CN104195147A - 一种钙调素基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种钙调素基因，其是在土生隐球酵母BSLL1-1菌株中克隆的，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，编码如SEQIDNO：2所示氨基酸序列的蛋白质；将该蛋白在大肠杆菌中表达，并进一步将该基因在酿酒酵母中成功表达，该基因使酿酒酵母的耐铝能力增加，基因工程菌可以吸附（或者吸收）培养介质中的活性铝，该酿酒酵母基因工程菌菌株具有降低酸性土壤中活性铝含量的应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地，涉及土生隐球酵母编码钙调素的耐铝基因，核苷酸序列和氨基酸序列，以及耐铝蛋白的异源表达，涉及含有该基因的重组质粒和表达该耐铝基因的工程菌株，它们的制备和表达方法，以及它们在吸附环境中活性铝的应用。
背景技术
酸性土壤在世界上广泛存在，其中可耕种面积为1.79亿hm2。我国酸性土壤的分布遍及14个省区，约占全国耕地面积的21% （熊毅和李庆逵，1987）。氮肥的过量施用是导致农田土壤酸化的最主要原因。此外，工业化发展导致的酸雨、人类不良的耕作方式和阳离子在土壤中的淋失，使酸性土壤的面积不断扩大，酸化程度不断加剧。
铝（aluminum，Al）在地壳中分布广泛，约占地壳总质量的7%。在土壤中，铝的主要存在形态是不溶于水的氧化物或铝硅酸盐，这些形态是对植物和环境没有伤害的。但是随着土壤酸化程度的增加，土壤中的铝从不溶于水的形态中溶解出来，转化为可溶于水的无机离子态，如Al3+、(AlOH)2+、(AlOH)2 +，这些形态对植物根系的毒害作用最大，又称为活性Al。因此，在酸性土壤上铝毒害是影响农作物产量的主要限制因素之一。通常，解决铝毒害的方法是大量施用石灰来提高土壤的pH值，使游离铝沉淀。但是这种方法难以彻底解决土壤酸度和铝毒害问题，同时还存在着潜在的环境问题。
土壤微生物是土壤生态体系的重要组成部分，在植物和土壤的相互作用过程中扮演着重要的角色。土壤微生物参与土壤养分转化、物质代谢、有机物分解、矿化以及污染物降解等多种生化反应。特别是，土壤微生物在土壤中污染物或者是重金属清除中发挥了重要作用，也即微生物修复技术。微生物修复技术是利用微生物（土著菌、外来菌、基因工程菌）对污染物的代谢作用而转化、降解污染物。微生物修复技术已成功应用于煤气厂址PAHs污染修复，石油烃污染土壤修复，农药污染土壤修复等。此外，重金属污染土壤的微生物修复主要是利用土壤中天然的微生物资源，削减、净化土壤中重金属或降低重金属毒性，从而使污染物的浓度降低到可以接受的水平，或将有毒有害的污染物转化为无害的物质，也包括将其稳定化以减少其向周边环境扩散。在重金属污染土壤的生态修复中微生物主要通过以下几种方式起作用：（1）通过微生物的吸附、代谢达到对重金属消减、净化作用和固定作用；（2）通过微生物改变重金属的化学形态，使重金属固定或生物可利用性降低，减少重金属的危害；（3）土壤微生物通过氧化还原作用改变根际重金属形态或产生的有机酸可增加金属的溶解性，提高重金属的有效性，以利于植物吸收；（4）通过促进植物生长，提高植物抗病性、抗逆能力等方式间接影响修复效率。因为微生物种类多，代谢类型丰富，生长在酸性环境中的微生物在长期的进化过程中，为了保护细胞免受铝的毒害，产生了一系列的抗铝毒机制：如有机酸及其代谢产物对铝的螯合作用；抗氧化胁迫作用；抗细胞程序性死亡等。因此，筛选或者改良土壤微生物使其增加对铝的耐受性或者提高其对土壤中铝的清除能力，是解决酸性土壤上铝毒害的直接而有效的措施。
钙离子（Ca2+）作为动植物及微生物细胞内重要的第二信使，参与了胞内很多生理反应。Ca2+作为离子信号分子，需要下游受体才能将信号传递下去，并调节多种细胞反应和生物进程。钙调素（Calmodulin, CaM）是真核细胞内高度保守的、广泛存在的一种非常重要的钙离子受体蛋白。CaM自身不具有酶的活性，但其能与靶蛋白相互作用，从而对靶蛋白的活性进行调节。当细胞内的Ca2+ 浓度升高时，Ca2+会与CaM的EF-hand结构域结合，直接导致钙调素结合蛋白的氢键网络结构被破坏，CaM结合结构域被释放出来，结合了四个Ca2+的CaM再通过CaM结合结构域，与CaM结合蛋白相结合，从而将信号传导下去。很多研究表明，钙离子/钙调素信号途径参与包括干旱胁迫、盐胁迫、冷和热刺激在内的很多非生物胁迫应答。有报道发现，在拟南芥中CaM3敲除突变株对热的耐受性明显降低，而过表达CaM3使植株耐热性增加（Zhang et al., Plant Physiol, 2009, 149(4):1773-1784.）。这些结果表明，钙调素信号途径可能是生物体耐受逆境胁迫的一种普遍机制，过表达该途径上的基因会提高对逆境胁迫的耐受能力。因此，克隆这些基因对研究它们在抗铝毒中的作用具有非常重要的意义。同时，对克隆到的基因进行改造或者构建基因工程菌株，还可以为治理酸性土壤上的铝毒害问题提供理论和应用基础。
