KR101472122B1

KR101472122B1 - 돼지 근섬유소 형태를 진단하는 유전자 마커 및 그 진단방법

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Publication number: KR101472122B1
Application number: KR1020120132010A
Authority: KR
Inventors: 김태헌; 이경태; 장길원; 이승환
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2012-11-20
Filing date: 2012-11-20
Publication date: 2014-12-17
Also published as: KR20140072230A

Abstract

본 발명은 돼지 근섬유소 형태를 진단하는 유전자 마커 및 그 진단방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, MYH4 (Myosin heavy chain 4) 유전자의 5' 조절영역 상에 존재하는 SNP를 이용하여 돼지의 육질형질 중 하나인 근섬유소 형태를 진단하는 유전자 마커를 제공하며, 상기의 유전자 마커를 이용하여 근섬유소 형태를 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 돼지 근섬유소 형태 진단용 유전자 마커를 이용하여 돼지의 육질형질 중 하나인 근섬유소 형태에 대한 분자생물학적 수준에서의 해석이 가능하며, 돼지의 근섬유소 형태를 진단할 수 있는 분자표지인자로서 종돈을 선발 및 돼지고기의 육질과 밀접한 관계가 있는 근섬유소 형태를 진단함으로써 돼지고기의 육질 개량에 활용이 가능하다.

Description

돼지 근섬유소 형태를 진단하는 유전자 마커 및 그 진단방법{Genetic marker for diagnosis of muscle fiber type within porcine muscle and diagnosis method using the same}

본 발명은 돼지 근섬유소 형태를 진단하는 유전자 마커 및 그 진단방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, MYH4 (Myosin heavy chain 4) 유전자의 5' 조절 영역에 존재하는 SNP를 이용하여 돼지의 육질형질 중 하나인 근섬유소 형태를 진단하는 유전자 마커를 제공하며, 상기의 유전자 마커를 이용하여 근섬유소 형태를 진단하는 방법에 관한 것이다.

최근의 분자 유전학 기법의 발달은 DNA 수준에서의 유전병이나 가축의 육질 등 특정 형질과 연관되어 있는 유전자 마커(genetic marker)의 개발이 가능한 방향으로 발달되어 왔다. DNA의 다형성은 중요한 경제형질을 결정하는 주요유전자와 양적형질좌위(QTL; quantitative trait loci)에 의한 마커 개발을 가능하게 하며, 연관 분석(linkage analysis), 유전자 지도(genetic map), 친자 감별(parentage testing), 품종간의 구별(distinction of breeds), 가계도 분석(pedigree analysis), 유전적 다양성(divergence) 및 관련성 (relationship) 등을 분석할 수 있는 강력한 도구로서 이용되어 왔다. 특히 가축의 유전 및 육종학 분야에서는 DNA 의 다형성에 기초한 유전자 마커를 통한 도움 선발(MAS, marker assisted selection)에 활용되고 있다.

가축에 있어서 대부분의 경제형질들은 다양한 유전자의 영향을 통해 나타나는 양적형질로 알려져 있으며 이러한 형질에 관여하는 원인 유전자 발굴 및 유전적 위치를 탐색하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 형질관련 유전자 마커 발굴을 위하여 기능 유전자를 대상으로 단일염기다형성(SNP; single nucleotide polymor phism) 발굴 및 형질 관련성 연구가 활발히 진행되고 있으며, 현재까지 다양한 형질관련 SNP들이 발굴되었다.

SNP가 표현형에 영향을 미쳐 돼지의 육질 또는 육량 관련 형질이 달라지는 경우 상기 SNP는 돼지의 육질 또는 육량 관련 형질에 대한 효과가 있는 마커로서 사용될 수 있다. 게놈 지도의 완성에 따라 SNP의 존재도 밝혀진 경우가 많으나, 아직 발견되지 않은 SNP 역시 존재하며, 발견된 SNP일지라도 표현형에 미치는 영향에 대해서 연구되지 않은 경우가 다수 존재한다.

이와 관련된 종래 기술로는 한국공개특허공보 제2012-0065103호, 제2012-0067941호가 있으나, 상기 종래 기술에는 유전자 마커가 존재하는 유전자가 PPARG1A(peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1)이라는 점에서 본 발명과 유전자 마커가 존재하는 대상 유전자를 달리하고 있다.

