CN103614404A - 巨大芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶共表达载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

一种基因工程技术领域的巨大芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶共表达载体及其构建方法，首先测定巨大芽孢杆菌全基因组序列作为模板，根据设计出的PCR引物扩增出含有酶切位点亚硝酸盐还原酶大亚基(Bm-Nas D)和小亚基(Bm-Nas E)的基因序列，并依次连接到共表达载体pETDuet-1上，通过菌落PCR技术挑选含有目的基因片段的大肠杆菌DH5α的阳性克隆。本发明克服现有技术中由于亚硝酸盐还原酶小亚基基因序列在天然的巨大芽孢杆菌中表达量非常低，严重限制使用效果，实现极大的提高该基因的表达量。

Description

巨大芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶共表达载体及其构建方法

技术领域

本发明涉及的是一种基因工程技术领域的方法，具体是一种亚硝酸盐还原酶小亚基基因序列、含有该基因的重组载体、重组菌以及利用该重组菌产生该基因的表达产物及其应用。 

背景技术

从环境角度来讲，N元素的积累，可造成肥料的浪费而且影响作物生长及土壤利用，同时可通过农田的地表径流和农田渗漏，导致农业面源污染；从食品安全角度来讲，人体摄入过量的硝酸盐后，在体内硝酸盐(NO₃–)容易还原成亚硝酸盐(NO₂–)，亚硝酸盐能使细胞中携氧的低铁血红蛋白氧化成无携氧能力的高铁蛋白而造成组织缺氧，不仅如此，被氧化成的高铁蛋白还会降低已携有氧的氧合血红蛋白向身体组织释放氧的功能，使人体缺氧，严重时有使人窒息死亡的危险。更可怕的是亚硝酸盐和二甲胺、三甲胺作用后会生成亚硝胺。亚硝胺是一种具有强烈致癌性的化合物，在已发现的120种亚硝胺类化合物中，75%被确认有致癌性，亚硝胺还有引起遗传变异和怪胎的潜在危险，一旦这种物质进入蔬菜，对人的影响是非常可怕的。因此，如何快速消除环境中残存的亚硝酸盐，便成为接下工作的重中之重。 

生物修复法尤其是生物酶法的出现，为快速降解环境中的亚硝酸盐提供了一个新的方法。但是一般而言亚硝酸盐还原酶在微生物体内的表达量很低，不能满足修复环境的要求，于是构建一种高效的亚硝酸盐还原酶表达载体，实现亚硝酸盐还原酶的高效表达就显得尤为关键。 

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种巨大芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶共表达载体及其构建方法，克服现有技术中由于亚硝酸盐还原酶小亚基基因序列在天然的巨大芽孢杆菌中表达量非常低，严重限制使用效果，应用基因工程菌表达本发明所述的亚硝酸盐还原酶小亚基基因序列，实现极大的提高该基因的表达量。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本发明涉及一种巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)亚硝酸盐还原酶共表达载体，其核苷酸序列由亚硝酸盐还原酶大亚基Bm-Nas D，如Seq ID No.1所示，以及亚硝酸盐还原酶小亚基Bm-Nas E，如Seq ID No.2所示组成。 

所述的亚硝酸盐还原酶是由亚硝酸盐还原酶大亚基和小亚基组成，对应基因序列分别由2415和327个碱基对组成。 

所述的共表达载体为包含所述亚硝酸盐还原酶大亚基Bm-Nas D和亚硝酸盐还原酶小亚基Bm-Nas E的pETDuet-1质粒。 

所述的共表达载体通过以下方式构建得到：首先测定巨大芽孢杆菌全基因组序列作为模板，根据设计出的PCR引物扩增出含有酶切位点亚硝酸盐还原酶大亚基(Bm-Nas D)和小亚基(Bm-Nas E)的基因序列，并依次连接到共表达载体pETDuet-1上，通过菌落PCR技术挑选含有目的基因片段的大肠杆菌DH5α的阳性克隆。 

所述的大肠杆菌DH5α的阳性克隆是指：含有重组表达质粒pETDuet-1-Bm-Nas D-NasE的大肠杆菌BL21(DE3)。 

本发明涉及上述大肠杆菌DH5α的阳性克隆的应用，将其发酵后修复次生盐渍化土壤。 

所述的应用进一步是指：将该共表达载体倒入大肠杆菌BL21(DE3)内，通过加入IPTG进行诱导，使该重组菌表达出具有生物学活性的硝酸盐还原酶，进而优化发酵条件提高硝酸盐还原酶的表达量，最终实现酶制剂法修复次生盐渍化土壤。 

技术效果 

亚硝酸盐还原酶基因序列在天然的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中表达量非常低，严重限制了使用效果。本发明通过构建重组共表达菌株，实现了亚硝酸盐还原酶大亚基和小亚基的外源共表达，在保证亚硝酸盐还原酶表达量的同时也维持了其良好的生物学活性。 

附图说明

图1为实施例中pETDuet-1-Bm-Nas D重组载体验证电泳图。 

图2为实施例中pETDuet-1-Bm-Nas D-Nas E重组载体验证电泳图。 

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 

实施例1 

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)NCT-2的培养 

巨大芽孢杆菌NCT-2分离自上海市崇明岛设施栽培12-15年的大棚，保藏编号为CGMCC NO.4698，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学微生物研究所；保存日期为2011年3月21日。将该菌接种于LB液体培养基中，32℃培养OD₆₀₀至1.5左右，离心收集菌体用于提取细菌的基因组DNA。 

所述的LB液体培养基组分为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，去离子水1L，pH6.8-7.2。LB固体培养基即为在LB液体培养基的基础上添加15-20g的琼脂。 

