CN111521765A - 一种用于耐盐碱鱼类肠道离体实验的缓冲液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于耐盐碱鱼类肠道离体实验的缓冲液及其制备方法，包括浆膜侧缓冲液和粘膜侧缓冲液。本发明的缓冲液可以最大程度模拟活体状态下肠道两侧的真实环境，保证肠道在离体环境下长时间存活，满足研究耐盐碱鱼类肠道功能的需要。

Description

一种用于耐盐碱鱼类肠道离体实验的缓冲液及其制备方法
技术领域
本发明属于鱼类养殖领域，特别涉及一种用于耐盐碱鱼类肠道离体实验的缓冲液及其制备方法。
背景技术
肠道在鱼类渗透调节和酸碱调节中起着重要作用。在高渗环境下，鱼类通过饮水来补偿水分流失。对于海水鱼类，环境中Cl-浓度升高会立即刺激鱼类的饮水反应。饮水在几分钟内发生，饮入的高渗水首先经过食道，在食道中进行脱盐作用，之后部分Na+和Cl-在肠道吸收，为水分吸收提供局部渗透压差；水分通过中后肠上皮吸收进入体内从而维持渗透平衡。同时，肠道还是大部分鱼类食物消化、吸收的重要场所。
盐碱水不同于海水，除了具有高渗特点、还具有高碱和离子不平衡的特点。我们前期的研究表明，类似海水鱼类耐盐碱鱼类(比如青海湖裸鲤)在高盐碱环境下同样具有饮水行为特点，而由于饮入的盐碱水与海水差别很大，研究耐盐碱鱼类肠道的渗透调节、酸碱调节和食物消化吸收，具有重要的科学意义和应用价值。
研究表明，在较好的缓冲液条件下，海水鱼类肠道在离体条件下能够存活较长时间，这为肠道功能研究创造了良好的体外条件。国外用海湾豹蟾鱼(Opsanus beta)作为模式鱼类，研究出了适用于海水鱼类的肠道离体实验的缓冲液，而关于盐碱环境生存鱼类肠道离体实验的缓冲液尚未有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于耐盐碱鱼类肠道离体实验的缓冲液及其制备方法，该缓冲液可以最大程度模拟活体状态下肠道两侧的真实环境，保证肠道在离体环境下长时间存活，满足研究耐盐碱鱼类肠道功能的需要。
本发明提供了一种用于耐盐碱鱼类肠道离体实验的缓冲液，包括浆膜侧缓冲液和粘膜侧缓冲液；
其中，按重量百分比，浆膜侧缓冲液的组分包括：NaCl 27.49～53.68％、KCl 0.80～1.36％、MgSO4 0.39～0.74％、MgCl2 0.00～0.25％、Na2HPO4 0.00～0.43％、KH2PO4 0.00～0.41％、CaCl2 0.61～0.68％、NaHCO3 2.29～2.56％、HEPES Acid 15.95～30.79％、HEPES salt 17.42～33.63％、尿素0.00～1.64％、葡萄糖3.41-5.48％；
粘膜侧缓冲液的组分包括：NaCl 31.72～70.90％、KCl 2.93～8.17％、MgSO419.35～44.13％、MgCl2 0.77～16.85％、CaCl2 0.81-4.37％。
本发明还提供了一种用于耐盐碱鱼类肠道离体实验的缓冲液的制备方法，包括：
将蒸馏水进行高温灭菌，随后按比例将原料溶解于灭菌蒸馏水中，混合均匀得到缓冲液；使缓冲液浓度维持在6-13mg/L，维持缓冲液氧气和酸碱平衡，调整缓冲液渗透压为224～452mosmol·L-1，pH 7.80-8.20，即可。
浆膜侧和粘膜侧溶液渗透压和pH保持一致。。
所述维持缓冲液氧气和酸碱平衡方法为浆膜侧充含0.3％CO2的O2，粘膜侧充100％O2。
本发明缓冲液配方中NaCl主要用于维持溶液的渗透压，使其接近鱼肠道内外环境渗透压；NaHCO3、HEPES Acid、HEPES salt用于维持溶液的酸碱环境，使其接近鱼肠道内外酸碱环境；葡萄糖用为肠道浆膜侧转运蛋白提供必需的能量，从而保证肠道渗透调节和酸碱调节功能。
有益效果
本发明的缓冲液可以最大程度模拟活体状态下肠道两侧的真实环境，保证肠道在离体环境下长时间存活，满足研究耐盐碱鱼类肠道功能的需要。利用本发明缓冲液可以使耐盐碱鱼类肠道离体存活1-7个小时。同时保证Na+,K+-ATPase,H+-ATPase等跨膜转运蛋白的活性,肠道在离体条件下保持了较好的生理功能。本发明可以直接用于研究离体条件下鱼类肠道离子调节、水分吸收以及药物代谢功能，为研究鱼类盐碱适应机制提供针对生理学数据。
附图说明
图1为实施例1中青海湖裸鲤前肠、中肠开路电压；
图2为实施例1中青海湖裸鲤前肠、中肠短路电流；
图3为实施例1中青海湖裸鲤前肠、中肠跨膜电位。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.根据青海湖裸鲤生存环境特点，配制缓冲液(两侧渗透压280-380mOsm，pH7.80；浆膜测充含0.3％CO2的O2，粘膜测充100％O2)。
2.浆膜侧和浆膜侧缓冲液配制，按如下重量百分比配制。
浆膜侧缓冲液的组分包括：NaCl 30.53％、KCl 1.20％、MgSO4 0.56％、MgCl20.12％、CaCl2 0.65％、NaHCO3 2.34％、HEPES Acid 29.76％、HEPES salt 30.64％、葡萄糖4.20％；
粘膜侧缓冲液的组分包括：NaCl 69.52％、KCl 7.89％、MgSO4 18.35％、MgCl22.94％、CaCl2 1.30％。
3.肠道组织制备
取出裸鲤肠道，清除多余的组织，分离出前肠、中肠，置于含浆膜缓冲液的培养皿中。将0.50～1.00cm左右的前肠、中肠展开，粘膜侧朝上，安装于组织夹片上(组织展开面积为0.20cm2)。
4.肠道活性检测
4.1测试系统
可采用Ussing chamber系统测试肠道活性。系统主要组成部分：Ussing小室、电极、电压电流钳、数据采集器、数据分析软件、恒温水浴箱和气体(含0.30％CO2的O2以及100％O2)。打开恒温水浴箱，将温度设置为25℃将制备好的电极(含4％琼脂糖的饱和KCl溶液)插入Ussing小室电极孔，连接电极电缆，插入组织夹片，拧紧固定螺丝，向两侧小室中加入缓冲液；打开气瓶，调节气流，检查电极状态后进行溶液电压电流调零补偿。
4.2电生理参数测量
实验开始前，将青海湖裸鲤浆膜和粘膜缓冲液放入恒温(20℃)水浴锅中水浴，浆膜缓冲液持续的充混合气(含0.30％CO2的O2)，粘膜缓冲液持续的充100％O2。
开路电压测量：将安装好肠道组织的组织夹片固定于Ussing小室上，向两侧同时加入5mL浆膜缓冲液，打开混合气气瓶，调节气流。使用数据采集软件采集30～40min数据。
短路电流(Isc)测量：Ussing小室两侧缓冲液以及所充气体与测量开路电压相同，钳制电压，使电压为0mV，设置单向3s·min-1 2mV脉冲，采集数据60min。短路电流变化由钳制电压模式下电流差值计算得到，电导通过欧姆定律计算得到。
跨膜电位(TEP)测量：Ussing小室左侧(肠道粘膜侧)和右侧(肠道浆膜侧)分别同时加入5mL粘膜和浆膜缓冲液，粘膜测充100％O2，浆膜测充混合气，钳制电流，使电流为0μA，采集60min数据。
4.3离体肠道电生理特征
从图1-图3可以看出，青海湖裸鲤前肠、中肠开路电压分别稳定在0.25mV和0.75mV左右；前肠、中肠短路电流分别维持在-10.0uAmpcm-2和-20.0uAmpcm-2左右；前肠、中肠跨膜电位分别维持在-0.60mV和-0.80mV左右，均保持了较好的数值。在60分钟离体实验过程中，青海湖裸鲤前肠、中肠均保持了较高的生理活性。本实施例用肠上皮两侧缓冲液最大程度模拟活体状态下肠道两侧的真实环境，使得肠道在离体条件下保持了较好的生理功能。

