CN102367486A - 草鱼出血病的病原草鱼呼肠孤病毒rt-pcr快速检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及草鱼出血病的病原草鱼呼肠孤病毒RT-PCR快速检测试剂盒及检测方法。本发明所述的草鱼出血病的病原草鱼呼肠孤病毒的RT-PCR快速检测试剂盒，包括：2×反应混合缓冲液1.0ml，包含优选设计的上游引物和下游引物；酶混合液；无RNA酶的去离子水；阳性对照液；阴性对照液。本发明克服了现有草鱼出血病RT-PCR检测方法无法检测当前流行毒株的不足，提供了一种新型的RT-PCR快速检测试剂盒及其检测方法，能快速、高效地适用于目前多数流行毒株的检测。
Description
技术领域
本发明涉及草鱼出血病的病原草鱼呼肠孤病毒RT-PCR快速检测试剂盒及检测方法，特别涉及一种草鱼呼肠孤病毒的基因检测试剂及检测方法，适用于草鱼出血病流行病学监测、病原的检测及基因工程技术等领域。
背景技术
草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）隶属水生呼肠孤病毒属，为呼肠孤病毒科一新成员，是中国大陆分离的第一株鱼类病毒。该病毒主要引起中国、越南、缅甸等亚洲国家淡水养殖中的草鱼品种在鱼种阶段发生出血病，死亡率可高达60%以上。该病毒流行广、危害大、死亡率高、发病季节长，严重威胁渔业生产。草鱼呼肠孤病毒具双层衣壳，病毒粒子平均直径为60 nm-70nm，二十面体对称，无囊膜，基因组由11条分节段的双链RNA组成。目前己经报道了近20个分离株，包括GCRV854、GCRV861、GCRV873、GCRV875、GCRV876、GCRV991、H962、ZV-8802、GCHV-854、HZ08、JX09-01、GD10等，不同分离株在基因组序列、基因组带型、细胞病变、对草鱼的致病力等方面差异较大，其中对GCRV 873株研究的较为深入，是第一株完成全基因序列分析的水生呼肠孤病毒，也是迄今研究的最为系统最为深入的水生呼肠孤病毒，但是这个毒株现在毒力较弱，也不算目前主要流行株。本发明人课题组2008年从浙江湖州分离到的GCRV HZ08株于2009年已完成全基因组测序，部分序列的分析结果已发表，亦从多方面对其进行了较为系统的研究，而其他分离株的研究报道近几年则相对较少。
自20世纪80年代以来，我国鱼病科研工作者就致力于草鱼呼肠孤病毒的防治研究，土法疫苗和组织浆疫苗取得了较好的效果。但是，在疫苗的应用过程中也发现，同一地区的草鱼出血病疫苗对本地区有效，免疫其他地区引起失败或效果欠佳，推测不同地区的草鱼呼肠孤病毒流行株存在较大差异。要想有效的防治草鱼出血病，必须进行草鱼呼肠孤病毒的分子流行病学调查，从基因水平了解病毒结构，根据不同地区草鱼出血病的特点制备相应的疫苗。而流行病学调查的关键是建立一种简便、快速和可行的草鱼呼肠孤病毒检测方法。目前针对草鱼呼肠孤病毒的主要检测方法还是基于873株的核苷酸信息设计特异性引物建立的RT-PCR方法，而目前流行毒株多数和873株在核苷酸序列方面存在较大的差异，已不能适应目前草鱼出血病病原检测的要求，无法对现在主要流行的草鱼呼肠孤病毒进行检测和监测。
发明内容
本发明的目的在于针对目前草鱼出血病病原的检测要求，克服现有草鱼出血病RT-PCR检测方法无法检测当前流行毒株的不足，提供了一种新型的RT-PCR快速检测试剂盒及其检测方法，能快速、高效地适用于目前多数流行毒株的检测。
本发明所述的草鱼出血病的病原草鱼呼肠孤病毒的RT-PCR快速检测试剂盒，包括：
（1）2× 反应混合缓冲液 1.0ml，包含以下成分：
KCl 20 mM，
MgCl2 25 mM，
(NH4)2SO4 20mM，
吐温 20 0.2%，
dNTP 3mM，
Oligo dT 2.5mM，
甜菜碱 1.5 mM，
Tris-HCl，pH8.8 40mM，
