TW201738384A - 冷水魚病原菌鮭魚甲病毒以及感染性鮭魚貧血病毒檢測方法 - Google Patents

冷水魚病原菌鮭魚甲病毒以及感染性鮭魚貧血病毒檢測方法 Download PDF

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Abstract

本發明涉及一種檢測冷水魚中病原菌鮭魚甲病毒(salmonid alphaviurs, SAV)以及感染性鮭魚貧血病毒(infectious salmon anemia virus, ISAV)的方法。此外，本發明並涉及用於檢測冷水魚中該些病原菌的寡核苷酸對。

Description

冷水魚病原菌鮭魚甲病毒以及感染性鮭魚貧血病毒檢測方法
本發明關於在冷水魚中檢測病原菌鮭魚甲病毒(salmonid alphaviurs, SAV)以及感染性鮭魚貧血病毒(infectious salmon anemia virus, ISAV)的方法，特別是關於使用寡核苷酸對檢測該些冷水魚病原菌的方法。
冷水魚的經濟價值已達到數十億美金，其中大西洋鮭魚為最大的單一養殖種類，且其數量於2013年已超過150萬噸。冷水魚疾病可造成高達超過90%的死亡率，但一般較常見的死亡率為10-30%，這樣的死亡率對於水產養殖業仍是巨大的負面經濟因素，造成一年數億美金的損失。這些疾病可能在生產週期的早期與晚期發生，其中發生在晚期對經濟的衝擊最大。
解決上述問題的關鍵在於，診斷冷水魚之病原菌且採取必要措施以避免高死亡率。由於冷水魚養殖業通常分散在偏遠的沿海地區，因此本發明即提供了快速、分散的冷水魚病原菌檢測方法以供產業利用
於一方面，本發明涉及一種冷水魚病原菌檢測方法，包含提供一可能含有在冷水魚中的病原菌的一或多個核苷酸序列的樣本；提供一寡核苷酸引子對，該寡核苷酸引子對定義在該病原菌的一或多個核苷酸序列上一雙股目標序列的二互補股的5’端；提供一聚合酶；在一容器中混合該樣本、該寡核苷酸引子對、該聚合酶、去氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphates, dATPs)、去氧胞核苷三磷酸(deoxycytidine triphosphates, dCTPs)、去氧鳥苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphates, dGTPs)，以及去氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphates, dTTPs)，以形成一聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)混合物；透過在一固定溫度下加熱該容器的底部，使該PCR混合物進行隔絕恆溫聚合酶連鎖反應(insulated isothermal polymerase chain reaction, iiPCR)，以形成一PCR產物；以及偵測該PCR產物以辨識該雙股目標序列。
在某些具體實施例中，該聚合酶連鎖反應(PCR)混合物進一步包含一寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針包含一與該雙股目標序列的一區段互補的序列、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子，以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子，當該寡核苷酸探針未雜合於該雙股目標序列的該區段時，該螢光抑制分子大體上抑制該螢光分子，且當該寡核苷酸探針雜合於該雙股目標序列的該區段時，該螢光分子大體上未被抑制。
在某些具體實施例中，該病原菌為Candidatus Branchiomonas cysticola ，且該寡核苷酸引子對包含一第一引子與一第二引子，該第一引子的序列如SEQ ID NO: 1所示，該第二引子的序列如SEQ ID NO: 2所示。在某些具體實施例中，該聚合酶連鎖反應(PCR)混合物進一步包含一寡核苷酸探針，其為一介於該病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola 的16S核糖體RNA基因(GenBank accession No. JQ723599)的第136至第225個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸。在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針的序列如SEQ ID NO: 3所示。
在某些具體實施例中，該病原菌為Candidatus Branchiomonas cysticola ，且該寡核苷酸引子對包含一第一引子與一第二引子，該第一引子的序列選自於由SEQ ID NOs: 23, 25以及27所組成的群組，該第二引子的序列選自於由SEQ ID NOs: 24, 26以及28所組成的群組。在某些具體實施例中，該聚合酶連鎖反應(PCR)混合物進一步包含一寡核苷酸探針，其為一介於該病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola 的16S核糖體RNA基因(GenBank accession No. JQ723599)的第968至第1068個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸。在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針的序列如SEQ ID NO: 29所示。
在某些具體實施例中，該病原菌為魚呼吸道與腸道病毒(piscine reovirus, PRV)，且該寡核苷酸引子對包含一第一引子與一第二引子，該第一引子的序列選自於由SEQ ID NOs: 4, 30, 32, 33以及35所組成的群組，該第二引子的序列選自於由SEQ ID NOs: 5, 31, 34以及36所組成的群組。在某些具體實施例中，該聚合酶連鎖反應(PCR)混合物進一步包含一寡核苷酸探針，其為一介於該病原菌PRV的L1區段基因(GenBank accession No. GU994013)的第3178至第3287個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸。在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針的序列如SEQ ID NOs: 6或37所示。
在某些具體實施例中，該病原菌為感染性胰臟壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)，且該寡核苷酸引子對包含一第一引子與一第二引子，該第一引子的序列如SEQ ID NO: 7所示，該第二引子的序列如SEQ ID NO: 8或9所示。在某些具體實施例中，該聚合酶連鎖反應(PCR)混合物進一步包含一寡核苷酸探針，其為一介於該病原菌IPNV的A區段基因(GenBank accession No. AY379740)的第432至第519個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸。在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針的序列如SEQ ID NO: 10所示。
在某些具體實施例中，該病原菌為鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus, SAV)，且該寡核苷酸引子對包含一第一引子與一第二引子，該第一引子的序列選自於由SEQ ID NOs: 11, 12以及13所組成的群組，該第二引子的序列選自於由SEQ ID NOs: 14, 15以及16所組成的群組。在某些具體實施例中，該聚合酶連鎖反應(PCR)混合物進一步包含一寡核苷酸探針，其為一介於該病原菌SAV的完整基因組(GenBank accession No. KC122926)的第446至第534個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸。在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針的序列如SEQ ID NO: 17所示。
在某些具體實施例中，該病原菌為感染性鮭魚貧血病毒(infectious salmon anemia virus, ISAV)，且該寡核苷酸引子對包含一第一引子與一第二引子，該第一引子的序列如SEQ ID NOs: 18或19所示，該第二引子的序列如SEQ ID NO: 20或21所示。在某些具體實施例中，該聚合酶連鎖反應(PCR)混合物進一步包含一寡核苷酸探針，其為一介於該病原菌ISAV的非結構蛋白與基質蛋白的基因(GenBank accession No. DQ785286)的第178至第305個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸。在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針的序列如SEQ ID NOs: 22或38所示。
於一方面，本發明涉及一種用於偵測冷水魚病原菌的寡核苷酸對。
在某些具體實施例中，該病原菌為Candidatus Branchiomonas cysticola ，且該寡核苷酸對包含一第一引子與一第二引子，該第一引子的序列如SEQ ID NO: 1所示，該第二引子的序列如SEQ ID NO: 2所示。在某些具體實施例中，該寡核苷酸對進一步包含一寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針包含一介於該病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola 的16S核糖體RNA基因(GenBank accession No. JQ723599)的第136至第225個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子，以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子。在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針的序列如SEQ ID NO: 3所示。
在某些具體實施例中，該病原菌為Candidatus Branchiomonas cysticola ，且該寡核苷酸對包含一第一引子與一第二引子，該第一引子的序列選自於由SEQ ID NOs: 23, 25以及27所組成的群組，該第二引子的序列選自於由SEQ ID NOs: 24, 26以及28所組成的群組。在某些具體實施例中，該寡核苷酸對進一步包含一寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針包含一介於該病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola 的16S核糖體RNA基因(GenBank accession No. JQ723599)的第968至第1068個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子，以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子。在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針的序列如SEQ ID NO: 29所示。
在某些具體實施例中，該病原菌為魚呼吸道與腸道病毒(piscine reovirus, PRV)，且該寡核苷酸對包含一第一引子與一第二引子，該第一引子的序列選自於由SEQ ID NOs: 4, 30, 32, 33以及35所組成的群組，該第二引子的序列選自於由SEQ ID NOs: 5, 31, 34以及36所組成的群組。在某些具體實施例中，該寡核苷酸對進一步包含一寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針包含一介於該病原菌PRV的L1區段基因(GenBank accession No. GU994013)的第3178至第3287個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子，以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子。在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針的序列如SEQ ID NOs: 6或37所示。
