.iiPCR
50μl的PCR混合物含有pTA-IPNV质粒、0.01-2μM前置引子IPNVF1(SEQ ID NO:7)、0.01-2μM后置引子IPNVR1(SEQ ID NO:8)或IPNVR2(SEQ ID NO:9)、0.01-2μM探针IPNVP1(5’FAM-ACGCTCAACGCTGCCA-MGB 3’,SEQ ID NO:10)、1X qPCR缓冲液以及1-5U Taq DNA聚合酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一iiPCR仪中一段指定的时间(约1小时)。以所述iiPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。此外，扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液中分析，并且以溴化乙锭染色显现。
iiPCR的结果如图3C所示。如图3C所示，第1及3道的条带显示，本发明的引子IPNVF1与IPNVR1、引子IPNVF1与IPNVR2分别正确地扩增83-bp、88-bp的目标序列(如箭头所指)，而在阴性对照组中则无目标序列被扩增(第2及4道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在阴性对照组中则未侦测到荧光讯号。
此外，以不同拷贝数(分别为101,102,103,104,105个拷贝数)的pTA-IPNV DNA质粒，或以不同拷贝数(分别为101,102,103,104,105,106个拷贝数)的IPNV体外转录RNA模板，或以来自得到感染性胰脏坏死病毒(IPNV)的鱼类而来的总RNA萃取物(分别为原液与稀释至10-3,10-4,10-5,10-6,10-7倍数)，重复上述iiPCR分析试验，以评估引子IPNVF1(SEQ ID NO:7)与IPNVR1(SEQ ID NO:8)以及探针IPNVP1(SEQ ID NO:10)的敏感度。以总RNA萃取物进行iiPCR分析的试验，还加入50U MMLV RTase与4U RNase抑制剂至反应物中。敏感度测试的结果分别如图3D、3E、3F所示。
如图3D所示，第1至5道的条带显示，所述引子IPNVF1与IPNVR1可正确地扩增83-bp的目标序列(如箭头所指)，而在阴性对照组中则无目标序列被扩增(第6道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在第6道中则未侦测到荧光讯号。
如图3E所示，第4至7道的条带显示，所述引子IPNVF1与IPNVR1可正确地扩增83-bp的目标序列(如箭头所指)，而在阴性对照组与101及102个拷贝数的体外转录RNA中则无目标序列被扩增(第1、2与3道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在第1、2与3道中则未侦测到荧光讯号。
如图3F所示，第1、2、3及8道的条带显示，所述引子IPNVF1与IPNVR1可正确地扩增83-bp的目标序列(如箭头所指)，而在稀释至10-5、10-6、10-7倍的RNA样本与阴性对照组中则无目标序列被扩增(第4、5、6与7道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在稀释至10-5、10-6、10-7倍的RNA样本与阴性对照组中则未侦测到荧光讯号。重复此PRV的RNA样本的敏感性试验5次(n＝5)的统计数据如表5所示。
表5引子IPNVF1、IPNVR1与探针IPNVP1的敏感度测试结果(n＝5)
RNA稀释倍数 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1
阳性率％ 0 0 0 20 100 100 100
以萃取自鲑鱼肌肉组织的DNA萃取物以及不同鱼类病原菌的DNA/RNA模板(分别为ISAV、SAV、NNV、PRV以及IPNV)进行iiPCR，以分析引子IPNVF1(SEQ ID NO:7)、IPNVR1(SEQID NO:8)与探针IPNVP1(SEQ ID NO:10)的专一性。
iiPCR的结果如图3G所示。如图3G所示，只有在含有IPNV的RNA模板的样本中(第7道)可以正确地扩增83-bp的目标序列(如箭头所指)，而含ISAV、SAV、NNV、PRV、IPNV的DNA/RNA模板以及萃取自鲑鱼肌肉组织的DNA萃取物的样本中则无目标序列被扩增(第1至6道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在第1至6道中则未侦测到荧光讯号。
4.实时PCR
以稀释的pTA-IPNV质粒(分别为101,102,103,104,105,106个拷贝数)于一实时PCR仪(例如，但不限于ABI StepOnePlusTM；Applied BioSystem,Life Technologies，加州，美国)中进行实时PCR分析。以含有2μl pTA-IPNV质粒、0.01-2μM前置引子IPNVF1(SEQ ID NO:7)、0.01-2μM后置引子IPNVR1(SEQ ID NO:8)、0.01-2μM探针IPNVP1(5’FAM-ACGCTCAACGCTGCCA-MGB 3’,SEQ ID NO:10)总体积为20μl的商用RT-PCR试剂盒(例如，但不限于，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit；Takara Bio Inc.，日本)进行实时PCR分析。实时PCR的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果。
如图3H所示，计算连续稀释(10倍)的pTA-IPNV质粒的实时PCR分析的标准曲线。至少10个拷贝数的pTA-IPNV质粒可被侦测到。所述标准曲线的R2值为0.99795，表示本发明的引子对与探针可以被用于实时PCR，并产生可信的结果。
所述结果表明，本发明的引子对与探针可用于iiPCR扩增反应以检测感染性胰脏坏死病毒(IPNV)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。
实施例4病原菌鲑鱼甲病毒(SAV)的检测
病原菌鲑鱼甲病毒(SAV)的完整基因组(GenBank登录号KC122926)的一段984-bp部分序列(自第33至1016个核苷酸)被插入T&ATM选殖载体中(Yeastern biotech，台湾)，以得到pTA-IPNV质粒。