上游引物P01 25mM，
下游引物P02 25mM，
其中，上游引物P01序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物P02序列如SEQ ID NO：2所示；
（2）酶混合液 200μl，包含以下成分：
AMV逆转录酶 5U/μl，
Ex-Taq酶 5U/μl，
RNA酶抑制剂 40U/μl；
（3）无RNA酶的dH2O 1.0ml；
（4）阳性对照液：草鱼呼肠孤病毒HZ08株基因组RNA；
（5）阴性对照液：健康草鱼组织总RNA。
注：AMV是Avian Myeloblastosis Virus（禽成髓细胞瘤病毒）的缩写。
上述阳性对照液与阴性对照液均按目前商业化的RNA提取试剂盒（如Invitrogen公司的Trizol试剂盒或Qiagen公司的Qiagen RNA提取试剂盒的说明书所述方法提取而得。
阳性对照液所采用的草鱼呼肠孤病毒HZ08株，是由珠江水产研究所鱼病室的博士研究生张超于2008年从浙江湖州患出血病草鱼体内分离所得，并对其分子生物学特性和基因组信息进行了分析，有关技术背景请参见已发表文献（1、张超，王庆，石存斌，曾伟伟，刘永奎，江海明，吴淑勤.草鱼呼肠孤病毒HZ08株的分离与鉴定.中国水产科学.2010，17； Chao Zhang,Qing Wang, Cunbin Shi, Weiwei Zeng,Yongkui Liu,Shuqin. Molecular analysis of grass carp reovirus HZ08 genome segments 1-3 and 5-6. Wu.Virus Genes.2010,41:102104..）。
本发明还提供了所述试剂盒用于检测草鱼出血病的病原草鱼呼肠孤病毒的方法，包括以下步骤：
（1）提取发病草鱼的组织或感染病毒细胞的总RNA，作为RT-PCR反应的模板；
（2）分别取模板1.5μl、2× RT-PCR反应混合液12.5μl、酶混合液1.5μl和无RNA酶的dH2O 11μl加入到PCR管中，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混匀后离心数秒，置于PCR反应仪上；
（3）按下列条件进行扩增：42℃ 15min， 95℃ 5min，1个循环；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min 1个循环，4℃ 保存；
（4）反应结束后，取3-8μL加入到2μL溴酚蓝混匀，经1%琼脂糖凝胶电泳20-30min 后，于紫外仪上观察，若检测样品在229bp处出现明亮的发应条带，而阴性对照没有目的条带，则为草鱼呼肠孤病毒阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无反应条带出现，则为阴性。
与现有技术相比，本发明所述的草鱼出血病的病原草鱼呼肠孤病毒的RT-PCR快速检测试剂盒及其检测方法具有如下特定与优点：
（1）通过最近几年的流行病学调查发现，目前流行的毒力较强的草鱼呼肠孤病毒同 HZ08株在核酸信息方面存在较大的同源性，其中GCRV HZ861株、GCRV HZ08株、GCRV GD10株通过部分核苷酸序列分析表明其核苷酸序列比较相似，而本发明根据这几个毒株的S6基因的保守序列部分及其他从全国各地分离的二十多株草鱼呼肠孤病毒的S6基因共有的核苷酸序列设计出一对特异性引物，采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，对患病出血病和隐性感染草鱼草鱼呼肠孤病毒特异的S6基因进行定性检测，经实验验证，可用于草鱼出血病的快速、高效地监测，克服了现有草鱼出血病RT-PCR检测方法无法检测当前流行毒株的不足。