在某些具體實施例中，該病原菌為感染性胰臟壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)，且該寡核苷酸對包含一第一引子與一第二引子，該第一引子的序列如SEQ ID NO: 7所示，該第二引子的序列如SEQ ID NO: 8或9所示。在某些具體實施例中，該寡核苷酸對進一步包含一寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針包含一介於該病原菌IPNV的A區段基因(GenBank accession No. AY379740)的第432至第519個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子，以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子。在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針的序列如SEQ ID NO: 10所示。
在某些具體實施例中，該病原菌為鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus, SAV)，且該寡核苷酸對包含一第一引子與一第二引子，該第一引子的序列選自於由SEQ ID NOs: 11, 12以及13所組成的群組，該第二引子的序列選自於由SEQ ID NOs: 14, 15以及16所組成的群組。在某些具體實施例中，該寡核苷酸對進一步包含一寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針包含一介於該病原菌SAV的完整基因組(GenBank accession No. KC122926)的第446至第534個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子，以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子。在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針的序列如SEQ ID NO: 17所示。
在某些具體實施例中，該病原菌為感染性鮭魚貧血病毒(infectious salmon anemia virus, ISAV)，且該寡核苷酸對包含一第一引子與一第二引子，該第一引子的序列如SEQ ID NOs: 18或19所示，該第二引子的序列如SEQ ID NO: 20或21所示。在某些具體實施例中，該寡核苷酸對進一步包含一寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針包含一介於該病原菌ISAV的非結構蛋白與基質蛋白的基因(GenBank accession No. DQ785286)的第178至第305個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子，以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子。在某些較佳具體實施例中，該寡核苷酸探針的序列如SEQ ID NOs: 22或38所示。
於一方面，本發明涉及一種冷水魚病原菌檢測方法。在某些具體實施例中，該方法為聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)。在某些具體實施例中，該方法為反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse-transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)。在某些具體實施例中，該方法為隔絕恆溫聚合酶連鎖反應(insulated isothermal polymerase chain reaction, iiPCR)。在某些具體實施例中，該方法為即時聚合酶連鎖反應(real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)。
於一方面，本發明涉及一種冷水魚病原菌檢測方法，包含: 提供一可能含有在冷水魚中的病原菌的一或多個核苷酸序列的樣本； 提供一寡核苷酸引子對，該寡核苷酸引子對定義在該病原菌的一或多個核苷酸序列上一雙股目標序列的二互補股的5’端； 提供一聚合酶； 在一容器中混合該樣本、該寡核苷酸引子對、該聚合酶、去氧腺苷三磷酸(dATPs)、去氧胞核苷三磷酸(dCTPs)、去氧鳥苷三磷酸(dGTPs)，以及去氧胸苷三磷酸(dTTPs)，以形成一聚合酶連鎖反應(PCR)混合物； 透過在一固定溫度下加熱該容器的底部，使該PCR混合物進行隔絕恆溫聚合酶連鎖反應(iiPCR)，以形成一PCR產物；以及 偵測該PCR產物以辨識該雙股目標序列。
於另一方面，本發明涉及一種冷水魚病原菌檢測方法，包含: 提供一可能含有在冷水魚中的病原菌的一或多個核苷酸序列的樣本； 提供一寡核苷酸引子對，該寡核苷酸引子對定義在該病原菌的一或多個核苷酸序列上一雙股目標序列的二互補股的5’端； 提供一寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針包含一與該雙股目標序列的一區段互補的序列、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子，以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子，當該寡核苷酸探針未雜合於該雙股目標序列的該區段時，該螢光抑制分子大體上抑制該螢光分子，且當該寡核苷酸探針雜合於該雙股目標序列的該區段時，該螢光分子大體上未被抑制； 提供一聚合酶； 在一容器中混合該樣本、該寡核苷酸引子對、該聚合酶、去氧腺苷三磷酸(dATPs)、去氧胞核苷三磷酸(dCTPs)、去氧鳥苷三磷酸(dGTPs)，以及去氧胸苷三磷酸(dTTPs)，以形成一聚合酶連鎖反應(PCR)混合物； 透過在一固定溫度下加熱該容器的底部，使該PCR混合物進行隔絕恆溫聚合酶連鎖反應(iiPCR)，以形成一PCR產物；以及 偵測該PCR產物以辨識該雙股目標序列。
於又一方面，本發明涉及一種用於偵測冷水魚病原菌的寡核苷酸對。
於再一方面，本發明涉及一種用於偵測冷水魚病原菌的寡核苷酸對與寡核苷酸探針。
應當進一步理解的是，在某些具體實施例中，本文揭露的寡核苷酸對及/或寡核苷酸探針可用於各種基礎PCR技術之變異，例如但不限於，反轉錄聚合酶連鎖反應(RT-PCR)、隔絕恆溫聚合酶連鎖反應(iiPCR)、即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)、巢式聚合酶連鎖反應(nested PCR)，以及熱不對稱性交錯聚合酶連鎖反應(thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)。
如本文所用，術語「冷水」意指在北半球及南半球水溫介於冬天為冰凍且夏天最高達15-20 °C之間的水域。冷水魚包含鮭魚，例如但不限於，大西洋鮭魚、銀鮭魚、帝王鮭(Chinook salmon)以及虹鱒魚，此外海洋物種例如大比目魚、鱈魚及比目魚。在某些具體實施例中，該冷水魚為鮭魚。
如本文所用，術語「冷水魚病原菌」意指在冷水魚中發現的病毒性、細菌性及寄生性病原菌。冷水魚病原菌的例子如，但不限於：a) 病毒：感染性胰臟壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)、鮭魚胰腺病病毒(Salmon pancreas disease virus, SPDV)、感染性鮭魚貧血病毒(infectious salmon anemia virus, ISAV)、魚呼吸道與腸道病毒(piscine reovirus, PRV，造成心臟及骨骼肌炎症heart and muscle inflammation, HSMI)、感染性造血器官壞死病毒(infectious haematopoietic necrosis virus, IHNV)、病毒性出血性敗血症病毒(viral hemorrhagic septicemia virus, VHSV)、神經壞死病毒(viral nervous necrosis virus, VNNV)；b) 細菌：鮭魚腎菌(Renibacterium salmoninarum ，造成細菌性腎病bacterial kidney disease, BKD)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum )、鮭弧菌(Vibrio salmonicida )、鮭產氣單胞菌(Aeromonas salmonicida )、柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnare )、鱒魚紅嘴病耶氏桿菌(Yersinia ruckeri )、鮭魚病原菌(Candidatus Branchiomonas cysticola )；c) 寄生蟲：佩魯蘭新副變形蟲(Neoparamoeba perurans ，造成阿米巴鰓病amoebic gill disease, AGD)、腦黏體蟲(Myxosoma cerebralis )，以及海蝨(sea lice)。
如本文所用，術語「隔絕恆溫聚合酶連鎖反應(iiPCR)」意指一種聚合酶連鎖反應，其中，在一試管中的自發性液體對流是受到溫度梯度所驅動，該溫度梯度是單純透過自該試管底部以一固定溫度加熱而形成。因此，反應成分循環經過溫度梯度的各區域，而PCR的變性、黏合，以及延伸步驟分別發生於該試管的底部、頂部及中間區域。隔絕恆溫聚合酶連鎖反應(iiPCR)的詳細描述請參見如，Chang et al., Biotech J. (2012) 7: 662-666; Tsai et al., J. Virol. Methods (2012) 181: 134-137；美國專利號8,187,813以及8,574,516；美國公開專利申請案號2012/0094373、2012/0309083、2013/0023010，以及2013/0217112皆以引用的方式將其整體併入本文。
如本文所用，術語「螢光分子」意指一物質或其一部份，其係能夠在可偵測的範圍內顯示螢光。如本文所用，術語「螢光抑制分子」意指一物質或其一部份，其係能夠抑制當由一光源激發時由該螢光分子所發射的螢光。在某些具體實施例中，術語「螢光分子」與「螢光抑制分子」為TaqMan™分析套組(Applied Biosystems Inc.，加州，美國)的螢光分子與螢光抑制分子。TaqMan™分析套組的詳細描述請參見如，Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. (1991) 88:7276- 7280；美國專利號5,538,848、5,723,591、5,876,930，以及7,413,708皆以引用的方式將其整體併入本文。
該螢光分子的例子包括，但不限於，3-(ε-羧)-3'-乙基-5,5'-二甲基己羰花青(3-(ε-carboxypentyl)-3'-ethyl-5,5'-dimethyloxa-carbocyanine, CYA)、6-羧基螢光素(6-carboxyfluorescein, FAM)、5,6-羧基羅丹明-L LO (5,6-carboxyrhodamine-l lO, R110)、6羧基羅丹明-6G (6- carboxyrhodamine-6G, R6G)、N'，N'，N'，N'-四甲基-6-羧基羅丹明(N’,N’,N’,N’-tetramethyl-6-carboxyrhodamine, TAMRA)、6-羧基-X-羅丹明(6-carboxy-X-rhodamine, ROX)、2'，4'，5'，T， - 四氯4-7-二氯螢光素(2’, 4’, 5’, T, - tetrachloro-4-7- dichlorofluorescein, TET)、2'，7-二甲氧基 - 4'，5'-6羧基羅丹明(2’, 7- dimethoxy - 4’, 5’- 6 carboxyrhodamine, JOE)、6-羧基-2'，4,4'，5'，7,7'-六氯熒光素(6- carboxy-2’,4,4’,5’,7,7’-hexachlorofluorescein, HEX)、ALEXA螢光、Cy3螢光與Cy5螢光。該螢光抑制分子的例子包括，但不限於，4-(4'-二甲基氨基-苯偶氮基)苯甲酸(4-(4’-dimethylamino-phenylazo)-benzoic acid, Dabcyl)、黑洞螢光抑制劑1 (Black Hole Quencher 1, BHQ1)、黑洞螢光抑制劑2 (Black Hole Quencher 2, BHQ2)、黑洞螢光抑制劑3 (Black Hole Quencher 3, BHQ3)、四甲基羅丹明(tetramethylrhodamine, TAMRA)。在某些具體實施例中，該螢光分子為6-羧基螢光素(6-carboxyfluorescein, FAM)，且該螢光抑制分子為二氫環吡咯並吲哚三肽小溝結合物(dihydro cyclo pyrrolo indole tripeptide minor groove binder, MGB)。
