CN110408708B - 一种多标记辅助选择猪肌内脂肪性状的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多标记辅助选择猪肌内脂肪性状的方法。本发明筛选和验证了18个显著影响肌内脂肪含量的SNP位点，利用MassARRAY质谱平台确定各SNP位点上的基因型，根据各SNP位点上每个基因型对肌内脂肪含量效应的大小为各个SNP位点上的每个基因型赋值，建立了分子标记辅助预测肌内脂肪含量的遗传评估方法。本方法克服了现有猪肌内脂肪检测技术中基于单个SNP进行的检测的缺陷，准确性高，费用低，对肉质的肌内脂肪含量准确性高，可对待选猪进行早期、活体选择，有效提高实际生产中猪肌内脂肪含量的育种效率，在猪的育种方面具有很高的实践应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种多标记辅助选择猪肌内脂肪性状的方法，属于分子标记领域。
背景技术
随着人们消费水平的提高，在追求肉品高瘦肉率的同时，对其香味、感观满意程度以及保健功能也提出了更高的要求。肌内脂肪(Intramuscular fat，IMF)与猪肉的风味品质和食用价值有很大的关系，是影响肉质的重要因素。但自二十世纪七十年代以来，国内外在猪的选育中一直侧重于降低背膘厚和提高瘦肉率，导致瘦肉型猪IMF含量降到1.5％左右，极大地降低了猪肉品质。在保证较高生长速度和瘦肉率的前提下维持一个适当的IMF水平已成为21世纪猪遗传改良的研究方向。
IMF活体测定难度大，屠宰测定不仅成本高且被屠宰猪失去了种用价值，传统育种方法对肌内脂肪的选育效果不佳，而基于DNA标记发展起来的分子育种技术得到了越来越多的重视。在猪上，最显著的例子是氟烷基因(Houde et al.,1993)的应用，使用PCR-RFLP的方法，快速淘汰了导致猪应激综合征的敏感基因型猪。但对于肉质等受多基因控制的复杂性状，应用单个基因或标记预测性状值的能力非常有限，限制了其在标记辅助选择育种中的应用。随着分子遗传学的发展，过去一二十年间，广大科研工作者通过候选基因、数量性状基因座(Quantitative trait loci mapping,QTL)定位和全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)等策略已经发现了数十个影响肌内脂肪性状的SNP标记。
联合应用多个标记进行肌内脂肪性状辅助选择将大幅度提高选择效率。然而，至今已公布的猪肌内脂肪遗传特性检测专利中，均是基于单个SNP进行的检测，单个SNP检测价格高、自动化低、预测肌内脂肪性状效果差。
发明内容
本发明克服了上述现有技术的不足，提供一种多标记辅助选择猪肌内脂肪性状的方法。本发明筛选和验证了18个显著影响肌内脂肪含量的SNP位点，针对这些位点设计了扩增引物和单碱基延伸引物，利用MassARRAY质谱平台确定每个SNP位点的基因型，并根据各SNP位点上的每个基因型对肌内脂肪含量效应值大小为各个SNP位点上的每个基因型赋值，建立了分子标记辅助预测肌内脂肪含量的遗传评估方法。本方法准确性高，费用低，预测肌内脂肪性状效果好。
一种多标记辅助选择猪肌内脂肪性状的方法，同时检测影响肌内脂肪含量性状的18个SNP位点，根据各个SNP位点上每个基因型对肌内脂肪含量效应的大小分别赋值，将每个SNP位点上的赋值相加获得肌内脂肪标记估计值，肌内脂肪标记估计值大的其肌内脂肪含量高，估计值的小的其肌内脂肪含量低。
上述方法具体包括如下步骤：
1)设计用来评估猪肌内脂肪遗传特性的18个SNP位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物；
2)以待测样本基因组DNA为模板，利用步骤1)中所述的18个SNP位点的上下游扩增引物分别进行PCR扩增，获得每个位点的扩增产物；
3)使用虾碱式磷酸酶消化步骤2)的PCR扩增反应体系中剩余的dNTP，获得每个位点的纯化的扩增产物；
4)利用步骤3)中获得的每个位点的纯化后的扩增产物和步骤1)中获得的每个位点的单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物；
5)使用脱盐树脂纯化步骤4)中获得的延伸产物，获得每个位点的纯化延伸产物；
6)利用检测平台，将步骤5)纯化延伸产物进行芯片点样、扫描，检测结果通过应用软件分型并输出结果，确定各个SNP位点上的不同基因型；
7)将步骤6)中获得的各个SNP位点的基因型，依据各个基因型对肌内脂肪含量效应值大小进行各SNP位点不同基因型的赋值；
8)待选猪各SNP位点基因型的赋值之和即为该样本的肌内脂肪标记估计值；
9)肌内脂肪标记估计值大的猪的肌内脂肪含量高，估计值的小的猪的肌内脂肪含量低，选择肌内脂肪标记估计值的大的样本的所属的待选猪进行猪高肌内脂肪含量的选育，选择估计值的小的样本的所属的待选猪进行猪低肌内脂肪含量的选育。
进一步的，上述步骤1)中所述的SNP位点包括：PIK3C3基因的rs81211045 C/T位点，PCK1基因的rs343196765 A/C位点，LEP基因的rs45431504 A/G位点，FTO基因的g.31427531 T/G位点(猪6号染色体上第31427531处的T/G突变)和g.31444947 C/G位点(猪6号染色体上第31444947处的C/G突变)，SCD基因的rs80912566 C/T位点，HSL基因的rs328830166 G/A位点，FABP3基因的rs790168193 A/G位点、rs196952811 C/T位点和rs337014162 G/T位点，NR6A1基因的rs326780270 A/G位点，VRTN基因的rs709317845 A/C位点，PLIN1基因的rs80924701 G/C位点，FAT3基因的rs81268514 C/T位点，基因间区的ASGA0095513 C/T位点(猪9号染色体上第25596359处的C/T突变)，SLC9A7基因的rs81271744 A/C位点，ADAM22基因的rs81412865 A/G位点，USP43基因的rs81477974 A/G位点。
进一步的，上述rs81211045 C/T位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.1-3所示；
上述rs343196765 A/C位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.4-6所示；
上述rs45431504 A/G位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.7-9所示；
