CN109971890A - Ii型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字pcr检测试剂盒及其专用引物和探针 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR检测试剂盒及其专用引物和探针，其专用引物和探针：JX02‑M‑F：5'‑CGAGAATAGATGCAGTGGACG‑3'，JX02‑M‑R：5'‑CACAAATAACCCTTCTCCCGT‑3'，JX02‑M‑P：5'‑荧光基团‑TATAGTCGATGACCAGAGG‑淬灭基团‑3'；将包含上述专用引物和探针的微滴式数字PCR检测试剂盒用于检测II型草鱼呼肠孤病毒，与传统PCR技术相比，其不依赖Ct值或内参基因，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目，成本低，实用性强。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及II型草鱼呼肠孤病毒的检测技术，具体涉及II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR检测试剂盒及其专用引物和探针，及在检测II型草鱼呼肠孤病毒的应用。
背景技术
草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)是引起草鱼出血病的病原，隶属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)、水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus)。GCRV在中国、越南、缅甸等国家均有报道，其流行广、危害大、死亡率高、发病季节广，每年4至9月全国各地均有报道。草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国第一大淡水养殖品种，据2015年全国渔业统计情况记载，我国草鱼年产量567.62万吨，占全国大宗淡水鱼类养殖产量的18％左右，是目前全球产量和消费量最大的淡水养殖鱼类品种之一。但因病害影响，尤其是草鱼出血病的流行，对1龄和2龄幼鱼的致死率达80％以上，严重影响养殖户对该品种的养殖积极性。该病不仅能够感染草鱼，还能感染青鱼(Mylopharyngodon piceus)、稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus)、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)等养殖品种，我国农业部将其列为二类传染疫病。截至目前研究发现，主要有三种基因型的毒株流行，分别为GCRV-873和GCRV-JX0901(genotype I)，GCRV-HZ08(genotype II)以及HGDRV(genotype III)，II型草鱼呼肠孤病毒是我国主要流向毒株。
微滴式数字PCR系统在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。与传统PCR相比，该方法不依赖Ct值或内参基因，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目，且微滴技术让数字PCR成本更低，实用性强。
发明内容
本发明的主要目的在于提供II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR专用引物和探针。
本发明的另一目的在于提供II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR检测试剂盒，包含上述专用引物和探针，用于检测草鱼呼肠孤病毒时，其不依赖Ct值或内参基因，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目，成本低，实用性强。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
第一方面，II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR专用引物和探针如下：
JX02-M-F：5'-CGAGAATAGATGCAGTGGACG-3'，
JX02-M-R：5'-CACAAATAACCCTTCTCCCGT-3'，
JX02-M-P：5'-荧光基团-TATAGTCGATGACCAGAGG-淬灭基团-3'；
其中，所述荧光基团为VIC，所述淬灭基团为BHQ-X。
第二方面，II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR检测试剂盒，包含上述微滴式数字PCR专用引物和探针，还包括阳性对照和阴性对照。
进一步，所述阳性对照为II型草鱼呼肠孤病毒cDNA模板，所述阴性对照为无菌ddH2O。
第三方面，上述II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR检测试剂盒用于检测II型草鱼呼肠孤病毒的方法，包括：
(1)获取如上所述的微滴式数字PCR专用引物和探针；
(2)提取待测样本、阳性对照和阴性对照的RNA并反转录；
(3)将步骤(2)所得RNA进行微滴式数字PCR扩增，获得反应液；
(4)对步骤(3)所得反应液进行微滴荧光信号分析扫描。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用微滴式数字PCR技术检测II型草鱼呼肠孤病毒，在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。与传统PCR技术相比，本发明不依赖Ct值或内参基因，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目，成本更低，实用性强。
附图说明
图1为实施例中待测样本RNA抽提电泳照片(1.5％琼脂糖、1×TAE电泳缓冲液)。
图2为基因JX02的微滴荧光信号分析扫描图；
图3为1号样JX02-01的微滴荧光信号分析扫描图；
图4为2号样JX02-02的微滴荧光信号分析扫描图；
图5为3号样JX02-03的微滴荧光信号分析扫描图；
图6为4号样Con-blank的微滴荧光信号分析扫描图；
图7为NTC的微滴荧光信号分析扫描图；