除非本文另有定義，否則用以與本文結合的科學與技術術語應具有本領域普通技術人員通常理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數術語應包括複數，並且複數術語應包括單數。本發明的方法與技術一般可根據本領域已知的常規方法進行。一般而言，本文所描述之用以連結以下技術的命名法，以及生物化學、酵素學、分子及細胞生物學、微生物學、遺傳學與蛋白質及核酸化學及雜合反應的技術皆為本領域已知且經常使用者。除非另有說明，本發明的方法與技術一般可根據本領域已知的常規方法進行，且被描述於在本說明書中被引用且討論的各種一般及更具體的參考文獻中。
本發明進一步透過以下的實施例闡釋，其不應以任何方式被解釋為進一步的限縮。本申請案中引用的所有引用文件(包括參考文獻、核准的專利、公開的專利申請，以及一同在申請中的專利申請案)的整體內容，在此透過引用的方式明確地併入本案中。
實施例
實施例 1 病原菌 Candidatus Branchiomonas cysticola 的檢測
病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola 的16S核糖體RNA基因(GenBank accession No. JQ723599)被插入pUC57選殖載體中(Thermo公司，麻州，美國)，以得到pUC57-BC質體。
1. 以引子BCF1與BCR1進行傳統PCR
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：稀釋的pUC57-BC質體(分別為1010 , 109 , 108 , 107 , 106 , 105 , 104 , 103 , 102 , 101 , 100 個拷貝數)、0.01-2 µM前置引子BCF1 (SEQ ID NO: 1)、0.01-2 µM後置引子BCR1 (SEQ ID NO: 2)、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94°C持續3分鐘，以及35個循環的94°C 30秒、60°C 30秒以及72°C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠(polyacrylamide gel)在TAE緩衝液(40 mM Tris, 20 mM acetic acid, 1 mM EDTA)中分析，並且以溴化乙錠(ethidium bromide)染色顯現。
傳統PCR的結果如圖1A所示。如圖1A所示，第1至9道的條帶顯示，本發明的引子BCF1與BCR1正確地擴增90-bp的目標序列，而在負對照組中則無目標序列被擴增(第12道)。該結果表明，該引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測Candidatus Branchiomonas cysticola 的存在。
2. 以引子BCF1、BCR1以及探針BCP1進行iiPCR
50 µl的PCR混合物含有pUC57-BC質體(分別為100 , 101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)、0.01-2 µM前置引子BCF1 (SEQ ID NO: 1)、0.01-2 µM後置引子BCR1 (SEQ ID NO: 2)、0.01-2 µM探針BCP1 (5’ FAM-CAGGCTTTCCTCTCCCA-MGB 3’, SEQ ID NO: 3)、1X qPCR緩衝液以及1-5 U Taq DNA聚合酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一iiPCR儀中一段指定的時間(約1小時)。以該iiPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。此外，擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
iiPCR的結果如圖1B所示。如圖1B所示，第2至7道的條帶顯示，本發明的引子及探針正確地擴增90-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在負對照組中則無目標序列被擴增(第1道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在負對照組中則未偵測到螢光訊號。
此外，重複上述iiPCR分析試驗6次(n = 6)以評估引子BCF1 (SEQ ID NO: 1)、BCR1 (SEQ ID NO: 2)與探針BCP1 (SEQ ID NO: 3)的敏感度。敏感度測試的結果如表1所示。 【表1】引子BCF1、BCR1與探針BCP1的敏感度測試結果(n = 6)
以下列iiPCR分析引子BCF1 (SEQ ID NO: 1)、BCR1 (SEQ ID NO: 2)與探針BCP1 (SEQ ID NO: 3)的專一性。50 µl的PCR混合物含有自鮭魚鰓抽取的DNA樣本或不同魚類病原菌的DNA/RNA模板(分別為SAV、IPNV、ISAV、NNV、PRV以及pUC57-BC質體)、0.01-2 µM前置引子BCF1 (SEQ ID NO: 1)、0.01-2 µM後置引子BCR1 (SEQ ID NO: 2)、0.01-2 µM探針BCP1 (5’ FAM-CAGGCTTTCCTCTCCCA-MGB 3’, SEQ ID NO: 3)、1X qPCR緩衝液以及1-5 U Taq DNA聚合酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一iiPCR儀中一段指定的時間(約1小時)。以該iiPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。此外，擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
iiPCR的結果如圖1C所示。如圖1C所示，只有在含有Candidatus Branchiomonas cysticola DNA模板的樣本中(第8道)可以正確地擴增90-bp的目標序列(如箭頭所指)，而含有鮭魚鰓、SAV、IPNV、ISAV、NNV或PRV的DNA/RNA模板的樣本中則無目標序列被擴增(第1至7道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在第1至7道中則未偵測到螢光訊號。
3. 以引子BCF2、BCR2、BCF3、BCR3、BCF4、BCR4以及探針BCP2進行iiPCR
50 µl的PCR混合物含有pUC57-BC質體(108 個拷貝數)、0.01-2 µM前置引子BCF2 (SEQ ID NO: 23)或BCF3 (SEQ ID NO: 25)或BCF4 (SEQ ID NO: 27)、0.01-2 µM後置引子BCR2 (SEQ ID NO: 24)或BCR3 (SEQ ID NO: 26)或BCR4 (SEQ ID NO: 28)、0.01-2 µM探針BCP2 (5’ FAM-CGGCGTGCCTGAGAA-MGB 3’, SEQ ID NO: 29)、1X qPCR緩衝液以及1-5 U Taq DNA聚合酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一iiPCR儀中一段指定的時間(約1小時)。以該iiPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。此外，擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
iiPCR的結果如圖1D所示。如圖1D所示，第2、4、6道的條帶顯示，引子BCF2 (SEQ ID NO: 23)與BCR2 (SEQ ID NO: 24)、BCF3 (SEQ ID NO: 25)與BCR3 (SEQ ID NO: 26)、BCF4 (SEQ ID NO: 27)與BCR4 (SEQ ID NO: 28)分別正確地擴增100-bp、75-bp以及100-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在負對照組中則無目標序列被擴增(第1、3、5道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在負對照組中則未偵測到螢光訊號。該結果表明，引子BCF2、BCR2、BCF3、BCR3、BCF4、BCR4以及探針BCP2可用於iiPCR擴增反應以檢測Candidatus Branchiomonas cysticola 的存在。
此外，以不同拷貝數(分別為100 , 101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)的DNA模板pUC57-BC質體重複上述iiPCR分析試驗7次(n = 7)以評估引子BCF3 (SEQ ID NO: 25)、BCR3 (SEQ ID NO: 26)與探針BCP2 (SEQ ID NO: 29)的敏感度。敏感度測試的結果如表2及圖1E所示。 【表2】引子BCF3、BCR3與探針BCP2的敏感度測試結果(n = 7)
如圖1E所示，第3至8道的條帶顯示，該引子可正確地擴增75-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在負對照組與100 個拷貝數的pUC57-BC質體樣本中則無目標序列被擴增(第1與2道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在第1與2道中則未偵測到螢光訊號。
4. 以引子BCF3、BCR3以及探針BCP2進行即時PCR
以稀釋的pUC57-BC質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pUC57-BC質體、0.01-2 µM前置引子BCF3 (SEQ ID NO: 25)、0.01-2 µM後置引子BCR3 (SEQ ID NO: 26)、0.01-2 µM探針BCP2 (5’ FAM-CGGCGTGCCTGAGAA-MGB 3’, SEQ ID NO: 29)總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42°C 5分鐘、94°C 10秒，以及40個循環的94°C 10秒以及60°C 30分鐘。在60°C的步驟中記錄螢光測量的結果。
如圖1F所示，計算連續稀釋(10倍)的pUC57-BC質體的即時PCR分析的標準曲線。至少10個拷貝數的pUC57-BC質體可被偵測到。該標準曲線的R2 值為0.994，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
該結果表明，本發明的引子對與探針可用於iiPCR擴增反應以檢測Candidatus Branchiomonas cysticola 的存在，並且具有高度敏感度及專一性。
實施例 2 病原菌魚呼吸道與腸道病毒 (PRV) 的檢測
病原菌魚呼吸道與腸道病毒(PRV)的L1區段基因(GenBank登錄號GU994013)被插入pUC57選殖載體中(Thermo)，以得到pUC57-PRV質體。
此外，透過使用一商用套組(例如，但不限於，MAXIscript® Kit; Thermo Fisher Scientific，麻州，美國)對PRV的L1區段基因的DNA序列進行轉錄，以製備PRV的體外轉錄RNA模板。
1. 以引子PRVF1與PRVR1進行傳統PCR
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：稀釋的pUC57-PRV質體(分別為106 , 105 , 104 , 103 , 102 , 101 個拷貝數)、0.01-2 µM前置引子PRVF1 (SEQ ID NO: 4)、0.01-2 µM後置引子PRVR1 (SEQ ID NO: 5)、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94°C持續3分鐘，以及35個循環的94°C 30秒、60°C 30秒以及72°C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液中分析，並且以溴化乙錠(ethidium bromide)染色顯現。