发明内容
本发明旨在提供一种钙调素基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质；其由土生隐球酵母（C. humicolus）BSLL1-1菌株产生，基因序列全长450bp，与大豆疫霉菌（P. sojae）钙调素基因同源性达到85%，钙调蛋白由149个氨基酸编码，理论pI值为4.36，分子量约为17KDa。
本发明的另一目的在于提供一种钙调素基因的重组表达载体pYES3/CT-CaM。
本发明另一目的是提供一种含有钙调素基因或上述重组表达载体的酿酒酵母工程菌株。
本发明另一目的是将钙调素基因应用在吸附环境中活性铝中。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
1、本发明利用从云南省保山市龙陵县周边茶园茶树根际酸性土壤中分离的土生隐球酵母（C. humicolus）BSLL1-1菌株，采用TRIzoL试剂盒(Invitrogen公司)提取总RNA，然后用PoylATract mRNA Isolation systems试剂盒(Pormega公司)进行mRNA分离。以铝处理的土生隐球酵母为测试方，没有铝处理的作为消减方，构建土生隐球酵母的正向SSH cDNA文库。用AMV反转录酶将mRNA反转录合成cDNA，用限制性内切酶RsaI酶切，酶切产物进行PCR扩增，回收扩增产物并与pMD-18T载体连接，转化大肠杆菌DH5a，然后涂布含氨苄青霉素的平板，挑取阳性菌落测序，鉴定出编码CaM蛋白的基因，其序列如SEQ ID NO：1所示，该蛋白由149个氨基酸编码，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2、以土生隐球酵母的cDNA作为模板，用特异引物扩增CaM片段，与经限制性内切酶酶切的pGEX-4T-1载体连接并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得重组质粒pGEX-4T-1-CaM和含重组表达质粒的重组菌株大肠杆菌BL21(DE3)- pGEX-4T-1-CaM。
3、从测序正确的pMD-18T-CaM质粒上酶切回收目的片段，连接到经限制性内切酶酶切的pYES3/CT质粒上，得到重组质粒pYES3/CT-CaM，将重组质粒用电击法转化酿酒酵母（INVSc1）感受态细胞，用Western blotting法在转基因酵母中检测到了目的条带的存在，从而成功得到含pYES3/CT-CaM表达载体的重组酵母工程菌株INVSc-pYES3/CT-CaM。
本发明的优点和技术效果如下：
本发明的钙调素基因可以增加酵母的耐铝能力，钙调素基因工程菌株可以通过吸附作用降低环境中活性铝的含量，这种利用微生物修复环境中活性铝的技术费用低，操作简便，对环境影响小，不会造成二次污染。
附图说明
图1为本发明钙调素蛋白在大肠杆菌中的表达电泳检测示意图，其中M：蛋白Marker；诱导时间0h，2h，4h，6h，8h；空4T：转空载体的对照菌株；上清：诱导菌体上清液；沉淀：诱导菌体沉淀；
图2 为本发明转基因酵母的构建及检测示意图，其中A图为 pYES3/CT-CaM质粒的酶切检测示意图，1-5：EcoRI和XhoI酶切的pYES3/CT-CaM质粒；B图为Western blotting 检测转基因酵母中CaM蛋白的表达；
图3 为本发明中转基因酵母耐铝能力检测示意图；
图4为本发明转基因酵母吸附（或吸收）铝能力的检测结果示意图；其中：图A为0.2mM铝时转基因酵母和对照酵母培养基中剩余铝含量；图B为2mM铝时转基因酵母和对照酵母培养基中剩余铝含量。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。
实施例1：土生隐球酵母（C. humicolus）BSLL1-1菌株CaM基因的克隆和鉴定
从云南省保山市龙陵县周边茶园茶树根际酸性土壤中分离的一株对铝离子具有高抗性的土生隐球酵母（C. humicolus）BSLL1-1菌株，收集菌体材料约0.1g，采用TRIzoL试剂盒(Invitrogen公司)提取总RNA 500μg，然后用PoylATract mRNA Isolation systems试剂盒(Pormega公司)进行mRNA分离。以铝处理的土生隐球酵母为测试方，没有铝处理的作为消减方，来构建土生隐球酵母的正向SSH cDNA文库。