（2）本发明提供了针对上述RT-PCR方法的优化的RT-PCR反应液、反应体系和反应条件，本发明的反应液包含反转录和PCR所需要的全部成分和环境，包括引物，另外是酶混合物中包括反转录酶、Taq酶和RNA酶抑制剂，反应时只需加入适量无Rnase的去离子水和模板即可实现反转录和PCR两个过程一次完成，整个反应所需要的时间在1.5个小时内即可完成。本发明通过设计特异性引物和优化反应条件，使反转录和PCR在同一个体系中进行，缩短反应时间，从而是该方法更加简便、快速、特异、灵敏。
（3）使用本发明的试剂盒及检测方法，从检测前的样品处理到完成一组待检样品的检测，一般只需要3-4个小时（具体时间的长短取决于样品处理所采用的方法和操作人员的熟练程度），因此可高效地用于现今草鱼出血病病原的跟踪监测，克服了以前的草鱼出血病RT-PCR检测方法无法检测当前流行毒株的不足，同时，通过优化反应体系和反应条件，简化了反应过程和缩短了反应时间，极大地方便了草鱼出血病病原草鱼呼肠孤病毒的早期监测和草鱼出血病的流行病学调查，以及用于草鱼出血病病原及弱毒疫苗使用后的跟踪监测，避免培育的草鱼被草鱼呼肠孤病毒污染，对草鱼出血病的防控和消灭具有较高的实用价值。
附图说明
图1为感染草鱼呼肠孤病毒HZ08株内脏组织 的RT-PCR扩增结果。其中， 标号1为阴性对照（以阴性对照液作为模板）；标号2为阳性对照（以阳性对照液作为模板）；标号3为草鱼呼肠孤病毒HZ08株感染草鱼样品；标号M为分子量标准DL2000（购自宝生物工程有限公司）。
图2为22份草鱼出血病样品 的RT-PCR扩增结果。其中，标号1-22为22份不同草鱼出血病样品；标号23为阴性对照（以阴性对照液作为模板）；标号24为阳性对照（以阳性对照液作为模板）；标号M为分子量标准DL2000。
图3为对不同病原的RT-PCR扩增结果。其中，标号1-10分别为柱状嗜纤维菌、嗜水气单胞菌，爱德华氏菌、美洲金鳊呼肠股病毒、哈维弧菌、鳜传染性脾肾坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒鳜鱼虹彩病毒、GCRV873株、GCRV JX09-01株；标号11为GCRV HZ08株；标号12为GCRV JX09-02株；标号13为阳性对照；标号14为阴性对照；标号M为分子量标准DL2000。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例一：草鱼出血病病原—草鱼呼肠孤病毒RT-PCR快速检测试剂盒
本实施例所述的草鱼出血病病原—草鱼呼肠孤病毒RT-PCR快速检测试剂盒的所有化学试剂均购自Sigma公司，引物由Invitrogen公司合成。但上述试剂和引物来源不构成对本发明的任何限制，本发明可自行配制有关试剂和合成有关引物。
试剂盒由下列部分构成（8样份）：
（1）2×反应混合缓冲液（Reaction Mix Buffer） 1.0ml，包含以下成分：
KCl 20 mM，
MgCl2 25 mM，
(NH4)2SO4 20mM，
吐温 20 0.2%，
dNTP 3mM，
Oligo dT 2.5mM，
Betaine（甜菜碱） 1.5 mM，
Tris-HCl，pH8.8 40mM，
上游引物P01 25mM，
下游引物P02 25mM，
P01：5’-CCA AGG GGT CTG TGG CGA CA-3’（SEQ ID NO:1）
P02：5’-TTT CAC CGG TAA CAG GAT TG-3’（SEQ ID NO:2）
(2)酶混合液（Enzyme Mix） 200μl，包含以下成分：
AMV逆转录酶 5U/μl，
Ex-Taq酶 5U/μl，
RNA酶抑制剂 40U/μl；
注：AMV是Avian Myeloblastosis Virus（禽成髓细胞瘤病毒）的缩写。
(3)Rnase Free dH2O 1.0ml。