透过使用一商用试剂盒(例如，但不限于， Kit；Thermo FisherScientific，麻州，美国)对SAV的所述984-bp部分序列的DNA序列进行转录，以制备SAV的体外转录RNA模板。
此外，收集来自养殖场的鲑鱼心脏组织，并进行测试以评估iiPCR用于野外样本上的表现。来自鲑鱼养殖场的鲑鱼被诊断得到鲑鱼甲病毒(SAV)。藉由使用商业试剂盒(例如，但不限于FavorPrepTM病毒核酸萃取试剂盒；Favorgen Biotech Corp.，台湾)萃取来自组织的RNA萃取物。以在波长260/280nm下测量吸光率来评估总RNA的纯度。
1.iiPCR
50μl的PCR混合物含有pTA-SAV质粒、0.01-2μM前置引子SAVF1、SAVF2或SAVF3(分别为SEQ ID NOs:11、12或13)、0.01-2μM后置引子SAVR1、SAVR2或SAVR3(分别为SEQ IDNOs:14、15或16)、0.01-2μM探针SAVP1(5’FAM-CGTGAGTTGTAAAGTAAAG-MGB 3’,SEQ ID NO:17)、1XqPCR缓冲液以及1-5U Taq DNA聚合酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一iiPCR仪中一段指定的时间(约1小时)。以所述iiPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。此外，扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液中分析，并且以溴化乙锭染色显现。
iiPCR的结果如图4A所示。如图4A所示，第2、4及6道的条带显示，本发明的引子primers SAVF1与SAVR1、SAVF2与SAVR2、SAVF3与SAVR3分别正确地扩增70-bp、85-bp以及70-bp的目标序列(如箭头所指)，而在阴性对照组中则无目标序列被扩增(第1、3及5道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在阴性对照组中则未侦测到荧光讯号。
此外，以不同拷贝数(分别为101,102,103,104,105个拷贝数)的pTA-SAV DNA质粒，或以不同拷贝数(分别为101,102,103,104,105,106个拷贝数)的SAV体外转录RNA模板，或以来自得到鲑鱼甲病毒(SAV)的鱼类而来的总RNA萃取物(分别为原液与稀释至10-1,10-3,10-4,10-5,10-6倍数)，重复上述iiPCR分析试验，以评估引子SAVF1(SEQ ID NO:11)与SAVR1(SEQ ID NO:14)以及探针SAVP1(SEQ ID NO:17)的敏感度。以总RNA萃取物进行iiPCR分析的试验，还加入50U MMLV RTase与4U RNase抑制剂至反应物中。敏感度测试的结果分别如图4B、4C、4D所示。
如图4B所示，第1至4道的条带显示，所述引子SAVF1与SAVR1可正确地扩增70-bp的目标序列(如箭头所指)，而在101拷贝数的pTA-SAV DNA质粒以及阴性对照组中则无目标序列被扩增(第5与6道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在第5与6道中则未侦测到荧光讯号。
如图4C所示，第3至7道的条带显示，所述引子SAVF1与SAVR1可正确地扩增70-bp的目标序列(如箭头所指)，而在阴性对照组与101个拷贝数的SAV体外转录RNA中则无目标序列被扩增(第1与2道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在第1与2道中则未侦测到荧光讯号。
如图4D所示，第1至6道的条带显示，所述引子SAVF1与SAVR1可正确地扩增70-bp的目标序列(如箭头所指)，而在阴性对照组中则无目标序列被扩增(第7道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在阴性对照组中则未侦测到荧光讯号。重复此SAV的RNA样本的敏感性试验5次(n＝5)的统计数据如表6所示。
表6引子SAVF1、SAVR1与探针SAVP1的敏感度测试结果(n＝5)
RNA稀释倍数 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1
阳性率％ 0 20 60 60 100 100 100
2.实时PCR
以稀释的pTA-SAV质粒(分别为101,102,103,104,105,106个拷贝数)于一实时PCR仪(例如，但不限于ABI StepOnePlusTM；AppliedBioSystem,Life Technologies，加州，美国)中进行实时PCR分析。以含有2μl pTA-SAV质粒、0.01-2μM前置引子SAVF1(SEQ ID NO:11)、0.01-2μM后置引子SAVR1(SEQ ID NO:14)、0.01-2μM探针SAVP1(5’FAM-CGTGAGTTGTAAAGTAAAG-MGB 3’,SEQ ID NO:17)总体积为20μl的商用RT-PCR试剂盒(例如，但不限于，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit；Takara Bio Inc.，日本)进行实时PCR分析。实时PCR的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果。
如图4E所示，计算连续稀释(10倍)的pTA-SAV质粒的实时PCR分析的标准曲线。至少10个拷贝数的pUC57-BC质粒可被侦测到。所述标准曲线的R2值为0.99046，表示本发明的引子对与探针可以被用于实时PCR，并产生可信的结果。
所述结果表明，本发明的引子对与探针可用于iiPCR扩增反应以检测鲑鱼甲病毒(SAV)的存在，并且具有高度敏感度。
实施例5病原菌感染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)的检测
病原菌感染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)的非结构蛋白与基质蛋白的基因(GenBank登录号DQ785286)被插入T&ATM选殖载体中(Yeastern biotech，台湾)，以得到pTA-ISAV质粒。