1、 cDNA第一条链的合成
分别取测试方和消减方的mRNA 2μg，用AMV反转录酶将mRNA反转录合成cDNA第一条链。具体反应如下：在两个1.5 ml Eppendorf管中，分别加入测验方和消减方mRNA 2 μg约2~4 μl，Oligo（dT）18引物 (10μmol/L) 1μl，然后加水至总体积5μl。混合并快速短暂离心后，将Eppendorf管置于金属浴中，70℃保温2 min。快速离心收集液体至管底，冰上冷却2 min。然后在每一个Eppendorf管中加入如下试剂，轻轻混合离心。5×第一链Buffer 2μl，dNTP混合物（各10 mmol/L）1μl，灭菌去离子水1μl，AMV反转录酶（20U/μl）1μl。42℃保温1.5h，将Eppendorf管放于冰上终止第一条链的合成。
2、cDNA第二条链的合成
在第一条链的反应体系（10μl）中加入如下成分：5×第二链Buffer 16μl，dNTP混合物（各10mmol/L）1.6 μl，20×第二链酶混合物4μl，加ddH2O 48.4μl至总体积 70μl。将混合物短暂离心，16℃水浴或金属浴保温2 h。加入2μl（6U）的T4 DNA聚合酶，混合均匀。16℃水浴保温30 min。加入4μl 20×EDTA/肝糖原混合物以终止第二链的合成。加入100μl酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)。充分混合，14000转/min室温离心10 min。小心地吸取上清液到一个干净的Eppendorf管中。加入100μl氯仿/异戊醇。小心地吸取上清液到一个干净的Eppendorf管中。加入40μl 4 mol/L NH6Ac和300μl 95%乙醇。充分混合，14000转/min室温离心20 min。小心地弃上清液，用500μl 80%乙醇清洗沉淀。14000转/min室温离心10 min。弃上清液。空气干燥10 min，蒸发剩余的乙醇。用50μl灭菌去离子水溶解沉淀。
3、RsaⅠ酶切
在Eppendorf管中加入Ds cDNA 43.5μl，10×RsaⅠ酶酶切缓冲液5μl，RsaⅠ酶（10 U/μl）1.5μl，加ddH2O使总体积达到50μl。将混合物短暂离心，金属浴37℃保温过夜。取出5μl酶切混合物电泳分析RsaⅠ酶酶切的效果。加入2.5μl 20×EDTA/肝糖原混合物终止反应。加入50μl酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，充分混合。室温14000转/min离心10 min。小心地吸取上清液到一个干净的Eppendorf管中。加入50 μl 氯仿：异戊醇，充分混合。室温14000 rpm离心10 min。小心地吸取上层的液体到一个干净的Eppendorf管。加入25μl 4 mol/L NH4Ac和187.5μl 无水乙醇，充分混合。室温14000 rpm离心20 min。弃上清液。用200μl 80%乙醇清晰沉淀。室温14000 rpm离心10 min。小心地弃去上清液，空气干燥5~10 min。用5.5μl灭菌去离子水溶解沉淀物，贮存于-20℃。琼脂糖凝胶电泳检测RsaⅠ酶酶切产物。
4、接头的连接
此步骤中只有测验方cDNA连接接头，消减方cDNA不连接接头。将5μl蒸馏水与RsaⅠ酶酶切的每种测验方cDNA 1μl混合，进行稀释。在两个0.5 ml的微型Eppendorf管中分别混合如下试剂：
；
将上述混合物短暂离心，16℃水浴16h。加入1 μl EDTA/肝糖原混合物终止接头的连接反应。72℃条件下加热样品5 min，使连接酶失活。
5、第一次杂交
本部分实验在PCR中操作，杂交前要对连接效率进行检测，使用基因特异性引物（5’-TGCTGCCTTCCTTGGATGTG-3’）和PCR引物1（5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’）进行PCR反应，如果连接效率高，则应该能够得到PCR产物。杂交步骤如下：
（1） 在0.5 ml的Eppendorf管中按以下顺序将每一个实验差减物与以下试剂相混合：
（2）在上述混合物上加一滴矿物油，离心；
（3）将混合物在PCR仪中98℃保温1.5 min；
（4）混合物在68℃保温8 h，马上进行第二次杂交（杂交时间可以在6-12 h，但不要超过12 h）。