(4) 阳性对照液，草鱼呼肠孤病毒HZ08株基因组RNA。
(5) 阴性对照液，健康草鱼组织的总RNA。
(6) 操作说明书一份。
(7) 长方体盒子，可装上述1~6号部件, 8.0×5.0×5.2cm3。
(8）一块硬纸板，其大小与盒子的底面相同，高2.5cm，有2排孔，每排四个孔，孔径1.1cm，上述各小管分别对应放置于这些小孔中，装于长方体盒子中。
上述阳性对照液与阴性对照液均按目前商业化的RNA提取试剂盒（如Invitrogen公司的Trizol试剂盒或Qiagen公司的Qiagen RNA提取试剂盒的说明书所述方法提取而得。
阳性对照液所采用的草鱼呼肠孤病毒HZ08株，是由珠江水产研究所鱼病室的博士研究生张超于2008年从浙江湖州患出血病草鱼体内分离所得，并对其分子生物学特性和基因组信息进行了分析，有关技术背景请参见已发表文献（1、张超，王庆，石存斌，曾伟伟，刘永奎，江海明，吴淑勤.草鱼呼肠孤病毒HZ08株的分离与鉴定.中国水产科学.2010，17； Chao Zhang,Qing Wang, Cunbin Shi, Weiwei Zeng,Yongkui Liu,Shuqin. Molecular analysis of grass carp reovirus HZ08 genome segments 1-3 and 5-6. Wu.Virus Genes.2010,41:102104..）。
RT-PCR扩增反应体系（25μL体系）为：
2×Reaction Mix Buffer 12.5μL
Enzyme mix 1 μL
模板 1 μL
ddH2O 10.5μL
RT-PCR扩增反应条件为：
42℃ 10min
95℃ 5 min
1个循环
94℃ 30s
52℃ 30s
72℃ 30s
30个循环
72℃ 8min
1个循环
扩增产物4℃ 保存。
实施例二：草鱼出血病病原—草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测方法
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
（1）按Trizol试剂盒（购自Invitrogen公司，货号：15596-026）的说明书或按照Qiagen RNA提取试剂盒（购自Qiagen公司，货号：74104）的说明书步骤，从人工感染草鱼呼肠孤病毒JX09-02株的草鱼内脏组织（GCRV JX09-02株为2009年从江西南昌患出血病草鱼体内分离所得，并经过细胞分离、电镜观察、基因组电泳、RT-PCR等多种方法鉴定，其内容发表的文章是：《刘永奎，王庆，曾伟伟，等..一株草鱼呼肠孤病毒的分离及鉴定.中国水产科学，2011》中提取RNA，作为RT-PCR反应的模板。
（2）分别取2×reaction mix buffer 12.5μL，Enzyme mix 1μL，ddH20 10.5μL，模板1 μL，另外，取3号液（阳性对照液）和4号液（阴性对照液）各1 μL作为模板，作为阳性和阴性对照组。混匀后离心8sec，置于PCR反应仪上。
（3）按下列条件进行扩增：42℃ 10min，95℃ 5 min，1个循环；94℃ 30S，
52℃ 30S，72℃ 30S，30个循环；72℃ 8min，1个循环；扩增产物4℃ 保存。
（4）反应结束后，取3-80μL加入到2μL溴酚蓝混匀，经1%琼脂糖凝胶电泳20-30min 后，于紫外仪上观察，若在229bp处出现明亮的反应条带，则为草鱼呼肠孤病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性。
（5）实验结果分析：如图1所示，在标号3（待测样品）的电泳带中229bp处出现明亮的反应条带，在标号2（阳性对照品）的电泳带中也出现同样的反应条带，而在标号1（阴性对照品）的电泳带中未出现反应条带，表明本RT-PCR试剂盒的检测效果符合预期。