한국공개특허공보 제2012-0065103호 한국공개특허공보 제2012-0067941호

이와 같은 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 예의 노력한 결과, 돼지 근섬유소 형태를 진단하는 유전자 마커 및 그 진단방법을 개발하기에 이르렀다.

결국, 본 발명의 목적은 돼지 근섬유소 형태 진단용 유전자 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 돼지 근섬유소 형태 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지 근섬유소 형태 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지 근섬유소 형태 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 마커를 이용하여 돼지 근섬유소 형태 진단방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서, 621번째 염기에서 G/T인 SNP를 포함하는 서열번호 1 내의 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 돼지 근섬유소 형태 진단용 유전자 마커가 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서, 621번째 염기에서 G/T인 SNP를 포함하는 서열번호 1 내의 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이들에 대한 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지 근섬유소 형태 진단용 조성물이 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 이들에 대한 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지 근섬유소 형태 진단용 마이크로 어레이가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 폴리뉴클레오티드 또는 이들에 대한 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지 근섬유소 형태 진단용 키트가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서, 621번째 염기에서 G/T인 SNP가 TT 유전자형인 경우를 GG와 GT 유전자형인 경우보다 돼지 근섬유소 타입Ⅱ a의 발현량이 더 낮은 것으로 판정하는 돼지 근섬유소 형태 진단방법이 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 돼지 근섬유소 형태 진단용 유전자 마커를 이용하여 돼지의 육질형질 중 하나인 근섬유소 형태에 대한 분자생물학적 수준에서의 해석이 가능하며, 돼지의 근섬유소 형태를 진단할 수 있는 분자표지인자로서 종돈을 선발 및 돼지고기의 육질과 밀접한 관계가 있는 근섬유소 형태를 진단함으로써 돼지고기의 육질 개량에 활용이 가능하다.

도 1은 돼지의 MYH4 유전자에 존재하는 SNP(g.-1398G>T)를 보여주는 electropherogram이다.
도 2는 돼지의 MYH4 유전자에 존재하는 SNP(g.-1398G>T)의 유전자형별 유전자 발현정도를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어, "뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어, "프로브"는 특정 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드이다.

본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어, "단일염기다형(SNP; single nucleotide polymorphism)"은 동일한 종의 개체 사이의 DNA에 존재하는 한 염기쌍의 차이(single base-pair variation)로서 유전자 다형성 중 가장 많이 존재하는 형태이다. 프로모터와 같은 전사조절부위 염기서열에 존재하는 SNP는 발현되는 유전자의 양을 조절할 수 있으며, RNA 스플라이싱에 영향을 주는 엑손-인트론 경계에 있는 염기서열들이나, 3'-비번역부위에 존재하는 SNP는 RNA 안정성이나 번역 능력에 영향을 주는 경우가 있다.

본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어, 근섬유소는 근육을 구성하는 단위로 수축성을 가진 섬유상 세포로서, 계층적 구조를 형성하고 있다.

돼지의 근육내 근섬유는 ATPase 활성을 담당하는 미오신-중쇄(myosin-heavy chain)의 종류에 따라서 크게 세 가지 형태로 구분이 된다 (Brooke and Kaiser, 1970). 근섬유 타입 I(type I)의 경우는 느린-산화작용(slowoxidative)의 성질을 띠어 사후 대사속도를 지연시켜 함량이 높을 경우 육질에 긍정적인 영향을 미치게 되며, 이와는 반대로 타입 II b(type IIb)의 경우는 빠른-당분해(fast-glycolytic)의 성질을 갖게 되어 빠른 사후 대사 속도로 인해 함량이 많을 경우 돈육질이 육색이 창백하고, 조직이 흐물거리며 육즙이 많이 나오는(pale, soft, exudative; PSE) 이상육으로 판정될 가능성이 높아진다 (Klont 등, 1998). 나머지 하나인 타입 II a(type IIa)는 이들 둘과 중간의 성질인 느린-당분해(slow-glycolytic)의 성질을 갖는다. 이들 세 가지 형태의 근섬유형에 따라서 근섬유조성이 결정되어 지며, 돼지의 등심근(longissimus dorsi)은 대부분 백색근 계열로써 타입 II b의 비율은 80% 정도를 차지하고 있다.

