CN102647988A

CN102647988A - 鱼呼肠弧病毒免疫原性组合物

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Publication number: CN102647988A
Application number: CN2010800446027A
Authority: CN
Inventors: W·I·利普金; R·T·康托普; G·帕拉西奥斯; E·布龙
Original assignee: National Veterinary Institute; Columbia University in the City of New York
Current assignee: National Veterinary Institute; Columbia University in the City of New York
Priority date: 2009-10-02
Filing date: 2010-10-04
Publication date: 2012-08-22
Also published as: CL2016000240A1; EP2482825A1; EP2482824A1; EP2482824B1; WO2011041790A1; US20130058968A1; EP2482825B1; EP2482825A4; JP2013506672A; EP2482824A4; CA2776386A1; CL2013002907A1; US9395356B2; US20130072542A1; WO2011041789A1; CL2012000821A1; CA2776534A1; DK201170227A; US20160287694A1; US9366667B2

Abstract

本发明涉及免疫原性组合物以及用于诱导动物体内针对鱼呼肠弧病毒(PRV)的免疫反应的方法。在另一方面，本发明涉及与鱼呼肠弧病毒多肽结合的抗体。在又一方面，本发明涉及用于预防或降低动物体内PRV感染的方法。

Description

鱼呼肠弧病毒免疫原性组合物

【技术领域】

本申请要求2009年10月2日提交的美国临时专利申请No.61/248,058、2010年4月16日提交的美国临时专利申请No.61/325,047和2010年9月7日提交的美国临时专利申请No.61/380,594的权益和优先权，这些临时申请的全部内容据此以引用的方式并入以用于所有目的。

所有出版物、专利申请、专利以及在本文中提到的其它参考文献的全部内容通过引用的方式并入。本文提及的专利和科学文献确立了对本领域技术人员而言可用的知识。本文所引用的已公布的专利、申请和其它出版物据此以引用的方式并入，其程度如同具体且单独地指明各文献均以引用的方式并入。如果存在不一致的情况，以本公开内容为准。

【发明背景】

鱼类正日益成为食品和收入的重要来源；全球年消耗量预计从2010年的1.1亿吨上升至2030年的2亿吨以上。鉴于野生鱼类的捕捞率由于过度捕捞和栖息地丧失而疲软或下降，全球海水养殖产量正在以每年超过8％的速度增长。然而，水产养殖中传染性疾病的出现威胁到生产，也可对野生鱼类种群造成影响。大西洋鲑鱼(Salmo salar L.)是其中最普遍的养殖鱼类，其年产量超过一百万吨。大西洋鲑鱼海水养殖一直与传染性疾病的流行相关，而这些传染性疾病不仅威胁到当地生产，也对海产养殖围栏附近的野生鱼类或者从围栏中逃出的鱼类造成威胁。心脏和骨骼肌炎症(HSMI)是一种频发的养殖大西洋鲑鱼的致命疾病。1999年在挪威的一家养殖场中首次发现了HSMI(Kongtorp等，J Fish Dis 27，351-358(2004))，随后在挪威和英国的其它农场中爆发HSMI(Ferguson等，J Fish Dis 28，119-123(2005))。尽管病理学和疾病传播研究已指出其传染基础，但鉴定致病因子的努力均以失败告终。

HSMI是可传染的，但此前并未分离出致病因子。HSMI是一种威胁水产养殖的重要疾病。需要适于预防和遏制PRV感染并治疗患有HSMI的动物的免疫原性组合物和疫苗。本发明致力于解决这些需求。

【发明概述】

本发明涉及鱼呼肠孤病毒(PRV)(与鲑鱼HSMI相关的新型正呼肠孤病毒样病毒)、分离的核酸序列及其肽。本发明还涉及针对来自PRV的抗原的抗体及产生此种抗体的方法。本发明还涉及诱导动物体内针对PRV的免疫反应的免疫原性组合物。

在一方面，本发明提供了一种PRV免疫原性组合物，其包含PRV核酸。在一个实施方案中，所述PRV核酸为SEQ ID NO：1-10中任何一个的核酸序列。在另一个实施方案中，所述PRV核酸包含SEQ IDNO：1-10中任何一个的至少24个连续核酸。在又一个实施方案中，所述PRV核酸与SEQ ID NO：1-10中任何一个的核酸序列基本上同一。在又一个实施方案中，所述PRV核酸是具有与SEQ ID NO：1-10至少约85％同一性的SEQ ID NO：1-10中任何一个的变体。在一个实施方案中，所述变体与SEQ ID NO：1-10中任何一个具有至少约90％、约95.5％、约96％、约96.5％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％或约99.9％的同一性。

在另一方面，本发明提供了一种PRV免疫原性组合物，其包含PRV多肽。在一个实施方案中，所述PRV多肽为由SEQ ID NO：1-10中任何一个编码的多肽。在另一个实施方案中，所述PRV多肽为由包含SEQ ID NO：1-10中任何一个的至少24个连续核酸的核酸编码的多肽。在另一个实施方案中，所述PRV多肽为由与SEQ ID NO：1-10中任何一个的核酸序列基本上同一的核酸编码的多肽。在又一个实施方案中，所述PRV多肽为由核酸编码的多肽，所述核酸为与SEQ IDNO：1-10具有至少约85％同一性的SEQ ID NO：1-10中任何一个的变体。在又一个实施方案中，所述变体与SEQ ID NO：1-10中任何一个具有至少约90％、约95.5％、约96％、约96.5％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％或约99.9％的同一性。在又一个实施方案中，所述PRV多肽为包含SEQ ID NO：29-40的氨基酸序列的多肽。在又一个实施方案中，所述PRV多肽为包含SEQ ID NO：29-40中任何一个的至少8个连续氨基酸的多肽。在又一个实施方案中，所述PRV多肽与SEQ ID NO：29-40中任何一个的氨基酸序列基本上同一。在又一个实施方案中，所述PRV多肽为SEQ ID NO：29-40中任何一个的变体且与SEQ ID NO：29-40具有至少约85％的同一性。在又一个实施方案中，所述变体与SEQ ID NO：29-40中任何一个具有至少约90％、约95.5％、约96％、约96.5％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％或约99.9％的同一性。

在另一方面，本发明提供了一种与PRV或PRV多肽结合并抑制、中和或降低所述PRV或PRV多肽的功能或活性的抗体。在一个实施方案中，所述抗体为多克隆抗体。在另一个实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。在又一个实施方案中，所述抗体为硬骨鱼抗体。在又一个实施方案中，所述抗体为鲑鱼抗体。在又一个实施方案中，所述抗体为IgM抗体。在又一个实施方案中，所述抗体为嵌合抗体。

在另一方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含含有PRV多肽的灭活病毒。在又一方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含含有PRV多肽的减毒病毒。在一个实施方案中，本文所述的任何一种免疫原性组合物进一步包含至少一种赋形剂、添加剂或佐剂。在一个实施方案中，本文中所述的任何一种免疫原性组合物进一步包含来自其它病毒的至少一种多肽或其片段。

在另一方面，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含融合多肽，其中所述融合多肽包含PRV多肽、片段或其变体以及来自其它病毒的至少一种多肽或其片段。在一个实施方案中，所述其它病毒选自由以下组成的组：嗜睡症病毒(SDV)；鲑鱼胰腺病病毒(SPDV)；传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)；病毒性出血性败血病病毒(VHSV)；传染性造血组织坏死病病毒(IHNV)；传染性胰坏死病毒(IPNV)；鲤鱼春病毒血症(SVC)；斑点叉尾鮰病毒(CCV)；杀鲑气单胞菌；鲑肾杆菌；粘放线菌(Moritella viscosis)；耶尔森氏鼠疫杆菌(Yersiniosis)；巴斯德杆病菌(Pasteurellosis)；鳗弧菌；火神弧菌(Vibrio logei)；病海弧菌(Vibrioordalii)；鲑弧茵；爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)；迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)；柱状纤维粘细菌(Cytophaga columnari)或鲑鱼立克次氏菌(Piscirickettsia salmonis)。

在另一方面，本发明提供了一种诱导动物体内免疫反应的方法，所述方法包括施用本文所述的任何一种PRV免疫原性组合物。

在另一方面，本发明提供了一种预防或降低动物体内PRV感染的方法，所述方法包括施用本文所述的任何一种PRV免疫原性组合物。

在另一方面，本发明提供了一种预防或降低动物体内PRV感染的方法，所述方法包括施用本文所述的任何一种动物抗体。

在一个实施方案中，本文所述方法中的任何施用为口服施用、浸泡施用或注射施用。

在另一方面，本发明提供了本文所述的任何一种免疫原性组合物在生产用于治疗动物体内病症PRV感染的疫苗中的用途。

在另一方面，本发明提供了本文所述的任何一种免疫原性组合物在生产用于预防或降低治疗动物体内病症PRV感染的疫苗中的用途。

【附图说明】

图1：通过焦磷酸测序获取的鱼呼肠孤病毒(PRV)序列。针对PRV串联序列(concatenated sequence)对装配序列数据作图。由BLASTN、BLASTX、FASTX和FASD标识的基因组区分别用红色、蓝色、绿色和橙色示出。

图2：呼肠孤病毒RNA依赖性RNA聚合酶的系统发生分析。使用在MEGA软件上实施的ClustalX14(Tamura等，Mol Biol Evol 24，1596-1599(2007))比对全长氨基酸序列并使用T-Coffee(Notredame等，J Mol Biol 302，205-217(2000))改进，以合并蛋白质结构数据。使用p距离作为氨基酸取代的模型，由ICTV进行系统系统发生分析，以分析呼肠孤病毒科(Mertens等，T.Family Reoviridae.447-454(Elsevier Academic Press，2005))。MEGA用于产生系统树，通过邻接(NJ)法进行重构。通过对所述序列进行引导程序重取样1000次来评估特定树形拓扑的统计学显著性。

图3：归一化为鲑鱼宿主基因的病毒负载对数比的组差异图示。非参数方法用于测定健康和受HSMI影响的养殖鱼中相对病毒负载比较的统计显著性。尽管如此，仍在计算L1(病毒)/EF1A(管家基因)比率之后对所有样本进行未归一化对数比分布的对数变换，以辅助图示。图3A示出来自健康养殖鱼和患有HSMI的养殖鱼的混合心脏和肾脏样本中调整对数比的比较；＊，p＜0.0001(Mann-Whitney U)。图3B示出未患有HSMI的养殖鱼(健康养殖鱼)、HSMI爆发早期、HSMI爆发中期和HSMI爆发高峰过程中的调整对数比的比较；＊＊，p＜0.0005；＊，p＜0.01(单独Mann-Whitney U)。所有四个养殖鱼组的调整对数比也显著不同(p＜0.0001；Kruskal-Wallis)。

图4：用靶向鱼呼肠孤病毒的L2片段的锁核酸(LNA)探针进行原位杂交。在用地高辛(DIG)标记LNA探针进行杂交后接着用蛋白酶K侵入切片。将切片与小鼠单克隆抗辣根过氧化物酶一起培养并用酪胺信号扩增体系进行染色。用梅衣尔苏木精(Meyer′s hematoxylin)溶液对切片进行复染。图4A示出感染HSMI的鱼的心脏(10倍)。图4B示出感染HSMI的鱼的心脏(40倍)。图4C示出未感染HSMI的鱼的心脏(40倍)。图4D示出感染鲑鱼胰腺病病毒的鱼的心脏(40倍)。

图5：水生呼肠孤病毒和正呼肠孤病毒的λ1 ORF的系统发生分析。用BEAST、BEAUti和示踪分析软件包进行片段λ1、λ2、λ3、μ1、μ2、μ3、σ2和σNS(水生呼肠孤病毒和正呼肠孤病毒的σ1和σ3具有不同的基因组结构)间的序列差异的贝叶斯定理系统发生分析。用Dayhoff氨基酸取代模型进行10,000,000代初步分析来选择最适宜于每一个ORF的时钟和种群模型。边缘相似性的分析表明对所有的数据集都选用松散对数正态分子钟和常数种群数量模型。最终数据分析包括5,000,000-30,000,000代的MCMC链长，其中每1000个形态进行取样。彩色框表示不同呼肠孤病毒属或物种的代表。绿色，水生呼肠孤病毒属；蓝色，物种I(哺乳动物正呼肠孤病毒)；红色，物种II(鸟类正呼肠孤病毒)；紫色，物种III(纳尔逊海湾正呼肠孤病毒)；橙色，物种IV(爬行动物正呼肠孤病毒)和淡蓝色，物种V(狒狒正呼肠孤病毒)。

图6：水生呼肠孤病毒和正呼肠孤病毒的λ2 ORF的系统发生分析。用BEAST、BEAUti和示踪分析软件包进行片段λ1、λ2、λ3、μ1、μ2、μ3、σ2和σNS(水生呼肠孤病毒和正呼肠孤病毒的σ1和σ3具有不同的基因组结构)间的序列差异的贝叶斯定理系统发生分析。用Dayhoff氨基酸取代模型进行10,000,000代初步分析来选择出最适宜于每一个ORF的时钟和种群模型。边缘相似性的分析表明对所有的数据集都选用松散对数正态分子钟和常数种群数量模型。最终数据分析包括5,000,000-30,000,000代的MCMC链长，其中每1000个形态进行取样。彩色框表示不同呼肠孤病毒属或物种的代表。绿色，水生呼肠孤病毒属；蓝色，物种I(哺乳动物正呼肠孤病毒)；红色，物种II(鸟类正呼肠孤病毒)；紫色，物种III(纳尔逊海湾正呼肠孤病毒)；橙色，物种IV(爬行动物正呼肠孤病毒)和淡蓝色，物种V(狒狒正呼肠孤病毒)。

