CN104388588B

CN104388588B - Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的nasba-elisa检测引物、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN104388588B
Application number: CN201410633166.7A
Authority: CN
Inventors: 曾伟伟; 王庆; 王英英; 石存斌; 李莹莹; 任燕; 宋新建
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2014-11-11
Filing date: 2014-11-11
Publication date: 2017-02-15
Anticipated expiration: 2034-11-11
Also published as: CN104388588A

Abstract

本发明公开了一种Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒NASBA‑ELISA检测引物、探针及试剂盒。所述引物及探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。所述试剂盒中含有引物、探针、NASBA扩增缓冲液，酶混合液，扩增产物检测试剂，阴性对照和阳性对照。本发明的Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒NASBA‑ELISA 检测试剂盒检测时间周期短、检测效率高；检测病毒特异性高，准确率高；在进行病毒定性分析的同时还能进行病毒定量分析；检测灵敏度比普通PCR高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好。

Description

Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的NASBA-ELISA检测引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明属于病毒分子生物学领域，涉及一种草鱼呼肠孤病毒体外检测方法，特别是一种Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒NASBA-ELISA 检测试剂盒。

背景技术

草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）隶属水生呼肠孤病毒属，为呼肠孤病毒科一新成员，是中国大陆分离的第一株鱼类病毒。该病毒主要引起中国、越南、缅甸等亚洲国家淡水养殖中的草鱼品种在鱼种阶段发生出血病，死亡率可高达60%以上。该病毒流行广、危害大、死亡率高、发病季节长，严重威胁渔业生产。草鱼呼肠孤病毒具双层衣壳，病毒粒子平均直径为60 nm-70nm，二十面体对称，无囊膜，基因组由11条分节段的双链RNA组成。目前己经报道了30多个分离株，包括GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、GCRV H962、ZV-8802、GCRV-854、GCRV HZ08、GCRV JX09-01、GCRV JX09-02、GCRVGD10、GCRV GCRV104株等，不同分离株在基因组序列、基因组带型、细胞病变、对草鱼的致病力等方面差异较大。到目前为止，已完成全基因组序列分析的毒株有GCRV 873株、GCRVHZ08、GCRV GD10、GCRV 104等，也有比较多的毒株只完成了部分节段或者部分序列的测序工作。草鱼呼肠孤病毒比较复杂，不同分离株的各基因节段存在重配和抗原漂移现象，使得目前还没在血清学或者基因型上对其进行亚型分类。但是通过现有的分离株序列信息来看，至少应该有三类，各类的代表株分别是：第一类为873株和JX09-01株，第二类为HZ08株和GD10株，第三类型为104株。在相关的研究报道中已有提到将其进行基因分型的探讨，即分别把一、二和三类按照基因序列差异分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。同一亚型的毒株，其对应各节段基因同源性均在95%以上。当前，全国各地分离到的流行株中，三类亚型均有报道，有的单独感染，也有混合感染。根据近几年的草鱼出血病监测和流行病学调查分析表明，目前导致草鱼出血病流行和爆发的最主要为GCRV Ⅱ型。

目前，检测草鱼呼肠孤病毒的方法有多种，如病毒分离、电镜观察、核酸带型分析、RT-PCR 和实时荧光RT-PCR 技术。病毒分离敏感度不高，特别是对于没有明显细胞病变的Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒，而且操作烦琐，成本较高，周期较长，对病料的要求较高。目前，广泛应用的常规RT-PCR 检测方法简单、方便、快速，但仍存在假阳性和PCR 污染的问题；实时荧光RT-PCR ( real-time RT-PCR) 技术虽然灵敏度较高，但仪器设备和技术含量都要求较高，不适合基层兽医部门的诊断。

依赖核酸序列的扩增( nucleuic acid sequence based amplification，NASBA)是在PCR 基础上发展起来的一种新技术。NASBA-ELISA方法是将NASBA 技术和ELISA (酶联免疫吸附剂测定) 方法相结合，其原理是将地高辛标记到检测探针上，通过探针捕获探针将地高辛标记的探针和NASBA 产物的复合物吸附到微量反应板上，作用于底物硝基苯基磷酸盐显色，然后通过分析吸光度来检测RNA 产物。由于捕获探针和检测探针的应用，使检测结果更为特异，而酶标仪的高通量性能使一次能够检测多个样品。当前，还没有建立草鱼呼肠孤病毒NASBA检测方法的报道。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒NASBA-ELISA检测引物、探针及试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供上述引物、探针及试剂盒在检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒NASBA-ELISA检测引物及探针，其针对Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒S6节段保守区域。所述引物及探针的序列如下所示：