傳統PCR的結果如圖2A所示。如圖2A所示，第1至3道的條帶顯示，本發明的引子PRVF1與PRVR1正確地擴增86-bp的目標序列，而在負對照組中則無目標序列被擴增(第7道)。該結果表明，該引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測魚呼吸道與腸道病毒(PRV)的存在。
2. 以引子PRVF1、PRVR1、PRVF2、PRVR2、PRVF3、PRVF4、PRVR4以及探針PRVP1進行iiPCR
50 µl的PCR混合物含有pUC57-PRV質體、0.01-2 µM前置引子PRVF1 (SEQ ID NO: 4)或PRVF2 (SEQ ID NO: 30)或PRVF3 (SEQ ID NO: 32)或PRVF4 (SEQ ID NO: 33)、0.01-2 µM後置引子PRVR1 (SEQ ID NO: 5)或PRVR2 (SEQ ID NO: 31)或PRVR4 (SEQ ID NO: 34)、0.01-2 µM探針PRVP1 (5’ FAM-CTCCAGGAGTCATTGTC-MGB 3’, SEQ ID NO: 6)、1X qPCR緩衝液以及1-5 U Taq DNA聚合酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一iiPCR儀中一段指定的時間(約1小時)。以該iiPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。此外，擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
iiPCR的結果如圖2B所示。如圖2B所示，第1及3道的條帶顯示，本發明的引子PRVF1 (SEQ ID NO: 4)及PRVR1 (SEQ ID NO: 5)正確地擴增86-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在負對照組中則無目標序列被擴增(第2及4道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在負對照組中則未偵測到螢光訊號。
如圖2C所示，第2、4、6、8、10及12道的條帶顯示，本發明的引子primers PRVF2 (SEQ ID NO: 30)與PRVR2 (SEQ ID NO: 31)、PRVF3 (SEQ ID NO: 32)與PRVR2 (SEQ ID NO: 31)、PRVF4 (SEQ ID NO: 33)與PRVR4 (SEQ ID NO: 34)分別正確地擴增89-bp、83-bp以及100-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在負對照組中則無目標序列被擴增(第1、3、5、7、9及11道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在負對照組中則未偵測到螢光訊號。
此外，以不同拷貝數(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)的PRV體外轉錄RNA模板重複上述iiPCR分析試驗，以評估引子PRVF2 (SEQ ID NO: 30)與PRVR2 (SEQ ID NO: 31)、PRVF3 (SEQ ID NO: 32)與PRVR2 (SEQ ID NO: 31)以及探針PRVP1 (SEQ ID NO: 6)的敏感度。敏感度測試的結果分別如圖2D (針對引子PRVF2、PRVR2以及探針PRVP1)及表3與圖2F (針對引子PRVF3、PRVR2以及探針PRVP1)所示。
如圖2D所示，第4至7道的條帶顯示，該引子PRVF2及PRVR2可正確地擴增89-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在負對照組與101 及102 個拷貝數的體外轉錄RNA中則無目標序列被擴增(第1、2與3道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在第1、2與3道中則未偵測到螢光訊號。
如圖2E所示，第3至7道的條帶顯示，該引子PRVF3及PRVR2可正確地擴增83-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在負對照組與101 個拷貝數的體外轉錄RNA中則無目標序列被擴增(第1與2道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在第1與2道中則未偵測到螢光訊號。重複此敏感性試驗8次(n = 8)的統計數據如表3所示。 【表3】引子PRVF3、PRVR2與探針PRVP1的敏感度測試結果(n = 8)
3. 以引子PRVF5、PRVR5以及探針PRVP2進行iiPCR
50 µl的PCR混合物含有pUC57-PRV質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)或PRV體外轉錄RNA模板(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)、0.01-2 µM前置引子PRVF5 (SEQ ID NO: 35)、0.01-2 µM後置引子PRVR5 (SEQ ID NO: 36)、0.01-2 µM探針PRVP2 (5’ FAM-CAATGGGATGCTAACACTC-MGB 3’, SEQ ID NO: 37)、1X qPCR緩衝液以及1-5 U Taq DNA聚合酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一iiPCR儀中一段指定的時間(約1小時)。以該iiPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。此外，擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。iiPCR的結果分別如圖2F (針對DNA質體)及表4與圖2G (針對體外轉錄RNA)所示。
如圖2F及圖2G所示，第3至7道的條帶顯示，該引子對可正確地擴增72-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在負對照組與101 個拷貝數的pUC57-PRV質體(圖2F，第1與2道)或體外轉錄RNA (圖2G，第1與2道)中則無目標序列被擴增。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在圖2F或圖2G中的第1與2道中則未偵測到螢光訊號。以PRV體外轉錄RNA模板重複此敏感性試驗4次(n = 4)的統計數據如表4所示。 【表4】引子PRVF5、PRVR5與探針PRVP2的敏感度測試結果(n = 4)
該結果表明，本發明的引子對與探針可用於iiPCR擴增反應以檢測魚呼吸道與腸道病毒(PRV)的存在，並且具有高度敏感度。
實施例 3 病原菌感染性胰臟壞死病毒 (IPNV) 的檢測
病原菌感染性胰臟壞死病毒(IPNV)的A區段基因(GenBank登錄號AY379740)被插入T&A™選殖載體中(Yeastern biotech，台灣)，以得到pTA-IPNV質體。
透過使用一商用套組(例如，但不限於，MAXIscript® Kit; Thermo Fisher Scientific，麻州，美國)對IPNV的A區段基因的DNA序列進行轉錄，以製備IPNV的體外轉錄RNA模板。
此外，收集來自養殖場的鮭魚病毒樣本，並進行測試以評估iiPCR與即時PCR用於野外樣本上的表現。來自鮭魚養殖場的鮭魚被診斷得到感染性胰臟壞死病毒(IPNV)。藉由使用商業套組(例如，但不限於FavorPrep™病毒核酸萃取套組；Favorgen Biotech Corp.，台灣)萃取來自組織的RNA萃取物。以在波長260/280 nm下測量吸光率來評估總RNA的純度。
1. 傳統PCR
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：稀釋的pTA-IPNV質體(分別為105 , 104 , 103 , 102 , 101 個拷貝數)、0.01-2 µM前置引子IPNVF1 (SEQ ID NO: 7)、0.01-2 µM後置引子IPNVR1 (SEQ ID NO: 8)、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94°C持續3分鐘，以及35個循環的94°C 30秒、60°C 30秒以及72°C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如圖3A所示。如圖3A所示，第1至4道的條帶顯示，本發明的引子IPNVF1與IPNVR1正確地擴增83-bp的目標序列，而在負對照組中則無目標序列被擴增(第6道)。該結果表明，該引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測感染性胰臟壞死病毒(IPNV)的存在。
2. 反轉錄PCR (RT-PCR)
藉由使用商業套組(例如，但不限於One step RT-PCR kit；LTK Biolab，台灣)以來自得到感染性胰臟壞死病毒(IPNV)的魚類而來的總RNA萃取物、0.01-2 µM前置引子IPNVF1 (SEQ ID NO: 7)、0.01-2 µM後置引子IPNVR1 (SEQ ID NO: 8)進行反轉錄PCR。反轉錄PCR於42°C進行30分鐘後，接著進行以下PCR程序：94°C 10分鐘，以及35個循環的94°C 30秒、60°C 30秒，以及在72°C下延長30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
反轉錄PCR的結果如圖3B所示。如圖3B所示，第1至4道的條帶顯示，本發明的引子IPNVF1與IPNVR1正確地擴增83-bp的目標序列，而在負對照組中則無目標序列被擴增(第6道)。該結果表明，該引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測感染性胰臟壞死病毒(IPNV)的存在。
3. iiPCR
50 µl的PCR混合物含有 pTA-IPNV質體、0.01-2 µM前置引子IPNVF1 (SEQ ID NO: 7)、0.01-2 µM後置引子IPNVR1 (SEQ ID NO: 8)或IPNVR2 (SEQ ID NO: 9)、0.01-2 µM探針 IPNVP1 (5’ FAM-ACGCTCAACGCTGCCA-MGB 3’, SEQ ID NO: 10)、1X qPCR緩衝液以及1-5 U Taq DNA聚合酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一iiPCR儀中一段指定的時間(約1小時)。以該iiPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。此外，擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
iiPCR的結果如圖3C所示。如圖3C所示，第1及3道的條帶顯示，本發明的引子IPNVF1與IPNVR1、引子IPNVF1與IPNVR2分別正確地擴增83-bp、88-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在負對照組中則無目標序列被擴增(第2及4道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在負對照組中則未偵測到螢光訊號。
此外，以不同拷貝數(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 個拷貝數)的pTA-IPNV DNA質體，或以不同拷貝數(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)的IPNV體外轉錄RNA模板，或以來自得到感染性胰臟壞死病毒(IPNV)的魚類而來的總RNA萃取物(分別為原液與稀釋至10-3 , 10-4 , 10-5 , 10-6 , 10-7 倍數)，重複上述iiPCR分析試驗，以評估引子 IPNVF1 (SEQ ID NO: 7)與IPNVR1 (SEQ ID NO: 8) 以及探針 IPNVP1 (SEQ ID NO: 10)的敏感度。以總RNA萃取物進行iiPCR分析的試驗，還加入50 U MMLV RTase與4 U RNase抑制劑至反應物中。敏感度測試的結果分別如圖3D、3E、3F所示。