图7：水生呼肠孤病毒和正呼肠孤病毒的λ3 ORF的系统发生分析。用BEAST、BEAUti和示踪分析软件包进行片段λ1、λ2、λ3、μ1、μ2、μ3、σ2和σNS(水生呼肠孤病毒和正呼肠孤病毒的σ1和σ3具有不同的基因组结构)间的序列差异的贝叶斯定理系统发生分析。用Dayhoff氨基酸取代模型进行10,000,000代初步分析来选择出最适宜于每一个ORF的时钟和种群模型。边缘相似性的一项分析表明对所有的数据集都选用松散对数正态分子钟和常数种群数量模型。最终数据分析包括5,000,000-30,000,000代的MCMC链长，其中每1000个形态进行取样。彩色框表示不同呼肠孤病毒属或物种的代表。绿色，水生呼肠孤病毒属；蓝色，物种I(哺乳动物正呼肠孤病毒)；红色，物种II(鸟类正呼肠孤病毒)；紫色，物种III(纳尔逊海湾正呼肠孤病毒)；橙色，物种IV(爬行动物正呼肠孤病毒)和淡蓝色，物种V(狒狒正呼肠孤病毒)。

图8：水生呼肠孤病毒和正呼肠孤病毒属的Mu-1 ORF的系统发生分析。用BEAST、BEAUti和示踪分析软件包进行片段λ1、λ2、λ3、μ1、μ2、μ3、σ2和σNS(水生呼肠孤病毒和正呼肠孤病毒的σ1和σ3具有不同的基因组结构)间的序列差异的贝叶斯定理系统发生分析。用Dayhoff氨基酸取代模型进行10,000,000代初步分析来选择出最适宜于每一个ORF的时钟和种群模型。边缘相似性的分析表明对所有的数据集都选用松散对数正态分子钟和常数种群数量模型。最终数据分析包括5,000,000-30,000,000代的MCMC链长，其中每1000个形态进行取样。彩色框表示不同呼肠孤病毒属或物种的代表。绿色，水生呼肠孤病毒属；蓝色，物种I(哺乳动物正呼肠孤病毒)；红色，物种II(鸟类正呼肠孤病毒)；紫色，物种III(纳尔逊海湾正呼肠孤病毒)；橙色，物种IV(爬行动物正呼肠孤病毒)和淡蓝色，物种V(狒狒正呼肠孤病毒)。

图9：水生呼肠孤病毒和正呼肠孤病毒属的Mu-2 ORF的系统发生分析。用BEAST、BEAUti和示踪分析软件包进行片段λ1、λ2、λ3、μ1、μ2、μ3、σ2和σNS(水生呼肠孤病毒和正呼肠孤病毒的σ1和σ3具有不同的基因组结构)间的序列差异的贝叶斯定理系统发生分析。用Dayhoff氨基酸取代模型进行10,000,000代初步分析来选择出最适宜于每一个ORF的时钟和种群模型。边缘相似性的分析表明对所有的数据集都选用松散对数正态分子钟和常数种群数量模型。最终数据分析包括5,000,000-30,000,000代的MCMC链长，每1000个形态进行取样。彩色框表示不同呼肠孤病毒属或物种的代表。绿色表示水生呼肠孤病毒属；蓝色，物种I(哺乳动物正呼肠孤病毒)；红色，物种II(鸟类正呼肠孤病毒)；紫色，物种III(纳尔逊海湾正呼肠孤病毒)；橙色，物种IV(爬行动物正呼肠孤病毒)和淡蓝色，物种V(狒狒正呼肠孤病毒)。

图10：水生呼肠孤病毒和正呼肠孤病毒属的Mu-3 ORF的系统发生分析。用BEAST、BEAUti和示踪分析软件包进行片段λ1、λ2、λ3、μ1、μ2、μ3、σ2和σNS(水生呼肠孤病毒和正呼肠孤病毒的σ1和σ3具有不同的基因组结构)间的序列差异的贝叶斯定理系统发生分析。用Dayhoff氨基酸取代模型进行10,000,000代初步分析来选择出最适宜于每一个ORF的时钟和种群模型。边缘相似性的分析表明对所有的数据集都选用松散对数正态分子钟和常数种群数量模型。最终数据分析包括5,000,000-0,000,000代的MCMC链长，其中每1000个形态进行取样。彩色框表示不同呼肠孤病毒属或物种的代表。绿色，水生呼肠孤病毒属；蓝色，物种I(哺乳动物正呼肠孤病毒)；红色，物种II(鸟类正呼肠孤病毒)；紫色，物种III(纳尔逊海湾正呼肠孤病毒)；橙色，物种IV(爬行动物正呼肠孤病毒)和淡蓝色，物种V(狒狒正呼肠孤病毒)。

图11：水生呼肠孤病毒和正呼肠孤病毒属的σ2 ORF的系统发生分析。用BEAST、BEAUti和示踪分析软件包进行片段λ1、λ2、λ3、μ1、μ2、μ3、σ2和σNS(水生呼肠孤病毒和正呼肠孤病毒的σ1和σ3具有不同的基因组结构)间的序列差异的贝叶斯定理系统发生分析。用Dayhoff氨基酸取代模型进行10,000,000代初步分析来选择出最适宜于每一个ORF的时钟和种群模型。边缘相似性的分析表明对所有的数据集都选用松散对数正态分子钟和常数种群数量模型。最终数据分析包括5,000,000-30,000,000代的MCMC链长，其中每1000个形态进行取样。彩色框表示不同呼肠孤病毒属或物种的代表。绿色，水生呼肠孤病毒属；蓝色，物种I(哺乳动物正呼肠孤病毒)；红色，物种II(鸟类正呼肠孤病毒)；紫色，物种III(纳尔逊海湾正呼肠孤病毒)；橙色，物种IV(爬行动物正呼肠孤病毒)和淡蓝色，物种V(狒狒正呼肠孤病毒)。

图12：水生呼肠孤病毒和正呼肠孤病毒属的σNS ORF的系统发生分析。用BEAST、BEAUti和示踪分析软件包进行片段λ1、λ2、λ3、μ1、μ2、μ3、σ2和σNS(水生呼肠孤病毒和正呼肠孤病毒的σ1和σ3具有不同的基因组结构)间的序列差异的贝叶斯定理系统发生分析。用Dayhoff氨基酸取代模型进行10,000,000代初步分析来选择出最适宜于每一个ORF的时钟和种群模型。边缘相似性的分析表明对所有的数据集都选用松散对数正态分子钟和常数种群数量模型。最终数据分析包括5,000,000-30,000,000代的MCMC链长，其中每1000个形态进行取样。彩色框表示不同呼肠孤病毒属或物种的代表。绿色，水生呼肠孤病毒属；蓝色，物种I(哺乳动物正呼肠孤病毒)；红色，物种II(鸟类正呼肠孤病毒)；紫色，物种III(纳尔逊海湾正呼肠孤病毒)；橙色，物种IV(爬行动物正呼肠孤病毒)和淡蓝色，物种V(狒狒正呼肠孤病毒)。

图13：S1的推定ORF具有与FAST蛋白类似的特性。利用TopPred程序(可从http://mobyle.pasteurfr/cgibin/portal.py？form＝toppred获取)中进行的Kyle-Doolittle算法获取ARV(红色)和PRV(蓝色)的疏水性图。序列分析表明PRV包含FAST蛋白质的主要组分：疏水区(HP)、跨膜区(TM)和碱性区(BR)。

图14：PRV感染的病理学可包括肝脏变色、心包积血、脂肪组织充血和脾肿大。

图15：焦磷酸测序覆盖度。

图16：PRV、正呼肠孤病毒和水生呼肠孤病毒的系统发生分析。

图17：HSMI诊断，诊断表明HSMI不仅浸润心外膜而且还引发了严重的心肌炎症。

图18：产生针对σ1、σ3和μ1C的抗体的方法。图18A示出外衣壳蛋白σ1、σ3、λ2、μ1c和内衣壳蛋白λ1、σ2、μ2和λ3。图18B示出由PCR扩增的σ1、σ3和μ1C全长片段。图18C示出扩增的片段可被克隆入表达载体中以产生表达构建体。所述表达可用于在表达体系中表达抗原(如大肠肝菌)。所述抗原接着可被纯化并用于对兔进行免疫。

图19：肽抗原。图19A示出由S4编码的FAST(融合相关的小跨膜蛋白)。图19B示出抗原性指数根据氨基酸位置的变化。抗原性指数越高，抗体就更可能“看到”残基的那些基团。

图20：抗血清识别出正如在大肠肝菌组氨酸标签融合蛋白的免疫印迹中所发现的μ1C蛋白。泳道11-13是纯化蛋白的洗脱液，泳道14-15是被诱导细菌沉淀的稀释液，泳道16-17是未诱导的细菌沉淀。

图21：抗血清识别出了正如在大肠肝菌组氨酸标签融合蛋白和不同的阴性对照物的免疫印迹中所发现的σ2蛋白。泳道2-4是纯化蛋白的洗脱液，泳道5-6是被诱导细菌沉淀的稀释液，泳道7-泳道8是未诱导的细菌沉淀。

图22：PRV图解。

【发明详述】

除非上下文中另外清楚地指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个提及物。

本文使用的术语“约”指近似、接近、大致或大约。术语“约”与数值范围连用时，其通过将界限扩展至高于和低于所列数值而修饰此范围。通常，本文使用的术语“约”是修饰所述数值以20％上下变动的数值。

本文使用的“PRV”指的是文中所述的鱼呼肠孤病毒的分离菌株。

本文使用的术语“动物”指的是脊椎动物，包括但不限于硬骨鱼(如鲑鱼)

本文使用的术语“PRV”多肽包括PRV多肽、PRV多肽片段或PRV多肽变体或基本上与PRV多肽同一的肽。

本文使用的术语“抗体”指的是与PRV多肽、PRV多肽片段或PRV多肽变体或基本上与PRV多肽同一的肽相结合并抑制、中和或降低PRV多肽或PRV活性或功能的抗体。术语抗体尤其不包括与PRV多肽、PRV多肽片段或PRV多肽变体或基本上与PRV多肽同一的肽相结合并且不抑制、中和或降低所述肽或所述PRV活性或功能的诊断用抗体。

海水养殖，即在海水环境中进行水产养殖，日益成为人类消费的膳食蛋白的重要来源。HSMI是在鱼从淡水转移至海水围栏后5-9个月出现(Kongtorp等，J Fish Dis 27，351-358(2004))，但纪录的最早爆发的时间是转移至海水后的14天。受感染的鱼食欲不振并表现出游水姿势反常。剖检结果通常包括心脏颜色苍白、肝脏发黄、腹水、脾肿大以及内脏周围有瘀斑。病理学的进一步的特征是心包炎、心内膜炎、心肌炎、心肌坏死、肌炎和红色骨骼肌坏死，死亡率高达20％(Kongtorp等，Dis Aquat Organ 59，217-224(2004))。虽然死亡率是可变的(高达20％)，但在受感染的网箱中，发病率可能极高。HSMI是基于组织病理学作出的诊断。主要的病变发生在心肌和红色骨骼肌，其中大面积发炎和肌细胞的多灶性坏死明显。

可以通过实验注射来自患HSMI病的鱼的组织匀浆或将鱼与患有HSMI的鱼共居(Kongtorp等，J Fish Dis 27，351-358(2004))来在首次用于实验的鱼中诱发疾病。已经观察到病毒样颗粒(Watanabe，K.等，Dis Aquat Organ70，183-192(2006))；然而，通过利用培养、消减克隆和共有聚合酶链式反应来找出传染原的努力也以失败告终。

在一方面，本发明表明HSMI与感染有称为鱼呼肠孤病毒(PRV)的新型呼肠孤病毒有关。利用新型频率分析方法及标准比对方法对通过实验方法感染的鱼的血清和心脏组织进行高通量焦磷酸测序，从而鉴定出PRV。在另一方面，本发明提供了PRV核酸序列。

在其它方面，本发明涉及表达构建体(例如质粒和载体)和分离的核酸，所述分离的核酸包含SEQ ID NO：1-10的PRV核酸序列、其片段、互补序列和/或变体。

文中所述核酸序列和多肽可用于多种应用，包括但不限于制备抗体和产生免疫原性组合物。例如，在一方面，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含由SEQ ID NO：1-10中任何一个的PRV核酸序列所编码的多肽。

在另一方面，本发明涉及一种免疫原性组合物，其包含多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：29-40中任何一个的氨基酸序列。

在一方面，本发明提供了一种分离的PRV核酸或其片段，所述分离的PRV核酸具有SEQ ID NO：1-10中任何一个的序列。

在另一方面，本发明提供了一种分离的PRV核酸或其片段，所述分离的PRV核酸包含连续核苷酸，所述连续核苷酸具有选自由SEQID NO：1-10中任何一个组成的组的序列。

在另一方面，本发明提供了一种分离的PRV核酸或其片段，其包含连续核苷酸，所述核苷酸具有选自由SEQ ID NO：1-10中任何一个的变体组成的组的序列。在一个实施方案中，所述变体与SEQ ID NO：1-10或其片段具有至少约85％的同一性。在本发明上述方面的一个实施方案中，所述变体与SEQ ID NO：1-10中任何一个的变体或其片段具有至少约90％、95.5％、约96％、约96.5％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％或约99.9％的同一性。

在一方面，本发明提供了一种分离的PRV核酸或其片段，所述分离的PRV核酸与SEQ ID NO：1-10中任何一个中的PRV核酸序列互补。

在另一方面，本发明提供了一种分离的PRV核酸或其片段，其包含连续核苷酸，所述连续核苷酸与SEQ ID NO：1-10中任何一个中的PRV核酸序列互补。

在另一方面，本发明提供了一种分离的PRV核酸或其片段，其包含连续核苷酸，所述连续核苷酸与SEQ ID NO：1-10中任何一个中的PRV核酸序列互补。在一个实施方案中，所述变体与SEQ ID NO：1-10或其片段具有至少约85％的同一性。在本发明的上述方面的一个实施方案中，所述变体与SEQ ID NO：1-10中任何一个的变体或其片段具有至少约90％、95.5％、约96％、约96.5％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％或约99.9％的同一性。

在另一方面，本发明提供了一种分离的PRV核酸或其片段，所述分离的PRV核酸具有与SEQ ID NO：1-10中任何一个中的PRV核酸序列基本上同一的序列。

在另一方面，本发明提供了一种分离的PRV核酸或其片段，所述分离的PRV核酸具有这样的序列，其与和SEQ ID NO：1-10中任何一个中的PRV核酸序列互补的序列基本上同一。

本文中所述PRV核酸序列可尤其用于PRV编码蛋白质或其片段、变体或衍生物的表达、产生针对PRV蛋白质的抗体、产生针对鱼呼肠孤病毒的疫苗以及筛选有效针对本文中所述的鱼呼肠孤病毒的药物。