본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어, MYH4 유전자는 미오신 중쇄 4 (Myosin heavy chain 4) 유전자를 의미하며, 미오신 중쇄 아형(Myosin heavy chain isoform)을 발현하는 유전자 중의 하나로서 근섬유 타입Ⅱ a의 발현과 연관성이 있다.

본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어, 돼지의 육질은 고기의 질을 pH, 육색, 근내지방도, 지방색, 조직감, 성숙도 등에 따라 등급을 구분하게 되는데, 이 중 특히 pH와 육색은 돼지고기의 육질 특정을 나타내는데 중요한 판별 기준이 된다. 최근 돼지고기의 가격이 급등하고 있기 때문에 육질이 우수한 돼지를 선발하고 육종 및 생산함으로써 품질이 향상된 고급육의 개발이 중요하며, 따라서 본 발명의 유전자 마커를 이용하면 근섬유 타입Ⅱ a가 증가된 개체를 조기에 진단하고, 종돈 선별에서 제외하여 육질이 향상된 고급육을 손쉽게 선별할 수 있다.

본 발명자들은 서열번호 1로 표시되는 MYH4 유전자의 5' 조절 영역(regulatory region)에서 돼지의 근육내 근섬유 조성과 관련된 SNP를 찾아내고, 이러한 SNP와 돼지의 근육내 근섬유 조성과의 연관성을 분석하였다. 상기 유전자 마커는 돼지의 MYH4 유전자의 서열 중 일부로서, 특정 부위인 MYH4 5’UTR 조절영역에서 -1398번째 염기(서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 621번째 위치)에서 G 또는 T로 염기가 치환된 SNP 위치를 포함한다.

근섬유소 타입Ⅱ a의 발현량이 높은 종돈은 이상육으로 판정될 가능성이 있으며, 본 발명에 따라 근섬유소 타입Ⅱ a의 발현량과 통계적 연관성이 있는 유전자 마커를 이용할 경우 우수한 육질을 가진 고기를 생산할 수 있는 종돈을 선발하는 것이 가능하다.

보다 구체적으로, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 621번째 SNP 위치가 G에서 T로 치환됨에 따라 유전자의 발현, 즉 MYH4 유전자의 발현에 차이를 주게 되며, 결국 근섬유 조성 중 근섬유 타입Ⅱ a의 비율이 감소되는 결과를 가져온다. 따라서, MYH4 유전자의 발현과 근섬유 타입Ⅱ a의 비율은 부의 상관관계를 가지고 있는 것으로 나타났다. 결국 유전자형 TT 타입에서 근섬유 조성 중 근섬유 타입Ⅱ a가 감소함에 따라 육질 향상에 영향을 주게된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서, 621번째 SNP 위치의 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이들에 대한 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지 근섬유소 형태 진단용 조성물이 제공될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 또는 이들에 대한 상보적 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서, 621번째 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 다형성 서열(polymorphic sequence)이며, 본 발명에 있어서 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 SNP 위치의 염기를 포함하는 돼지 근섬유 형태 진단용폴리뉴클레오티드 또는 이들에 대한 상보적 폴리뉴클레오티드는 10개 이상의 연속된 염기로 구성되는 것이 바람직하다. 특히, 15 내지 30 염기의 경우 상기 SNP를 탐지하기 위한 프로브(probe)나 프라이머로 이용될 수 있으며, 그 이상의 크기를 갖는 염기의 경우 PCR_RFLP 방법으로 탐지하는데 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 SNP를 포함하는 돼지 근섬유 형태 진단용 폴리뉴클레오티드 또는 이들에 대한 상보적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는 대립형질 특이적(대립유전자-specific) 폴리뉴클레오티드이다.

대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드라 함은 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것을 의미하며, 특히 다형성 서열 중에 존재하는 다형성 부위의 염기를 특이적으로 구별할 수 있도록 혼성화하는 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 돼지 근섬유소 형태 진단용 마이크로어레이 또는 키트의 제조를 위한 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서, 621번째 SNP 위치의 염기를 포함하는 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이들에 대한 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지 근섬유소 형태 진단용 조성물의 용도를 제공한다.