如圖3D所示，第1至5道的條帶顯示，該引子IPNVF1與IPNVR1可正確地擴增83-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在負對照組中則無目標序列被擴增(第6道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在第6道中則未偵測到螢光訊號。
如圖3E所示，第4至7道的條帶顯示，該引子IPNVF1與IPNVR1可正確地擴增83-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在負對照組與101 及102 個拷貝數的體外轉錄RNA中則無目標序列被擴增(第1、2與3道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在第1、2與3道中則未偵測到螢光訊號。
如圖3F所示，第1、2、3及8道的條帶顯示，該引子IPNVF1與IPNVR1可正確地擴增83-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在稀釋至10-5 、10-6 、10-7 倍的RNA樣本與負對照組中則無目標序列被擴增(第4、5、6與7道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在稀釋至10-5 、10-6 、10-7 倍的RNA樣本與負對照組中則未偵測到螢光訊號。重複此PRV的RNA樣本的敏感性試驗5次(n = 5)的統計數據如表5所示。 【表5】引子IPNVF1、IPNVR1與探針IPNVP1的敏感度測試結果(n = 5)
以萃取自鮭魚肌肉組織的DNA萃取物以及不同魚類病原菌的DNA/RNA模板(分別為 ISAV、SAV、NNV、PRV以及IPNV)進行iiPCR，以分析引子IPNVF1 (SEQ ID NO: 7)、IPNVR1 (SEQ ID NO: 8)與探針IPNVP1 (SEQ ID NO: 10)的專一性。
iiPCR的結果如圖3G所示。如圖3G所示，只有在含有IPNV的RNA模板的樣本中(第7道)可以正確地擴增83-bp的目標序列(如箭頭所指)，而含ISAV、SAV、NNV、PRV、IPNV的DNA/RNA模板以及萃取自鮭魚肌肉組織的DNA萃取物的樣本中則無目標序列被擴增(第1至6道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在第1至6道中則未偵測到螢光訊號。
4. 即時PCR
以稀釋的pTA-IPNV質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pTA-IPNV質體、0.01-2 µM前置引子IPNVF1 (SEQ ID NO: 7)、0.01-2 µM後置引子IPNVR1 (SEQ ID NO: 8)、0.01-2 µM探針IPNVP1 (5’ FAM-ACGCTCAACGCTGCCA-MGB 3’, SEQ ID NO: 10)總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42°C 5分鐘、94°C 10秒，以及40個循環的94°C 10秒以及60°C 30分鐘。在60°C的步驟中記錄螢光測量的結果。
如圖3H所示，計算連續稀釋(10倍)的pTA-IPNV質體的即時PCR分析的標準曲線。至少10個拷貝數的pTA-IPNV質體可被偵測到。該標準曲線的R2 值為0.99795，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
該結果表明，本發明的引子對與探針可用於iiPCR擴增反應以檢測感染性胰臟壞死病毒(IPNV)的存在，並且具有高度敏感度及專一性。
實施例 4 病原菌鮭魚甲病毒 (SAV) 的檢測
病原菌鮭魚甲病毒(SAV)的完整基因組(GenBank登錄號KC122926)的一段984-bp部分序列(自第33至1016個核苷酸)被插入T&A™選殖載體中(Yeastern biotech，台灣)，以得到pTA-IPNV質體。
透過使用一商用套組(例如，但不限於，MAXIscript® Kit; Thermo Fisher Scientific，麻州，美國)對SAV的該984-bp部分序列的DNA序列進行轉錄，以製備SAV的體外轉錄RNA模板。
此外，收集來自養殖場的鮭魚心臟組織，並進行測試以評估iiPCR用於野外樣本上的表現。來自鮭魚養殖場的鮭魚被診斷得到鮭魚甲病毒(SAV)。藉由使用商業套組(例如，但不限於FavorPrep™病毒核酸萃取套組；Favorgen Biotech Corp.，台灣)萃取來自組織的RNA萃取物。以在波長260/280 nm下測量吸光率來評估總RNA的純度。
1. iiPCR
50 µl的PCR混合物含有pTA-SAV質體、0.01-2 µM前置引子SAVF1、SAVF2或SAVF3 (分別為SEQ ID NOs: 11、12或13)、0.01-2 µM後置引子SAVR1、SAVR2或SAVR3 (分別為SEQ ID NOs: 14、15或16)、0.01-2 µM探針SAVP1 (5’ FAM-CGTGAGTTGTAAAGTAAAG-MGB 3’, SEQ ID NO: 17)、1X qPCR緩衝液以及1-5 U Taq DNA聚合酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一iiPCR儀中一段指定的時間(約1小時)。以該iiPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。此外，擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
iiPCR的結果如圖4A所示。如圖4A所示，第2、4及6道的條帶顯示，本發明的引子primers SAVF1與 SAVR1、SAVF2與SAVR2、SAVF3與SAVR3分別正確地擴增70-bp、85-bp以及70-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在負對照組中則無目標序列被擴增(第1、3及5道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在負對照組中則未偵測到螢光訊號。
此外，以不同拷貝數(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 個拷貝數)的 pTA-SAV DNA質體，或以不同拷貝數(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)的SAV體外轉錄RNA模板，或以來自得到鮭魚甲病毒(SAV)的魚類而來的總RNA萃取物(分別為原液與稀釋至10-1 , 10-3 , 10-4 , 10-5 , 10-6 倍數)，重複上述iiPCR分析試驗，以評估引子SAVF1 (SEQ ID NO: 11)與SAVR1 (SEQ ID NO: 14)以及探針SAVP1 (SEQ ID NO: 17)的敏感度。以總RNA萃取物進行iiPCR分析的試驗，還加入50 U MMLV RTase與4 U RNase抑制劑至反應物中。敏感度測試的結果分別如圖4B、4C、4D所示。
如圖4B所示，第1至4道的條帶顯示，該引子SAVF1與SAVR1可正確地擴增70-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在101 拷貝數的pTA-SAV DNA質體以及負對照組中則無目標序列被擴增(第5與6道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在第5與6道中則未偵測到螢光訊號。
如圖4C所示，第3至7道的條帶顯示，該引子SAVF1與SAVR1可正確地擴增70-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在負對照組與101 個拷貝數的SAV體外轉錄RNA中則無目標序列被擴增(第1與2道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在第1與2道中則未偵測到螢光訊號。
如圖4D所示，第1至6道的條帶顯示，該引子SAVF1與SAVR1可正確地擴增70-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在負對照組中則無目標序列被擴增(第7道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在負對照組中則未偵測到螢光訊號。重複此SAV的RNA樣本的敏感性試驗5次(n = 5)的統計數據如表6所示。 【表6】引子SAVF1、SAVR1與探針SAVP1的敏感度測試結果(n = 5)
2. 即時PCR
以稀釋的pTA-SAV質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pTA-SAV質體、0.01-2 µM前置引子SAVF1 (SEQ ID NO: 11)、0.01-2 µM後置引子SAVR1 (SEQ ID NO: 14)、0.01-2 µM探針SAVP1 (5’ FAM-CGTGAGTTGTAAAGTAAAG-MGB 3’, SEQ ID NO: 17)總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42°C 5分鐘、94°C 10秒，以及40個循環的94°C 10秒以及60°C 30分鐘。在60°C的步驟中記錄螢光測量的結果。
如圖4E所示，計算連續稀釋(10倍)的pTA-SAV質體的即時PCR分析的標準曲線。至少10個拷貝數的pUC57-BC質體可被偵測到。該標準曲線的R2 值為0.99046，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
該結果表明，本發明的引子對與探針可用於iiPCR擴增反應以檢測鮭魚甲病毒(SAV)的存在，並且具有高度敏感度。
實施例 5 病原菌感染性鮭魚貧血病毒 (ISAV) 的檢測
病原菌感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)的非結構蛋白與基質蛋白的基因(GenBank登錄號DQ785286)被插入T&A™選殖載體中(Yeastern biotech，台灣)，以得到pTA-ISAV質體。
此外，收集來自養殖場的鮭魚心臟組織，並進行測試以評估iiPCR用於野外樣本上的表現。來自鮭魚養殖場的鮭魚被診斷得到感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)。藉由使用商業套組(例如，但不限於FavorPrep™病毒核酸萃取套組；Favorgen Biotech Corp.，台灣)萃取來自組織的RNA萃取物。以在波長260/280 nm下測量吸光率來評估總RNA的純度，且以瓊脂凝膠(1%)在TAE緩衝液中確認RNA的品質，並且以溴化乙錠染色顯現。
1. 傳統PCR
進行傳統PCR所用的50 µl PCR混合物含有：稀釋的pTA-ISAV質體(分別為105 , 104 , 103 , 102 , 101 個拷貝數)、0.01-2 µM前置引子ISAVF1 (SEQ ID NO: 18)、0.01-2 µM後置引子ISAVR1 (SEQ ID NO: 20)、0.2 µM dNTP以及1.25U Taq DNA聚合酶。在一熱循環儀(例如，但不限於PC818, Astec Co. Ltd.，日本)中進行擴增反應，且包含一個變性的初始循環94°C持續3分鐘，以及35個循環的94°C 30秒、60°C 30秒以及72°C延展30秒。擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。
傳統PCR的結果如圖5A所示。如圖5A所示，第1至3道的條帶顯示，本發明的引子ISAVF1與ISAVR1正確地擴增92-bp的目標序列，而在負對照組中則無目標序列被擴增(第6道)。該結果表明，該引子對可用於傳統PCR擴增反應以檢測感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)的存在。
2. iiPCR