实施例三：草鱼出血病病原—草鱼呼肠孤病毒RT-PCR快速检测试剂盒对不同地区样品的检测
使用实施例1所述的试剂盒，按下列步骤进行：
（1）分别对从江西、浙江、广东、山东、广西、湖北、江苏等地具有典型草鱼出血病症状的22份样品（该22份样品由珠江水产研究所鱼病室的研究生张超、刘永奎、杨淞等于2008-2010年期间分别从江西南昌、江西赣州、江西九江、浙江湖州、广东花都、广东番禺、山东青岛、广西崇左、广西柳州、湖北武汉、江苏盐城采集）进行检测，按照Trizol试剂盒说明书从患出血病草鱼内脏组织（主要是肝、脾、肾和肠）中提取RNA，作为RT-PCR反应的模板。
（2）分别取2×reaction mix buffer 12.5μL，Enzyme mix 1μL，ddH20 10.5μL，模板1 μL，另外，取3号液（阳性对照液）和4号液（阴性对照液）各1 μL作为模板，作为阳性和阴性对照组。混匀后离心10 S，置于PCR反应仪上。
（3）按下列条件进行扩增：42℃ 10min，95℃ 5 min，1个循环；94℃ 30S，
52℃ 30S，72℃ 30S，30个循环；72℃ 8min，1个循环；4℃ 保存。
（4）反应结束后，取3-8μL加入到2μL溴酚蓝混匀，经1%琼脂糖凝胶电泳20-30min 后，于紫外仪上观察，若在229bp处出现明亮的发应条带，则为草鱼呼肠孤病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性。
检测结果和分离电镜观察结果以及测序结果吻合，22份样品中检测20份，其阳性检出率为91%，通过进一步测序表明，其检测的结果均为草鱼呼肠孤病毒，且核苷酸序列同源性都在96%以上，RT-PCR检测结果见图2。
实施例四：草鱼出血病病原—草鱼呼肠孤病毒RT-PCR快速检测试剂盒特异性实验
使用实施例一所述的试剂盒，按下列步骤进行：
（1）分别提取柱状嗜纤维菌（2007年分离）、嗜水气单胞菌（2008年分离），爱德华氏菌（2006年分离）、美洲金鳊呼肠孤病毒（ATCC编号：VR-957）、鳜鱼虹彩病毒（2009年分离）、哈维弧菌（2006年分离）、传染性胰腺坏死病毒（ATCC编号：VR-883）、传染性造血器官坏死病毒(2010年分离)、GCRV873株（由中国科学院水生生物研究所张奇亚研究员馈赠）、GCRV JX09-01株（2009年从江西所取病料分离所得《曾伟伟，王庆，石存斌，等. 一株草鱼呼肠孤病毒的分离与鉴定，水生生物学报.2010》），GCRV JX09-02株（GCRV JX09-02株为2009年从江西南昌患出血病草鱼体内分离所得，并经过细胞分离、电镜观察、基因组电泳、RT-PCR等多种方法鉴定，其内容发表的文章是：《刘永奎，王庆，曾伟伟，等..一株草鱼呼肠孤病毒的分离及鉴定.中国水产科学，2011》）、GCRV HZ08株（2008年分离鉴定，张超，王庆，石存斌，曾伟伟，刘永奎，江海明，吴淑勤.草鱼呼肠孤病毒HZ08株的分离与鉴定.中国水产科学.2010，17（6)）的核酸作为模板，进行RT-PCR检测。（注：上述病原中，除GCRV873株为馈赠所得之外，其他均购自ATCC病原库，并由珠江水产研究所鱼病室分离、鉴定并保存，部分已经发表论文。）
（2）分别取2×reaction mix buffer 12.5μL，Enzyme mix 1μL，ddH20 10.5μL，模板1 μL，另外，取3号液（阳性对照液）和4号液（阴性对照液）各1 μL作为模板，作为阳性和阴性对照组。混匀后离心10 S，置于PCR反应仪上。
（3）按下列条件进行扩增：42℃ 10min，95℃ 5 min，1个循环；94℃ 30S，
52℃ 30S，72℃ 30S，30个循环；72℃ 8min，1个循环；扩增产物4℃ 保存。
