CN103571866A

CN103571866A - 巨大芽孢杆菌硝酸盐还原酶催化-电子转移亚基共表达载体

Info

Publication number: CN103571866A
Application number: CN201310566278.0A
Authority: CN
Inventors: 周培; 冯海玮; 支月娥; 孙玉静; 陆伟; 刘群录; 卫星; 时唯伟; 初少华
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2013-11-13
Filing date: 2013-11-13
Publication date: 2014-02-12

Abstract

一种基因工程技术领域的巨大芽孢杆菌硝酸盐还原酶催化-电子转移亚基共表达载体，首先测定巨大芽孢杆菌全基因组序列作为模板，根据设计出的PCR引物扩增出含有酶切位点硝酸盐还原酶催化亚基(Bm-Nas B)和电子转移亚基(Bm-Nas C)的基因序列，并依次连接到共表达载体pETDuet-1上，通过菌落PCR技术挑选含有目的基因片段的大肠杆菌DH5α的阳性克隆。本发明克服现有技术中由于硝酸盐还原酶电子转移亚基基因序列在天然的巨大芽孢杆菌中表达量非常低，严重限制使用效果，实现极大的提高该基因的表达量。

Description

巨大芽孢杆菌硝酸盐还原酶催化-电子转移亚基共表达载体

技术领域

本发明涉及的是一种基因工程技术领域的方法，具体是一种硝酸盐还原酶催化-电子转移亚基基因序列、含有该基因的重组载体、重组菌以及利用该重组菌产生该基因的表达产物及其应用。

背景技术

随着设施农业的发展，栽培面积不断扩大，氮素化肥使用量大幅度上升，大大超过植物的需求量。由于土壤中硝酸盐未能被植物及时吸收转化，造成大量盐分在植物体和土壤中积累，从而造成设施栽培土壤次生盐渍化。

研究表明，设施栽培次生盐渍化土壤中除HCO₃ ^-外，Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、SO₄ ^2-、NO₃ ^-均有不同程度的积累。研究表明，次生盐渍化土壤的阳离子组成中，Na⁺已不是主要离子，阳离子以Ca²⁺为主，其含量约占阳离子总量的60%以上，Mg²⁺含量在15%-20%之间；阴离子以NO₃ ^-和SO₄ ^2-为主，NO₃ ^-含量约为阴离子总量的56%-76%。NO₃ ^-可在植物体内累积，最终通过食物链进入人体，过量的NO₃ ^-在体内易被还原成为NO₂ ^-，NO₂ ^-可使细胞组织缺氧，严重时使人窒息死亡。因此治理设施栽培中过量的硝态氮已成为设施农业一项重要且刻不容缓的工作。目前针对我国设施栽培大棚盐渍化，采取了一些治理措施，如灌水洗盐，土壤改良剂法和半腐熟有机肥法等方法。虽然这些方法有不少优点，但也存在很大的不足：灌水洗盐会把硝态氮淋洗到地下，不仅造成土壤氮素的损失，而且还污染地下水；土壤改良剂法成本比较高，易产生二次污染；半腐熟有机肥法存在肥效慢，使用不便等缺点。

与传统治理次生盐渍化方法相比，生物法尤其是生物酶法有许多突出优点，比如见效快、不会给周边环境带来负担。但是一般而言硝酸盐还原酶在微生物体内的表达量很低，不能满足修复环境的要求，于是构建一种高效的硝酸盐还原酶表达载体，实现硝酸盐还原酶的高效表达就显得尤为关键。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种巨大芽孢杆菌硝酸盐还原酶催化-电子转移亚基共表达载体，克服现有技术中由于硝酸盐还原酶电子转移亚基基因序列在天然的巨大芽孢杆菌中表达量非常低，严重限制使用效果，应用基因工程菌表达本发明所述的硝酸盐还原酶电子转移亚基基因序列，实现极大的提高该基因的表达量。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种巨大芽孢杆菌硝酸盐还原酶催化-电子转移共表达载体，由硝酸盐还原酶催化亚基Bm-Nas B，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示，以及硝酸盐还原酶电子转移亚基Bm-Nas C，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示组成。

所述的催化亚基和电子转移亚基的基因序列分别由2346和2151个碱基对组成。

所述的共表达载体为包含硝酸盐还原酶催化亚基序列Bm-Nas B以及硝酸盐还原酶电子转移亚基序列Bm-Nas C的pETDuet-1质粒。

本发明涉及上述共表达载体的构建方法，首先测定巨大芽孢杆菌全基因组序列作为模板，根据设计出的PCR引物扩增出含有酶切位点硝酸盐还原酶催化亚基(Bm-Nas B)和电子转移亚基(Bm-Nas C)的基因序列，并依次连接到共表达载体pETDuet-1上，通过菌落PCR技术挑选含有目的基因片段的大肠杆菌DH5α的阳性克隆。