（1）Ⅱ型GCRV S6基因一对特异性引物：

S6-F:5-GATGCAAGGTCGCATATGAGCAGACGGGTCACCGTATTGTTACA-3’（SEQ ID NO.1)，

S6-R：5’-AATTCTAATACGACTCACTAAAGGGAGAAGGGAACTCATCAGTAAAGTCGGA-3’ （SEQID NO.2)；

（2）Ⅱ型GCRV S6基因特异性捕获探针：

S6-CP：5'BIO-TCAGCAGGTGCCGTTAATTTGT-3'（SEQ ID NO.3)；

（3）Ⅱ型GCRV S6基因特异性检测探针

S6-DP：5'-TGATGCAAGGTCGCATATGAG-DIG3'（SEQ ID NO.4)。

一种用于检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的NASBA-ELISA试剂盒，其含上述的引物及探针，还含有NASBA扩增缓冲液，酶混合液，扩增产物检测试剂，阴性对照和阳性对照。

所述NASBA扩增缓冲液含有： pH 8.5 Tris-HCl 50 mmol/L，KCl 50 mmol/L，MgCl₂ 12 mmol/L，DTT 5 mmol/L，dNTP 2 mmol/L，NTP 10 mmol/L，DMSO 100 g/L。

所述酶混合液含有：AMV反转录酶20U ，T7 RNA聚合酶40U，核糖核酸酶H 0.8U。

所述扩增产物检测试剂的组成为：

（1）链霉亲和素包被的96孔酶标板；

（2）杂交缓冲液：20×SSPE（pH7.4），50mM/L Tris-HCl（pH8.8），1%（W/V）BSA 45μL；

（3）酶标抗体：碱性磷酸酶抗地高辛抗体 100μL；

（4）洗液：PBST溶液500μL；

（5）显色液：3mg pNPP 溶于1mL ddH₂O中，加入1ml二乙醇胺，避光-20℃保存，100μL；

（6）终止液：0.5M Na2CO3 溶液 100μL。

所述阳性对照为GCRV HZ08株病毒液提取的RNA，所述阴性对照为未感染草鱼呼肠孤病毒的健康草鱼内脏组织提取的总RNA。

以上所述的试剂盒在检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒中的应用。

本发明的NASBA-ELISA技术由1 对带有T7 启动子序列的引物引导的连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术，反应在41℃条件下进行，可在2 h 内将模板RNA 扩增10⁹ 倍，比常规PCR法高10³ 倍，而且不需特殊仪器，是一种快速﹑简便﹑特异的扩增技术，具有敏感性高、特异性好、操作简单等特点，很适合基层兽医部门推广应用。

NASBA 的简要过程如下：（1）RNA 模板链进入反应混合物后，第一个引物首先与模板链的3' 端结束。（2）反转录酶（AMV），合成反义的补偿的DNA 链。（3）RNaseH，分解破坏RNA模板链。（4）第二个引物与DNA 的5’端结合。（5）T7 RNA polymerase 合成RNA 补偿链，并加入到步骤1中，使反应可以循环进行。

本发明的有益效果是：

本发明的Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒NASBA-ELISA 检测试剂盒检测时间周期短、检测效率高；检测病毒特异性高，准确率高；在进行病毒定性分析的同时还能进行病毒定量分析；检测灵敏度比普通PCR高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好。

附图说明

图1为K⁺浓度对NASBA的影响，其中M为DNA分子量标准，1、2、3为KCl浓度分别为25mM、50mM和75mM的扩增结果，RT为RT-PCR扩增结果；

图 2为RnaseH用量对NASBA的影响，其中M为DNA分子量标准，1、2、3为RnaseH的用量分别是0.6U、0.8U、1.2U的扩增结果；

图3 为T7 RNA polymerase用量对NASBA的影响，其中M为DNA分子量标准，1、2、3为T7 RNA polymerase分别是20U、40U和60U的扩增结果；