在一方面，本发明提供了一种分离的PRV多肽或其片段，所述分离的PRV多肽由SEQ ID NO：1-10中的任何一个中的PRV核酸序列编码。

在一个实施方案中，所述PRV多肽片段可以是包含本文中所述PRV多肽的大约8个连续氨基酸的多肽。在另一个实施方案中，所述片段可以是包含本文中所述PRV多肽的大约10个连续氨基酸的多肽。在另一个实施方案中，所述片段可以是包含本文中所述PRV多肽的大约14个连续氨基酸的多肽。在另一个实施方案中，所述片段可以是包含本文中所述PRV多肽的大约16个连续氨基酸的多肽。在另一个实施方案中，所述片段可以是包含本文中所述PRV多肽的大约18个连续氨基酸的多肽。在另一个实施方案中，所述片段可以是包含本文中所述PRV多肽的大约20个连续氨基酸的多肽。在另一个实施方案中，所述片段可以是包含本文中所述PRV多肽的大约21个或更多个连续氨基酸的多肽。

在又一个实施方案中，所述PRV多肽片段可以是包含约8至约50、约8至约100、约8至约200、约8至约300、约8至约400、约8至约500、约8至约600、约8至约700、约8至约800、约8至约900或更多个PRV多肽的连续氨基酸的多肽。

在另一方面，本发明提供了一种由核酸编码的分离的PRV多肽或其片段，所述核酸包含具有选自SEQ ID NO：1-10中任何一个中的PRV核酸序列的序列的连续核苷酸。

在另一方面，本发明提供了一种由核酸编码的分离PRV多肽，所述核酸包含连续核苷酸，所述核苷酸具有选自SEQ ID NO：1-10中任何一个中的PRV核酸序列的变体或其片段的序列。在一个实施方案中，所述变体与SEQ ID NO：1-10或其片段具有至少约85％的同一性。在本发明上述方面的一个实施方案中，所述变体与SEQ ID NO：1-10中任何一个的变体或其片段具有至少约90％、约95.5％、约96％、约96.5％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％或约99.9％的同一性。

在一方面，本发明提供了一种由核酸编码的分离的PRV多肽或其片段，所述核酸与SEQ ID NO：1-10中任何一个中的PRV核酸序列互补。

在另一方面，本发明提供了一种由核酸编码的分离的PRV多肽或其片段，所述核酸包含SEQ ID NO：1-10中任何一个中的PRV核酸序列的连续核苷酸。

在另一方面，本发明提供了一种由核酸编码的分离的PRV多肽或其片段，所述核酸具有与SEQ ID NO：1-10中任何一个中的PRV核酸序列基本上同一的序列。

在另一方面，本发明提供了一种由核酸编码的分离的PRV多肽或其片段，所述核酸具有这样的序列，其与和SEQ ID NO：1-10中任何一个中的PRV核酸序列互补的序列基本上同一。

在一方面，本发明提供了一种分离的PRV多肽或其片段，所述分离的PRV多肽具有SEQ ID NO：29-40中任何一个的序列。

在另一方面，本发明提供了一种分离的PRV多肽或其片段，所述分离的PRV多肽包含连续氨基酸，所述氨基酸具有选自由SEQ ID NO：29-40中任何一个所组成的组的序列。

在另一方面，本发明提供了一种分离PRV多肽或其片段，所述分离PRV多肽包含连续氨基酸，所述氨基酸具有选自SEQ ID NO：29-40中任何一个的变体的序列。在一个实施方案中，所述变体与SEQ IDNO：29-40或其片段具有至少约85％的同一性。在本发明上述方面的一个实施方案中，所述变体与SEQ ID NO：1-10中任何一个的变体或其片段具有至少约90％、约95.5％、约96％、约96.5％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％或约99.9％的同一性。

在另一方面，本发明提供了一种分离PRV多肽或其片段，所述分离PRV多肽具有与SEQ ID NO：29-40中任何一个中的PRV氨基酸基本上同一的序列。

文中所述PRV多肽和氨基酸序列尤其可用于表达PRV编码蛋白质或其片段、变体或衍生物的表达以及产生针对鱼呼肠孤病毒的疫苗。

在一方面，本发明提供了一种分离的PRV多肽或其片段，所述分离的PRV多肽由SEQ ID NO：1-10中任何一个中的PRV核酸序列片段编码。

在一个实施方案中，所述分离的PRV多肽片段可以包含SEQ IDNO：29-40中任何一个的PRV氨基酸序列的大约8个连续氨基酸的多肽。在另一个实施方案中，所述片段可以是包含SEQ ID NO：29-40中任何一个的PRV氨基酸序列的大约10个连续氨基酸的多肽。在另一个实施方案中，所述片段可以是包含SEQ ID NO：29-40中任何一个的PRV氨基酸序列的大约14个连续氨基酸的多肽。在另一个实施方案中，所述片段可以是包含SEQ ID NO：29-40中任何一个的PRV氨基酸序列的大约16个连续氨基酸的多肽。在另一个实施方案中，所述片段可以是包含SEQ ID NO：29-40中任何一个的PRV氨基酸序列的大约18个连续氨基酸的多肽。在另一个实施方案中，所述片段可以是包含SEQ ID NO：29-40中任何一个的PRV氨基酸序列的大约20个连续氨基酸的多肽。在又一个实施方案中，所述片段可以是包含SEQ IDNO：29-40中任何一个的PRV氨基酸序列的大约21个或更多个连续氨基酸的多肽。

在另一个实施方案中，所述分离的PRV多肽片段可以是包含约8至约50、约8至约100、约8至约200、约8至约300、约8至约400、约8至约500、约8至约600、约8至约700、约8至约800、约8至约900或更多个SEQ ID NO：29-40中任何一个的PRV氨基酸序列的连续氨基酸的多肽。

在另一方面，本发明提供了一种分离的PRV多肽，所述分离的PRV多肽包含连续氨基酸，所述连续氨基酸具有选自SEQ ID NO：29-40中任何一个的PRV氨基酸序列的序列。

在另一方面，本发明提供了一种分离的PRV多肽或其片段，所述分离的PRV多肽包含连续氨基酸，所述连续氨基酸具有选自SEQ IDNO：29-40中任何一个的PRV氨基酸序列的变体的序列。在一个实施方案中，所述变体与SEQ ID NO：29-40中任何一个或其片段具有至少约85％的同一性。在本发明上述方面的一个实施方案中，所述变体与SEQ ID NO：29-40中任何一个或其片段具有至少约90％、约95.5％、约96％、约96.5％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％或约99.9％的同一性。

在另一方面，本发明提供了一种分离的PRV多肽其片段，所述分离PRV多肽与SEQ ID NO：29-40中任何一个的PRV氨基酸序列的变体基本上同一。

在两个核酸或多肽的情况中的“基本上同一”指的是如使用下列序列比较算法的一种或通过肉眼检验，当比较和比对最大一致时，两个或更多个具有至少98％、至少99％或更高核苷酸或氨基酸残基同一性的序列或子序列。因此，在某些实施方案中，与本文中所述PRV多肽基本上同一的多肽也可以用来产生与本文中所述PRV多肽结合的抗体。

在两个或多个核酸或多肽情况中的“同一性百分比”指的是两个或更多个序列或子序列包含的相同核苷酸或氨基酸的百分比。使用下列序列比较算法的一种或通过人工比对或肉眼检验在比较窗口比较和比对最大相似性时，指定的氨基酸残基或核苷酸百分比可具有超过指定区域的指定同一性。一方面，本发明提供了一种PRV多肽，所述PRV多肽为PRV多肽变体并与SEQ ID NO 29-40所示的PRV多肽具有至少约90％、约95.5％、约96％、约96.5％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％或约99.9％的同一性。

应理解，对于此处所述的特定PRV多肽，自然变化可存在于单个PRV菌株之间。这些变化可体现在整体序列中的氨基酸差异或所述序列中氨基酸的缺失、取代、插入、倒位或添加。Neurath等在″TheProteins″Academic Press New York(1979)中描述了氨基酸取代本质上并不改变生物和免疫活性。此外，在相关15个氨基酸间的氨基酸替换或在进化中频繁发生的替换还有Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn、Ile/Val(参见Dayhof，M.D.，Atlas of protein sequence andstructure，Nat.Biomed.Res.Found.，Washington D.C.，1978，vol.5，suppl.3)。其它20种氨基酸取代包括Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn，、Ala/Val、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Leu/Ile、Leu/Val和Ala/Glu。基于此信息，Lipman和Pearson开发了一种快速灵敏的蛋白质比较(Science，227，1435-1441，1985)和确定同源蛋白质间功能相似性的方法。只要所产生的蛋白质保持有其免疫反应性，本发明的示例性实施方案的这些氨基本取代以及具有缺失和/或插入的变化都属于本发明的范围。已知，与参考多肽相比，具有一个或更多个氨基酸序列变化的多肽序列仍可用于产生与所述参考多肽相结合的抗体。因此，在某些实施方案中，PRV多肽及与其有关的抗体和抗体产生方法涵盖了从具有至少约90％的序列同一性水平的不同病毒分离物中分离出的PRV多肽，同时还代表具有相同免疫原性特性的相同PRV蛋白。

所述序列同一性可以通过序列比较算法的分析或通过肉眼检验来确定。可以用本领域已知的多种序列比较算法和程序中的任一种评估蛋白质和/或核酸序列同一性(同源性)。

对于序列比较，一般是一个序列作为参考序列，测试序列与参考序列相比较。当用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入电脑，如有必要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或者指定可选参数。然后基于程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。对于核酸和蛋白质的序列比较，可以使用BLAST和BLAST 2.2.2.或FASTA 3.0t78版本的算法和下面讨论的缺省参数。

适用于确定序列同一性和序列相似性的算法的一个实例是FASTA算法，这在Pearson，W.R.和Lipman，D.J.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444，1988进行了描述。也可参看W.R.Pearson，Methods Enzymol.266：227-258，1996。对用在DNA序列的FASTA比对中来计算同一性百分比的示例性参数进行了优化，BL50矩阵15:-5，k-tuple＝2；归并罚分(joining penalty)＝40，最优化参数(optimization)＝28；空位罚分-12，空位长度罚分＝-2；以及宽度＝16。

适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的另一个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其在Altschul等，Nuc.Acids Res.25：3389-3402，1977；和Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990中分别进行了描述。用本文中所述的参数，利用BLAST和BLAST 2.0确定本发明的核酸和蛋白质的序列同一性百分比。执行BLAST分析的软件可以从公开地从美国国家生物技术信息中心获取(NationalCenter for Biotechnology Information)(http://wwwncbi.nlm.nih.gov/)。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的默认值为单词长度(W)11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默认值为单词长度3，期望值(E)10以及BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915，1989)比对(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较。

BLAST算法也可以执行两个序列间相似性的统计分析(参见例如Karlin & Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5787，1993)。BLAST算法提供的一种相似性方法是最小总和概率(P(N))，它提供概率的指示，通过所述概率的指示两个核苷酸或氨基酸序列就有机会匹配。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中，最小总和概率小于约0.2、小于约0.01以及小于约0.001，就认为核酸与参考序列相似。

另一个可用算法的实例是PILEUP。PILEUP利用渐进双序列比对从一组相关序列中建立多序列比对，以显示序列关系和序列同一性百分比。它也描绘出显示用来建立比对的聚类关系的树状图或系统树图。PILEUP使用了Feng & Doolittle J.Mol.Evol.35：351-360，1987的简化渐进比对法。所用方法与Higgins & Sharp，CABIOS 5：151-153，1989中所描述的方法相似。所述程序可比对多达300个序列，每个序列最大长度为5000个核苷酸或氨基酸。多重比对程序从两个最相似序列的双比对开始，产生一个双配对序列的聚类。这个聚类然后与下一个最相关序列或联配序列聚类进行比对。通过两单个序列的双比对的简单延伸来比对两个序列聚类。通过一系列的渐进双比对实现最终比对。通过指定序列比较区域的特定序列及其氨基酸或核苷酸相配物或指定所述程序参数来运行所述程序。使用PILEUP，利用下列参数来比较参考序列与其它测试序列从而确定序列同一性百分比关系：缺省空位权重(3.00)、缺省空位长度权重(0.10)和加权端空位。可以从GCG序列分析软件包如7.0版本(Devereaux等，Nuc.Acids Res.12：387-395，1984)获取PILEUP。

适用于多个DNA和氨基酸序列比对的算法的又一个实例是CLUSTALW程序(Thompson，J.D.等，Nucl.Acids.Res.22：4673-4680，1994)。ClustalW执行序列组间多个双序列比较，并基于同源性将它们装配到多重比对中。空位起始罚分和空位延长罚分分别为10和0.05。对于氨基酸比对，BLOSUM算法可用作蛋白质权重矩阵(Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915-10919，1992)。

在又一方面，本发明提供了一种计算机可读介质，所述介质上储存有(i)选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO：1-10中任何一个中的PRV核酸序列、与SEQ ID NO：1-10中任何一个中的PRV核酸序列基本上同一的序列、SEQ ID NO：1-10中任何一个中的PRV核酸序列的序列变体；或(ii)核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO：1-10中任何一个中的PRV核酸序列、与SEQ ID NO：1-10中任何一个中的PRV核酸序列基本上同一的序列所编码的氨基酸序列、SEQ ID NO：1-10中任何一个中的PRV核酸序列的序列变体所编码的氨基酸序列。

本文中所述多肽可用于生成抗体(例如用于免疫接种)。在一方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体与PRV多肽、PRV多肽片段或PRV多肽变体或基本上与PRV多肽同一的多肽相结合，其中所述抗体为抑制、中和或降低所述多肽或PRV活性或功能的疫苗抗体。在一些实施方案中，所述抗体为多克隆抗体、单克隆抗体、硬骨鱼抗体或嵌合抗体。从硬骨鱼纯化免疫球蛋白类的方法也在本领域已知。参见，例如，参见Havarstein等，Dev Comp Immunol 1988，12(4)：773-85；Al-Harbi等，Bull Eur Ass Fish Pathol 1993，13：40-4；Itami等，NipponSuisan Gakkaishi 1988，54(9)：1611-7。