此外，收集来自养殖场的鲑鱼心脏组织，并进行测试以评估iiPCR用于野外样本上的表现。来自鲑鱼养殖场的鲑鱼被诊断得到感染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)。藉由使用商业试剂盒(例如，但不限于FavorPrepTM病毒核酸萃取试剂盒；Favorgen Biotech Corp.，台湾)萃取来自组织的RNA萃取物。以在波长260/280nm下测量吸光率来评估总RNA的纯度，且以琼脂凝胶(1％)在TAE缓冲液中确认RNA的质量，并且以溴化乙锭染色显现。
1.传统PCR
进行传统PCR所用的50μl PCR混合物含有：稀释的pTA-ISAV质粒(分别为105,104,103,102,101个拷贝数)、0.01-2μM前置引子ISAVF1(SEQ ID NO:18)、0.01-2μM后置引子ISAVR1(SEQ ID NO:20)、0.2μM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一热循环仪(例如，但不限于PC818,Astec Co.Ltd.，日本)中进行扩增反应，且包含一个变性的初始循环94℃持续3分钟，以及35个循环的94℃30秒、60℃30秒以及72℃延展30秒。扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液中分析，并且以溴化乙锭染色显现。
传统PCR的结果如图5A所示。如图5A所示，第1至3道的条带显示，本发明的引子ISAVF1与ISAVR1正确地扩增92-bp的目标序列，而在阴性对照组中则无目标序列被扩增(第6道)。所述结果表明，所述引子对可用于传统PCR扩增反应以检测感染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)的存在。
2.iiPCR
50μl的PCR混合物含有pTA-ISAV质粒、0.01-2μM前置引子ISAVF1或ISAVF2(分别为SEQ ID NOs:18或19)、0.01-2μM后置引子ISAVR1或ISAVR2(分别为SEQ ID NOs:20或21)、0.01-2μM探针ISAVP1(5’FAM-CGACGATGACTCTCTACTGTGT-MGB 3’,SEQ ID NO:22)或ISAVP2(5’FAM-CGATGACTCTCTACTGTGTGA-MGB 3’,SEQ ID NO:38)、1XqPCR缓冲液以及1-5U TaqDNA聚合酶。将PCR混合物加入一反应试管中，并置于一iiPCR仪中一段指定的时间(约1小时)。以所述iiPCR仪侦测每个样本中的FAM荧光。此外，扩增的产物接着以15％聚丙烯酰胺凝胶在TAE缓冲液中分析，并且以溴化乙锭染色显现。iiPCR的结果如图5B及5C所示。
如图5B所示，第1、3、5及7道的条带显示，本发明的引子ISAVF1与ISAVR1、ISAVF1与ISAVR2、ISAVF2与ISAVR2分别正确地扩增92-bp、93-bp以及128-bp的目标序列(如箭头所指)，而在阴性对照组中则无目标序列被扩增(第1、3、5及7道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在阴性对照组中则未侦测到荧光讯号。
如图5C所示，第5、6及7道的条带显示，所述引子ISAVF1(SEQ ID NO:18)与ISAVR1(SEQ ID NO:20)可在含有104,105,106个拷贝数的pTA-ISAV质粒样本中正确地扩增92-bp的目标序列(如箭头所指)，而在阴性对照组以及含有101、102、103个拷贝数的pTA-ISAV DNA质粒的样本中，则无目标序列被扩增(第1至4道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在第1至4道中则未侦测到荧光讯号。
以来自得到感染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)的鱼类而来的总RNA萃取物(分别为稀释至10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7倍数)，重复上述iiPCR分析试验，以评估引子ISAVF1(SEQID NO:18)与ISAVR1(SEQ ID NO:20)以及探针ISAVP2(5’FAM-CGATGACTCTCTACTGTGTGA-MGB3’,SEQ ID NO:38)的敏感度。以总RNA萃取物进行iiPCR分析的试验，还加入50U MMLVRTase与4U RNase抑制剂至反应物中。重复所述iiPCR分析试验5次(n＝5)，其结果如表7及图5D所示。
表7引子ISAVF1、ISAVR1与探针ISAVP1的敏感度测试结果(n＝5)
RNA稀释倍数 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2
阳性率％ 0 20 60 100 100 100
如图5D所示，第4至7道的条带显示，所述引子ISAVF1与ISAVR1可正确地扩增92-bp的目标序列(如箭头所指)，而在阴性对照组以及稀释至10-6、10-7倍的RNA样本中则无目标序列被扩增(第1至3道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在阴性对照组以及稀释至10-6、10-7倍的RNA样本中则未侦测到荧光讯号。
以萃取自鲑鱼肌肉组织的DNA萃取物以及不同鱼类病原菌的DNA/RNA模板(分别为SAV、IPNV、NNV、PRV以及ISAV)进行iiPCR，以分析引子ISAVF1(SEQ ID NO:18)、ISAVR1(SEQID NO:20)与探针ISAVP2(SEQ ID NO:38)的专一性。
iiPCR的结果如图5E所示。如图5E所示，只有在含有ISAV的RNA模板的样本中(第7道)可以正确地扩增92-bp的目标序列(如箭头所指)，而在阴性对照组以及含SAV、IPNV、NNV、PRV的DNA/RNA模板以及萃取自鲑鱼肌肉组织的DNA萃取物的样本中则无目标序列被扩增(第1至6道)。此外，以所述iiPCR仪在相同的样本中侦测到显着的探针水解反应(即侦测到荧光)，而在第1至6道中则未侦测到荧光讯号。
3.实时PCR