所述的大肠杆菌DH5α的阳性克隆是指：含有重组表达质粒pETDuet-1-Bm-Nas B-Nas C的大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明涉及上述大肠杆菌DH5α的阳性克隆的应用，将其发酵后修复次生盐渍化土壤。

所述的应用进一步是指：将该共表达载体倒入大肠杆菌BL21(DE3)内，通过加入IPTG进行诱导，使该重组菌表达出具有生物学活性的硝酸盐还原酶，进而优化发酵条件提高硝酸盐还原酶的表达量，最终实现酶制剂法修复次生盐渍化土壤。

技术效果

本发明所述的硝酸盐还原酶基因序列在天然的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中表达量非常低，严重限制了使用效果，本发明通过构建重组共表达菌株，实现了硝酸盐还原酶催化亚基和电子转移亚基的外源共表达，保证了编码硝酸盐还原酶的生物学活性。

附图说明

图1为实施例中pETDuet-1-Bm-Nas C重组载体验证电泳图。

图2为实施例中pETDuet-1-Bm-Nas B-Nas C重组载体验证电泳图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-2的培养

巨大芽孢杆菌NCT-2分离自上海市崇明岛设施栽培12-15年的大棚，保藏编号为CGMCC NO.4698，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学微生物研究所；保存日期为2011年3月21日。将该菌接种于LB液体培养基中，32℃培养OD₆₀₀至1.5左右，离心收集菌体用于提取细菌的基因组DNA。

所述的LB液体培养基组分为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，去离子水1L，pH6.8-7.2。LB固体培养基即为在LB液体培养基的基础上添加15-20g的琼脂。

实施例2

硝酸盐还原酶催化亚基基因(Bm-Nas B)序列验证

根据全基因组测序结果，设计PCR引物：

正向引物Nas B-F:5′-ATGACGAAACAAAAGCTAATATTAA-3′

反向引物Nas B-R:5′-TATAATAAATATGTGATTGCACGAG-3′

以巨大芽孢杆菌NCT-2的基因组DNA为模板，用上述两对引物进行扩增。PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，53℃退火30s，72℃延伸90s；30个循环后72℃终延伸10min。

将PCR扩增产物进行电泳检测，结果表明获得片段约为2.4kb；然后将PCR产物切胶回收后连接到pMD19-T载体上送公司测序。经测序后得到的核昔酸序列与基因组测序结果相吻合，即为本发明序列表中SEQ ID No.1。

实施例3

硝酸盐还原酶电子转移亚基基因(Bm-Nas C)序列验证

根据全基因组测序结果，设计PCR引物：

正向引物Nas C-F:5′-ATGACTGAGATGCTATTGAAATATT-3′

反向引物Nas C-R:5′-TAATAGCTGCTTCTTTTTACAGAAG-3′

以巨大芽孢杆菌NCT-2的基因组DNA为模板，用上述两对引物进行扩增。PCR条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸75s；30个循环后72℃终延伸10min。

将PCR扩增产物进行电泳检测，结果表明获得片段约为2.1kb；然后将PCR产物切胶回收后连接到pMD19-T载体上送公司测序。经测序后得到的核昔酸序列与基因组测序结果相吻合，即为本发明序列表中SEQ ID No.2。

实施例4

pETDuet-1-Bm-Nas C重组载体的构建

根据测序得到的硝酸盐还原酶电子转移亚基(Bm-Nas C)基因序列，设计含有酶切位点的引物扩增该基因并连接到pETDuet-1共表达载体上。

设计引物如下：

正向引物Nas C-EcoRⅤ-F:

5′-TGCAGGATATCATGACTGAGATGCTATTGAAATATT-3′

反向引物Nas C-Kpn I-R:

5′-GGGGTACCTTAATAGCTGCTTCTTTTTACAGAAG-3′

上下游引物的5′端分别设计了EcoRⅤ和Kpn I酶切位点用于连接共表达载体 pETDuet-1，用含有酶切位点的引物扩增硝酸盐还原酶电子转移亚基基因序列并将PCR产物连接pMD19-T(Simple)载体，将连接产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞内。挑取阳性克隆摇菌并回收其质粒，然后用EcoRⅤ和Kpn I双酶切，回收含有硝酸盐还原酶电子转移亚基的基因片段Bm-Nas C′。用相同的内切酶酶切共表达载体pETDuet-1并回收酶切产物。将片段Bm-Nas C′与pETDuet-1酶切产物混合，用T4DNA Ligase(TaKaRa)过夜连接，将连接产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞内，通过菌落PCR筛选含有重组共表达质粒pETDuet-1-Bm-Nas C的阳性克隆(见图1)。挑取阳性克隆，摇菌(培养基中氨苄青霉素浓度为50μg/ml)16小时并提取其质粒。