6、第二次杂交
（1）在灭菌的Eppendorf管中加入如下试剂：
；
（2）混合后，加一滴矿物油覆盖；在PCR仪中98℃保温1.5 min将消减方变性；
（3）将移液枪调至15μl，轻轻将枪头尖端伸到杂交样品2管中的下端，小心地将全部样品吸到枪头中，随后吸入少许空气，接着按同样方法吸入上述新变性的消减方。
（4）将上述全部混合物转移到含有杂交样品1的管子中，用移液器吸打混合均匀后， 68℃保温过夜；
（5）加入200 μl的稀释缓冲液，用移液器吸打混合均匀。68℃保温7 min，然后贮存于-20℃保存备用。
7、PCR扩增
（1）在每个做好标记的PCR管中加入1μl稀释好的cDNA；
（2）准备第一次PCR反应的混合液master mix
（3）向每个样品中加入9μl master mix，滴加一滴矿物油；
（4）75℃，5 min，延伸接头（完成后不要将样品管从PCR仪中取出，此步骤用于生成接头的互补脸，并且产生引物的结合点）；
（5）立即按照以下程序进行PCR反应：
（6）吸取第一次PCR的产物3μl，加入27μl水进行稀释；取1μl作为模板，进行第二次抑制PCR；
（7）准备第二次PCR反应混合液：
巢式PCR引物1序列：5’-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’，巢式PCR引物2序列：5’-GCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’；
（8）漩涡混合均匀，短暂离心收集液体至管底，加一滴矿物油；
（9）立即按照以下程序进行PCR反应：
（10）取5μl反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
8、大量PCR扩增
（1）PCR反应体系
（2）立即按照以下程序进行PCR反应：
（3）取5μl电泳检测，其余回收浓缩。
9、CaM蛋白的基因的鉴定
将回收的PCR产物连接到pMD18-T载体上，连接产物加入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，42℃热击90s，转化产物涂布在含氨苄青霉素的LB培养基平板上，采用蓝白斑筛选方法进行筛选。从20个平板上挑取含有插入片段的白斑菌落，接种到含有12%甘油的液体LB培养基的96孔板中，37℃培养过夜。共挑取1248个阳性克隆组成SSH cDNA文库。挑选插入片段大于200bp的阳性克隆进行测序，从而鉴定出编码CaM蛋白的基因， CaM基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
实施例2：CaM蛋白的异源表达
为了便于构建表达载体，根据核苷酸序列设计特异引物，分别在上下游引物的5’端引入EcoRI和XhoI酶切位点，引物序列如下：正向引物CaM-F：5’- CGGAATTCATGGCGGAGCAGCTGACCAAG-3’ (下划线为EcoRI酶切位点)，反向引物CaM-R：5’- GGCCTCGAGTTACTTGGCC ATCATCATGGTAAC -3’（下划线为XhoI酶切位点）。用土生隐球酵母的cDNA为模板扩增CaM基因片段。PCR反应条件为：94℃预变性3min，然后按照94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸45s的程序扩增30个循环，循环结束后72℃反应10min。CaM基因的PCR产物亚克隆到pMD18-T载体上，获得的TA克隆载体命名为pMD18-T-CaM，对pMD18-T-CaM进行酶切，检测正确的pMD18-T-CaM质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序验证。
分别用两种限制性内切酶（EcoRI和XhoI）对原核表达载体pGEX-4T-1和pMD18-T-CaM质粒进行酶切，回收目的片段和线性化的载体片段，用T4DNA连接酶进行连接。连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，通过PCR扩增和双酶切质粒鉴定重组子，结果表明CaM基因已经成功克隆到pGEX-4T-1质粒上，含有重组质粒的pGEX-4T-1-CaM的重组大肠杆菌称为大肠杆菌BL21(DE3) - pGEX-4T-1-CaM菌株。