在另一方面，本发明提供了一种PRV免疫原组合物，所述免疫组合物包含RPV多肽、PRV多肽片段或PRV多肽变体或与PRV多肽基本上同一的多肽。

本文中所用的术语“免疫原性多肽”指的是能够诱导脊椎动物宿主(如硬骨鱼)体内免疫反应的PRV多肽或PRV多肽片段。术语“免疫原性多肽”也指PRV多肽或PRV多肽片段，其可用于利用其它本领域已知的抗体产生技术来产生针对PRV多肽或PRV多肽片段的抗体，所述抗体产生技术包括但不限于杂交瘤细胞、噬菌体展示和核糖体展示技术。

在另一方面，本发明提供了一种PRV疫苗组合物，所述疫苗组合物包含PRV核酸、PRV核酸片段或PRV核酸变体、与PRV核酸基本上同一的核酸、PRV多肽、PRV多肽片段或PRV多肽变体或与PRV多肽基本上同一的多肽。

当多肽用于生成抗体时，本领域的技术人员将了解不必使用完整多肽来产生可识别全长多肽的抗体。在某些方面，本发明涉及通过产生与本文中所述多肽的片段相结合的抗体来生成与本文中所述PRV多肽相结合的抗体的方法。因此，在一方面，本发明涉及用于对抗PRV感染的疫苗，所述疫苗包含蛋白质或PRV多肽的免疫原性片段。本发明的又一个实施方案涉及在疫苗中使用的本文中所述的PRV蛋白质或其免疫原性片段。在另一个实施方案中，本发明涉及本文中所述的PRV蛋白质或其免疫原性片段用于生产用于对抗PRV感染的疫苗的用途。

在一个实施方案中，本文中所述PRV免疫原性组合物和PRV疫苗能够改善PRV感染的症状和/或减少PRV感染的持续时间。在另一个实施方案中，所述免疫原性组合物能够诱导针对PRV感染的保护性免疫。本发明的所述免疫原性组合物可以有效地针对本文中所公开的PRV，也可以与PRV的多个不同进化枝和菌株交叉反应并有效针对所述进化枝和菌株以及其它呼肠孤病毒。

在另一方面，本发明提供了核酸载体，其包含PRV核酸序列、PRV核酸片段或PRV核酸变体或与PRV核酸基本上同一的核酸。

在另一方面，本发明提供了一种核酸载体，所述核酸载体编码PRV多肽、PRV多肽片段或PRV多肽变体或大体上与PRV多肽完全相同的多肽。载体的非限制性实例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和泡状口腔炎病毒载体。

在又一方面，本发明提供了一种宿主生物体，所述宿主生物体包含核酸载体，所述核酸载体编码PRV多肽、PRV多肽片段或PRV多肽变体或与PRV多肽基本上同一的多肽。在一个实施方案中，所述宿主生物体为原核生物、真核生物或真菌。在另一个实施方案中，所述宿主生物体为硬骨鱼(如鲑鱼)。

在又一方面，本发明提供了一种诱导动物体内(如鲑鱼)免疫反应的方法，所述方法包括对动物施用给所述动物服用PRV核酸、PRV多肽或PRV免疫原性组合物。对动物(如硬骨鱼)施用多肽的方法和通过施用免疫原性有效量的免疫原性肽在动物体内产生免疫反应的方法在本领域中是已知的。

硬骨鱼缺少骨髓或淋巴液且B细胞淋巴液生成发生在前肾(前肾)和脾脏。对于硬骨鱼体内免疫前变化和抗体生成的综述，请参见Solem和Stenvik，Developmental and Comparative Immunology 30(2006)57-76)。哺乳动物的血液循环中存在几种免疫球蛋白(如IgG、IgE和IgA等)，而与哺乳动物不同，结构异质IgM四聚体是硬骨鱼体内主要的免疫球蛋白(Warr G.W.(1995)：Developmental and ComparativeImmunology，19，1-12；Koumansvandiepen等，(1995)Developmentaland Comparative Immunology，19，97-108；Kaattari等，1998.Immunol.Rev.166：133-142；Evans等，1998.J.Theor.Biol.195：505-524)。在硬骨鱼中也识别出了IgD、IgZ、IgT和IgH免疫球蛋白(Hordvik等，(1999)Scandinavian Journal of Immunology，50，202-210l；Hirono等，(2003)Fish & Shellfish Immunology，15，63-70；Danilova等，(2000)Immunogenetics，52，81-91；Hansen等，(1994)Molecular Immunology，31，499-501；Savan等，(2005)EuropeanJournal of Immunology，35，3320-333)。

本文中所述多肽可以PRV免疫原性组合物的形式根据本领域所已知的任一种方法给动物(如硬骨鱼)接种疫苗。参见，例如Veseley等，Veterinarni Medicina，51，2006(5)：296-302；Engelbrecht等，ActaVet Scand 1997，38(3)：275-82；Ingram等，J Fish Biol 1979，14(3)：249-60。用于疫苗接种的免疫原性组合物也可以包含减毒活疫苗、非活性(灭活)疫苗和亚单位疫苗。在某些实施方案中，可通过以下方式对PRV进行减毒，去除或破坏产物会导致或促成与PRV感染有关的疾病和症状的病毒序列，并且使病毒复制所需的那些序列保留完整。用这种方式可以产生在动物体内复制的减毒PRV，并且诱导动物体内免疫反应，但是这种方法并不能诱导通常与PRV感染相关的有害疾病和症状。为了生成适宜于用作疫苗的减毒PRV，本领域中的技术人员可以确定哪些PRV序列可以或应该去除或破坏，哪些序列应该保留完整。PRV疫苗也可以包含非活性PRV，如通过化学处理来“灭活”这样的病毒，从而这病毒就不能够再在动物体内复制或引发疾病，然而，仍可以诱导动物(如鲑鱼)体内免疫反应。本领域中有很多已知的适宜的病毒灭活方法，并且本领域中的技术人员可以很容易地选择合适的方法并制备适于用作疫苗的非活性“灭活”PRV。

多肽和灭活病毒的纯化方法在本领域内是已知的并且可包括例如梯度离心、超速离心法、连续流超速离心和层析法，诸如离子交换层析法、尺寸排阻层析法和亲和层析法中的一种或多种。其它纯化方法包括超滤和超细过滤。参见J P Gregersen″Herstellung vonVirussimpfstoffen aus Zellkulturen″Pharmazeutische Biotechnology中的章节4.2(O.Kayser和R H Mueller编)WissenschaftlicheVerlagsgesellschaft，Stuttgart，2000.也参见O′Neil等，″VirusHarvesting and Affinity Based Liquid Chromatography.A Method forVirus Concentration and Purification″，Biotechnology(1993)11：173-177；Prior等，″Process Development for Manufacture ofInactivated HIV-1″，Pharmaceutical Technology(1995)30-52；和Majhdi等，″Isolation and Characterization of a Coronavirus from ElkCalves with diarrhea″Journal of Clinical Microbiology(1995)35(11)：2937-2942。

适用于本发明使用的纯化方法的其它实例包括聚乙二醇或硫酸铵沉淀法(参见Trepanier等，″Concentration of human respiratorysyncytial virus using ammonium sulfate，polyethylene glycol or hollowfiber ultrafiltration″Journal of Virological Methods(1981)3(4)：201-211；Hagen等，″Optimization of Poly(ethylene glycol)Precipitation of Hepatitis Virus Used to prepare VAQTA，a HighlyPurified Inactivated Vaccine″Biotechnology Progress(1996)12：406-412；和Carlsson等，″Purification of Infectious PancreaticNecrosis Virus by Anion Exchange Chromatography Increases theSpecific Infectivity″Journal of Virological Methods(1994)47：27-36)以及超滤和微细过滤(参见Pay等，Developments in BiologicalStandardization(1985)60：171-174；Tsurumi等，″Structure andfiltration performances of improved cuprammonium regeneratedcellulose hollow fiber(improved BMM hollow fiber)for virusremoval″Polymer Journal(1990)22(12)：1085-1100；和Makino等，″Concentration of live retrovirus with a regenerated cellulose hollowfiber，BMM″，Archives of Virology(1994)139(1-2)：87-96.)。

多肽和病毒可以用层析法纯化，如离子交换层析。层析纯化法产生大量含病毒悬浮液。目标病毒产物可通过简单的吸附/解吸附机制与层析介质相互作用，并且可以在单负载中加工大量样本。使对吸附剂不具亲和力的致污物经过柱。然后可以浓缩的形式洗提病毒物质。

可以使用的阴离子交换树脂包括DEAE、EMD TMAE。阳离子交换树脂可包含硫酸改性的表面。可以用离子交换层析纯化病毒，所述离子交换层析包含第一步的强阴离子交换树脂(如EMD TMAE)和第二步的EMD-SO3(阳离子交换树脂)。可选地，进一步纯化可包括金属结合亲合层析步骤(参见如WO 97/06243)。

也可以使用诸如Fractogel EMD的树脂。这种合成甲基丙烯酸树脂具有共价连接的长线型聚合物链，并允许有大量的空间可及配体用于结合生物分子而不会有任何位阻。

基于柱的液体亲和层析是另一种可以用在本发明中的纯化方法。用于纯化方法中的树脂的一个实例是Matrex Cellufine Sulfate(MCS)。MCS由排阻限为3,000道尔顿(它的孔结构不包括高分子)的硬球形(直径大约45-105μm)纤维素基质组成，纤维素的6位上有低浓度硫酸酯官能度。由于功能配体(硫酸酯)相对高度弥散，它的阳离子电荷密度不足，使得最可溶性蛋白质被吸收到小珠表面。因此在一般病毒池(细胞培养物上清液，如焦精和最脏蛋白质以及核酸和内毒素)中发现大量的蛋白质从柱上被冲洗掉，实现结合病毒的一定程度的纯化。

灭活病毒可用梯度离心或密度梯度离心进一步纯化。对于工业规模操作，可以选用连续流蔗糖梯度离心。这种方法可以用来纯化抗病毒疫苗，并且对于本领域的技术人员是已知的。

可用于纯化本发明病毒的其它纯化方法包括使用核酸降解剂、核酸降解酶，如具有脱氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶(RNase)活性的核酸酶或核酸内切酶，诸如来自灵杆菌、带阴离子官能团或用阴离子官能团(如DEAE或TMAE)进行附加层析法步骤的膜吸附剂。超滤/超细过滤和最终的无菌过滤步骤也可加入到纯化方法。

本文中所述的纯化免疫制剂可基本上消除来自细胞或细胞培养午的污染蛋白质，并可包含少于约1000、500、250、150、100或50pg的细胞核酸/μg病毒抗原和少于约1000、500、250、150、100或50pg的细胞核酸/剂。

在一方面，给动物接种疫苗可通过直接将所述PRV多肽、其片段或变体注射到动物体内从而产生免疫原性应答来进行。在某些实施方案中，PRV多肽可以单独注射或作为包含其它组分(例如赋形剂、添加剂或佐剂的免疫原性PRV组合物进行注射。

为了产生本文中所述的免疫原性制剂，可以例如通过用含有PRV核酸序列的质粒或表达载体去转染培养的细胞或通过用含有PRV核酸序列的重组病毒去感染培养的细胞来将本发明的PRV核酸序列递送至培养的细胞中。然后PRV多肽可以在宿主细胞或表达体系中表达并纯化。宿主细胞可以是细菌来源的细胞，如大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)和乳杆菌(Lactobacillus)属，与细菌基质粒组合作为pBR322，或与细菌表达载体结合作为pGEX，或与噬菌体组合。宿主细胞也可是真核来源的细胞，如与酵母特异性载体分子结合的酵母细胞或与载体或重组杆状病毒结合的高等真核细胞比如昆虫细胞(Luckow等；Bio-technology 6：47-55(1988))、与如Ti质粒基载体或植物病毒载体组合的植物细胞(Barton，K.A.等；Cell32：1033(1983))、哺乳动物细胞如希拉细胞(Hela cell)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或猫肾传代细胞系，也与适当的载体或重组病毒组合。可以用体外表达系统(如体外转录和体外翻译系统)产生本文所述RPV多肽。然后将纯化的蛋白质并入适于施用于动物的组合物中。重组蛋白的表达和纯化方法和技术在本领域内已众所周知，而且可以使用任何这类合适的方法。

也可以用编码PRV多肽的DNA直接接种来进行接种。当使用这样的疫苗时，将核酸施用于动物，并且由核酸编码的免疫原性多肽在动物体内表达，从而在动物体内产生针对蛋白质或多肽的免疫反应。亚单位疫苗也可以是蛋白质疫苗，其包含病毒蛋白或亚单位本身或那些蛋白质或亚单位的部分。可以使用任何可驱动多肽表达的适用质粒或表达载体。质粒和表达载体可包含指导核酸转录的启动子。编码PRV多肽的核酸序列也可以并入合适的重组病毒用于施用于动物。合适的病毒的例子包括但不限于牛痘病毒、逆转录酶病毒、腺病毒和腺相关病毒。本领域中的技术人员将能够选择合适的质粒、表达载体或重组病毒用于递送本发明的PRV核酸序列。用编码蛋白质的DNA直接接种已经在许多不同的蛋白质中取得了成功(例如在Donnelly等.The Immunologist 2：20-26(1993)中所综述)。

也可以使用能够表达本文中所述多肽的活重组载体进行使用本文中所述的PRV核酸和多肽的接种。活重组载体是微生物或病毒，其中更多的遗传信息，如编码PRV多肽或其片段的核酸序列已经被克隆。感染了此类活重组载体的鱼不仅会产生针对载体的免疫原的免疫反应而且也会产生针对PRV多肽或PRV多肽片段的免疫反应。适用于本文中所述方法的活重组载体的非限制性实例包括鳗弧菌(Vibrioanguillarum)(Singer，J.T等.New Developments in MarineBiotechnology，p.303-306，Eds.Le Gal and Halvorson，Plenum Press，New York，1998)和α病毒载体(Sondra Schlesinger and Thomas W.Dubensky Jr.Alphavirus vectors for gene expression and vaccines.Current opinion in Biotechnology，10：434439(1999))。

或者，可通过在对第二个动物物种(例如硬骨鱼)施用这类抗体(以纯化或非纯化的形式)之前，由抗体产生细胞系或的体外技术在第一个动物物种(例如兔)中产生PRV抗体来进行被动接种。当第二种动物已经感染了PRV，可用使用这种被动接种。在有些情况下，当第二种动物体内的感染不能或已经没有足够时间对感染建立免疫反应时，被动接种是有效的。