50 µl的PCR混合物含有pTA-ISAV質體、0.01-2 µM前置引子ISAVF1或ISAVF2 (分別為SEQ ID NOs: 18或19)、0.01-2 µM後置引子ISAVR1或ISAVR2 (分別為SEQ ID NOs: 20或21)、0.01-2 µM探針ISAVP1 (5’ FAM-CGACGATGACTCTCTACTGTGT-MGB 3’, SEQ ID NO: 22)或 ISAVP2 (5’ FAM- CGATGACTCTCTACTGTGTGA -MGB 3’, SEQ ID NO: 38)、1X qPCR緩衝液以及1-5 U Taq DNA聚合酶。將PCR混合物加入一反應試管中，並置於一iiPCR儀中一段指定的時間(約1小時)。以該iiPCR儀偵測每個樣本中的FAM螢光。此外，擴增的產物接著以15%聚丙烯醯胺凝膠在TAE緩衝液中分析，並且以溴化乙錠染色顯現。iiPCR的結果如圖5B及5C所示。
如圖5B所示，第1、3、5及7道的條帶顯示，本發明的引子ISAVF1與ISAVR1、ISAVF1與ISAVR2、ISAVF2與ISAVR2分別正確地擴增92-bp、93-bp以及128-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在負對照組中則無目標序列被擴增(第1、3、5及7道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在負對照組中則未偵測到螢光訊號。
如圖5C所示，第5、6及7道的條帶顯示，該引子ISAVF1 (SEQ ID NO: 18)與ISAVR1 (SEQ ID NO: 20)可在含有104 , 105 , 106 個拷貝數的pTA-ISAV質體樣本中正確地擴增92-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在負對照組以及含有101 、102 、103 個拷貝數的pTA-ISAV DNA質體的樣本中，則無目標序列被擴增(第1至4道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在第1至4道中則未偵測到螢光訊號。
以來自得到感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)的魚類而來的總RNA萃取物(分別為稀釋至10-2 , 10-3 , 10-4 , 10-5 , 10-6 , 10-7 倍數)，重複上述iiPCR分析試驗，以評估引子 ISAVF1 (SEQ ID NO: 18)與ISAVR1 (SEQ ID NO: 20)以及探針ISAVP2 (5’ FAM- CGATGACTCTCTACTGTGTGA -MGB 3’, SEQ ID NO: 38)的敏感度。以總RNA萃取物進行iiPCR分析的試驗，還加入50 U MMLV RTase與4 U RNase抑制劑至反應物中。重複該iiPCR分析試驗5次(n = 5)，其結果如表7及圖5D所示。 【表7】引子ISAVF1、ISAVR1與探針ISAVP1的敏感度測試結果(n = 5)
如圖5D所示，第4至7道的條帶顯示，該引子ISAVF1與ISAVR1可正確地擴增92-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在負對照組以及稀釋至10-6 、10-7 倍的RNA樣本中則無目標序列被擴增(第1至3道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在負對照組以及稀釋至10-6 、10-7 倍的RNA樣本中則未偵測到螢光訊號。
以萃取自鮭魚肌肉組織的DNA萃取物以及不同魚類病原菌的DNA/RNA模板(分別為 SAV、IPNV、NNV、PRV以及ISAV)進行iiPCR，以分析引子ISAVF1 (SEQ ID NO: 18)、ISAVR1 (SEQ ID NO: 20)與探針ISAVP2 (SEQ ID NO: 38)的專一性。
iiPCR的結果如圖5E所示。如圖5E所示，只有在含有ISAV的RNA模板的樣本中(第7道)可以正確地擴增92-bp的目標序列(如箭頭所指)，而在負對照組以及含SAV、IPNV、NNV、PRV的DNA/RNA模板以及萃取自鮭魚肌肉組織的DNA萃取物的樣本中則無目標序列被擴增(第1至6道)。此外，以該iiPCR儀在相同的樣本中偵測到顯著的探針水解反應(即偵測到螢光)，而在第1至6道中則未偵測到螢光訊號。
3. 即時PCR
以稀釋的pTA-ISAV質體(分別為101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數)於一即時PCR儀(例如，但不限於ABI StepOnePlusTM ; Applied BioSystem, Life Technologies，加州，美國)中進行即時PCR分析。以含有2 µl pUC57-BC質體、0.01-2 µM前置引子ISAVF1 (SEQ ID NO: 18)、0.01-2 µM後置引子ISAVR1 (SEQ ID NO: 20)、0.01-2 µM探針ISAVP2 (5’ FAM- CGATGACTCTCTACTGTGTGA -MGB 3’, SEQ ID NO: 38)總體積為20 µl的商用RT-PCR套組(例如，但不限於，OneStep PrimeScriptTM RT-PCR Kit; Takara Bio Inc.，日本)進行即時PCR分析。即時PCR的程序為42°C 5分鐘、94°C 10秒，以及40個循環的94°C 10秒以及60°C 30分鐘。在60°C的步驟中記錄螢光測量的結果。
如圖5F所示，計算連續稀釋(10倍)的pTA-IPNV質體的即時PCR分析的標準曲線。至少100個拷貝數的pTA-IPNV質體可被偵測到。該標準曲線的R2 值為0.992，表示本發明的引子對與探針可以被用於即時PCR，並產生可信的結果。
該結果表明，本發明的引子對與探針可用於iiPCR擴增反應以檢測感染性鮭魚貧血病毒(ISAV)的存在，並且具有高度敏感度及專一性。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。
綜上所述，本案所揭露之技術特徵已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請　貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。
圖 1A 所示為使用引子BCF1與BCR1進行傳統PCR檢測鮭魚病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola 的結果；第1至11道：分別以1010 , 109 , 108 , 107 , 106 , 105 , 104 , 103 , 102 , 101 , 100 個拷貝數的pUC57-BC質體進行傳統PCR的結果；第12道：不含DNA模板所進行之傳統PCR的結果(負對照組)。圖 1B 所示為使用引子BCF1、BCR1與探針BCP1進行iiPCR檢測的結果；第1道：不含DNA模板所進行之iiPCR的結果(負對照組)；第2至7道：分別以101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數的pUC57-BC質體進行iiPCR的結果。圖 1C 所示為以iiPCR分析引子BCF1、BCR1與探針BCP1的專一性的結果；第1道：不含DNA模板所進行之iiPCR的結果(負對照組)；第2至8道：分別以鮭魚鰓、SAV、IPNV、ISAV、NNV、PRV以及pUC57-BC質體的DNA/RNA模板進行iiPCR的結果。圖 1D 所示為使用不同引子與探針BCP2進行iiPCR檢測的結果；第1與2道：以引子BCF2、BCR2與探針BCP2在不含DNA模板(第1道，負對照組)以及含DNA模板(第2道)下進行iiPCR的結果；第3與4道：以引子BCF3、BCR3與探針BCP2在不含DNA模板(第3道，負對照組)以及含DNA模板(第4道)下進行iiPCR的結果；第5與6道：以引子BCF4、BCR4與探針BCP2在不含DNA模板(第5道，負對照組)以及含DNA模板(第6道)下進行iiPCR的結果。圖 1E 所示為以iiPCR分析引子BCF3、BCR3與探針BCP2的敏感度的結果；第1道：不含DNA模板所進行之iiPCR的結果(負對照組)；第2至8道：分別以100 , 101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數的pUC57-BC質體進行iiPCR的結果。圖 1F 所示為使用引子BCF3與BCR3進行即時PCR (real-time PCR)檢測鮭魚病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola ，pUC57-BC質體的結果。“M”代表分子量標記；箭頭指示目標PCR產物；“+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
圖 2A 所示為使用引子PRVF1與PRVR1進行傳統PCR檢測魚呼吸道與腸道病毒(piscine reovirus, PRV)的結果；第1至6道：分別以106 , 105 , 104 , 103 , 102 , 101 個拷貝數的pUC57-PRV質體進行傳統PCR的結果；第7道：不含DNA模板所進行之傳統PCR的結果(負對照組)。圖 2B 所示為使用引子PRVF1、PRVR1與探針PRVP1進行iiPCR檢測的結果；第1與3道：以pUC57-PRV質體進行之iiPCR的結果；第2與4道：在不含DNA模板下進行之iiPCR的結果(負對照組)。圖 2C 所示為使用不同引子與探針PRVP1進行iiPCR檢測的結果；第1與3道：以引子PRVF2、PRVR2與探針PRVP1在不含DNA模板下進行之iiPCR的結果(負對照組)；第2與4道：以引子PRVF2、PRVR2與探針PRVP1在含有pUC57-PRV質體下進行之iiPCR的結果；第5與7道：以引子PRVF3、PRVR2與探針PRVP1在不含DNA模板下進行之iiPCR的結果(負對照組)；第6與8道：以引子PRVF3、PRVR2與探針PRVP1在含有pUC57-PRV質體下進行之iiPCR的結果；第9與11道：以引子PRVF4、PRVR4與探針PRVP1在不含DNA模板下進行之iiPCR的結果(負對照組)；第10與12道：以引子PRVF4、PRVR4與探針PRVP1在含有pUC57-PRV質體下進行之iiPCR的結果。圖 2D 所示為以iiPCR分析引子PRVF2、PRVR2與探針PRVP1的敏感度的結果；第1道：不含DNA模板所進行之iiPCR的結果(負對照組)；第2至7道：分別以101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數的PRV體外轉錄RNA (in vitro transcriptional RNA)進行iiPCR的結果。圖 2E 所示為以iiPCR分析引子PRVF3、PRVR2與探針PRVP1的敏感度的結果；第1道：不含DNA模板所進行之iiPCR的結果(負對照組)；第2至7道：分別以101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數的PRV體外轉錄RNA進行iiPCR的結果。圖 2F 所示為以iiPCR分析引子PRVF5、PRVR5與探針PRVP2的敏感度的結果；第1道：不含DNA模板所進行之iiPCR的結果(負對照組)；第2至7道：分別以101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數的pUC57-PRV質體進行iiPCR的結果。圖 2G 所示為以iiPCR分析引子PRVF5、PRVR5與探針PRVP2的敏感度的結果；第1道：不含DNA模板所進行之iiPCR的結果(負對照組)；第2至7道：分別以101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數的PRV體外轉錄RNA進行iiPCR的結果。“M”代表分子量標記；箭頭指示目標PCR產物；“+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