将重组BL21(DE3)- pGEX-4T-1-CaM菌株和对照菌株即含有pGEX-4T-1质粒的大肠杆菌BL21(DE3) -pGEX-4T-1，接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，200 rpm、37℃培养过夜，再按1%的接种量转接于新鲜的LB液体培养基中培养至OD600为0.6-0.8时，加入ITPG至终浓度为1mM，对含有CaM目的基因的表达载体进行诱导表达；分别收集诱导0h、2h、4h、6h、8h后的表达菌体2ml，收集后的菌液于4 ℃、12 000 rpm离心1 min，弃上清液，沉淀用2M尿素100μl重悬，之后再加20μl SDS凝胶加样缓冲液，煮沸5 -10min后，12 000 rpm离心1 min，取20 μl上清进行SDS-PAGE分析，确定菌体的最优表达时间。本实验以含有目的基因的表达菌诱导0 h和含pGEX-4T-1空载体的大肠杆菌诱导表达8 h作为对照。随后，对收集的菌体进行超声波破碎，4℃，12000rpm，离心20min，收集上清与沉淀，SDS-PAGE检测蛋白的表达形式。SDS-PAGE分离胶的浓度为12%，浓缩胶浓度为4%。SDS-PAGE结果表明，CaM基因编码的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中大量表达，且在上清和沉淀中都有表达。GST标签大小为25KDa，理论CaM蛋白大小为17KDa，与图1中大小一致。重组蛋白的最佳表达条件为37℃，1mM IPTG诱导时间为8h。
实施例3：CaM转基因酵母的构建及检测
用EcoRI和XhoI酶切测序正确的pMD-18T-CaM质粒，回收目的基因CaM片段。用EcoRI和XhoI酶切酵母表达载体质粒pYES3/CT，回收线性载体pYES3/CT片段，然后将二者进行连接反应，即得到pYES3/CT-CaM 质粒。通过双酶切pYES3/CT-CaM 质粒得到了目的片段大小的条带（图2A），说明目的基因成功连到酵母表达载体上。将带有CaM基因的pYES3/CT-CaM 质粒电击转入酿酒酵母INVSc1感受态细胞中。在SD-Trp平板上长2-3天，挑取单菌落，30℃培养过夜，收集菌体后提取总蛋白， 用CaM抗体进行Western blotting 检测，能够在转基因酵母菌株中检测到目的蛋白条带（图2B），说明外源CaM基因在酿酒酵母细胞中成功表达了蛋白。
实施例4：转CaM基因酵母耐铝能力测定
配制铝浓度为0、0.1、0.2、2mM 的YPD诱导固体培养基（碳源为半乳糖），将活化的菌体按初始OD600为1，稀释倍数分别为100 、10-1 、10-2 、10-3 、10-4，将稀释的菌液5μl点种到平板上，48h后观察生长情况，从图3中看出，随着铝浓度的增加，含pYES3/CT-CaM的转基因酵母耐铝能力明显高于含有空载体pYES3/CT的对照酵母。在含有0.1mM铝的固体平板上，与对照酵母相比，转基因酵母菌落长得较大，表明对照酵母生长受到抑制。在含有2mM铝的固体平板上，在10-4稀释度时， pYES3/CT-CaM转基因酵母生长良好，对照酵母基本不生长。随着铝浓度的增加，转基因酵母生长状况比对照酵母好，说明在铝胁迫下CaM基因有促进生长的作用。
实施例5：转基因酵母吸附（或吸收）铝的检测
通过检测培养基中剩余活性铝的含量，进而检测pYES3/CT-CaM转基因酵母吸收或吸附铝的能力。分别用含有0.2mM和2mM铝的空白培养基作为对照，其培养基中剩余铝含量定义为100%。在含有0.2mM铝时，pYES3/CT-CaM转基因酵母培养基中活性铝剩余37.84%，与转空载体pYES3/CT的对照酵母相比，pYES3/CT-CaM转基因酵母的培养基中剩余的活性铝含量明显减少（图4A）；在含有2mM铝时，pYES3/CT-CaM转基因酵母培养基中活性铝剩余80.92%，与转空载体pYES3/CT对照酵母相比，培养基中剩余的活性铝含量也明显减少（图4B）。这些结果表明，在转基因酵母中，CaM基因可能通过增加菌体对铝的吸附或者吸收来达到其耐铝的目的。
序列表
<110> 昆明理工大学 <120> 一种钙调素基因及其应用 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 450
<212> DNA <213> 土生隐球酵母BSLL1-1
<400> 1
atggcggagc agctgaccaa ggagcaaatc gccgagttca aggaggcctt ctccctcttc 60
gacaaggacg gcgatggaac catcaccacc aaggagctcg gtaccgtcat gcgctcgctt 120