上述g.31427531 T/G位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.10-12所示；
上述g.31444947 C/G位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.13-15所示；
上述rs80912566 C/T位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.16-18所示；
上述rs328830166 G/A位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.19-21所示；
上述rs790168193 A/G位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.22-24所示；
上述rs196952811 C/T位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.25-27所示；
上述rs337014162 G/T位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.28-30所示；
上述rs326780270 A/G位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.31-33所示；
上述rs709317845 A/C位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.34-36所示；
上述rs80924701 G/C位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.37-39所示；
上述rs81268514 C/T位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.40-42所示；
上述ASGA0095513 C/T位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.43-45所示；
上述rs81271744 A/C位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.46-48所示；
上述rs81412865 A/G位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.49-51所示；
上述rs81477974 A/G位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.52-54所示。
进一步的，上述步骤2)中所述的PCR扩增的扩增条件为：94℃120s；94℃20s，56℃30s，72℃60s；72℃180s。
进一步的，上述步骤3)中所示的消化的条件为：37℃40min，85℃5min
进一步的，上述步骤4)中所示的单碱基延伸反应的延伸反应条件为：94℃、30s；94℃、5s，[(52℃、5s，5个循环)，80℃、5s)]，35个循环；72℃保持5min。
进一步的，上述步骤8)中所述赋值的具体情况为：rs81211045位点上基因型为CC设定为1分、基因型为CT设定为2分、基因型为TT设定为3分；rs343196765位点上基因型为AA设定为1分、基因型为CA设定为2分、基因型为CC设定为3分；rs45431504位点上基因型为AA设定为1分、基因型为GA设定为2分、基因型为GG设定为3分；g.31427531位点上基因型为GG设定为3分、基因型为GT设定为3分、基因型为TT设定为1分；g.ss31444947位点上基因型为CC设定为1分、基因型为GC设定为2分、基因型为GG设定为3分；rs80912566位点上基因型为CC设定为1分、基因型为CT设定为2分、基因型为TT设定为3分；rs328830166位点上基因型为AA设定为3分、基因型为AG设定为3分、基因型为GG设定为1分；rs790168193位点上基因型为AA设定为1分、基因型为GA设定为2分、基因型GG设定为3分；rs196952811位点上基因型为CC设定为1分、基因型为CT设定为3分、基因型TT设定为3分；rs337014162位点上基因型为GG设定为1分，基因型GT设定为2分、基因型TT设定为3分；rs326780270位点上基因型为AA设定为1分、基因型GA设定为2分、基因型GG设定为3分；rs709317845位点上基因型为AA设定为3分、基因型CA设定为2分、基因型CC设定为1分；rs80924701位点上基因型为CC设定为3分、基因型GC设定为2分、基因型GG设定为1分；rs81268514位点上基因型为CC设定为1分、基因型TC设定为2分、基因型TT设定为3分；ASGA0095513位点上基因型为CC设定为3分、基因型CT设定为2分、基因型TT设定为1分；rs81271744位点上基因型为AA设定为3分、基因型CA设定为1分、基因型CC设定为1分；rs81412865位点上基因型为AA设定为1分、基因型AG设定为2分、基因型GG设定为3分；rs81477974位点上基因型为AA设定为1分、基因型AG设定为2分、基因型GG设定为3分。
有益效果：
(1)本发明克服了已有猪肌内脂肪检测专利中基于单个SNP进行的检测的缺陷，且其中部分SNP位点是肌内脂肪研究的热点SNP，部分是本课题组研究结果，该SNP位点组合具有前沿优势。
(2)本发明提供的基于MassARRAY核酸质谱技术，改变了传统单碱基检测价格昂贵、耗时长、操作繁琐等劣势，具有准确度高、检测费用低等技术优势，并可实现自动化检测，易于推广应用。
(3)本发明提供的多标记肌内脂肪辅助选择方法可对备选猪进行早期筛选，通过检测信息，评估其肉质的肌内脂肪含量准确性高，有效地解决传统育种方法对肌内脂肪的选育效果不佳和基于单个SNP预测肌内脂肪性状值的能力有限的缺陷，可对待选猪进行早期、活体选择，有效提高实际生产中猪肌内脂肪含量的育种效率，在猪的育种方面具有很高的实践应用价值。
附图说明
图1全部试验猪肌内脂肪SNP标记辅助估计值和肌内脂肪含量测定值间散点图。
图2山东地方猪SNP肌内脂肪标记辅助估计值和肌内脂肪含量测定值间散点图。
图3杜长大肌内脂肪SNP标记辅助估计值和肌内脂肪含量测定值间散点图。
具体实施方式
为了使本技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述实施例的限制。
非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，采用的数据库均为公开的在线数据库。