상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.

프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 "프로브 폴리뉴클레오티드"는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보적 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 Nielsen 등, Science, 254, 1497-1500(1991)에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립형질성 형태 간에 유의한 혼성화 차이를 유발할 수 있다.

본 발명의 돼지 근섬유소 형태 진단과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드의 기판 상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 Cy3 또는 Cy5와 같은 형광 물질 등을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

상기 돼지 근섬유소 형태 진단용 키트는 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 제작될 수 있다. 상기 키트에는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 중합 반응에 필요한 시약, 예를 들면 dNTP, 각 종의 중합효소 및 발색제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서, 621번째 SNP 위치가 TT 유전자형인 경우를 GG와 GT 유전자형인 경우보다 돼지 근섬유소 타입Ⅱ a의 비율이 더 낮은 것으로 판정하는 돼지 근섬유소 형태 진단방법이 제공될 수 있다.

상기 단일염기다형을 확인하는 방법에는 특별한 제한은 없으며, 통상 당업계에서 사용되고 있는 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 실시예에서와 같이 PCR을 이용하여 SNP 분석을 수행하거나, 디데옥시법에 의해 직접적인 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통하여 수행할 수 있으며, 또는 SNP 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하거나, 대립 유전자 특이적 프로브 혼성화 방법(대립유전자-specific probe hybridization), 대립 유전자 특이적 증폭 방법(대립유전자-specific amplification), 서열분석법(sequencing), 5' 뉴클레아제 분해법(5' nuclease digestion), 분자 비콘 어세이법(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 결합 어세이법 (oligonucleotide ligation assay), 크기 분석법(size analysis) 및 단일 가닥 배좌 다형성법(single-stranded conformation polymorphism) 등을 이용하여 수행할 수 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예 1

공시동물 및 형질 조사

MYH4 유전자 5' 조절 영역의 SNP를 찾기 위하여 5품종(랜드레이스, 요크셔,두록, 버크셔, 재래돼지)의 돼지 총 117두를 사용하였고 발굴된 SNP와 돼지형질과의 연관성 분석을 하기 위하여 133두(거세돈 40두, 암컷 93두)의 랜드레이스 돼지를 사용하였다. 모든 돼지들은 평균 체중 110kg이 될 때까지 같은 농장에서 동일한 사양방식을 통하여 사육되었다.

돼지는 대한민국 표준절차에 따라 도축하였다. 근섬유의 특성은 이전에 보고된 바와 같이 8번째 척추 부위에 있는 등심조직을 사후 45분 후에 채취하였으며 채취 즉시 액채 질소에 보관한 후 측정하였다(kim 등, 2010). 각 시료에 대하여 조직화학적인 분석을 통해 근섬유소의 형태를 확인했으며, 고기의 일반성분에 대한 분석도 동시에 진행하였다.

SNP 발굴 및 Genotyping

Genomic DNA는 EDTA가 처리된 혈액샘플에서 DNA 분리 키트(Promega) 사용하여 분리 하였고, SNP 발굴을 위해 돼지 MYH4 5' 조절 영역(regulatory region)의 2kb정도의 크기로 하기의 표 1에 기재되어 있는 프라이머를 이용하여 5품종 117두에서 PCR을 수행 하였다. PCR은 genomic DNA 100ng, 0.25mM dNTP 2ul, 10X PCR buffer 2ul, 10pmol primer 2ul, DNA 중합효소 0.25U를 포함하여 총 20ul로 반응하였다.

프라이머 명칭		서열(5' → 3')	적용
MYH4	F	GCAGCAGGAGATTTCTGACC	실시간 PCR
	R	CAAGTTGGATGCGAAGGATT	실시간 PCR
	P1F	TCACATCTCTCCTCCCACCT	프로모터 서열화
	P1R	CGGGAGTTCTTTAAGACTTAGCA	프로모터 서열화
	P2F	CAAGGCTCTCTGACCCACTC	프로모터 서열화
	P2R	ACCGCATAATGATGGAAGGA	프로모터 서열화
GAPDH	F	GCAAAGTGGACATTGTCGCCATCA	실시간 PCR
GAPDH	R	TCCTGGAAGATGGTGATGGCCTTT	실시간 PCR

반응조건은 94 C에서 5분, 94 C에서 30초, 62 C에서 30초, 72 C에서 1분씩 35회 반복하고 최종적으로 72 C에서 10분간 DNA Engine Tetrad^®2ThermalCycler을 이용하여 수행 하였다. 증폭된 PCR 산물을 ABI 3730 염기서열분석기를 이용하여 염기서열을 분석하였다.