Claims (4)

1.一种用于耐盐碱鱼类肠道离体实验的缓冲液，其特征在于：包括浆膜侧缓冲液和粘膜侧缓冲液；
其中，按重量百分比，浆膜侧缓冲液的组分包括：NaCl 27.49～53.68％、KCl 0.80～1.36％、MgSO4 0.39～0.74％、MgCl2 0.00～0.25％、Na2HPO4 0.00～0.43％、KH2PO4 0.00～0.41％、CaCl20.61～0.68％、NaHCO3 2.29～2.56％、HEPES Acid 15.95～30.79％、HEPESsalt 17.42～33.63％、尿素0.00～1.64％、葡萄糖3.41-5.48％；
粘膜侧缓冲液的组分包括：NaCl 31.72～70.90％、KCl 2.93～8.17％、MgSO4 19.35～44.13％、MgCl2 0.77～16.85％、CaCl2 0.81-4.37％。
2.一种如权利要求1所述的用于耐盐碱鱼类肠道离体实验的缓冲液的制备方法，包括：
将蒸馏水进行高温灭菌，随后按比例将原料溶解于灭菌蒸馏水中，混合均匀得到缓冲液；使缓冲液浓度维持在6-13mg/L，维持缓冲液氧气和酸碱平衡，调整缓冲液渗透压为224～452mosmol·L-1，pH 7.80-8.20，即可。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：浆膜侧和粘膜侧溶液渗透压和pH保持一致。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述维持缓冲液氧气和酸碱平衡方法为浆膜侧充含0.3％CO2的O2，粘膜侧充100％O2。
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