实施例2 

pETDuet-1-Bm-Nas D重组载体的构建 

根据测序得到的亚硝酸盐还原酶电子转移亚基(Bm-Nas D)基因序列，设计相应引物扩增该基因并分别连接到pETDuet-1共表达载体上。 

设计引物如下： 

正向引物Nas D-BamH I-F: 

5'-CGGGATCCATGCAAAAAAAGAAACTCGTATTGAT-3' 

反向引物Nas D-EcoR I-R: 

5'-CGGAATTCTTATGATGTGACAACTGTTTCGAACAG-3' 

上下游引物的5'端分别设计了BamH I和EcoR I酶切位点用于连接共表达载体pETDuet-1，用含有酶切位点的引物扩增亚硝酸盐还原酶大亚基基因序列并将PCR产物连接pMD19-T(Simple)载体，将连接产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞内。挑取阳性克隆摇菌并回收其质粒，然后用BamH I和EcoR I双酶切，回收含有亚硝酸盐还原酶大亚基的片段Bm-Nas D'。用相同的内切酶酶切共表达载体pETDuet-1并回收酶切产物。将片段Bm-Nas D'与pETDuet-1酶切产物混合，用T4DNA Ligase(TaKaRa)过夜连接，将连接产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞内，通过菌落PCR筛选含有重组共表达质粒pETDuet-1-Bm-Nas D的阳性克隆(见图1)。挑取阳性克隆，摇菌(培养基中氨苄青霉素浓度为50μg/ml)16小时并提取其质粒。 

所述的菌落PCR条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火30s，72℃延伸90s；30个循环后72℃终延伸10min。 

实施例3 

pETDuet-1-Bm-Nas D-Nas E重组载体的构建 

根据测序得到的亚硝酸盐还原酶小亚基(Bm-Nas E)基因序列，设计相应引物扩增该基因并连接到pETDuet-1-Bm-Nas D重组载体上。 

设计引物如下： 

正向引物Nas E-Kpn I-F: 

5'-GGGGTACCATGGTGAATAAAAACATTACAAAAG-3' 

反向引物Nas E-Xho I-R: 

5'-CCGCTCGAGTTATTCCTCAATTAAAAGATACAGCA-3' 

用含有Kpn I和Xho I酶切位点的引物扩增亚硝酸盐还原酶小亚基基因序列并将PCR产物连接pMD19-T(Simple)载体，将连接产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞内。挑取阳性克隆摇菌并回收其质粒，然后用Kpn I和Xho I双酶切，回收含有亚硝酸盐还原酶催化亚基的片段Bm-Nas E'。用相同的内切酶酶切pETDuet-1-Bm-Nas D质粒并回收酶切产物。将片段Bm-Nas E'与pETDuet-1-Bm-Nas D酶切产物混合，用T4DNA Ligase(TaKaRa)过夜连接，将连接产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞内，通过菌落PCR筛选含有重组共表达质粒pETDuet-1-Bm-Nas  D-Nas E的阳性克隆(见图2)。 

所述的菌落PCR条件为：95℃预变性3min；94℃变性40s，54℃退火30s，72℃延伸30s；30个循环后72℃终延伸10min。 

Claims (8)

1.一种巨大芽孢杆菌亚硝酸盐还原酶共表达载体，其特征在于，其核苷酸序列由亚硝酸盐还原酶大亚基Bm-Nas D，如Seq ID No.1所示，以及亚硝酸盐还原酶小亚基Bm-Nas E，如Seq ID No.2所示组成。

2.一种pETDuet-1质粒，其特征在于，包含权利要求1中所述的亚硝酸盐还原酶大亚基Bm-Nas D和亚硝酸盐还原酶小亚基Bm-Nas E。

3.一种根据权利要求1所述的共表达载体的构建方法，其特征在于，首先测定巨大芽孢杆菌全基因组序列作为模板，根据设计出的PCR引物扩增出含有酶切位点亚硝酸盐还原酶大亚基(Bm-Nas D)和小亚基(Bm-Nas E)的基因序列，并依次连接到共表达载体pETDuet-1上，通过菌落PCR技术挑选含有目的基因片段的大肠杆菌DH5α的阳性克隆。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的依次连接包括：

1）将Bm-Nas D基因连接到pETDuet-1共表达载体上；

2）将Bm-Nas E基因连接到pETDuet-1-Bm-Nas D重组载体上。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征是，所述的PCR引物由

用于将Bm-Nas D基因并分别连接到pETDuet-1共表达载体上的

正向引物Nas D-BamH I-F:

5'-CGGGATCCATGCAAAAAAAGAAACTCGTATTGAT-3'，以及

反向引物Nas D-EcoR I-R:

5'-CGGAATTCTTATGATGTGACAACTGTTTCGAACAG-3'，和

用于将Bm-Nas E基因连接到pETDuet-1-Bm-Nas D重组载体上的

正向引物Nas E-Kpn I-F:

5'-GGGGTACCATGGTGAATAAAAACATTACAAAAG-3'，以及

反向引物Nas E-Xho I-R:

5'-CCGCTCGAGTTATTCCTCAATTAAAAGATACAGCA-3'组成。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的大肠杆菌DH5α的阳性克隆是指：含有重组表达质粒pETDuet-1-Bm-Nas B-Nas C的大肠杆菌BL21(DE3)。

7.一种根据权利要求3-6中任一所述大肠杆菌DH5α的阳性克隆的应用，其特征在于，将其发酵后修复次生盐渍化土壤。

8.一种涉及上述任一权利要求所述的共表达载体的应用，其特征是，将该共表达载体倒入大肠杆菌BL21(DE3)内，通过加入IPTG进行诱导，使该重组菌表达出具有生物学活性的硝酸盐还原酶，进而优化发酵条件提高硝酸盐还原酶的表达量，最终实现酶制剂法修复次生盐渍化土壤。

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