以稀释的pTA-ISAV质粒(分别为101,102,103,104,105,106个拷贝数)于一实时PCR仪(例如，但不限于ABI StepOnePlusTM；Applied BioSystem,Life Technologies，加州，美国)中进行实时PCR分析。以含有2μl pUC57-BC质粒、0.01-2μM前置引子ISAVF1(SEQ ID NO:18)、0.01-2μM后置引子ISAVR1(SEQ ID NO:20)、0.01-2μM探针ISAVP2(5’FAM-CGATGACTCTCTACTGTGTGA-MGB3’,SEQ ID NO:38)总体积为20μl的商用RT-PCR试剂盒(例如，但不限于，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit；Takara Bio Inc.，日本)进行实时PCR分析。实时PCR的程序为42℃5分钟、94℃10秒，以及40个循环的94℃10秒以及60℃30分钟。在60℃的步骤中记录荧光测量的结果。
如图5F所示，计算连续稀释(10倍)的pTA-IPNV质粒的实时PCR分析的标准曲线。至少100个拷贝数的pTA-IPNV质粒可被侦测到。所述标准曲线的R2值为0.992，表示本发明的引子对与探针可以被用于实时PCR，并产生可信的结果。
所述结果表明，本发明的引子对与探针可用于iiPCR扩增反应以检测感染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)的存在，并且具有高度敏感度及专一性。
上列详细说明系针对本发明之一可行实施例的具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。
序列表
<110> 福又达生物科技股份有限公司
<120> 鱼呼吸道与肠道病毒、感染性胰脏坏死病毒、鲑鱼甲病毒、感染性鲑鱼贫血病毒检测方法
<130> 201510183810.X
<150> US 61/981,311
<151> 2014-04-18
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcgaaagtta agctaatacc gcata 25
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taatcagcca tcagccgctc 20
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caggctttcc tctccca 17
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcaacgttat cggctggga 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaatccgctg cagatgagta gag 23
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctccaggagt cattgtc 17
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tccaaagctc cacactaccg 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcagacaga ctgccttcga a 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tccacctcag acagactgcc t 21
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acgctcaacg ctgcca 16
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caccagtatc tgcctgaacg a 21
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggacacgtc actggaaac 19
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaaaccacca gtatctgcct ga 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cacgtcctgg tacactgcaa 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcctggtaca ctgcaatatc gg 22
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cctggtacac tgcaatatcg g 21
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgtgagttgt aaagtaaag 19
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccaattggtg aacggaatga 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccagaaggga aaatggtgaa ag 22
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcatcagtgt cgccatgctt 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ctcatcagtg tcgccatgct 20
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cgacgatgac tctctactgt gt 22
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ttgacatgtg cggaagctg 19
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ccaacatctc acgacacgag 20
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gacatgtgcg gaagctgtaa ga 22
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
acgacagcca tgcagca 17
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgacatgtgc ggaagctg 18
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cccaacatct cacgacacg 19