许多用于对硬骨鱼接种的分方法在本领域是已知的。例如，可以通过注射、浸泡、浸渍或通过口服施用来进行用本文中所述的PRV核酸和多肽的接种。可根据标准接种实践优化施用方案。

对于硬骨鱼的口服接种，可以将本文中所述的PRV核酸、多肽或免疫原性组合物混入饲料、涂在饲料上或以胶囊的形式施用。在某些实施方案中，进行疫苗接种的方式是在给动物(如鲑鱼)喂食前，在PRV疫苗悬浮液中培养卤虫无节幼体(Artemia nauplii)、桡足(copepod)或轮虫(rotifer)等活饲料，这样摄取活饲料就会造成PRV疫苗在经受疫苗接种的动物的消化道内积累。本领域的技术人员将理解这些施用方法可能会使抗原分解或变性，因此熟练的技术人员要确保接种方法适用于所选抗原。在口服接种的情况下，疫苗也可以与一种或多种载体混合。适于口服接种的载体包括可代谢和不可代谢物质。

也可通过浸泡方案进行骨鱼的疫苗接种。鱼类中的表皮和鳃上皮细胞具有通过吸附抗原而有助于识别病原体的黏膜表面。顺序吸附引起抗体产生细胞活化而成为免疫反应的一部分。因此在一个实施方案中，用本文中所述的多肽给鱼类接种可以通过将鱼浸泡在含有PRV疫苗组合物的水中来进行。可使用至少两种浸泡接种方式与本文中所述的多肽结合。在浸渍接种中，鱼被短时间(如约30秒)浸泡在包含浓缩疫苗溶液的水中(如1份疫苗，9份水)。在浸浴接种中，浸泡在含有低浓度疫苗的水中的时间更长一些(如几小时)。本领域的技术人员会很容易地确定在浸泡方案中足以诱导免疫反应的PRV疫苗的稀释浓度和浸泡持续的时间。

用本文中所述的PRV核酸和多肽对硬骨鱼接种的另一种方法是通过注射接种。在注射接种中，疫苗被注射入鱼的腹腔。尽管本领域的技术人员能够轻易地确定合适的注射点，但鲑鱼中的一般针插入部位是在腹部的中线，即腹鳍底部前一个腹鳍长的位置。在某些实施方案中，PRV核酸、多肽或免疫原性组合物可以在增强和/或延长免疫反应的油乳剂或其它佐剂或添加剂中递送到鱼的体腔中。除了腹腔内注射接种之外，注射接种还可以通过肌肉内注射来进行。本领域中的技术人员将了解操作不当和针插入不当可引起鱼的死亡，并且因此在接种过程中可以使用浅麻醉来降低对动物的应力和机械损伤。熟练的技术人员也会了解具有恰当长度和厚度的针头对确保恰当接种是很重要的，还同时避免由于感染、验证或组织损伤所造成的继发并发症。

也可以使用合适的推进剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适气体，从加压包或喷雾器以气雾剂的形式递送本文中所述PRV核酸、多肽或免疫原性组合物。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过装设阀门来递送计量的量来确定。也可配制含有所述化合物和适当的粉末基料(如乳糖或淀粉)的粉末混合物的胶囊和药盒。

可以任何足以激发动物体内免疫反应的免疫有效量来施用本文所述的PRV核酸、多肽或免疫原性组合物。在某些情况中，此量可以是每只动物介于约0.01和约1000微克之间的RPV核酸、多肽或免疫原性组合物。

本文中所述术语“免疫有效量”指的是能够诱导或增强诱导动物体内期望的免疫反应的量。其中，所期望的反应还可包括诱导抗体或细胞介导的免疫反应或两者都有。所期望的反应也可以是诱导足以改善动物体内PRV感染症状、减少PRV感染持续时间的免疫反应和/或提供针对随后用PRV的激发的保护性免疫。免疫有效量可以是诱导针对PRV感染的实际“保护”的量，即预防动物体内由PRV感染所引起的任何症状或疾病。免疫有效量也可以是足以延迟与感染有关的症状和疾病的爆发、降低感染程度或感染率、降低由感染引发的任何疾病或症状的严重程度并减少受感染动物的病毒负载量的量。

本领域中的技术人员可以在没有进行任何不恰当的实验的情况下很容易地确定什么是本发明的组合物的免疫有效量。有效量可以用传统的手段确定，从低剂量开始然后增加剂量并同时监测免疫效果。确定最佳施用量时可以考虑许多因素，包括动物的大小、年龄和一般健康情况、动物体内有无其它药物、针对其对动物接种的特定PRV的毒性等。考虑多种动物研究的结果后可选择实际的剂量。

免疫原性组合物的免疫有效量可以单剂量、分剂量或使用“初免-加强免疫”方案来施用。组合物可以任何合适的途径施用，包括但不限于口服、浸泡施用、肠胃外施用、真皮内施用、经皮施用、皮下施用、肌肉内施用、静脉内施用、腹膜内施用、鼻内施用、口服或眼内施用途径，或者通过途径的组合。技术人员将能够根据所选的途径配制疫苗组合物。

除了接种技术外，也可以用本领域已知的任何其它方法产生本文所述的与PRV多肽结合的抗体。示例性的可选的体外抗体生成技术、转基因动物技术和杂交瘤技术。参见例如Ausubel，等，编，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，NY，N.Y.(1987-2001)；Sambrook，等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Colligan，等，编，Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc.，NY(1994-2001)；Colligan等，Current Protocols in Protein Science，JohnWiley & Sons，NY，N.Y.，(1997-2001)。

适于产生PRV结合抗体的体外技术包括但不限于核糖体展示、酵母展示和细菌展示技术。核糖体展示是一种将mRNA翻译成其同源蛋白同时保持蛋白质与RNA结合的方法。核酸编码序列由RT-PCR回收((Mattheakis，L.C.等.1994.Proc Natl Acad Sci USA 91，9022)。酵母展示是基于构建膜相关α凝集素酵母粘附受体、aga1和aga2的融合蛋白，交配型系统的一部分(Broder，等1997.Nature Biotechnology，15：553-7)。细菌展示是基于将靶标融合到与细胞膜或细胞壁关联的输出细菌蛋白(Chen和Georgiou 2002.Biotechnol Bioeng，79：496-503)。与杂交瘤技术相比，噬菌体和其它抗体展示方法提供了体外操控针对抗原靶标的选择的机会并且没有限制对抗原有宿主效应的可能性，反反之亦然。

例如，可以通过从文库(如噬菌体文库)中选择来获取与PRV多肽结合的抗体。可以通过插入随机寡核苷酸文库或含有目标序列(如来自免疫的动物的B细胞)的多核苷酸文库来创建噬菌体文库(Smith，G.P.1985.Science 228：1315-1317)。抗体噬菌体文库含有允许单链Fv片段或Fab片段表达的一个噬菌体中的重(H)和轻(L)链可变区对(Hoogenboom，等2000，Immunol Today 21(8)371-10)。可以操控噬菌体文库的多样性来增加和/或改变文库的单克隆抗体的免疫特异性从而产生并随后识别出另外理想的硬骨鱼抗体。例如，重(H)链和轻(L)链免疫球蛋白分子编码基因可以随机混合(搅乱(shuffle))以在装配的免疫球蛋白分子中创建新的HL对。此外，H链和轻链编码基因中的任何一个或两者都可以在免疫球蛋白多肽可变区的互补决定区(CDR)进行诱变处理，接着筛选期望的亲和力和中和能力。抗体文库也可以通过选择一个或更多个框架序列并引入源自抗体谱系的CDR盒或通过设计变异用合成的方法创建(Kretzschmar和von Ruden 2000，Current Opinion in Biotechnology，13：598-602)。多样性的位置并不局限于CDR，但也可以包括可变区的框架片段或可包括不同于抗体可变区的片段，如肽。

适用于产生针对本文中所述的PRV多肽或PRV多肽的片段的抗体的其它抗体生成技术包括Geysen等所描述的PEPSCAN技术(专利申请WO 84/03564、专利申请WO 86/06487，、美国专利No.4,833,092、Proc.Natl.Acad.Sci.81：3998-4002(1984)，J.Imm.Meth.102，259-274(1987))。

与PRV多肽结合的全部抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化可以用于产生与PRV多肽结合的抗体片段。具体而言，Fab片段由抗体分子的单价抗原结合片段组成，并且可以通过用木瓜蛋白酶来消化整个抗体分子来生成，从而产生由完整轻链和部分重链组成的片段。通过用胃蛋白酶处理整个抗体分子而不发生随后还原可以获得抗体的(Fab′)2片段。通过用硫醇还原剂还原来从(Fab′)2获得抗体分子的Fab′片段，这产生由完整轻链和部分重链组成的分子。用这种方式处理每个抗体分子可获得两个Fab′片段。

通过对选取的分子(已经通过用合成手段或通过编码多肽的核酸的表达生成)进行化学交联或通过重组DNA技术结合多肽的体外表达或细胞表达，然后进行寡聚化反应可以产生抗体。通过重组技术和表达、产生带不同表位特异性的抗体的杂交瘤的融合、或在单个细胞中表达具有不同表位特异性的多核酸编码抗体可变链同样可以产生抗体。

通过共价或非共价结合，如通过“多聚化域”，可以将抗体直接或间接地结合从而产生多聚体。“多聚化区”介导非共价蛋白质与蛋白质之间的相互作用。具体实例包括卷曲螺旋(如，亮氨酸拉链结构)和α螺旋结构蛋白质序列。通过范德华力、氢键结合或电荷-电荷间键合介导蛋白质-蛋白质结合的序列也可以用作多聚化域。另外的实例包括碱性螺旋-环-碱性螺旋区域和介导核酸结合蛋白(例如，DNA结合转录因子，如TAFs)中异源或同源蛋白质-蛋白质间的相互作用的蛋白质序列。多聚化域的一个具体实例是介导四聚体形成的p53残基319至360。另一个实例是胞外蛋白质TSP4，它是血小板反应蛋白家族的成员，它可以形成五聚体。另外的具体实例有jun、fos和酵母蛋白GCN4的亮氨酸拉链。

抗体可通过化学交联剂直接彼此连接或通过接头序列(如，肽序列)连接从而形成多聚体。

本文中所述抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。抗体也可以是嵌合抗体(即，来自超过一个物种的序列的组合，例如嵌合小鼠-鲑鱼免疫球蛋白)。物种特异的抗体避免某些与具有来自其它物种的可变和/或恒定区的抗体有关的问题。这类来自其它物种的蛋白序列其它形态种的存在会导致抗体的迅速消除或会导致通过抗体产生抵御抗体的免疫反应。

本文中所述抗体可以是分别通过重链和轻链可变区(VH和VL)与其它分子(抗原)结合的抗体。本文中所述的抗体包括但不限于IgY、IgY(ΔFc))、IgG、IgD、IgA、IgM、IgE和IgL。抗体可以是完整的免疫球蛋白分子、由二硫键连接的两个全长重链与两个全长轻链，以及与带有或不带有恒定区的与抗原表位结合的免疫球蛋白分子的子序列(即片段)，或带有或不带有恒定区的与抗原表位结合的免疫球蛋白分子的子序列(即片段)。抗体可以包含全长重链和轻链可变区、单独的VH和VL或任何组合。

基本免疫球蛋白(抗体)结构单位可以包含四聚体。每一个四聚体可以由两对完全相同的多肽链组成，每一对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N端界定约100-110或更多个氨基酸的主要负责抗原识别的可变区。术语可变轻链(V1)和可变重链(VH)分别指的是这些轻链和重链。

本文中所述抗体可以完整的免疫球蛋白的形式或以被各种肽酶消化产生的良好表征、的片段的形式存在。尤其是，胃蛋白酶消化铰键区二硫键以下的抗体以产生F(ab)′₂(Fab的二聚体)，而F(ab)′₂本身是由二硫键结合到VH-CH1的轻链。在温和的条件下F(ab)′₂可以被还原从而破坏铰链区中的二硫键从而将F(ab)′₂二聚体转化成Fab′单体。Fab′单体实质上是带有部分链接区的Fab(要了解更多的抗体片段术语，参见Fundamental Immunology，W.E.Paul，ed.，Raven Press，N.Y.(1993)。虽然Fab′域是根据完整抗体的消化来定义的，技术人员将了解这样的Fab′片段可以重新用化学方法或通过利用重组DNA方法合成。Fab′区可以是来自动物或人来源的抗体或者可以是嵌合的(Morrison等，Proc Natl.Acad.Sci.USA 81，6851-10855(1984)两者均以引用的方式并入本文)(Jones等，Nature 321，522-525(1986)，andpublished UK patent application No.8707252，两者均以引用的方式并入本文)。

本文中所述抗体可包括或源自任何哺乳动物，如但不限于鱼、人、小鼠、兔、大鼠、啮齿类动物、灵长类动物或其任何组合，并包括分离的鱼、人、灵长类动物、啮齿类动物、哺乳动物、嵌合、人源化和/或CDR移植或CDR适应抗体、免疫球蛋白、裂解产物及其其它部分和变体。在一个实施方案中，抗体被纯化。

本文中所述抗体包括保留有至少部分单体的抗原结合活性的全长抗体、子序列(如，单链形式)、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体或任何其它高分子量寡聚物(higher order oligomer)。多聚体可以包含如本文所述和本领域内已知的全长抗体、子序列、未修饰或修饰抗体的异源或同源组合物。由于多聚体具有多抗原结合位点，因此与单体相比，抗体多聚体对增加抗原亲和力是有用的。抗体多聚体也对于产生不同抗体的寡聚物(如二聚体、三聚体、四聚体等)组合从而产生多功能(如，双重功能、三重功能、四重功能等)抗体的组合物。

抗体子序列的具体实例包括，例如Fab、Fab′、(Fab′)2、Fv或单链抗体(SCA)片段(如scFv)。子序列包括保留全长序列的至少部分功能或活性的部分。例如，即使子序列的亲和力可能比全长抗体的结合亲和力更高或更低，但抗体序列将保留选择性地结合抗原的能力。