圖 3A 所示為使用引子IPNVF1與IPNVR1進行傳統PCR檢測感染性胰臟壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)的結果；第1至5道：分別以105 , 104 , 103 , 102 , 101 個拷貝數的pTA-IPNV質體進行傳統PCR的結果；第6道：不含DNA模板所進行之傳統PCR的結果(負對照組)。圖 3B 所示為使用引子IPNVF1與IPNVR1進行反轉錄PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)檢測IPNV的結果；第1至6道：分別以102 , 103 , 104 , 105 , 106 , 107 稀釋倍數的總RNA進行RT-PCR的結果；第7道：不含RNA樣本所進行之RT-PCR的結果(負對照組)。圖 3C 所示為使用不同引子進行iiPCR檢測IPNV的結果；第1道：以引子IPNVF1、IPNVR1與探針IPNVP1與pTA-IPNV質體進行iiPCR的結果；第2道：以引子IPNVF1、IPNVR1與探針IPNVP1在不含DNA模板下進行iiPCR的結果(負對照組)；第3道：以引子IPNVF1、IPNVR2與探針IPNVP1與pTA-IPNV質體進行iiPCR的結果；第4道：以引子IPNVF1、IPNVR2與探針IPNVP1在不含DNA模板下進行iiPCR的結果(負對照組)。圖 3D 所示為以pTA-IPNV質體進行iiPCR分析引子IPNVF1、IPNVR1與探針IPNVP1的敏感度的結果；第1至5道：分別以105 , 104 , 103 , 102 , 101 拷貝數的pTA-IPNV質體進行iiPCR的結果；第6道：不含DNA模板所進行之iiPCR的結果(負對照組)。圖 3E 所示為以體外轉錄RNA進行iiPCR分析引子IPNVF1、IPNVR1與探針IPNVP1的敏感度的結果；第1道：不含DNA模板所進行之iiPCR的結果(負對照組)；第2至7道：分別以101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數的IPNV體外轉錄RNA進行iiPCR的結果。圖 3F 所示為以連續稀釋的RNA進行iiPCR分析引子IPNVF1、IPNVR1與探針IPNVP1的敏感度的結果；第1至6道：分別以原液(100 ), 103 , 104 , 105 , 106 , 107 稀釋倍數的IPNV總RNA進行iiPCR的結果；第7道：不含RNA模板所進行之iiPCR的結果(負對照組)。圖 3G 所示為以iiPCR分析引子IPNVF1、IPNVR1與探針IPNVP1的專一性的結果；第6道：不含RNA模板所進行之iiPCR的結果(負對照組)；第1至5與7道：分別以ISAV、SAV、NNV、PRV、鮭魚肌肉組織以及pTA-IPNV質體的DNA/RNA模板進行iiPCR的結果。圖 3H 所示為使用引子IPNVF1、IPNVR1進行real-time PCR檢測IPNV，pTA-IPNV質體的結果。“M”代表分子量標記；箭頭指示目標PCR產物；“+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
圖 4A 所示為使用不同引子進行iiPCR檢測鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus, SAV)的結果；第1、3與5道：分別以引子SAVF1與SAVR1、引子SAVF2與SAVR2、以及引子SAVF3與SAVR3在不含pTA-SAV質體下進行iiPCR的結果(負對照組)；第2、4與6道：分別以引子SAVF1與SAVR1、引子SAVF2與SAVR2、以及引子SAVF3與SAVR3在含有pTA-SAV質體下進行iiPCR的結果。圖 4B 所示為以pTA-SAV質體進行iiPCR分析引子SAVF1、SAVR1與探針SAVP1的敏感度的結果；第1至5道：分別以105 , 104 , 103 , 102 , 101 個拷貝數的pTA-SAV質體進行iiPCR的結果；第6道：不含DNA模板所進行之iiPCR的結果(負對照組)。圖 4C 所示為以SAV的體外轉錄RNA進行iiPCR分析引子SAVF1、SAVR1與探針SAVP1的敏感度的結果；第1道：不含DNA模板所進行之iiPCR的結果(負對照組)；第2至7道：分別以101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數的SAV的體外轉錄RNA進行iiPCR的結果。圖 4D 所示為以連續稀釋的SAV總RNA進行iiPCR分析引子SAVF1、SAVR1與探針SAVP1的敏感度的結果；第1道：含有DNA模板所進行之iiPCR的結果(正對照組)；第2至6道：分別以101 , 103 , 104 , 105 , 106 稀釋倍數的SAV RNA進行iiPCR的結果；第7道：不含RNA模板所進行之iiPCR的結果(負對照組)。圖 4E 所示為使用引子SAVF1、SAVR1進行real-time PCR檢測SAV，pTA-SAV質體的結果。“M”代表分子量標記；箭頭指示目標PCR產物；“+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
圖 5A 所示為使用引子ISAVF1與ISAVR1進行傳統PCR檢測感染性鮭魚貧血病毒(infectious salmon anemia virus, ISAV)的結果；第1至5道：分別以105 , 104 , 103 , 102 , 101 個拷貝數的pTA-ISAV質體進行傳統PCR的結果；第6道：不含DNA模板所進行之傳統PCR的結果(負對照組)。圖 5B 所示為使用不同引子與探針ISAVP1進行iiPCR檢測的結果；第1、3、5與7道：分別以引子ISAVF1與ISAVR1、引子ISAVF1與ISAVR2、引子ISAVF2與ISAVR2，以及引子ISAVF2與ISAVR1在含有pTA-ISAV質體下進行iiPCR的結果；第2、4、6與8道：分別以引子ISAVF1與ISAVR1、引子ISAVF1與ISAVR2、引子ISAVF2與ISAVR2，以及引子ISAVF2與ISAVR1在不含pTA-ISAV質體下進行iiPCR的結果(負對照組)。圖 5C 所示為以pTA-ISAV質體進行iiPCR分析引子ISAVF1、ISAVR1與探針ISAVP2的敏感度的結果；第1道：不含DNA模板所進行之iiPCR的結果(負對照組)；第2至7道：分別以101 , 102 , 103 , 104 , 105 , 106 個拷貝數的pTA-ISAV質體進行iiPCR的結果。圖 5D 所示為以連續稀釋的SAV總RNA進行iiPCR分析引子ISAVF1、ISAVR1與探針ISAVP2的敏感度的結果；第1道：不含RNA模板所進行之iiPCR的結果(負對照組)；第2至7道：分別以107 , 106 , 105 , 104 , 103 , 102 稀釋倍數的ISAV總RNA進行iiPCR的結果。圖 5E 所示為以iiPCR分析引子ISAVF1、ISAVR1與探針ISAVP2的專一性的結果；第1道：不含RNA模板所進行之iiPCR的結果(負對照組)；第2至7道：分別以SAV、IPNV、NNV、PRV、鮭魚肌肉組織，以及pTA-ISAV質體的DNA/RNA模板進行iiPCR的結果。圖 5F 所示為使用引子ISAVF1、ISAVR1進行real-time PCR檢測ISAV，pTA-ISAV質體的結果。“M”代表分子量標記；箭頭指示目標PCR產物；“+”表示在該樣本中偵測到螢光訊號，而“-”表示在該樣本中未偵測到螢光訊號。
＜110＞ 福又達生物科技股份有限公司 ＜120＞ 冷水魚病原菌鮭魚甲病毒以及感染性鮭魚貧血病毒檢測方法 ＜130＞ P17-0166 ＜150＞ US 61/981,311 ＜151＞ 2014-04-18 ＜160＞ 38 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 25 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola的前置引子 ＜400＞ 1 gcgaaagtta agctaatacc gcata 25 ＜210＞ 2 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola的反置引子 ＜400＞ 2 taatcagcca tcagccgctc 20 ＜210＞ 3 ＜211＞ 17 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola的探針 ＜400＞ 3 caggctttcc tctccca 17 ＜210＞ 4 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌魚呼吸道與腸道病毒(piscine reovirus, PRV)的前置引子 ＜400＞ 4 tcaacgttat cggctggga 19 ＜210＞ 5 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌魚呼吸道與腸道病毒(piscine reovirus, PRV)的反置引子 ＜400＞ 5 gaatccgctg cagatgagta gag 23 ＜210＞ 6 ＜211＞ 17 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌魚呼吸道與腸道病毒(piscine reovirus, PRV)的探針 ＜400＞ 6 ctccaggagt cattgtc 17 ＜210＞ 7 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌感染性胰臟壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)的前置引子 ＜400＞ 7 tccaaagctc cacactaccg 20 ＜210＞ 8 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌感染性胰臟壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)的反置引子 ＜400＞ 8 ctcagacaga ctgccttcga a 21 ＜210＞ 9 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌感染性胰臟壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)的反置引子 ＜400＞ 9 tccacctcag acagactgcc t 21 ＜210＞ 10 ＜211＞ 16 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌感染性胰臟壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus, IPNV)的探針 ＜400＞ 10 acgctcaacg ctgcca 16 ＜210＞ 11 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus, SAV)的前置引子 ＜400＞ 11 caccagtatc tgcctgaacg a 21 ＜210＞ 12 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus, SAV)的前置引子 ＜400＞ 12 cggacacgtc actggaaac 19 ＜210＞ 13 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus, SAV)的前置引子 ＜400＞ 13 gaaaccacca gtatctgcct ga 22 ＜210＞ 14 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus, SAV)的反置引子 ＜400＞ 14 cacgtcctgg tacactgcaa 20 ＜210＞ 15 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus, SAV)的反置引子 ＜400＞ 15 tcctggtaca ctgcaatatc gg 22 ＜210＞ 16 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus, SAV)的反置引子 ＜400＞ 16 cctggtacac tgcaatatcg g 21 ＜210＞ 17 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus, SAV)的探針 ＜400＞ 17 cgtgagttgt aaagtaaag 19 ＜210＞ 18 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌感染性鮭魚貧血病毒(infectious salmon anemia virus, ISAV)的前置引子 ＜400＞ 18 ccaattggtg aacggaatga 20 ＜210＞ 19 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌感染性鮭魚貧血病毒(infectious salmon anemia virus, ISAV)的前置引子 ＜400＞ 19 ccagaaggga aaatggtgaa ag 22 ＜210＞ 20 