实验样本：本实验一共使用了220头100kg左右的山东地方猪与164头110kg左右杜长大猪，按照标准(NY/T 825-2004)进行屠宰测定，采集胸、腰椎结合处背腰最长肌样本，利用乙醚提取法测定肌内脂肪含量。
实施例1用于本发明的猪肌内脂肪性状SNPs标记筛选的可行性分析
在本课题组及国内外其它研究者的前期研究上，通过对公共生物信息数据资源进行信息挖掘，及不同来源信息的重复验证和筛选，获得影响肌内脂肪沉积性状的功能基因以及染色体区段，筛选出显著影响猪肌内脂肪沉积性状具有效应的SNP标记35个。35个SNP信息及其参考文献出处详见下表。
表1本发明中文献筛选的猪肌内脂肪性状SNP标记详细信息
注：SNP的基因组位置除了ASGA0098646、ASGA0095513、ALGA0073197和M1GA0016908是基于Sscrofa10.2参考基因组外，其它均为Sscrofa11.1参考基因组。
实施例2建立多标记辅助选择猪肌内脂肪性状的方法
(1)筛选和验证了可用来评估猪肌内脂肪遗传特性的SNP位点。本发明所述用来评估待选猪肌内脂肪含量的18个SNP位点为：PIK3C3基因的rs81211045C/T，PCK1基因的rs343196765A/C，LEP基因的rs45431504A/G，FTO基因的g.31427531T/G(目前无rs，对应于国际猪参考基因组11.1版本6号染色体上第31427531处的T/G突变)和g.31444947C/G(目前无rs，对应于国际猪参考基因组11.1版本6号染色体上第31444947处的C/G突变)，SCD基因的rs80912566C/T，HSL基因的rs328830166G/A，FABP3基因的rs790168193A/G、rs196952811C/T和rs337014162G/T，NR6A1基因的rs326780270A/G，VRTN基因的rs709317845A/C，PLIN1基因的rs80924701G/C，FAT3基因的rs81268514C/T，基因间区的ASGA0095513C/T(目前无rs，对应于国际猪参考基因组11.1版本9号染色体上第25596359处的C/T突变)，SLC9A7基因的rs81271744A/C，ADAM22基因的rs81412865A/G，USP43基因的rs81477974A/G。
(2)设计步骤(1)的用来评估猪肌内脂肪遗传特性的18个SNP位点的扩增引物和单碱基延伸引物，PCR引物、延伸引物的序列为：
rs81211045C/T
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGAGGCAGTCCATTACATGCAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGTGAATCTGTTCTACCACCGC-3'
延伸引物5'-GTCTGATTGATGAAAGTGTCCA-3'
rs343196765A/C
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCCCATGCTGAACGGGATGA-3'
下游5'-ACGTTGGATGAAAGGGGCGTGTTGTCCAAG-3'
延伸引物5'-GCTGAACGGGATGACATACA-3'
rs45431504A/G
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCACCGGTTTGGACTTCATC-3'
下游5'-ACGTTGGATGATCTGTTGGTAGATCGCCAG-3'
延伸引物5'-tgggaTCCATCCTGTCCTGAGT-3'
g.31427531T/G
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGTTATTTTATAGTGACAGTG-3'
下游5'-ACGTTGGATGCCATGAGGATGCGGGAATAC-3'
延伸引物5'-AGTGACAGTGAAATTTCTAC-3'
g.31444947C/G
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTCAGGTACGGCATTTTCTGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGCATCCTTTGACGGCCATGAC-3'
延伸引物5'-ATGAAGTTCAACAAAGTTAGGTTGTA-3'
rs80912566C/T
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCTTGGCAGCGAATAAAAGGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGCCAGGCTGGGTATTTAAAGG-3'
延伸引物5'-GGTCAGAGGAAATACAGGA-3'
rs328830166G/A
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGAGCTCTTCTTCGAGGGTGAC-3'
下游5'-ACGTTGGATGTAGAAGCAGCCCTTGTGTAG-3'
延伸引物5'-CTTCTTCGAGGGTGACGAAGGC-3'
rs790168193A/G
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGAAGGAGGAGGGGACATCTAC-3'
下游5'-ACGTTGGATGTTCTCCCTCTTCCATGCCTG-3'
延伸引物5'-CTACCCTCTCTCAGGA-3'
rs196952811C/T
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCTCTTCGGAATCTGAGAAGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGAACCGAAGATGTCCATGACC-3'
延伸引物5'-GAATCTGAGAAGGAAGCCG-3'
rs337014162G/T
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGAGATCACAAGCCTGGTGTAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGGAAGGGTCATGCTTTTGCCG-3'
延伸引物5'-GCAGGCCCCAGACACCTCCCCCC-3'
rs326780270A/G
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGACAGGGCTTCAGAGAGCAAC-3'