Fv片段是包含表达为两条链的轻链VL的可变区和重链的可变区的片段。缔合可以是非共价或共价的，如化学交联剂或分子间二硫键(Inbar等，(1972)Proc.Natl.Acad Sci.USA 69：2659；Sandhu(1992)Crit.Rev.Biotech.12：437)。

也可以使用其它产生抗体子序列方法，例如，分离重链形成单价轻-重链片段，片段进一步裂解或其它酶技术、化学技术或基因技术，前提是子序列与抗原结合，所述抗原与完整抗体结合。

单链抗体(″SCA″)是基因工程抗体或酶消化抗体，其含有以V_L-接头-V_H定向中或V_H-接头-V_L定向任选地由柔性接头(如多肽序列)连接的轻链V_L的可变区和重链的可变区。或者，可通过经两个半胱氨酸残基间的二硫链连接两个可变域来产生单链Fv片段。例如，Whitlow等，(1991)在：Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：97；U.S.Pat.No.4,946,778；and Pack等，(1993)Bio/Technology 11：1271中描述了产生scFv抗体的方法。

本文中所述PRV核酸、多肽和免疫原性组合物可以用来产生抑制、中和或降低多肽或PRV的活性或功能的抗体。在某些方面，本方面涉及用于处理动物(如鲑鱼)的方法，所述方法包括对动物施用PRV核酸、多肽和免疫原性组合物，或对动物施用与PRV多肽特异性结合的抗体从而抑制、中和或降低PRV多肽或PRV的活性或功能。

在另一方面，本文中所述的本发明涉及包含PRV多肽或PRV核酸的PRV免疫原性组合物。在一些实施方案中，PRV免疫原性组合物可进一步包含载体、佐剂、赋形剂等。可通过将活性化合物与本领域已知的免疫原性可接受的载体相结合来容易地配制本文中所述的PRV免疫组合物。可以使用一种或多种包含有利于将活性化合物加工成可用于诱导免疫反应的制备物的赋形剂或助剂的生理上可接受的载体以传统的方式配制本文所述的PRV免疫原性组合物。这类载体可用于配制合适的片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆料、悬浮液等。在一个实施方案中，可以通过固体赋形剂获取免疫原性组合物，研磨所得混合物，如果需要，加入合适的助剂后加工颗粒的混合物从而获得片剂或糖衣丸的核。

本文所述的免疫原性组合物可以其本身已知的方式生产，例如通过传统的混合、分解、造粒、制糖衣丸、磨细、乳化、装入胶囊、包埋、冻干工艺。适用的制剂取决于所选的施用途径。

当对动物施用免疫学上有效量的PRV免疫组合物时，组合物可以是无热原、非肠道可接受的水溶液的形式。制备这样的非肠道可接受的蛋白质或其它活性组分溶液是在本领域内的技术范围之内，应注意pH值、等渗性、稳定性等。例如，除了本发明的蛋白质或其它活性组分，本文中所述的PRV免疫原性组合物可以包含本领域内已知的等渗媒介物，如氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸钠林格氏注射液或其它媒介物。本发明的免疫原性组合物也可以含有本领域内技术人员已知的稳定剂、防腐剂、缓冲液、抗氧化剂或其它添加剂。PRV免疫原性组合物可以在水溶液、生理兼容缓冲液如Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中配制。对于经粘膜施用，制剂中要使用适于穿透屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常为本领域内已知的。

当口服施用PRV免疫原性组合物时，本发明的蛋白质或其它活性组分可以是片剂、胶囊、粉末、溶液或酏剂的形式。以片剂形式施用时，本发明的免疫原性组合物可以另外包含固体载体如明胶或佐剂。

本文所述的PRV免疫原性组合物可以编码或包含本文中所述的PRV蛋白质或肽的任何一种，或在动物体内是免疫原性的、或其部分、片段、衍生物或突变体。本领域中的技术人员能很容易地测试出本文中所述的PRV蛋白质和肽的免疫原性，并可选择合适的蛋白质或肽用于亚单位疫苗。

本文中所述的PRV免疫原性组合物包含至少一种PRV氨基酸或多肽，如本文中描述的那些。组合物也可包含一种或多种添加剂，包括但不限于一种或更多种药学上可接受的载体、缓冲液、稳定剂、稀释剂、防腐剂、增溶剂、脂质体或免疫调变剂。合适的免疫调变剂包括但不限于佐剂、细胞因子、编码细胞因子的多核苷酸和有助于PRV源免疫原性组分的细胞摄取的试剂。

本文所述的PRV免疫原性组合物也可包含免疫刺激性物质，也就是所谓的佐剂。广义的佐剂包括以非特异的方式增强宿主的免疫反应的物质。许多不同的佐剂在本领域是已知的。常用在鱼类和贝类养殖业佐剂的实例有胞壁酰二肽、脂多糖、几种葡聚糖和聚糖以及聚羧乙烯(一种均聚物)。在综述文章Jan Raa(Reviews inFisheries Science 4(3)：229-288(1996))中给出了适用于鱼类和贝类疫苗的佐剂的详细述评。

本文所述的PRV免疫原性组合物也可以包含所谓的“媒介物”。媒介物是与蛋白质粘附的未与之共价结合的一种化合物。例如，这样的媒介物例如为生物微胶囊、微海藻酸盐、脂质体和大分子物，所有都是本领域已知的。这种媒介物的一个特殊形式(其中抗原部分嵌入到媒介物中)是所谓的ISCOM(EP 109.942，EP 180.564，EP 242.380)。此外，疫苗可包含一种或更多种合适的表面活性化合物或乳化剂，如Span或Tween。也可以采用某些有机溶剂，如二甲亚砜。

本文中所述的PRV免疫原性组合物也可以与稳定剂混合，例如以而保护易于降解的蛋白质免受降解，提高疫苗的保质期或提高冷冻干燥效率。有用的稳定剂是即SPGA(Bovarnik等；J.Bacteriology 59：509(1950))、碳水化合物如山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、右旋糖苷或葡萄糖、蛋白质如白蛋白或酪蛋白或其降解产物，以及缓冲剂如碱金属磷酸盐。

以液体形式施用时，可以加入液体载体如水、石油、动物或植物油如花生油、矿物油、大豆油或芝麻油或合成油。免疫原性组合物的液体形式可进一步包含生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖类溶液、或二醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。当以液体形式施用时，免疫原性组合物包含以重量计约0.5-90％的本发明的蛋白质或其它活性组分和约1-50％的本发明的蛋白质或其它活性组分。

本文所述的PRV免疫原性组合物包括由明胶制成的推入配合式胶囊(push-fit capsule)以及由明胶和增塑剂(如甘油或山梨醇)制成的软密封胶囊。推入配合式胶囊可以包含活性组分，所述活性组分与填料(如乳糖)、粘结剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)，以及任选的稳定剂混合。在软胶囊中，活性化合物可在合适的液体如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中溶解或悬浮。此外，可以加入稳定剂。

本文所述的PRV免疫原性组合物也可以配制为通过注射，如弹丸注射或连续输注而用于肠道外施用。注射用制剂可以是单位剂量形式存在，如以安瓿瓶或多剂量容器，并加入防腐剂。组合物可以采用如在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳化液的形式，并可以包含配方剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

本文所述的PRV免疫原性组合物也可以是本发明的蛋白质或其它活性组分与蛋白质或肽抗原的络合物的形式。

本文所述的PRV免疫原性组合物也可以制成适合肠胃外施用并可包括水溶液，所述水溶液包含可溶于水的形式的PRV核酸或多肽。此外，将活性组分的悬浮液制备成合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(如芝麻油)或合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酸酯)或脂质体。水性注射悬浮液可包含提高悬浮液黏性的物质如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，悬浮液也可包含适合的稳定剂或提高化合物的溶解性的试剂从而可制备高浓度溶液。或者，在使用之前，活性组分可以是粉末形式，用于与合适的媒介物如无菌无热原水配制。

本文所述的PRV免疫原性组合物也可以是脂质体的形式，其中，除了其它可接受的载体外，在水溶液中，本发明的蛋白质与两性试剂(如以聚集的形式如胶束、不溶性单层、液晶或薄层存在的脂质)结合。用于脂质体制剂的适合的脂质包括但不限于单酸甘油酯、双酸甘油酯、硫脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂角苷、脂汁酸等。制备这样的脂质体制剂在本领域的技术水平之内，如在例如美国专利中No.4,235,871；4,501,728；4,837,028；和4,737,323所公开的，所有这些专利以引用的方式并入本文。

本文所述的PRV免疫原性组合物也可以配制成通过植入(如皮下或肌肉内)或通过肌肉注射进行施用的长效制剂。可使用缓释系统如含有治疗剂的固体疏水聚合物的半透性基质递送组合物。已确定各种类型的缓释材料并为本领域技术人员所熟知。缓释胶囊可根据其化学性质释放化合物达几个星期、甚至多达100多天。根据治疗剂的化学性质和生物稳定性，可采用另外的用于蛋白质或其它活性组分稳定的策略。因此，例如，化合物可以与合适的聚合材料或疏水材料(如作为可接受的油品中的乳化剂)或离子交换树脂配制、或作为少量的可溶性衍生物，例如，作为少量可溶性盐。

与本文所述PRV免疫原性组合物一起使用的载体可以是共溶剂体系，其包含苯甲醇、非极性表面活性剂、水溶性有机聚合物和水相。共溶剂体系可以是VPD共溶剂体系。VPD是3％w/v苯甲醇、8％w/v的非极性表面活性剂、聚山梨酯80和65％w/v的聚乙二醇300的溶液，在无水乙醇中补足到体积。VPD共溶剂体系(VPD：5W)由用5％葡萄糖的水溶液按1∶1稀释VPD组成。这种共溶剂体系充分溶解疏水化合物，它本身在全身施用后产生的毒性较低。共溶剂体系的比例在不破坏其溶解性和毒性特性的情况下，可以有相当大的变化。共溶剂组分的身份也可以变化：例如，可以使用其它低毒非极性表面活性剂代替聚山梨酯80；聚乙二醇的部分体积可以不同；其它生物相容性聚合物可以代替聚乙二醇，如聚乙烯吡咯烷酮；以及其它糖类或多糖可取代葡萄糖。

免疫原性组合物也可以包含合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。这样的载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物如聚乙二醇。本发明的许多活性组分可以提供为具有免疫原性兼容抗衡离子的盐。这样的免疫可接受的碱性加成盐是那些保留有游离酸的生物有效性和特性的那些盐，并且那些盐通过与无机碱或有机碱(如氢氧化钠、氢氧化镁、氨水、三烷基胺、二烷基胺、单烷基胺、氨基二元酸、乙酸钠、苯甲酸钾、三羧乙基胺等)反应获得。

适于用在本文所述免疫原性组合物中的赋形剂包括填料如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，也可以加入分裂剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐如海藻酸钠。糖衣丸核有合适的糖衣。为此，可以使用浓缩糖溶液，其任选地含有阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡泊波凝胶(carbopol gel)、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或色素加入到片剂或糖衣中用于识别或表征活性化合物剂量的不同组合。

本文所述的免疫原性组合物和疫苗也可以是多价免疫原性组合物，其进一步包含另外多肽或编码来自其它病毒的另外多肽的核酸序列。

本文中所述的免疫原性组合物和疫苗也可以是多价免疫原性组合物，其进一步包含另外多肽片段或编码来自其它病毒的另外多肽片段的核酸序列。

本文中所述的免疫原性组合物和疫苗也可以是多价免疫原性组合物，其进一步包含其它病毒(如，毒性减弱、灭活或以另外方式失活的病毒)或编码其它病毒(如毒性减弱、灭活或以另外方式失活的病毒)的核酸序列。

本文所述的免疫原性组合物和疫苗也可以包含融合蛋白或编码融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含PRV多肽或其片段和来自另一病毒的多肽或多肽片段。

可以包括在免疫原性组合物中的其它病毒、其它病毒的病毒多肽或其片段的实例包括但不限于嗜睡症病毒(SDV)或SDV病毒多肽或其片段；鲑鱼胰腺病病毒(SPDV)或SPDV病毒多肽或其片段；传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)或ISAV病毒多肽或其片段；病毒性出血性败血病病毒(VHSV)或VHSV病毒多肽或其片段；传染性造血组织坏死病病毒(IHNV)或IHNV病毒多肽或其片段；传染性胰坏死病毒(IPNV)或IPNV病毒多肽或其片段；鲤春病毒血症(SVC)或SVC病毒多肽或其片段；斑点叉尾鮰疱疹病毒(CCV)或CCV病毒多肽或其片段；杀鲑气单胞菌或杀鲑气单胞菌多肽或其片段；鲑肾杆菌或鲑肾杆菌多肽或其片段；粘放线菌或粘放线菌多肽及其片段；耶尔森氏鼠疫杆菌或耶尔森氏鼠疫杆菌多肽及其片段；巴斯德杆病菌或巴斯德杆病菌多肽或其片段；鳗弧菌或鳗弧菌多肽或其片段；火神弧菌或火神弧菌多肽或其片段；病海弧菌或病海弧菌多肽或其片段；鲑弧茵或鲑弧茵多肽或其片段；爱德华氏菌或爱德华氏菌多肽或其片段；迟钝爱德华氏菌或迟钝爱德华氏菌多肽或其片段；柱状纤维粘细菌或柱状纤维粘细菌多肽或其片段；鲑鱼立克次氏菌或鲑鱼立克次氏菌多肽或其片段。

例如，美国专利No.6,471,964中描述了编码传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)的结构蛋白质-1的cDNA。ISAV抗原也公开在WO 01/10469中。SPDV公开在WO 99/58639中。鲑鱼立克次氏菌抗原公开在WO01/68865中。白斑病毒抗原公开在WO 01/09340中。