<210> 29
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cggcgtgcct gagaa 15
<210> 30
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atcggctggg agcaatg 17
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tctactccgt tgaatccgct 20
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tgggagcaat gggatgc 17
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tctctggtct caacgttatc gg 22
<210> 34
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ccgttgaatc cgctgca 17
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gggttctctg gtctcaacgt tat 23
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
accggcgaca atgactcct 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
caatgggatg ctaacactc 19
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cgatgactct ctactgtgtg a 21

Claims (27)

1.一种冷水鱼病原菌检测方法，包含：
提供一可能含有在冷水鱼中的病原菌的一或多个核苷酸序列的样本；
提供一寡核苷酸引子对，所述寡核苷酸引子对定义在所述病原菌的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5’端；
提供一聚合酶；
在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引子对、所述聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphates,dATPs)、脱氧胞核苷三磷酸(deoxycytidinetriphosphates,dCTPs)、脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphates,dGTPs)，以及脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphates,dTTPs)，以形成一聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction,PCR)混合物；
透过在一固定温度下加热所述容器的底部，使所述PCR混合物进行隔绝恒温聚合酶连锁反应(insulated isothermal polymerase chain reaction,iiPCR)，以形成一PCR产物；
侦测所述PCR产物以辨识所述双股目标序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述病原菌为鱼呼吸道与肠道病毒(piscinereovirus,PRV)，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列选自于由SEQ ID NOs:4,30,32,33以及35所组成的群组，所述第二引子的序列选自于由SEQ ID NOs:5,31,34以及36所组成的群组。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述病原菌为感染性胰脏坏死病毒(infectiouspancreatic necrosis virus,IPNV)，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列如SEQ ID NO:7所示，所述第二引子的序列如SEQ ID NO:8或9所示。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述病原菌为鲑鱼甲病毒(salmonid alphavirus,SAV)，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列选自于由SEQ ID NOs:11,12以及13所组成的群组，所述第二引子的序列选自于由SEQ ID NOs:14,15以及16所组成的群组。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述病原菌为感染性鲑鱼贫血病毒(infectioussalmon anemia virus,ISAV)，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列如SEQ ID NOs:18或19所示，所述第二引子的序列如SEQ ID NO:20或21所示。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶连锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一与所述双股目标序列的一区段互补的序列、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子，当所述寡核苷酸探针未杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光抑制分子大体上抑制所述荧光分子，且当所述寡核苷酸探针杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光分子大体上未被抑制。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述病原菌为鱼呼吸道与肠道病毒(piscinereovirus,PRV)，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列选自于由SEQ ID NOs:4,30,32,33以及35所组成的群组，所述第二引子的序列选自于由SEQ ID NOs:5,31,34以及36所组成的群组，且所述寡核苷酸探针为一介于所述病原菌PRV的L1区段基因的第3178至第3287个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NOs:6或37所示。