下游5'-ACGTTGGATGTGCTTTCCTTGAAGCTCACC-3'
延伸引物5'-AGAGAGCAACCAGCCCTCAC-3'
rs709317845A/C
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGCAGTCCCGAGATGAAAGAAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGAGAGTGGACGAGACAATAGC-3'
延伸引物5'-gAGAAGTGCAAATTCGGGGG-3'
rs80924701G/C
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGAGTCCTGATGGGCTCTGTG-3'
下游5'-ACGTTGGATGTGCAGCACGTTCTCCTGCTC-3'
延伸引物5'-gccgCAGTGCTGCATTCCTTCC-3'
rs81268514C/T
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGTTGACACATTTCCTCCAAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGTCTGACCCTACACCTTTCTC-3'
延伸引物5'-AGAAACTTCAAATACAGTTATCC-3'
g.25596359C/T
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTAGGACAGAAGATCCTAGGG-3'
下游5'-ACGTTGGATGTTGGCTGATCAGTCAGACTC-3'
延伸引物5'-CAGCTTCTGTGGGTCTAGTCAATAA-3'
rs81271744A/C
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGTGGAAGAGACGCATGGTTTG-3'
下游5'-ACGTTGGATGAACAAGATCTGAGGCCAAGC-3'
延伸引物5'-ACGCATGGTTTGGAGGGTT-3'
rs81412865A/G
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGGGATTGAACCCAAGCCATAG-3'
下游5'-ACGTTGGATGCTTTCTGGCATCAAGAGGAG-3'
延伸引物5'-CCCAAGCTGCTGCCACA-3'
rs81477974A/G
PCR引物：上游5'-ACGTTGGATGAGTCTCAGAGGTGGACAAGC-3'
下游5'-ACGTTGGATGGACTCCTGATCTTTCCTCTG-3'
延伸引物5'-ccatgtACAAGCTCAGCCGCTCT-3'
(3)将步骤(2)中各SNP位点的上下游扩增引物先稀释成10μM，然后扩增引物等摩尔比混合均匀，得到扩增引物混合液，每管扩增引物混合液的最终工作浓度为0.5μM；
(4)以待测样本基因组DNA为模板，对步骤(3)中的每组扩增引物混合液分别进行PCR扩增，所得扩增产物最终在4℃保存。扩增条件为：94℃120s；94℃20s，56℃30s，72℃60s；72℃180s；
(5)虾碱式磷酸酶消化步骤(4)反应体系中剩余的dNTP。消化条件为：37℃40min，85℃5min；
(6)将步骤(2)中的单碱基延伸引物，根据其所含的每一条延伸引物的分子量，按相应体积进行混合，得到单碱基延伸引物混合液；将步骤(5)中纯化后的扩增产物加入延伸引物混合液进行单碱基延伸反应，获得延伸产物。延伸反应的条件为：94℃、30s；94℃、5s，[(52℃、5s，5个循环)，80℃、5s)]，35个循环；72℃保持5min；
(7)脱盐树脂纯化延伸产物；
(8)利用
SNP检测平台，分析进行芯片点样、扫描，检测结果应用专用的分析软件MassArray TYPER 4.0(sequenom)分型并输出结果，通过观察质谱峰变异碱基处是否出峰来判断是否存在突变。
(9)用来评估猪肌内脂肪遗传特性的SNPs位点的基因型赋值为：rs81211045 CC(1分)，CT(2分)，TT(3分)；rs343196765 AA(1分)，CA(2分)，CC(3分)；rs45431504 AA(1分)，GA(2分)，GG(3分)；g.31427531 GG(3分)，GT(3分)，TT(1分)；g.ss31444947 CC(1分)，GC(2分)，GG(3分)；rs80912566 CC(1分)，CT(2分)，TT(3分)；rs328830166 AA(3分)，AG(3分)，GG(1分)；rs790168193 AA(1分)，GA(2分)，GG(3分)；rs196952811 CC(1分)，CT(3分)，TT(3分)；rs337014162 GG(1分)，GT(2分)，TT(3分)；rs326780270 AA(1分)，GA(2分)，GG(3分)；rs709317845 AA(3分)，CA(2分)，CC(1分)；rs80924701 CC(3分)，GC(2分)，GG(1分)；rs81268514 CC(1分)，TC(2分)，TT(3分)；ASGA0095513 CC(3分)，CT(2分)，TT(1分)；rs81271744 AA(3分)，CA(1分)，CC(1分)；rs81412865 AA(1分)，AG(2分)，GG(3分)；rs81477974 AA(1分)，AG(2分)，GG(3分)。
(10)待选猪各SNP位点基因型值之和为该猪只的肌内脂肪标记估计值。
(11)选择肌内脂肪标记估计值的大的待选猪进行猪高肌内脂肪含量的选育，选择估计值的小的待选猪进行猪低肌内脂肪含量的选育。
实施例3本发明中猪肌内脂肪性状SNPs位点效应的验证分析
1.实验材料及其耳组织样本基因组DNA提取
以220头100kg左右的山东地方猪和164头杜长大猪为实验材料，采用苯酚-氯仿法提取全基因组DNA提取其耳缘组织的基因组DNA。用Nanodrop2000分光光度计对DNA进行质量检测和浓度测定。A260/280比值在1.8～2.2，A260/230比值在1.3～2.7判定为合格。最后将合格的DNA样品统一稀释成50ng/μM。
2.SNP位点基因型检测
(1)以提取的外周血的DNA为模板，以各SNP位点的上下游扩增引物等摩尔混合液(最终工作浓度为0.5μM)为扩增引物，按照下表中的PCR扩增体系配置反应液，在扩增仪中进行PCR扩增反应，获得目标位点的PCR产物片段。扩增的热循环参数为：94℃120s；94℃20s，56℃30s，72℃60s；72℃180s，4℃保存。