适合用于本文所述免疫原性组合物中的其它病毒多肽和核酸序列描述在Tucker等(2000)″Assessment of DNA vaccine potential forjuvenile Japanese flounder Paralichthys olivaceus，through theintroduction of reporter genes by particle bombardment andhistopathology″Vaccine 19(7-8)：801-809；Corbeil等(1999)″Evaluation of the protective immunogenicity of the N，P，M，NV，Gproteins of infectious hematopoietic necrosis virus in rainbow troutOncorhynchus mykiss using DNA vaccines″Dis.Aquat.Organ39(1)：29-26；Nusbaum等(2002)″Protective immunity induced byDNA vaccination of channel catfish with early and late transcripts ofthe channel catfish herpes virus(IHV-1)″Vet Immunol.Immunopathol 84(3-4)：151-168；Clark等(1992)″Developmentalexpression of surface antigen genes in the parasitic cilateIchtyophthirius multifiliis″Proc.Natl.Acad.Sci.89(14)：6363-6367；和Sato等(2000)″Expression of YAV proteins and vaccination againstviral ascites among cultured juvenile yellowtail″Biosci.Biotechnol.Biochem.64(7)：1494-1497中论述。鱼病原体抗原的许多核酸和氨基酸是已知的且可通过Genbank数据库和其它来源很容易获得。

用于疫苗制剂的其它添加剂在本领域是已知的且对本领域的技术人员来说显而易见。

以下实施例对本发明进行了说明，并提出以帮助理解本发明，但并不应解释为以任何方式限制如以下权利要求所限定的本发明的范围。

【实施例】

【实施例1：PRV片段的分离】

通过对从感染HSMI的挪威养殖鲑鱼获取的样本进行高通量测序来获得与哺乳动物正呼肠孤病毒在氨基酸水平有约50％同源性的200nt片段。来自感染HSMI的鲑鱼和正常鲑鱼的肌肉组织的定量PCR测定表明感染HSMI的鲑鱼中有更高的病毒负载量。

【实施例2：养殖鲑鱼的心脏和骨骼肌炎症与感染新型呼肠孤病毒有关】

对从通过实验方法诱导的HSMI鲑鱼的心脏提取的RNA进行焦磷酸测序(Margulies，M.等，Nature 437，376-380(2005))，产生106,073读数范围大小多达598个核苷酸(平均＝349.7，SD＝149.5)。尽管核苷酸水平的数据库比对分析表明没有感染的证据，但一个265核苷酸读数的所预期氨基酸序列与哺乳动物正呼肠孤病毒3(AF378009)的核心尖状蛋白λ2有49％的相似。基于这个序列的实时PCR测定用于测试从自然爆发(n＝20)或实验感染(n＝20)的感染HSMI的鲑鱼和未感染的对照鱼(n＝20)的心脏和血清获取的RNA提取物中候选病毒的存在。所有的感染HSMI的鲑鱼的样本都包含候选序列。在未感染HSMI的对照鲑鱼中未发现序列。

经PCR选取具有最高病毒负载量(3.0x106个基因组拷贝/μl)的HSMI血清样本另外用于焦磷酸测序，产生120,705个读数。用一套生物信息工具鉴定病毒序列。在分析的第一阶段，BLASTN和BLASTX(Altschul等，J Mol Biol 215，403-410(1990))分别检测出了1.5％和53.9％的预期病毒基因组，使得能够鉴定片段L1、L2、L3、M1、M2和M3(图1)。执行FASTX(Pearson等，Genomics 46，24-36(1997))产生另外的5.5％的基因组并在S1片段中检测出了基序以及在L2和M3片段中检测出了另外的序列。序列数据的频率分析(FASD)(Trifonov等，(提交))(一种基于核苷酸频率和顺序而不是序列比对来分类的程序)检测出了包含另外11.8％的最终病毒基因装配的代表S1、S2、S3和S4片段的新序列(图1)。总计，大约有序列的17个千碱基(基因组的72.8％)是通过焦磷酸测序获得的(图1)。片段间的空位和基因片段的末端是通过PCR克隆完成的。所有序列用根据草图序列设计的引物通过经典的双脱氧测序法进行验证。

与呼肠孤病毒家族的成员的基因组结构特点相一致，PRV的基因组包括至少10个RNA片段(基因库登录号GU994013-GU994022)。呼肠孤病毒为包含10-12个片段的带双链RNA基因组的非包膜二十面体病毒。基于宿主范围、基因组片段数量、G/C含量和抗原关系界定了12个属。用所知的呼肠孤病毒的L基因片段序列构建的系统树说明了PRV代表从鱼类、贝类、爬行动物、鸟类和哺乳动物病毒的水生呼肠孤病毒和正呼肠孤病毒祖先衍生的截然不同的遗传谱系(图2)。所有10个PRV基因片段的分析证实了PRV序列与其它呼肠孤病毒的不同(图5至12)。所有PRV基因片段都含有在正呼肠孤病毒和水生呼肠孤病毒发现的3’端核苷酸(UCAUC-3’)(Attoui等，J Gen Virol83，1941-1951(2002))；但是5’端核苷酸(5’-GAUAAA/U)是独有的。

正呼肠孤病毒在S1或S4中都具有多顺反子片段。而水生呼肠孤病毒属C在S7(正呼肠孤病毒S1同系物)中是多顺反子性的，其它水生呼肠孤病毒属则不是(Attoui等，J Gen Virol 83，1941-1951(2002))。PRV在S2的5’端(71aa，等电点pI＝8.8，8kDa)中有推定的可读框(ORF)，并且在S1的5’端(124aa，pI＝4.8，13kDa)具有推定的ORF。尽管在正呼肠孤病毒和水生呼肠孤病毒中发现了PRV的λ1、λ2、λ3、μ1、μ2、μ3、σ2和σNS序列的同系物，但在S2和S1中观察到的σ1和σ3序列以及小的推定可读框似乎与众不同。后者的结构与融合相关的小跨膜(FAST)呼肠孤病毒蛋白质相似(Shmulevitz等，EMBO J 19，902-912(2000))(图13)。呼肠孤病毒FAST蛋白质为诱导细胞间融合和合胞体形成的非结构单通膜蛋白质(Shmulevitz等，EMBO J 19，902-912(2000))。这些数据合在一起提供了有说服力的证据，即PRV是正肠孤病毒属和呼肠孤病毒属远枝的一种新型呼肠孤病毒基因的原型。

用靶向基因组片段L1、L2、M3和S4的实时PCR测定来检验在养殖鲑鱼和野生鲑鱼中PRV感染的流行程度。用针对L1的MGB检测定来量化病毒RNA的水平，其中用Pfaffl的公式将结果归一化为延伸因子1A(EF1A)(Pfaffl等，Nucleic Acids Res 29，e45(2001))。研究了来自代表3种不同的HSMI爆发的29个鲑鱼的心脏和肾脏样本(表1)，并研究了来自健康养殖鱼的10个样本。如通过L1/EF1A的基因对数比≥5.00界定，在已知的29个HSMI样本中有28个(96.5％)是阳性，但10个健康鲑鱼样本没有一个是阳性的(0％)。29个HSMI样本中只有一个样本是阴性；这个样本来自HSMI早期阶段在鱼死亡开始之前躲在鲑鱼网中的鱼(图3)。在有严重疾病征兆的鱼中，包括异常的游泳行为、食欲不振和全心炎和肌炎的组织炎症明显的鱼(Kongtorp等，J Fish Dis 29，233-244(2006))，中值调整后的L1/EF1A基因对数比是10.36(IQR，0.94)。L1/EF1A基因对数比不仅与有无HSMI有关，还与采样时疾病的严重程度有关。对数比在健康养殖鲑鱼中的值最低(对数比范围，-0.23-3.89；n＝10)，在HSMI爆发的早期阶段采集的鲑鱼中的比值较高，并且在HSMI爆发的高峰时获得的鲑鱼样本中的值最高(范围，8.52-11.90；n＝10))。为了研究来自不同地理位置的健康野生鲑鱼中PRV的流行程度和相对水平，测试了从挪威九条沿海河流中获取的66个样本。仅在这些样本中的16个样本中检测到了PRV(24.2％)。根据相对对数比为6.70和7.58的养殖鲑鱼的截断值，这16个样本中有2个样本为阳性；其它14个样本的L1/EF1A都低于截断值5.0(范围，-.20-4.57)。在其余的野生鲑鱼样本中均未检测到PRV转录物(n＝50)。

表1病毒负载量数据

a＝病毒负载量比(通过L1病毒基因定量)，用鲑鱼管家基因(EF1A)归一化并通过因数108的调整。b＝调整后的比率L1/EF1A的对数变换。c＝通过实时RT-PCR检测的病毒检测。d＝为了进行统计分析，无论调整后的对数比是否高于5.00，均认为样本是阳性的。

用探针通过对L2基因RNA的原位杂交来测试与病理学有关的PRV解剖分布。PRV RNA的分布遍及感染HSMI的鲑鱼的心肌层和心内膜(图4A，4B)，但在正常鲑鱼或感染鲑鱼胰腺病病毒的鲑鱼中未检测到PRV RNA(图4C，4D)。

通过科赫氏法则，疾病中含有微生物要求证明试剂对所述疾病是特异的，并且从感染的宿主分离出这样的微生物并在培养中得到繁殖并且那种疾病通过接种可以在天然宿主体内重复发生。尽管完成该法则可强有力地证明因果关系，但此标准过于严格。一些试剂是不能培养的。此外，遗传因素和其它因素可有助于研究发病机理。并未对PRV进行培养。而且，已经在养殖鱼中发现了PRV，但这些鱼并没有表现出HSMI的临床症状。再者，在野生大西洋鲑鱼也已经检测到了少量的PRV。然而，PRV的组织分布和负荷量都与自然感染和实验感染的鲑鱼中的疾病相关。商业家禽生产和大西洋鲑鱼养殖之间的类比也能提供信息。在许多的家禽疾病中也有呼肠孤病毒，包括小肠炎、心肌炎和肝炎(Jones，Rev Sci Tech 19，614-625(2000))。家禽生产和水产养殖都是将动物高密度地限制在有助于传染性微生物的传播且可以降低抗应激诱导疾病的能力的环境中。

与陆生动物饲养(其中容易监测和控制相同物种或紧密相关的物种的驯养动物与自由放牧的野生动物之间的接触)不同，基于海洋环的水产养殖是一个开放系统，其中养殖鱼可以孵育并将具有感染性的病毒传播给种群规模逐渐缩小的野生鱼种群。PRV将会在细胞培养中分离出来，并且通过使用特异性药物或疫苗会预防或缓和疾病。但是本文中所述的结果却表明存在着因果关系，由于PRV对驯养鲑鱼生产造成威胁并且也具有传播给野生鲑鱼种群的可能性，因此可以采取措施来控制PRV。

【实施例3：PRV鉴定和测序】

通过接种感染HSMI的鱼的心脏和肝脏提取物或与感染HSMI的鱼共居在正常大西洋鲑鱼体内通过实验方法诱导HSMI。从通过实验方法诱导感染HSMI的大西洋鲑的心脏组织中提取的RNA用作模板进行高通量焦磷酸测序。使用可从GreenePortal网址(http://tako.cpmc.columbia edu/Tools)获取的生物信息应用软件套装分析序列，包括FASD，即通过其将未知序列集中的寡核苷酸频率的统计分布与已知序列集计算所得的频率相比。利用比对和基于基序的程序识别出了一种新型呼肠孤病毒(鱼呼肠孤病毒(PRV))的十个片段中的七个，另三个片段用FASD识别出来。HSMI爆发期间采集的鱼和通过实验方法诱导感染HSMI的鱼的样本的定量实时PCR检测证实了PRV和HSMI之间的关联。原位杂交证实了感染HSMI的鱼的心脏中存在PRV序列。

通过高通量测序鉴定PRV实验装置(VESO，Vikan；Namsos，Norway)产生的平均体重是50gr健康大西洋鲑接种了HSMI现场爆发的心脏组织，并作为高能量测序材料的供体。未接种的鱼作为阴性对照(Kongtorp和Taksdal，J Fish Dis 32，253-262(2009))。三个心脏活检组织以1∶10在HBSS中稀释，通过0.22μm过滤器过滤，在TRIzolLS试剂中灭活。几个血清样本直接在TRIzol LS中灭活。总RNA提取物用DNase I处理，使用用于逆转录的Superscript II系统产生cDNA(Palacios等，Emerg Infect Dis 13，73-81(2007))，所述逆转录由与随意规定的17-mer引物序列相连的随机选取的八聚体引发。所得的cDNA用RNase H处理，然后通过聚合酶链式反应(PCR)随机扩增；分别涂抹与规定的17-mer序列对应的引物和随机八聚体连接的17-mer引物按9∶1的混合物(Palacios等，Emerg Infect Dis 13，73-81(2007))。通过柱纯化，选择产物＞70碱基对(bp)，并将它连接到特异性接头在454基因组测序器FLX上进行测序而没有进行cDNA断裂(Margulies，M.等，Nature 437，376-380(2005)；Palacios等N Engl JMed 358，991-998(2008)；Cox-Foster等，Science 318，283-287(2007))。

通过在GreenePortal网址(http://156.145.83 115/Tools)获取的分析应用软件用容易取得的软件程序进行引物序列去除、冗余过滤和序列装配。当传统的BLASTN、BLASTX和FASTX分析无法识别测序序列读数的来源时，应用FASD(Trifonov等，(提交))，它是一种基于寡核苷酸频率的统计分布的新型方法。与其它片段的计算值相比，由其寡核苷酸频率的分布而计算给定片段属于一类病毒的可能性。开发了一种统计方法来评估片段间关系的显著性。P值评估寡核苷酸分布源自不同的片段的可能性。因此，高相关分布显示高p值。

传统的PCR检测是用HotStar聚合酶在PTC-200热循环仪上在95℃进行酶活化步骤5分钟，接着在95℃进行45个循环的变性1分钟，在55℃退火1分钟，并根据所期望的扩增子的大小在72℃延伸1-3分钟。扩增产物在1％琼脂糖胶上电泳，纯化并在ABI PRISM 3700DNA分析器上用ABI PRISM Big Dye Terminator 1.1循环测序试剂盒在两个方向上直接测序。

【实施例4：序列分析】

New Zealand软件包程序(Biomatters，New Zealand)用于序列装配和分析。从基因库中下载序列并在MEGA软件(Tamura等，MolBiol Evol 24，1596-1599(2007))上用ClustalX比对(Thompson等，Curr Protoc Bioinformatics Chapter 2，Unit 23(2002))。所获取的氨基酸比对进一步并用T-Coffee(Notredame等J Mol Biol 302，205-217(2000))精制来整合蛋白质结构关于比对的数据。为了评价该方法的鲁棒性，发现和比对先前识别的保存在呼肠孤病毒中的基序的能力用作标记。用p距离作为被ICTV接受的氨基酸替换模型进行系统发生分析用于分析呼肠孤病毒家族。MEGA用于产生通过邻接(NJ)法重构的系统树。