염기서열 비교는 SeqMan 프로그램을 이용하여 SNP를 확인 하였다. -1389번째 염기서열에서 하나의 SNP를 확인 하였고 유전자형분석은 상기 표 1에 기재되어 있는 프라이머 세트 P2를 이용하여 133두의 랜드레이스에서 염기서열분석을 통하여 수행하였다.

또한, 돼지의 MYH4 5' 조절 영역의 전사인자 결합(binding) 지역을 추측하기 위하여 TFSEARCH V1.3 (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)와 TESS(http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess)를 사용하여 결합 지역을 예상 하였다.

통계분석

연관성 통계분석은 SAS 9.13 소프트웨어를 사용하여 수행 하였고 아래의 수식을 이용하여 GLM분석을 하였다.

(=일반적 평균, G _i =유전적 효과, S _j =성별 효과, P _k =도축 시기_, e _ijkl , = 임의적 오류)

GLM분석은 유전자 발현량 분석에도 표현 수준을 분석하기 위해 사용하였다. 수식은 유전자형, 성별 및 도축 기간은 통계모델의 고정효과로 포함 하였다. 모든 데이터는 평균 ± SE로 표시하였고, P <0.05 에서 유의한 것으로 간주하였다.

돼지 MYH4 유전자 5 조절 영역의 SNP 유전자형별 유전자 발현분석

유전자 발현분석을 위한 샘플은 GG타입 8두, GT타입 35두 및 TT타입 30두 총 73두의 돼지 샘플로 구성하였다. 총 RNA 분리는 TRIzol을 사용하였고, cDNA는 총 1 ㎍의 RNA를 사용하여 합성 하였다. cDNA 합성은 5X First-Strand 버퍼 4 ㎕ 0.1M DTT 1 ㎕, 10mM dNTP 1 ㎕, 재조합 RNasin^®Ribonuclease Inhibitor 1 ㎕, SuperScriptIII 역전사효소 200U, 무작위 프라이머 0.25 ㎍, 총 RNA 1 ㎍을 포함하여 전체 20 ㎕로 만들었고 반응은 50C에서 60분간 반응시켰다.

합성된 cDNA는 돼지 MYH4 유전자를 기초로 제작한 특정 프라이머 를 사용하여 ABI 9700 real-time PCR 기계를 이용하여 돼지등심조직에서 유전자발현분석을 실시 하였다. 이 때 표준유전자로 돼지 GAPDH 유전자를 사용하였다.

SNP 발굴 및 유전자형 빈도

돼지의 MYH4 유전자는 이전논문에 의해 돼지염색체 12번에 존재하는 것으로 밝혀졌다(Davoli 외., 2002). 본 연구에서 돼지의 MYH5 5' 조절 영역은 GenBank(Acc. No. NC_010454)에 의해서 추측하였다. MYH4 5' 조절 영역의 2kb 정도의 크기를 PCR기법을 이용하여 증폭하였고 5품종(랜드레이스, 요크셔, 두록, 버크셔, 재래돼지) 돼지에서 분리한 genomic DNA를 사용하여서 염기서열 분석을 하여 비교한 결과 랜드레이스에에서 5' 조절 영역에 -1398번째 염기가 G에서 T로 바뀌는는 것을 알 수 있었다.

랜드레이스를 제외한 나머지 4개의 품종에서는 SNP를 확인할 수 없었다. Davoli의 논문에서 MYH4 유전자의 28번째 염기가 바뀌면서 돼지의 일당증체량과 연관성이 있다고 보고 하였다(Davoli 등, 2003). 그러나 지금까지 MYH4의 5' 조절 영역에서의 SNP를 확인한 연구결과는 보고되지 않았다. MYH4 5' 조절 영역의 SNP 유전자형 빈도를 5개 품종 중 랜드레이스만이 유전적 다형성을 보였고 다른 4개의 품종은 하나의 유전자형으로 고정되어 있었다.