其中，图2至图7中，黑实线以上信号点代表发生PCR扩增的微滴，系统判读为阳性信号；黑实线以下的信号点代表未发生PCR扩增的微滴，系统判读为阴性信号，Pos代表阳性信号点的数量，Neg代表阴性信号点的数量。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
以下实例中使用的试剂和试剂盒、仪器设备如表1和2所示。
表1：试剂与试剂盒
表2：仪器设备
II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR检测试剂盒用于检测II型草鱼呼肠孤病毒的方法，具体步骤为：
(1)获取微滴式数字PCR专用引物和探针
针对II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR检测的专用引物和探针如下所示：
JX02-M-F：5'-CGAGAATAGATGCAGTGGACG-3'，
JX02-M-R：5'-CACAAATAACCCTTCTCCCGT-3'，
JX02-M-P：5'-荧光基团-TATAGTCGATGACCAGAGG-淬灭基团-3'；其中，荧光基团为VIC，淬灭基团为BHQ-X。
(2)提取待测样本、阳性对照和阴性对照的RNA并反转录
第一步：先进行待测样本RNA抽提，采用的试剂为氯仿：异戊醇(24：1)、无水乙醇、DEPC H2O、DNAseI、洗液DW、Buffer RDD；其中：
DNA酶的配制：DNA酶30ul，加RDD40ul，加DEPC水10ul。
DW洗液的配制：DW：无水乙醇＝9：1。
详见UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒(SK1321)。
在1.5％琼脂糖、1×TAE电泳缓冲液的条件下电泳检测上述抽提RNA，结果如图1所示；其中，Marker为DNA Marker，只为检测基因组污染，并不代表RNA条带大小。
表3：浓度以及OD值
第二步：进行RNA反转录，采用的试剂为第一链cDNA合成试剂盒(Revert AidPremium Reverse Transcriptase)，按照800ng反转，具体步骤为
1)在冰浴的nuclease-freePCR管中加入以下试剂：
2)轻轻混匀后离心3～5s，反应混合物在65℃温浴5min后，冰浴2min，然后离心3～5s。
3)将试管冰浴，再加入下列试剂：
4.0μl 5*RT Buffer，
0.5μl Thermo Scientific Ribo Lock RNase Inhibitor(20U)，
1.0μl Revert Aid Premium Reverse Transcriptase(200U)。
4)轻轻混匀后离心3～5s
5)在PCR仪上按照下列条件进行反转录反应：25℃孵育10min，cDNA合成50℃30min，终止反应85℃5min，处理后，置于-20℃保存。
第三步：按照表4配置反应体系，将上述试剂从冰箱中取出，在室温下解冻，检查样本浓度，必要时进行稀释处理，将融化后的混合液点到混匀后吸取进行反应液的配制，根据样本数量，在0.5-1.5ml混合管中配制合理体积的反应液。
表4：反应体系的配制
| 试剂 | 体积(uL) |
| 2X ddPCR supermix for probes | 10 |
| 引物(10uM) | 1.8 |
| 探针(10uM) | 0.5 |
| 模板 | 1 |
| ddH2O | 6.7 |
(3)将步骤(2)所得RNA进行微滴式数字PCR扩增
将一个新的DG8cartridgeDG8放入holder中，注意缺口方向；将20ul体系加入到DG8 cartridge中间一排的8个孔中(不足8样时用稀释一倍的20ul1×buffer controlbuffer补足)；在DG8cartridge最底下一排8个孔中各加入70ul微滴生成油(DG Oil)，同样不能有空着的孔；盖上胶垫(gasket)，注意两边的小孔都要钩牢；将以上holder轻轻地平稳放置于QX200微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态,一般约2分钟完成；微滴生成于cartridge最上面一排孔内，将生成的微滴转移到96孔板中，结束后将96孔板放在热封仪上，盖上热封膜进行封膜。再将反应板放入伯乐PCR仪中进行扩增，按以下程序进行微滴式数字PCR扩增反应，务必将升降温速率调制小于2.5℃/s。
表5：PCR扩增反应程序
(4)对步骤(3)所得反应液进行微滴荧光信号分析扫描
将样本板在电脑上设置成功后，放入QX200Droplet微滴分析中，进行微滴分析检测，数据可上传至电脑进行最终分析。反应程序完全结束后，根据具体反应情况调整阈值线至合适的位置，以便进行下一步的结果判读。
表6：微滴荧光信号分析
Claims (4)
1.II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR专用引物和探针，其特征在于，所述专用引物和探针如下：
JX02-M-F：5'-CGAGAATAGATGCAGTGGACG-3'，
JX02-M-R：5'-CACAAATAACCCTTCTCCCGT-3'，
JX02-M-P：5'-荧光基团-TATAGTCGATGACCAGAGG-淬灭基团-3'；
其中，所述荧光基团为VIC，所述淬灭基团为BHQ-X。
2.II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的微滴式数字PCR专用引物和探针，还包括阳性对照和阴性对照。
3.根据权利要求2所述的II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为II型草鱼呼肠孤病毒cDNA模板，所述阴性对照为无菌ddH2O。
4.权利要求2或3所述的II型草鱼呼肠孤病毒的微滴式数字PCR检测试剂盒用于检测II型草鱼呼肠孤病毒的方法，其特征在于，包括：
(1)获取如上所述的微滴式数字PCR专用引物和探针；
(2)提取待测样本、阳性对照和阴性对照的RNA并反转录；
(3)将步骤(2)所得RNA进行微滴式数字PCR扩增，获得反应液；
(4)对步骤(3)所得反应液进行微滴荧光信号分析扫描。
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| PB01 | Publication | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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