（4）反应结束后，取3-8μL加入到2μL溴酚蓝混匀，经1%琼脂糖凝胶电泳20-30min 后，于紫外仪上观察，在229bp处出现明亮的反应条带，则为所要检测的草鱼呼肠孤病毒阳性；若无反应条带出现，则为阴性。
（5）实验结果分析：如图3所示，标号1-10（分别为柱状嗜纤维菌、嗜水气单胞菌，爱德华氏菌、美洲金鳊呼肠股病毒、IHNV病毒、鳜鱼虹彩病毒、GCRV873株、GCRV JX09-01株）的电泳带在229bp处无反应条带出现，显示草鱼呼肠孤病毒阴性。（注：虽然标号9和10为草鱼呼肠孤病毒，但是这两个毒株为弱毒株，本发明所述的试剂盒对它们的特异性不强。）而标号11-12（草鱼呼肠孤病毒的目前流行的强毒株）与标号13（阳性对照）的电泳带在229bp处均有反应条带出现，显示草鱼呼肠孤病毒阳性，表明本发明所述的试剂盒对目前流行的草鱼呼肠孤病毒强毒株的特异性强。
SEQUENCE LISTING（序列表）
<110> 珠江水产研究所
<120> 草鱼出血病的病原草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒及检测方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ccaaggggtc tgtggcgaca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tttcaccggt aacaggattg 20
Claims (2)
1.草鱼出血病的病原草鱼呼肠孤病毒的RT-PCR快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
（1）2× 反应混合缓冲液 1.0ml，包含以下成分：
KCl 20 mM，
MgCl2 25 mM，
(NH4)2SO4 20mM，
吐温 20 0.2%，
dNTP 3mM，
Oligo dT 2.5mM，
甜菜碱 1.5 mM，
Tris-HCl，pH8.8 40mM，
上游引物P01 25mM，
下游引物P02 25mM，
其中，上游引物P01序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物P02序列如SEQ ID NO：2所示；
（2）酶混合液 200μl，包含以下成分：
AMV逆转录酶 5U/μl，
Ex-Taq酶 5U/μl，
RNA酶抑制剂 40U/μl；
（3）无RNA酶的dH2O 1.0ml；
（4）阳性对照液：草鱼呼肠孤病毒HZ08株基因组RNA；
（5）阴性对照液：健康草鱼组织总RNA。
2.如权利要求1所述试剂盒用于检测草鱼出血病的病原草鱼呼肠孤病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取发病草鱼的组织或感染病毒细胞的总RNA，作为RT-PCR反应的模板；
（2）分别取模板1.5μl、2× RT-PCR反应混合液12.5μl、酶混合液1.5μl和无RNA酶的dH2O 11μl加入到PCR管中，同时分别用阳性对照液和阴性对照液作为模板，设置阳性和阴性对照组，混匀后离心数秒，置于PCR反应仪上；
（3）按下列条件进行扩增：42℃ 15min， 95℃ 5min，1个循环；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min 1个循环，4℃ 保存；
（4）反应结束后，取3-8μL加入到2μL溴酚蓝混匀，经1%琼脂糖凝胶电泳20-30min 后，于紫外仪上观察，若检测样品在229bp处出现明亮的发应条带，而阴性对照没有目的条带，则为草鱼呼肠孤病毒阳性；若阳性对照可见目的条带，而检测样品无反应条带出现，则为阴性，没有或不是所要检测的目的呼肠孤病毒。
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