表2 PCR的体系为
| Reagent | Concentration | Volume(μL) |
| Water,HPLC grade | NA | 1.75 |
| PCR Buffer with 15mM MgCl2 | 10x | 0.625 |
| MgCl2 | 25mM | 0.325 |
| dNTP Mix | 25mM | 0.1 |
| Primer Mix | 0.5uM | 1 |
| HotStar Taq | 5U/μL | 0.2 |
| DNA template | 10ng/μL | 1 |
| Total | 5 |
(2)将步骤⑴得到的PCR产物进行虾碱式磷酸酶纯化处理，向步骤(1)得到的PCR产物中加入核酸外切酶SAP 0.3μL、SAP缓冲液0.17μL，水1.53μL；纯化处理条件为：37℃40min，85℃5min。
(3)以各SNP位点的延伸引物分子量混合得到的混合液为延伸引物，将步骤(2)中的目标产物的进行SNP位点单碱基延伸。延伸反应液按照下表进行配置，延伸反应热循环参数为：94℃、30s；94℃、5s，[(52℃、5s，5个循环)，80℃、5s)]，35个循环；72℃保持5min。
表3延伸反应液的配制
(4)将步骤(3)获得的产物加入脱盐树脂，进行脱盐纯化，避免离子在质谱中对待测样本的影响，消除盐峰干扰。加入水16μL，Clean Resin树脂6mg，将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30min,使树脂与反应物充分接触，然后3200g离心5min。
(5)启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫描；检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果，根据观察质谱图上变异碱基处是否出峰，判断基因是否突变。
3.背腰最长肌肌内脂肪含量测定
试验猪屠宰后2h内，使用乙醚提取法测定背腰最长肌肌内脂肪含量。3次测定结果的平均值，作为该肉样的肌内脂肪含量。具体操作如下：
(1)采集最末胸椎与第一腰椎结合处背最长肌肉样品，用绞肉机将肉样绞成肉糜状，放入表面皿中(记录重量W1)。65℃烘干至恒重后(记录重量W2)，将烘干肉样粉碎，并通过烘干前后质量差值计算干物质含量[1-(W1-W2)/W1]*100％。
(2)称取肌肉粉碎样0.5g左右于滤纸包中，按要求包好滤纸包放入称量瓶中，记录总重量W3。
(3)将包好的滤纸包放入105℃烘箱中烘5小时，取出置于干燥器中取出置于干燥器中，冷却称重记录重量W4a。再放入105℃烘箱中烘2小时，取出置于干燥器中取出置于干燥器中，冷却称重W4。直至2次称重恒重为止。
(4)将称量好的滤如纸包放入抽提管中，每个抽提管中放入10个左右滤纸包，加入无水乙醚60-100ml浸泡，加入的量以能浸泡滤纸包但不高于浸提器的虹吸管为准。打开水浴锅，在50℃的水浴中加热，待温度升高后，加入乙醚使其没过虹吸管使乙醚回流，冷凝管接水循环冷却。抽提时间不少于6个小时。
(5)抽提结束后，关掉水浴锅，等到冷凝管温度下降至常温后关掉冷凝水。将滤纸包取出后放通风橱中风干过夜，次日早上取出放105℃烘干4小时，取出置于干燥器中冷却称重W5。脂肪含量计算公式为：[(W5-W4)/W3]*干物质含量。
4.SNP基因型与猪肌内脂肪含量的关联分析
以最小二乘法对各SNP基因型与猪肌内脂肪含量开展关联分析，所用分析模型为：
Y＝S+B+P+G+e
其中Y为性状测定值，S为性别效应，B为品种次效应，P为屠宰批次效应，G为基因型效应，e为残差效应。
关联分析结果表明，18个SNP基因型与猪的肌内脂肪含量关联达显著(p值<0.05)或极显著水平(p值<0.01)。显著SNP结果如表2所示。表2表明，本发明中所包含的有利纯合基因型的肌内脂肪均值与不利纯合基因型的肌内脂肪均值差值在1.01-2.12％，大多数SNP位点的杂合基因型肌内脂肪均值介于有利纯合基因型和不利纯合基因型猪的均值之间，少数表现与有利纯合基因型猪一致。
为便于计算基于多个SNP进行肌内脂肪性状标记辅助育种的估计值，本发明根据各个SNP每个基因型均值的大小(即肌内脂肪的效应值)，对各SNP每个基因型赋值，建立了猪肌内脂肪性状的标记辅助值评估方法。其中，每个SNP位点的有利基因型赋值为3，不利基因型赋值1，杂合基因型根据其肌内脂肪表现不同赋值1、2或3。待选猪各SNP位点对应的基因型值之和为该猪只的肌内脂肪标记辅助估计值。
表4本发明SNP位点基因型与猪的肌内脂肪含量的关联性分析
基于表4中评估方法，计算每头试验猪基于本发明18个SNP肌内脂肪标记辅助估计值。利用Pearson相关分析方法，分别计算全部试验猪、山东地方品种和杜长大肌内脂肪标记辅助估计值与肌内脂肪含量测定值之间的相关系数。结果如下：
全部试验猪基于本发明SNP肌内脂肪评估值与肌内脂肪含量测定值之间的相关分析结果为：相关系数0.560，二者相关到极显著性水平(p值<2.2e-16)。山东地方猪基于本发明SNP肌内脂肪评估值与肌内脂肪含量测定值之间的相关分析结果为：相关系数0.411，二者相关到极显著性水平(p值<2.2e-16)。杜长大猪基于本发明SNP肌内脂肪评估值与肌内脂肪含量测定值之间的相关分析结果为：相关系数0.596，二者相关到极显著性水平(p值＝1.09e-13)。SNP肌内脂肪标记辅助估计值与肌内脂肪含量测定值间存在的高相关性表明：育种中用SNP肌内脂肪标记辅助估计值进行肌内脂肪性状选育可以有效提高实际生产中猪肌内脂肪含量的育种效率。
全部试验猪、山东地方品种和杜长大以SNP肌内脂肪标记辅助估计值和肌内脂肪含量测定值为横、纵坐标绘制散点图分别见图1、2和3。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种多标记辅助选择猪肌内脂肪性状的方法
<130> 2019
<160> 54
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acgttggatg aggcagtcca ttacatgcag 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acgttggatg tgaatctgtt ctaccaccgc 30
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtctgattga tgaaagtgtc ca 22
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acgttggatg cccatgctga acgggatga 29