ggccagaacc ccacacaggc tgagctcgag gacatgatca acgaggtcga cgccgacggc 180
aacaactcga tcgactttgc cgagttcatg accctcatgg cccgcaagat gcacgacact 240
gactcggagg aggagatccg cgaggccttc aaggtctttg acaagaacaa cgacggccac 300
atctcggctg ccgagctcaa gcacgtcatg accaaccttg gcgagaagct caccgacgac 360
gagatcaccc agatgatccg tgaggccgac aaggacggcg acggcatgat cgactacaac 420
gagtttgtta ccatgatgat ggccaagtaa 450
<210> 2 <211> 149
<212> PRT <213> 土生隐球酵母BSLL1-1
<400> 2
Met Ala Glu Gln Leu Thr Lys Glu Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala
1 5 10 15
Phe Ser Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Glu
20 25 30
Leu Gly Thr Val Met Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Gln Ala Glu
35 40 45
Leu Glu Asp Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asn Asn Ser Ile
50 55 60
Asp Phe Ala Glu Phe Met Thr Leu Met Ala Arg Lys Met His Asp Thr
65 70 75 80
Asp Ser Glu Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Lys Val Phe Asp Lys Asn
85 90 95
Asn Asp Gly His Ile Ser Ala Ala Glu Leu Lys His Val Met Thr Asn
100 105 110
Leu Gly Glu Lys Leu Thr Asp Asp Glu Ile Thr Gln Met Ile Arg Glu
115 120 125
Ala Asp Lys Asp Gly Asp Gly Met Ile Asp Tyr Asn Glu Phe Val Thr
130 135 140
Met Met Met Ala Lys
145
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgctgccttc cttggatgtg 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctaatacgac tcactatagg gc 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcgagcggcc gcccgggcag gt 22
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcgtggtcgc ggccgaggt 19
Claims (4)
1.一种钙调素基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。
2.一种含有权利要求1所述的钙调素基因的重组表达载体。
3.一种酿酒酵母工程菌株，所述工程菌株含有权利要求1所述的钙调素基因或权利要求2所述的重组表达载体。
4.权利要求1所述钙调素基因在吸附环境中活性铝中的应用。
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Family
ID=
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107653249A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-02-02 | 浙江大学 | 一种大麦钙调蛋白基因HvCAM1及其耐盐应用 |
| CN108165559A (zh) * | 2017-11-29 | 2018-06-15 | 昆明理工大学 | 一种c2h2型转录因子基因及其应用 |