하기의 표 2는 5품종(랜드레이스, 요크셔, 두록, 버크셔, 재래돼지)돼지에서 분리한 MYH4 5' 조절 영역의 SNP 유전자형 빈도를 나타낸 것이다.

종	SNP 좌위	수(n)	유전자형			대립유전자빈도
종	SNP 좌위	수(n)	GG	GT	TT	G	T
랜드레이스	-1398G/T	10	0.36	0.41	0.23	0.26	0.44
요크셔		26	1.00	0	0	1.00	0
버크셔		26	1.00	0	0	1.00	0
두록		26	1.00	0	0	1.00	0
재래돼지		13	1.00	0	0	1.00	0

상기의 표 2를 참조하면, 랜드레이스에서 유전자형 빈도는 각각 GG타입이 0.41, GT타입이 0.23, TT타입이 0.36 이었고 G 대립유전자는 0.56, T 대립유전자는 0.44로 나타났다.

연관성 분석

랜드레이스 돼지의 MYH4 5' 조절 영역의 SNP와 근섬유 특징, 육질형질과의 연관성 분석은 하기의 표 3에 기재되어 있다.

형질	유전자형			P 값
형질	GG (n=48)	GT (n=54)	TT (b=31)	P 값
1. 근섬유 형질
(1)총 근섬유수(×10³)	1,201 (51.3)¹	1,161 (39.4)	1,175 (66.8)	NS
(2)평균 근섬유단면적(㎛²)	4,443 (148.2)	4,349 (103.4)	4,274 (162.0)	NS
(3)총 근섬유밀도(/㎟)	233.7 (8.37)	234.3 (5.85)	239.63 (9.15)	NS
(4)근섬유 조성(%)
타입 Ⅰ	8.83 (0.92)	10.04 (0.64)	10. 82 (1.00)	NS
타입 Ⅱa	13.66^a(0.89)	11.28^b (0.62)	8.71^c (0.97)	0.004
타입 Ⅱb	77.55 (1.38)	78.70 (0.96)	80.48 (1.50)	NS
(5)근섬유 면적(%)
타입 Ⅰ	5.81 (0.60)	6.77 (0.42)	7.05 (0.65)	NS
타입 Ⅱa	7.93^a(0.65)	7.07^a (0.45)	5.50^b (0.70)	0.061
타입 Ⅱb	86.25 (0.98)	86.17 (0.67)	87.45 (1.06)	NS
2. 육질
산도(pH_45min)	6.08 (0.06)	5.99 (0.04)	6.03 (0.06)	NS
L*	48.51 (0.55)	48.86 (0.42)	49.27 (0.63)	NS
a*	6.56 (0.22)	6.24 (0.17)	6.61 (0.25)	NS
b*	3.00 (0.18)	2.88 (0.14)	3.20 (0.20)	NS
수분 손실(%)	5.99 (0.45)	5.15 (0.35)	5.20 (0.53)	NS
필터페이퍼 액체 흡수량(FFU) (mg)	65.74^a(4.60)	52.05^b (3.56)	59.73^ab (5.32)	0.047
물퇘지육(PSE) (n)	17²	9	2

상기의 표 3에서 n은 돼지의 수, 윗첨자 1은 최소제곱평균 및 표준오차로서 표현되는 값이며, 윗첨자 2는 유전자형마다 상당한 차이를 보이는 물퇘지육 빈도의 카이제곱 검정을 나타내며(P<0.001), 윗첨자 a, b, c는 동일한 행에서의 최소제곱평균을 다른 첨자로 표현한 것이다.

-1398번째의 염기서열의 유전자형에 따라 근섬유 타입Ⅱ a의 개수, 총 근섬유 수(total fibers number)는 GG 유전자형이 1,202x10³으로 가장 많았으며, 근섬유 하나당 섬유의 크기를 나타내는 평균 근섬유 단면적(Cross-sectional area)은 GG 유전자형이 4,443으로 GT와 TT 유전자형보다 더 넓게 나타났다. 또한, 근섬유 조성에 있어서 근섬유 타입Ⅱ a의 비율은 GG 유전자형이 13.66%로 가장 높게 나타났으며, 근섬유 타입Ⅱ a의 면적 역시 GG 유전자형에서 7.93%로 가장 넓게 나타났다. 이에 반하여, TT 유전자형에서는 근섬유 타입Ⅱ a의 비율 및 면적이 가장 낮은 값으로 나타났다.