图4 为引物浓度对NASBA的影响，其中M为DNA分子量标准，1、2、3中引物浓度分别为0.1、0.2、0.25uM。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版) (Sambrook J，Russell DW，Janssen K， Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社) ，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：特异性引物和探针的设计与合成

从NCBI获得GCRV-GD108、106、918、HeNan988、HeNan794、HZ08和 109共7个病毒株S6序列，进行比对；在保守区域设计1对扩增引物及相应的捕获探针和检测探针。

S6-F:5’-GATGCAAGGTCGCATATGAGCAGACGGGTCACCGTATTGTTACA-3’（SEQ ID NO.1），下划线部分与检测探针互补；

S6-R：5’-AATTCTAATACGACTCACTAAAGGGAGAAGGGAACTCATCAGTAAAGTCGGA-3’ （SEQID NO.2），下划线部分为T7启动子序列。

Ⅱ型GCRV S6基因特异性捕获探针： S6-CP：5'BIO-TCAGCAGGTGCCGTTAATTTGT-3'（SEQ ID NO.3）；

Ⅱ型GCRV S6基因特异性检测探针S6-DP：5'-TGATGCAAGGTCGCATATGAG-DIG3'（SEQID NO.4）。

实施例2 NASBA方法中引物浓度、酶浓度、离子浓度的摸索及优化

（1）K⁺浓度的优化

在不同的文献中，K⁺浓度分别为10mM、20mM、42mM、70mM、120mM；有文献显示100mM以上的浓度对结果影响不大；基础体系中K⁺浓度为25mM；分别设置KCl浓度为25mM、50mM、75mM进行NASBA扩增。50mM和75mM的结果相似，均比25mM扩增的条带要亮，确定以后体系中使用50mM KCl。

（2）RnaseH用量的优化

在不同的文献中，每20ul反应体系中RnaseH的用量从0.1U、0.2U至0.8U不等；使用较少RnaseH的反应体系中添加了DMSO或者山梨醇来激发AMV的内源RnaseH活性。但是过少的RnaseH很难用移液器吸取，故本反应系统没有添加DMSO和山梨醇。设立0.6U、0.8U和1.2U三个RnaseH用量。实电泳结果表明，RnaseH用量为0.8U时的条带最亮。

（3）T7 RNA polymerase用量的优化

在不同的文献中，每20ul反应体系中T7 RNA polymerase的用量从20U、38U、60U不等；保持上述基本体系不变，调整T7 RNA polymerase的用量分别为20U、40U和60U进行反应；当T7 RNA polymerase用量从20U增加到40U时，扩增产物量明显增加；但是60U的用量下，扩增产物较40U略有增加，没有明显的差异；考虑到酶的用量成本，选择40U为最佳用量。

（4）引物浓度的优化

在不同的文献中，引物的使用量从0.1uM、0.2uM、0.4uM到0.5uM不等。本体系中使用的引物浓度为0.25uM，电泳检测发现具有较强的引物二聚体。设立0.1、0.2、0.25uM三个引物浓度梯度，按上述优化的条件进行NASBA反应。电泳结果显示扩增产物条带和二聚体条带没有明显的变化。

实施例3NASBA-ELISA反应体系及反应程序的建立

1、病毒RNA的提取

①取200ul病毒样本，加入1ml Trizol，剧烈振荡15s，室温放置5min；

②加入200ul氯仿，剧烈振荡15s，4℃ 12000rpm离心15min；

③取上清，加入650ul异丙醇，-20℃沉淀10min；

④4℃ 12000rpm离心15min，去上清；

⑤加入1ml DEPC水配制的75%乙醇清洗沉淀，4℃ 8000rpm离心5min；

⑥轻轻去上清，用枪头吸去残留液体，室温干燥沉淀10min；

⑦加入24ul DEPC水溶解沉淀，5ul分装成8管于-80℃保存备用；同时提取健康草鱼组织的RNA作为对照之用。

2、NASBA反应体系和反应程序

取3μL 模板RNA，0.5μL 上游引物（100p mol/μL）和0.5μL 下游引物（100p mol/μL），12μL NASBA Buffer（含有50 mmol/L、pH 8.5 Tris-HCl，50 mmol/L KCl，12 mmol/LMgCl₂，5 mmol/L DTT，2 mmol/L dNTP，10 mmol/L NTP，100 g/L DMSO。）加入到500μL离心管中，65℃加热2 min，去除RNA二级结构，41℃冷却2 min；迅速加入酶混合液4μL（含20U 的AMV反转录酶，40U T7 RNA聚合酶，0.8 U 核糖核酸酶H），反应总体积为20μL，震荡混匀后，41℃反应90 min，-20℃终止反应。