| CN108359614A (zh) * | 2018-03-26 | 2018-08-03 | 山东圣琪生物有限公司 | 一株具有桔霉素脱毒能力的酿酒酵母 |
| CN108588109A (zh) * | 2018-04-10 | 2018-09-28 | 昆明理工大学 | C2H2型转录因子基因asr1的重组表达载体及应用 |
| CN111394359A (zh) * | 2020-03-23 | 2020-07-10 | 西南大学 | 朱砂叶螨钙调蛋白基因的克隆、原核表达和蛋白纯化方法 |
| CN114045294A (zh) * | 2021-11-22 | 2022-02-15 | 昆明理工大学 | 一种脂质转运蛋白基因及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1618964A (zh) * | 2003-11-20 | 2005-05-25 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 水稻传粉受精相关基因cDNA文库与应用 |
| CN103172722A (zh) * | 2013-03-07 | 2013-06-26 | 华南师范大学 | 斜带石斑鱼钙调蛋白基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用 |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1618964A (zh) * | 2003-11-20 | 2005-05-25 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 水稻传粉受精相关基因cDNA文库与应用 |
| CN103172722A (zh) * | 2013-03-07 | 2013-06-26 | 华南师范大学 | 斜带石斑鱼钙调蛋白基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| D"SOUZA，ET AL.: "hypothetical protein CGB_C1250W [Cryptococcus gattii WM276]D", 《NCBI REFERENCE SEQUENCE: XP_003192586.1》, 7 July 2011 (2011-07-07), pages 1 - 2 * |
| 王阁奇: "耐铝酵母菌的分离及土生隐球酵母铝响应基因的鉴定", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》, no. 5, 15 May 2012 (2012-05-15), pages 043 - 52 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107653249A (zh) * | 2017-09-30 | 2018-02-02 | 浙江大学 | 一种大麦钙调蛋白基因HvCAM1及其耐盐应用 |
| CN108165559A (zh) * | 2017-11-29 | 2018-06-15 | 昆明理工大学 | 一种c2h2型转录因子基因及其应用 |
| CN108359614A (zh) * | 2018-03-26 | 2018-08-03 | 山东圣琪生物有限公司 | 一株具有桔霉素脱毒能力的酿酒酵母 |
| CN108359614B (zh) * | 2018-03-26 | 2021-04-20 | 山东圣琪生物有限公司 | 一株具有桔霉素脱毒能力的酿酒酵母 |
| CN108588109A (zh) * | 2018-04-10 | 2018-09-28 | 昆明理工大学 | C2H2型转录因子基因asr1的重组表达载体及应用 |
| CN111394359A (zh) * | 2020-03-23 | 2020-07-10 | 西南大学 | 朱砂叶螨钙调蛋白基因的克隆、原核表达和蛋白纯化方法 |
| CN114045294A (zh) * | 2021-11-22 | 2022-02-15 | 昆明理工大学 | 一种脂质转运蛋白基因及其应用 |
| CN114045294B (zh) * | 2021-11-22 | 2023-03-24 | 昆明理工大学 | 一种脂质转运蛋白基因及其应用 |
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