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acgttggatg aaaggggcgt gttgtccaag 30
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gctgaacggg atgacataca 20
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
acgttggatg tcaccggttt ggacttcatc 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
acgttggatg atctgttggt agatcgccag 30
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgggatccat cctgtcctga gt 22
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acgttggatg gttattttat agtgacagtg 30
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acgttggatg ccatgaggat gcgggaatac 30
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
agtgacagtg aaatttctac 20
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
acgttggatg tcaggtacgg cattttctgg 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
acgttggatg catcctttga cggccatgac 30
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
atgaagttca acaaagttag gttgta 26
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
acgttggatg cttggcagcg aataaaaggg 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
acgttggatg ccaggctggg tatttaaagg 30
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ggtcagagga aatacagga 19
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
acgttggatg agctcttctt cgagggtgac 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
acgttggatg tagaagcagc ccttgtgtag 30
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cttcttcgag ggtgacgaag gc 22
<210> 22
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
acgttggatg aaggaggagg ggacatctac 30
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
acgttggatg ttctccctct tccatgcctg 30
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ctaccctctc tcagga 16
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
acgttggatg ctcttcggaa tctgagaagg 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
acgttggatg aaccgaagat gtccatgacc 30
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gaatctgaga aggaagccg 19
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
acgttggatg agatcacaag cctggtgtag 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
acgttggatg gaagggtcat gcttttgccg 30
<210> 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
gcaggcccca gacacctccc ccc 23
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
acgttggatg acagggcttc agagagcaac 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
acgttggatg tgctttcctt gaagctcacc 30
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
agagagcaac cagccctcac 20
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg cagtcccgag atgaaagaag 30
<210> 35
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<213> 人工序列
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acgttggatg agagtggacg agacaatagc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gagaagtgca aattcggggg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