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌感染性鮭魚貧血病毒(infectious salmon anemia virus, ISAV)的反置引子 ＜400＞ 20 tcatcagtgt cgccatgctt 20 ＜210＞ 21 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌感染性鮭魚貧血病毒(infectious salmon anemia virus, ISAV)的反置引子 ＜400＞ 21 ctcatcagtg tcgccatgct 20 ＜210＞ 22 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌感染性鮭魚貧血病毒(infectious salmon anemia virus, ISAV)的探針 ＜400＞ 22 cgacgatgac tctctactgt gt 22 ＜210＞ 23 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola的前置引子 ＜400＞ 23 ttgacatgtg cggaagctg 19 ＜210＞ 24 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola的反置引子 ＜400＞ 24 ccaacatctc acgacacgag 20 ＜210＞ 25 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola的前置引子 ＜400＞ 25 gacatgtgcg gaagctgtaa ga 22 ＜210＞ 26 ＜211＞ 17 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola的反置引子 ＜400＞ 26 acgacagcca tgcagca 17 ＜210＞ 27 ＜211＞ 18 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola的前置引子 ＜400＞ 27 tgacatgtgc ggaagctg 18 ＜210＞ 28 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola的反置引子 ＜400＞ 28 cccaacatct cacgacacg 19 ＜210＞ 29 ＜211＞ 15 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌Candidatus Branchiomonas cysticola的探針 ＜400＞ 29 cggcgtgcct gagaa 15 ＜210＞ 30 ＜211＞ 17 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌魚呼吸道與腸道病毒(piscine reovirus, PRV)的前置引子 ＜400＞ 30 atcggctggg agcaatg 17 ＜210＞ 31 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌魚呼吸道與腸道病毒(piscine reovirus, PRV)的反置引子 ＜400＞ 31 tctactccgt tgaatccgct 20 ＜210＞ 32 ＜211＞ 17 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌魚呼吸道與腸道病毒(piscine reovirus, PRV)的前置引子 ＜400＞ 32 tgggagcaat gggatgc 17 ＜210＞ 33 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌魚呼吸道與腸道病毒(piscine reovirus, PRV)的前置引子 ＜400＞ 33 tctctggtct caacgttatc gg 22 ＜210＞ 34 ＜211＞ 17 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌魚呼吸道與腸道病毒(piscine reovirus, PRV)的反置引子 ＜400＞ 34 ccgttgaatc cgctgca 17 ＜210＞ 35 ＜211＞ 23 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌魚呼吸道與腸道病毒(piscine reovirus, PRV)的前置引子 ＜400＞ 35 gggttctctg gtctcaacgt tat 23 ＜210＞ 36 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌魚呼吸道與腸道病毒(piscine reovirus, PRV)的反置引子 ＜400＞ 36 accggcgaca atgactcct 19 ＜210＞ 37 ＜211＞ 19 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌魚呼吸道與腸道病毒(piscine reovirus, PRV)的探針 ＜400＞ 37 caatgggatg ctaacactc 19 ＜210＞ 38 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 用於檢測病原菌感染性鮭魚貧血病毒(infectious salmon anemia virus, ISAV)的探針 ＜400＞ 38 cgatgactct ctactgtgtg a 21

Claims (15)

  1. 一種冷水魚病原菌檢測方法，包含： 提供一可能含有在冷水魚中的病原菌的一或多個核苷酸序列的樣本； 提供一寡核苷酸引子對，該寡核苷酸引子對定義在該病原菌的一或多個核苷酸序列上一雙股目標序列的二互補股的5’端； 提供一聚合酶； 在一容器中混合該樣本、該寡核苷酸引子對、該聚合酶、去氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphates, dATPs)、去氧胞核苷三磷酸(deoxycytidine triphosphates, dCTPs)、去氧鳥苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphates, dGTPs)，以及去氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphates, dTTPs)，以形成一聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)混合物； 透過在一固定溫度下加熱該容器的底部，使該PCR混合物進行隔絕恆溫聚合酶連鎖反應(insulated isothermal polymerase chain reaction, iiPCR)，以形成一PCR產物； 偵測該PCR產物以辨識該雙股目標序列。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該病原菌為鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus, SAV)，且該寡核苷酸引子對包含一第一引子與一第二引子，該第一引子的序列選自於由SEQ ID NOs: 11, 12以及13所組成的群組，該第二引子的序列選自於由SEQ ID NOs: 14, 15以及16所組成的群組。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該病原菌為感染性鮭魚貧血病毒(infectious salmon anemia virus, ISAV)，且該寡核苷酸引子對包含一第一引子與一第二引子，該第一引子的序列如SEQ ID NOs: 18或19所示，該第二引子的序列如SEQ ID NO: 20或21所示。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該聚合酶連鎖反應(PCR)混合物進一步包含一寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針包含一與該雙股目標序列的一區段互補的序列、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子，以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子，當該寡核苷酸探針未雜合於該雙股目標序列的該區段時，該螢光抑制分子大體上抑制該螢光分子，且當該寡核苷酸探針雜合於該雙股目標序列的該區段時，該螢光分子大體上未被抑制。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該病原菌為鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus, SAV)，且該寡核苷酸引子對包含一第一引子與一第二引子，該第一引子的序列選自於由SEQ ID NOs: 11, 12以及13所組成的群組，該第二引子的序列選自於由SEQ ID NOs: 14, 15以及16所組成的群組，且該寡核苷酸探針為一介於該病原菌SAV的完整基因組的第446至第534個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該寡核苷酸探針的序列如SEQ ID NO: 17所示。
  7. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該病原菌為感染性鮭魚貧血病毒(infectious salmon anemia virus, ISAV)，且該寡核苷酸引子對包含一第一引子與一第二引子，該第一引子的序列如SEQ ID NOs: 18或19所示，該第二引子的序列如SEQ ID NO: 20或21所示，且該寡核苷酸探針為一介於該病原菌ISAV的非結構蛋白與基質蛋白的基因的第178至第305個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該寡核苷酸探針的序列如SEQ ID NOs: 22或38所示。
  9. 一種用於偵測冷水魚病原菌的寡核苷酸對。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之寡核苷酸對，其中該病原菌為鮭魚甲病毒(salmonid alphavirus, SAV)，且該寡核苷酸對包含一第一引子與一第二引子，該第一引子的序列選自於由SEQ ID NOs: 11, 12以及13所組成的群組，該第二引子的序列選自於由SEQ ID NOs: 14, 15以及16所組成的群組。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之寡核苷酸對，進一步包含一寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針包含一介於該病原菌SAV的完整基因組的第446至第534個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子，以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之寡核苷酸對，其中該寡核苷酸探針的序列如SEQ ID NO: 17所示。
  13. 如申請專利範圍第9項所述之寡核苷酸對，其中該病原菌為感染性鮭魚貧血病毒(infectious salmon anemia virus, ISAV)，且該寡核苷酸對包含一第一引子與一第二引子，該第一引子的序列如SEQ ID NOs: 18或19所示，該第二引子的序列如SEQ ID NO: 20或21所示。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之寡核苷酸對，進一步包含一寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針包含一介於該病原菌ISAV的非結構蛋白與基質蛋白的基因的第178至第305個核苷酸之間的13至25個鹼基對的寡核苷酸、一附加於該寡核苷酸探針上的一第一位置的螢光分子，以及一附加於該寡核苷酸探針上的一第二位置的螢光抑制分子。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之寡核苷酸對，其中該寡核苷酸探針的序列如SEQ ID NOs: 22或38所示。
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