3、ELISA检测 NASBA 扩增产物

（1）链霉亲和素包被酶标板

取无Rnase的酶标板用pH9.6的0.05M 碳酸盐缓冲液配置0.01mg/ml的链霉亲和素，每孔100μl，室温过夜；

（2）封闭

用pH9.6的0.05M 碳酸盐缓冲液配置0.2% BSA封闭酶标板，每孔100ul，37℃孵30min，PBST洗版3次。4℃避光保存备用。

（3）杂交

配制如下杂交体系：NASBA产物 5μl，捕获探针（10μM）5μl，检测探针（10μM）5μl，20×SSPE杂交缓冲液 25μl，ddH₂O 60μl。然后振荡混匀，45℃孵育30min。

（4）结合酶标抗体

用含0.2%BSA的PBST按1 :250稀释AP-DIG抗体，每孔100μl，室温孵育30min，TBST洗版3次。

（5）显色及读值

每孔加入100ul pNPP显色液，室温避光显色1-2hr；每孔加入100ul 0.5M Na₂CO₃终止液终止显色。在405nm处读取吸光度值。以阴性对照MEAN+3SD为判定阳性的标准值。进行NASBA反应的产物进行ELISA检测，阳性孔和阴性孔各做4个复孔，显色后405nm读值，结果如下：

表1 阳性结果判定标准

阳性孔的读值在0.49-0.68之间，阴性孔的读值在0.21-0.25附近，阴性孔读值MEAN+3SD数值为0.284，读值超过0.284的孔可视为阳性。

实施例4 特异性实验

分别提取健康草鱼肝脾、肾组织混合的总RNA、美洲金体鳊呼肠孤病毒 (GoldenShiner Reovirus，GSRV)、草鱼呼肠孤病毒 JX09-01株（Grass Carp Reovirus JX09-01，GCRV JX09-01)、草鱼呼肠孤病毒104株（Grass Carp Reovirus 104，GCRV 104)、草鱼呼肠孤病毒HZ08株（（Grass Carp Reovirus HZ08，GCRV HZ08)、草鱼呼肠孤病毒109株（GrassCarp Reovirus109，GCRV 109)、杂交鳢弹状病毒C1207株(Hybrid Snakehead RhabdovirusC1207，HSHRV-C1207)、鳜鱼弹状病毒（ Siniperca Chuatsi Rhabdovirus ，SCRV）的RNA；提取锦鲤疱疹病毒（Koi Herpesvirus，KHV）、传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen andKidney Necrosis Virus，ISKNV)、大口黑鲈虹彩病毒(Large Mouth Bass Virus，LMBV)的DNA。以上述提取的RNA或DNA为模板，按照实施例3建立的方法进行NASBA-ELISA检测，验证其特异性。选用链霉亲和素包被板条对上述NASBA产物ELISA 检测，同时设定 DEPC水的NASBA产物为空白对照，结果见表2。结果显示：所有Ⅱ型GCRV的NASBA-ELISA结果为阳性，其他RNA或DNA病毒的NASBA-ELISA结果均为阴性，由此表明本发明建立的NASBA-ELISA方法具有特异性。

表2 NASBA-ELISA特异性检测结果

实施例5 敏感度实验

将GCRV-HZ08株提取的RNA（3.6×10⁵拷贝/μl）进行10倍系列稀释，进行NASBA-ELISA检测，验证其敏感性。即将提取的病毒RNA稀释为3.6×10⁵拷贝/μl、3.6×10⁴拷贝/μl、3.6×10³拷贝/μl、3.6×10²拷贝/μl、3.6×10¹拷贝/μl、3.6×10⁰拷贝/μl，按实施例3的方法，每20μl反应体系中加入3μl RNA进行NASBA反应；ELISA检测反应产物，每个稀释度设立4个复孔。ELISA检测结果表明，样品稀释10000倍之后，即36拷贝/μl的浓度还能检测出阳性信号，而RT-PCR检测的灵敏度为360拷贝/μl。