acgttggatg agtcctgatg ggctctgtg 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg tgcagcacgt tctcctgctc 30
<210> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
gccgcagtgc tgcattcctt cc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg gttgacacat ttcctccaag 30
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
acgttggatg tctgacccta cacctttctc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agaaacttca aatacagtta tcc 23
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<213> 人工序列
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acgttggatg taggacagaa gatcctaggg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg ttggctgatc agtcagactc 30
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<213> 人工序列
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cagcttctgt gggtctagtc aataa 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgttggatg tggaagagac gcatggtttg 30
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acgttggatg aacaagatct gaggccaagc 30
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acgcatggtt tggagggtt 19
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acgttggatg ggattgaacc caagccatag 30
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<213> 人工序列
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acgttggatg ctttctggca tcaagaggag 30
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cccaagctgc tgccaca 17
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<213> 人工序列
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acgttggatg agtctcagag gtggacaagc 30
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<213> 人工序列
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acgttggatg gactcctgat ctttcctctg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
ccatgtacaa gctcagccgc tct 23
Claims (4)
1.一种多标记辅助选择猪肌内脂肪性状的方法，其特征在于，同时检测影响肌内脂肪含量性状的18个SNP位点，根据各个SNP位点上每个基因型对肌内脂肪含量效应的大小分别赋值，将每个SNP位点上的赋值相加获得肌内脂肪标记估计值，肌内脂肪标记估计值大的其肌内脂肪含量高，估计值的小的其肌内脂肪含量低；
所述方法具体包括如下步骤：
1）设计用来评估猪肌内脂肪遗传特性的18个SNP位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物；
2）以待测样本基因组DNA为模板，利用步骤1）中所述的18个SNP位点的上下游扩增引物分别进行PCR扩增，获得每个位点的扩增产物；
3）使用虾碱式磷酸酶消化步骤2）的PCR扩增反应体系中剩余的dNTP，获得每个位点的纯化的扩增产物；
4）利用步骤3）中获得的每个位点的纯化后的扩增产物和步骤1）中获得的每个位点的单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物；
5）使用脱盐树脂纯化步骤4）中获得的延伸产物，获得每个位点的纯化延伸产物；
6）利用检测平台，将步骤5）纯化延伸产物进行芯片点样、扫描，检测结果应用软件分型并输出结果，确定各个SNP位点上的不同基因型；
7）将步骤6）中获得的各个SNP位点的基因型，依据各个基因型对肌内脂肪含量效应值大小进行各SNP位点不同基因型的赋值；
8）待选猪各SNP位点基因型的赋值之和即为该样本的肌内脂肪标记估计值；
9）肌内脂肪标记估计值大的猪的肌内脂肪含量高，估计值的小的猪的肌内脂肪含量低，选择肌内脂肪标记估计值的大的样本的所属的待选猪进行猪高肌内脂肪含量的选育，选择估计值的小的样本的所属的待选猪进行猪低肌内脂肪含量的选育；
上述步骤1）中所述的SNP位点包括：PIK3C3基因的rs81211045 C/T位点，PCK1基因的rs343196765 A/C位点，LEP基因的rs45431504 A/G位点，FTO基因的g.31427531 T/G位点和g.31444947 C/G位点，SCD基因的rs80912566 C/T位点，HSL基因的rs328830166 G/A位点，FABP3基因的rs790168193 A/G位点、rs196952811 C/T位点和rs337014162 G/T位点，NR6A1基因的rs326780270 A/G位点，VRTN基因的rs709317845 A/C位点，PLIN1基因的rs80924701G/C位点，FAT3基因的rs81268514 C/T位点，基因间区的ASGA0095513 C/T位点，SLC9A7基因的rs81271744 A/C位点，ADAM22基因的rs81412865 A/G位点，USP43基因的rs81477974 A/G位点；所述FTO基因的g.31427531 T/G位点对应于国际猪参考基因组11.1版本6号染色体上第31427531处的T/G突变，g.31444947 C/G位点对应于国际猪参考基因组11.1版本6号染色体上第31444947处的C/G突变；