通过对序列进行引导重取样1000次来评估特定树形拓扑结构的统计显著性。用BEAST、BEAUti和示踪分析软件包进行片段λ1、λ2、λ3、μ1、μ2、μ3、σ2和σNS(呼肠孤病毒和正呼肠孤病毒的σ1和σ3具有不同的基因组结构)间的序列差异的贝叶斯定理系统发生分析。

用Dayhoff氨基酸替换模型进行10,000,000代的初步分析以选择最适合每一个ORF的时钟和种群统计模型。边缘相似性的分析表明对所有的数据集都选用松散对数正态分子钟和常数种群数量模型。最终数据分析包括5,000,000-30,000,000代的MCMC链长，每1000个形态进行取样(图5-12)。

【实施例5：实时PCR检测】

基于从高通量测序获得的病毒特异性序列建立呼肠孤病毒片段的定量检测。设计了靶向基因组片段L1、L2和M3(SYBR green法)以及L1和S4(MGB测定)的六种不同的实时检测(参见表2引物表)。来自实验感染鱼的不同器官的样本为阳性，而来自未感染的对照鱼的样本为阴性。为了进一步筛选，用QIAGEN OneStep试剂盒进行实时PCR检测。对6μl的模板RNA进行变性(95℃/5min)。用下面的浓度进行反应：400nM引物、300nM探针和1.25mMMgCl₂。在StratageneMx3005P实时PCR机(Stratagene)中以下列循环参数完成扩增：在50℃时进行30分钟(逆转录)，在94℃时进行15分钟(RT灭活和PCR聚合酶活化)，在94℃时每15秒、54℃时每30秒和72℃时每15秒进行45个循环。用从三个具有高病毒负载量的鱼采集的RNA创建标准曲线。为MGB测定和EFIA测定创建一式两份的标准曲线(Olsvik等，BMC Mol Biol 6，21(2005))，并利用对EFIA的归一化计算现场样本的相对病毒负载量。

表2：用于靶向基因组片段L1、L2和M3(SYBR green)以及L1和S4的实时测定的引物

【实施例6：原位杂交】

根据做了一些改进的来自GeneDetect(Auckland，New Zealand)的方案，使用靶向L2的LNA探针进行原位杂交。在TE缓冲液中用40μg ml-1蛋白酶K在37℃对切片渗透15分钟，接着用两个5’和3’双DIG标记的LNA探针(5’-CACCATCAGTGAACTTAGGAGCAAC-3’和5’-CATACTCCAAGATCATCGCCAGCA-3’)(分别是SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：41)(每一个250nM)的混合物在50℃杂交18小时。在60℃进行严格洗涤。

将切片在4℃与小鼠单克隆抗DIG-HRP孵育过夜并根据制造商的方案用酪胺信号放大系统(Perkin Elmer，MA，USA)进行染色。用迈尔斯苏木精溶液对切片进行复染。所包括的阴性对照为来自实验研究的未感染鱼的样本、作为免疫细胞源的未感染鱼的前肾样本、患有胰腺疾病的鲑鱼(与HSMI鉴别诊断)和来自所送材料用于随机诊断的样本。

【实施例7：统计分析】

用Windows系统的StatView 5.0.1版软件(SAS Institute，Cary，NC，USA)进行所有的统计分析。统计分析不包括可检测的L1病毒基因转录物的样本。计算L1/EF1A比值后对所有其它的样本进行对数变换(用因数108调整)。尽管分布并没有用此方法进行归一化，但还是保留对数变换后的数据以便于群组差异的图形显示；因此，采用了非参数分析方法(Mann-Whitney U-test for comparison of healthy andHSMI fish；Kruskal-Wallis for comparisons of healthy and early，middle and peak phase HSMI fish)。对于所有检验，假设统计显著性p＜0.05。

【实施例8：病毒在细胞培养物中的繁殖】

用诊断患有HSMI的鱼的组织匀浆感染鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)和脂肪头鲤鱼细胞(FHM)细胞后可以观察到合胞体形成和空泡形成，但是2-4个传代后很少看到细胞病变效应(CPE)。

【实施例9：大西洋鲑鱼的激发】

用来自诊断患有HSMI的鱼的材料感染大西洋鲑鱼的实验激发表明病变与HSMI一致。

【实施例10：电子显微镜检验】

在诊断患有HSMI的坏死的心肌细胞中观察到直径为60-80nm病毒样颗粒。氯仿敏感性分析表明PRV属于呼肠孤病毒家族，它是一种裸病毒家族。

【实施例11：来自实验激发的心脏样本筛选】

在用来自诊断患有HSMI的鱼的组织匀浆激发大西洋鲑鱼后，通过RT-qPCR筛选心脏样本用于病毒量化。激发后的10周(wpc)，5条鱼中有4条对病毒的反应为阳性(表3)。结果与病理结果一致。

表3：激发后心脏样本中的病毒量化。Wpc＝激发后的周数

Wpc	0	1	2	3	4	5	6	8	10
										阳性(Ct)	0/5	1/5(40)	1/5(38)	0/5	0/5	0/5	0/5	1/5(39)	4/5(21-36)

【实施例12：兔的免疫】

将可读框(ORF)减去编码μ1蛋白质的M2基因组片段(SEQ IDNO：5)的最初126个核苷酸在pET100质粒中克隆并在E.coli中表达作为His标签融合蛋白，纯化。在将42aa从μ1的N端去掉的过程中，将μ1蛋白转录后裂解为哺乳动物正呼肠孤病毒中的μ1c。蛋白质用于给兔免疫从而获取多克隆、μ1C特异性抗血清。抗血清识别如在大肠杆His标签融合蛋白和不同阴性对照的免疫印迹中发现的μ1c蛋白(图20)。抗血清识别PRV，如已经在感染HSMI的鱼的心脏的免疫组织化学中所示。

将来自编码σ3蛋白质(长度为330个氨基酸)(SEQ ID NO：39)的S1基因组片段(SEQ ID NO：2)的核苷酸29-1018的可读框(ORF)在pET101质粒中克隆并在大肠杆菌中表达为His标签融合蛋白，纯化并用于给兔免疫从而获得多克隆、σ3特异性抗血清。抗血清识别了如在大肠杆菌His标签融合蛋白和不同阴性对照的免疫印迹中发现的s3蛋白。抗血清识别天然PRV，如已经在感染HSMI的鱼的心脏的免疫组织化学中所示。

将来自编码σ1蛋白(长度为420个氨基酸)(SEQ ID NO：35)的S2基因组片段(SEQ ID NO：2)的核苷酸22-1281的可读框(ORF)在pET101质粒中克隆并在大肠杆菌中表达为His标签融合蛋白，纯化并用于给兔免疫从而获得多克隆、σ2特异性抗血清。抗血清识别如在大肠杆菌His标签融合蛋白和不同阴性对照的免疫印迹中(图21)以及在感染HSMI的鱼的心脏的免疫组织化学中发现的σ1蛋白。

将来自编码σ2蛋白(SEQ ID NO：38)(长度为315个氨基酸)的S4基因组片段(SEQ ID NO：3)的核苷酸39-983的可读框(ORF)在pET101质粒中克隆并在大肠杆菌表达。进行蛋白质纯化。

从来自由S1(SEQ ID NO：2)(核苷酸108-479，相对于σ3的ORF的+1框)编码的融合关联的小跨膜蛋白(FAST)(SEQ ID NO：40)的假定抗原区的氨基酸序列合成肽，并且肽被用于给兔免疫从而获得多克隆、FAST特异性抗血清。目前它正在接受感染HSMI抗血清的鱼的心脏的免疫组织化学法识别PRV感染的细胞的测试。

用在大肠杆菌中表达的重组蛋白给兔免疫(第三代加强针)。除了S1(SEQ ID NO：40)的FAST蛋白的合成肽外，还表达和注射了外衣壳蛋白σ1(SEQ ID NO：35)、σ3(SEQ ID NO：37)和μ1C(SEQ ID NO：33)。因为FAST蛋白参与了合胞体的形成，靶向FAST蛋白的特异性抗体可增大培养病毒的机会。

在感染HSMI鲑鱼的心脏的免疫组织化学中，所有针对μ1、σ3和推定的σ2蛋白生成的血清都产生了阳性信号。针对μ1蛋白的血清的效果最好，并在免疫组织化学中产生了最好的信噪比。

表4：ORF蛋白的注释。基于硅片分析

【实施例13：病毒表征和毒性研究】

将PRV病毒片段在昆虫和鱼细胞系中克隆并表达以检验可能的致病因子、病毒鉴定和致病性研究。也将测试病毒的凝集红细胞的特性，并且将对来自地理上遥远地区的样本进行测序以研究可能的差异和菌株变异。

【实施例14：野生鱼和受精卵的筛选】

筛选来自国家基因库的材料中野生鲑鱼种群中的病毒的存在，并检验可能的病毒纵向转移。

【实施例15：亲鱼筛选】

保存在不同条件下的用于亲鱼筛选的材料尤其可从一家或多家商业繁育公司获得。

【参考文献】

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Claims

1.一种PRV免疫原性组合物，其包含PRV核酸。

2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述PRV核酸为SEQ ID NO：1-10中任何一个的核酸序列。

3.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述PRV核酸包含SEQ ID NO：1-10中任何一个的至少24个连续核酸。

4.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述PRV核酸与SEQ ID NO：1-10中任何一个的核酸序列基本上同一。

5.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述PRV核酸为与SEQ ID NO：1-10具有至少约85％同一性的SEQ ID NO：1-10中任何一个的变体。

6.根据权利要求5所述的核酸，其中所述变体与SEQ ID NO：1-10中任何一个的变体具有至少约90％、约95.5％、约96％、约96.5％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％或约99.9％的同一性。

7.一种PRV免疫原性组合物，其包含PRV多肽。

8.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其中所述PRV多肽为由SEQ ID NO：1-10中任何一个编码的多肽。

9.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其中所述PRV多肽为由包含SEQ ID NO：1-10中任何一个的至少24个连续核酸的核酸编码的多肽。

10.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其中所述PRV多肽为由与SEQ ID NO：1-10中任何一个的核酸序列基本上同一的核酸编码的多肽。

11.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其中所述PRV多肽为由核酸编码的多肽，所述核酸为与SEQ ID NO：1-10具有至少约85％同一性的SEQ ID NO：1-10中任何一个的变体。

12.根据权利要求11所述的多肽，其中所述变体与SEQ ID NO：1-10中任何一个的变体具有至少约90％、约95.5％、约96％、约96.5％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％或约99.9％的同一性。

13.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其中所述PRV多肽为包含SEQ ID NO：29-40的氨基酸序列的多肽。

14.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其中所述PRV多肽为包含SEQ ID NO：29-40中任何一个的至少8个连续氨基酸的多肽。

15.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其中所述PRV多肽与SEQ ID NO：29-40中任何一个的氨基酸序列基本上同一。

16.根据权利要求7所述的免疫原性组合物，其中所述PRV多肽为SEQ ID NO：29-40中任何一个的变体且与SEQ ID NO：29-40中任何一个具有至少约85％的同一性。

17.根据权利要求16所述的多肽，其中所述变体与SEQ ID NO：29-40中任何一个的变体具有至少约90％、约95.5％、约96％、约96.5％、约97％、约97.5％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％或约99.9％的同一性。

18.一种与PRV或PRV多肽结合并抑制、中和或降低所述PRV或PRV多肽的功能或活性的抗体。

19.根据权利要求18所述的抗体，其中所述抗体为多克隆抗体。

20.根据权利要求18所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。

21.根据权利要求18所述的抗体，其中所述抗体为硬骨鱼抗体。

22.根据权利要求18所述的抗体，其中所述抗体为鲑鱼抗体。

23.根据权利要求18所述的抗体，其中所述抗体为IgM抗体。

24.根据权利要求18所述的抗体，其中所述抗体为嵌合抗体。

25.一种免疫原性组合物，其包含含有PRV多肽的灭活病毒。

26.一种免疫原性组合物，其包含含有PRV多肽的减毒病毒。

27.根据权利要求1、7、25或26中任一项所述的免疫原性组合物，其进一步包含至少一种赋形剂、添加剂或佐剂。

28.根据权利要求1、7、25或26中任一项所述的免疫原性组合物，其进一步包含来自其它病毒的至少一种多肽或其片段。

29.一种免疫原性组合物，其包含融合多肽，其中所述融合多肽包含来自其它病毒的PRV多肽及其变体片段和至少一种多肽或其片段。

30.根据权利要求28或29所述的免疫原性组合物，其中所述其它病毒选自由以下组成的组：嗜睡症病毒(SDV)；鲑鱼胰腺病病毒(SPDV)；传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)；病毒性出血性败血病病毒(VHSV)；传染性造血组织坏死病病毒(IHNV)；传染性胰坏死病毒(IPNV)；鲤春病毒血症(SVC)；鲇鱼呼肠孤病毒(CCV)；杀鲑气单胞菌；鲑肾杆菌；粘放线菌；耶尔森氏鼠疫杆菌；巴斯德杆病菌；鳗弧菌；火神弧菌；病海弧菌；鲑弧茵；爱德华氏菌；迟钝爱德华氏菌；柱状纤维粘细菌或鲑鱼立克次氏菌。

31.一种诱导动物体内免疫反应的方法，所述方法包括施用根据权利要求1、7、25或26中任一项所述的PRV免疫原性组合物。

32.一种预防或降低动物体内PRV感染的方法，所述方法包括对所述动物施用根据权利要求1、7、25或26中任一项所述的PRV免疫原性组合物。

33.一种预防或降低动物体内PRV感染的方法，所述方法包括对所述动物施用根据权利要求18所述的抗体。

34.根据权利要求31、32或33中任一项所述的方法，其中所述施用为口服施用、浸泡施用或注射施用。

35.根据权利要求1、7、25或26中任一项所述的免疫原性组合物在生产用于治疗动物体内条件性PRV感染的疫苗中的用途。

36.根据权利要求1、7、25或26中任一项所述的免疫原性组合物在生产用于预防或降低动物体内条件性PRV感染的疫苗中的用途。