表 3 NASBA-ELISA敏感性检测结果

实施例6NASBA-ELISA方法的重复性测定

按实施例3的方法，将GCRV HZ08株提取的RNA进行5次NASBA反应，选用依诺金链霉亲和素包被板条对NASBA反应产物进行ELISA检测，结果均为阳性，其OD₄₀₅nm值均在0.68左右，表明该方法具有良好的重复性。

实施例7 NASBA-ELISA方法检测临床样品

按实施例3建立的方法，NASBA-ELISA方法和草鱼呼肠孤病毒RT-PCR对采集自江西、广东、湖北、浙江、重庆、四川、福建等草鱼主养区16个省市的103份草鱼出血病样品进行检测，并比较两方法的检测符合率。结果NASBA-ELISA方法检测阳份数为68份，RT-PCR检测阳性份数为62份，其中RT-PCR检测为阳性的62份样品，NASBA-ELISA检测均为阳性。

以上实施例表明：本发明的Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒NASBA-ELISA 检测试剂盒检测时间周期短、检测效率高；检测病毒特异性高，准确率高；在进行病毒定性分析的同时还能进行病毒定量分析；检测灵敏度比普通PCR高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的NASBA-ELISA检测引物、探针及试剂盒

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gatgcaaggt cgcatatgag cagacgggtc accgtattgt taca 44

<210> 2

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aattctaata cgactcacta aagggagaag ggaactcatc agtaaagtcg ga 52

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcagcaggtg ccgttaattt gt 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgatgcaagg tcgcatatga g 21

Claims

1.Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒NASBA-ELISA检测引物及探针，其特征在于，所述引物及探针针对Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒S6节段保守区域，所述引物及探针的序列如下所示：

（1）Ⅱ型GCRV S6基因一对特异性引物：

S6-F:5’-GATGCAAGGTCGCATATGAGCAGACGGGTCACCGTATTGTTACA-3’（SEQ ID NO.1)，

S6-R：5’-AATTCTAATACGACTCACTAAAGGGAGAAGGGAACTCATCAGTAAAGTCGGA-3’ （SEQ IDNO.2)；

（2）Ⅱ型GCRV S6基因特异性捕获探针：

S6-CP：5’-BIO-TCAGCAGGTGCCGTTAATTTGT-3’（SEQ ID NO.3)；

（3）Ⅱ型GCRV S6基因特异性检测探针

S6-DP：5’-TGATGCAAGGTCGCATATGAG-DIG-3’（SEQ ID NO.4)。

2.一种用于检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的NASBA-ELISA试剂盒，其含有权利要求1所述的引物及探针。

3.根据权利要求2所述的用于检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的NASBA-ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有NASBA扩增缓冲液，酶混合液，扩增产物检测试剂，阴性对照和阳性对照。

4.根据权利要求3所述的用于检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的NASBA-ELISA试剂盒，其特征在于，所述NASBA扩增缓冲液含有： pH 8.5 Tris-HCl 50 mmol/L，KCl 50 mmol/L， MgCl₂12 mmol/L，DTT 5 mmol/L，dNTP 2 mmol/L，NTP 10 mmol/L，DMSO 100 g/L。

5.根据权利要求3所述的用于检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的NASBA-ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶混合液含有：AMV反转录酶20U ，T7 RNA聚合酶40U，核糖核酸酶H 0.8U。

6.根据权利要求3所述的用于检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的NASBA-ELISA试剂盒，其特征在于，所述扩增产物检测试剂的组成为：

（1）链霉亲和素包被的96孔酶标板；

（2）杂交缓冲液：pH7.4的20×SSPE，pH8.8的50mM/L Tris-HCl，1%（W/V）BSA 45μL；

（3）酶标抗体：碱性磷酸酶抗地高辛抗体 100μL；

（4）洗液：PBST溶液500μL；

（6）终止液：0.5M Na₂CO₃ 溶液 100μL。

7.根据权利要求3所述的用于检测Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒的NASBA-ELISA试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为GCRV HZ08株病毒液提取的RNA，所述阴性对照为未感染草鱼呼肠孤病毒的健康草鱼内脏组织提取的总RNA。