步骤8）中所述赋值的具体情况为：rs81211045 位点上基因型为CC设定为1分、基因型为CT设定为2分、基因型为TT设定为3分；rs343196765 位点上基因型为AA设定为1分、基因型为CA 设定为2分、基因型为CC设定为3分；rs45431504 位点上基因型为AA 设定为1分、基因型为GA设定为2分、基因型为GG 设定为3分；g.31427531 位点上基因型为GG设定为3分、基因型为GT设定为3分、基因型为TT设定为1分；g.ss31444947 位点上基因型为CC 设定为1分、基因型为GC设定为2分、基因型为GG设定为3分；rs80912566 位点上基因型为CC设定为1分、基因型为CT设定为2分、基因型为TT设定为3分；rs328830166 位点上基因型为AA 设定为3分、基因型为AG 设定为3分、基因型为GG 设定为1分；rs790168193 位点上基因型为AA设定为1分、基因型为GA 设定为2分、基因型GG设定为3分；rs196952811 位点上基因型为CC设定为1分、基因型为CT 设定为3分、基因型TT设定为3分；rs337014162位点上基因型为 GG设定为1分，基因型GT设定为2分、基因型TT设定为3分；rs326780270位点上基因型为AA 设定为1分、基因型GA 设定为2分、基因型GG 设定为3分；rs709317845 位点上基因型为AA 设定为3分、基因型CA设定为2分、基因型CC设定为1分；rs80924701 位点上基因型为CC设定为3分、基因型GC 设定为2分、基因型GG设定为1分；rs81268514 位点上基因型为CC 设定为1分、基因型TC设定为2分、基因型TT设定为3分；ASGA0095513 位点上基因型为CC设定为3分、基因型CT 设定为2分、基因型TT 设定为1分；rs81271744 位点上基因型为AA 设定为3分、基因型CA设定为1分、基因型CC设定为1分；rs81412865位点上基因型为 AA设定为1分、基因型AG设定为2分、基因型GG设定为3分；rs81477974 位点上基因型为AA 设定为1分、基因型AG 设定为2分、基因型GG设定为3分。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述rs81211045 C/T位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.1-3所示；
所述rs343196765 A/C位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.4-6所示；
所述rs45431504 A/G位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.7-9所示；
所述g.31427531 T/G位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.10-12所示；
所述g.31444947 C/G位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.13-15所示；
所述rs80912566 C/T位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.16-18所示；
所述rs328830166 G/A位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO. 19-21所示；
所述rs790168193 A/G位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO. 22-24所示；
所述rs196952811 C/T位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO. 25-27所示；
所述rs337014162 G/T位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO. 28-30所示；
所述rs326780270 A/G位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO. 31-33所示；
所述rs709317845 A/C位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO. 34-36所示；
所述rs80924701 G/C位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO. 37-39所示；
所述rs81268514 C/T位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO. 40-42所示；
所述ASGA0095513 C/T位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO. 43-45所示；
所述rs81271744 A/C位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.46-48所示；
所述rs81412865 A/G位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.49-51所示；
所述rs81477974 A/G位点的PCR扩增的上下游扩增引物和单碱基延伸引物的序列分别如SEQ ID NO.52-54所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中所述的PCR扩增的扩增条件为：94℃120 s；94℃ 20 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s；72℃ 180s。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中所示的消化的条件为：37 ℃40min，85 ℃5 min。
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