所述的菌落PCR条件为：95℃预变性3min；94℃变性45s，56℃退火30s，72℃延伸90s；30个循环后72℃终延伸10min。

实施例5

pETDuet-1-Bm-Nas B-Nas C重组载体的构建

根据测序得到的硝酸盐还原酶催化亚基(Bm-Nas B)基因序列，设计含有酶切位点的引物扩增该基因并连接到pETDuet-1-Bm-Nas C重组载体上。

设计引物如下：

正向引物Nas B-BamH I-F:

5′-CGGGATCCATGACGAAACAAAAGCTAATATTAA-3′

反向引物Nas B-Not I-R:

5′-ATAGTTTAGCGGCCGCCTATAATAAATATGTGATTGCACGAG-3′

用含有BamH I和Not I酶切位点的引物扩增硝酸盐还原酶电子转移亚基基因序列并将PCR产物连接pMD19-T(Simple)载体，将连接产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞内。挑取阳性克隆摇菌并回收其质粒，然后用BamH I和Not I双酶切，回收含有硝酸盐还原酶催化亚基的片段Bm-Nas B′。用相同的内切酶酶切pETDuet-1-Bm-Nas C质粒并回收酶切产物。将片段Bm-Nas B′与pETDuet-1-Bm-Nas C酶切产物混合，用T4DNA Ligase(TaKaRa)过夜连接，将连接产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞内，通过菌落PCR筛选含有重组共表达质粒pETDuet-1-Bm-Nas B-Nas C的阳性克隆(见图2)。

所述的菌落PCR条件为：95℃预变性3min；94℃变性45s，54℃退火30s，72℃延伸90s；30个循环后72℃终延伸10min。

Claims

1.一种巨大芽孢杆菌硝酸盐还原酶共表达载体，其特征在于，其核苷酸序列由硝酸盐还原酶催化亚基Bm-Nas B，如Seq ID No.1所示，以及硝酸盐还原酶电子转移亚基Bm-Nas C，如Seq ID No.2所示组成。

2.一种pETDuet-1质粒，其特征在于，包含权利要求1中所述的硝酸盐还原酶催化亚基序列Bm-Nas B以及硝酸盐还原酶电子转移亚基序列Bm-Nas C。

3.一种根据权利要求1所述的共表达载体的构建方法，其特征在于，首先测定巨大芽孢杆菌全基因组序列作为模板，根据设计出的PCR引物扩增出含有酶切位点硝酸盐还原酶催化亚基(Bm-Nas B)和电子转移亚基(Bm-Nas C)的基因序列，并依次连接到共表达载体pETDuet-1上，通过菌落PCR技术挑选含有目的基因片段的大肠杆菌DH5α的阳性克隆。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的依次连接是指：

1）将Bm-Nas C基因连接到pETDuet-1共表达载体上；

2）将Bm-Nas B基因连接到pETDuet-1-Bm-Nas C重组载体上。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征是，所述的PCR引物由

用于将Bm-Nas C基因并分别连接到pETDuet-1共表达载体上的

正向引物Nas C-EcoRⅤ-F:

5′-TGCAGGATATCATGACTGAGATGCTATTGAAATATT-3′

反向引物Nas C-Kpn I-R:

5′-GGGGTACCTTAATAGCTGCTTCTTTTTACAGAAG-3′

5′-CGGAATTCTTATGATGTGACAACTGTTTCGAACAG-3′，和

用于将Bm-Nas B基因连接到pETDuet-1-Bm-Nas C重组载体上的

正向引物Nas B-BamH I-F:

5′-CGGGATCCATGACGAAACAAAAGCTAATATTAA-3′

反向引物Nas B-Not I-R:

5′-ATAGTTTAGCGGCCGCCTATAATAAATATGTGATTGCACGAG-3′组成。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的大肠杆菌DH5α的阳性克隆是指：含有重组表达质粒pETDuet-1-Bm-Nas B-Nas C的大肠杆菌BL21(DE3)。

7.一种根据权利要求3-6中任一所述大肠杆菌DH5α的阳性克隆的应用，其特征在于，将其发酵后修复次生盐渍化土壤。

8.一种涉及上述任一权利要求所述的共表达载体的应用，其特征是，将该共表达载体倒入大肠杆菌BL21(DE3)内，通过加入IPTG进行诱导，使该重组菌表达出具有生物学活性的硝酸盐还原酶，进而优化发酵条件提高硝酸盐还原酶的表达量，最终实现酶制剂法修复次生盐渍化土壤。