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述病原菌为感染性胰脏坏死病毒(infectiouspancreatic necrosis virus,IPNV)，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列如SEQ ID NO:7所示，所述第二引子的序列如SEQ ID NO:8或9所示，且所述寡核苷酸探针为一介于所述病原菌IPNV的A区段基因的第432至第519个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:10所示。
11.如权利要求6所述的方法，其中所述病原菌为鲑鱼甲病毒(salmonid alphavirus,SAV)，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列选自于由SEQ ID NOs:11,12以及13所组成的群组，所述第二引子的序列选自于由SEQ ID NOs:14,15以及16所组成的群组，且所述寡核苷酸探针为一介于所述病原菌SAV的完整基因组的第446至第534个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:17所示。
13.如权利要求6所述的方法，其中所述病原菌为感染性鲑鱼贫血病毒(infectioussalmon anemia virus,ISAV)，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列如SEQ ID NOs:18或19所示，所述第二引子的序列如SEQ ID NO:20或21所示，且所述寡核苷酸探针为一介于所述病原菌ISAV的非结构蛋白与基质蛋白的基因的第178至第305个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NOs:22或38所示。
15.一种用于侦测冷水鱼病原菌的寡核苷酸对。
16.如权利要求15所述的寡核苷酸对，其中所述病原菌为鱼呼吸道与肠道病毒(piscine reovirus,PRV)，且所述寡核苷酸对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列选自于由SEQ ID NOs:4,30,32,33以及35所组成的群组，所述第二引子的序列选自于由SEQ ID NOs:5,31,34以及36所组成的群组。
17.如权利要求16所述的寡核苷酸对，进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述病原菌PRV的L1区段基因的第3178至第3287个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子。
18.如权利要求17所述的寡核苷酸对，其中所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NOs:6或37所示。
19.如权利要求15所述的寡核苷酸对，其中所述病原菌为感染性胰脏坏死病毒(infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)，且所述寡核苷酸对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列如SEQ ID NO:7所示，所述第二引子的序列如SEQ ID NO:8或9所示。
20.如权利要求19所述的寡核苷酸对，进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述病原菌IPNV的A区段基因的第432至第519个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子。
21.如权利要求20所述的寡核苷酸对，其中所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:10所示。
22.如权利要求15所述的寡核苷酸对，其中所述病原菌为鲑鱼甲病毒(salmonidalphavirus,SAV)，且所述寡核苷酸对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列选自于由SEQ ID NOs:11,12以及13所组成的群组，所述第二引子的序列选自于由SEQ IDNOs:14,15以及16所组成的群组。
23.如权利要求22所述的寡核苷酸对，进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述病原菌SAV的完整基因组的第446至第534个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子。
24.如权利要求23所述的寡核苷酸对，其中所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:17所示。
25.如权利要求15所述的寡核苷酸对，其中所述病原菌为感染性鲑鱼贫血病毒(infectious salmon anemia virus,ISAV)，且所述寡核苷酸对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列如SEQ ID NOs:18或19所示，所述第二引子的序列如SEQ ID NO:20或21所示。
26.如权利要求25所述的寡核苷酸对，进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一介于所述病原菌ISAV的非结构蛋白与基质蛋白的基因的第178至第305个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子。
27.如权利要求26所述的寡核苷酸对，其中所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NOs:22或38所示。
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