마이오신 패밀리들은 근섬유를 구성하는 단백질이기 때문에 돼지고기의 품질에 많은 연관성이 있다고 알려져 있으며(Karlsson 등, 1999; Brocks 등, 2000), 돼지의 사후 pH는 근섬유의 유형에 따라 변화하며 타입Ⅱ a와 Ⅱ b는 주로 해당작용의 속도를 조절하여 산도의 감소에 기여한다고 알려져 있다(Candek-Potokar 등, 1999; Ryu 과 Kim, 2006). 또한 최근 연구에서는 소와 돼지에서 근섬유의 특성이 고기품질과 연관성이 있다고 보고하고 있다(Ozawa 등, 2000; Hwang 등, 2010; Karlsson 등, 1999; Eggert 등, 2002; Ryu 과 Kim, 2005).

따라서, 본 발명에 따른 결과 및 연구 결과들을 참고하여, TT타입의 유전자형이 GG와 GT타입의 유전자형 타입의 돼지보다 우수한 품질의 고기를 생산할 수 있다는 것을 확인할 수 있다.

실시예 2. 본 발명에 따른 SNP가 고정된 마이크로어레이의 제작

서열번호 1로 표시되는 염기서열에서, SNP 위치(621번째)의 염기를 포함하는 20개의 연속된 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드(SNP는 상기 20개의 연속된 염기 중 11번째에 위치)를 기판상에 고정하였다. SNP 위치에는 두 개의 대립형질이 존재하므로 각 서열마다 2개씩의 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하였다.

먼저, 상기 각 폴리뉴클레오티디의 N-말단을 아민기로 치환한 다음 실릴화 슬라이드(Telechem사)에 스팟팅하였으며, 이때 상기 스팟팅 버퍼는 2SSC(saline-sodium citrate, pH 7.0)을 사용하였다. 스팟팅 후 건조기에 두어 결합을 유도한 후 0.2% SDS(sodium dodecyl sulfate)로 2분간, 3차 증류수로 2분간 세척하여 결합되지 않은 올리고를 제거하였다. 상기 슬라이드를 95에서 2분간 처리하여 변성을 유도한 후, 블로킹 용액(1.0g NaBH₄, PBS(pH 7.4) 300, EtOH 100)으로 15분간, 0.2% SDS 용액으로 1분간, 3차 증류수로 2분간 각각 세척하고 상온에서 건조시켜 마이크로어레이를 제작하였다.

실시예 3. 본 발명에 따른 SNP가 고정된 마이크로어레이를 이용한 돼지 육량 판단

본 발명자들은 사상체질을 진단하고자 하는 돼지의 혈액으로부터 표적 DNA를 분리하고, Cy3-dUTP(Metabion사)로 형광 표지시켰다. UniHyb혼성화 용액(Telechem사) 하에서 상기 실시예2에서 제조된 마이크로어레이와 형광 표지된 표적 DNA의 혼성화를 42에서 4시간 동안 수행하였다. 2SSC로 실온에서 5분간 두 번 세척한 후 공기 중에서 건조시켰다. 건조 후 슬라이드를 스캔어레이 5000(ScanArray 5000: GSI Lumonics 사)으로 스캔하고 스캔 결과를 퀀트어레이(QuantArray)(GSI Lumonics 사)와 ImaGene 소프트웨어(BioDiscover사)로 분석하여 상기 돼지가 본 발명에 따른 SNP를 갖고있는지 여부를 확인함으로써, 돼지의 육질 관련 형질, 특히 돼지 근육내 근섬유소 형태를 진단하였다.

즉, 본 발명은 MYH4 (Myosin heavy chain 4) 유전자의 5' 조절 영역 상에 존재하는 SNP를 이용하여 돼지의 육질형질 중 하나인 근섬유소 형태를 진단하는 유전자 마커를 제공하며, 상기의 유전자 마커를 이용하여 근섬유소 형태를 진단하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면 돼지 근섬유소 형태 진단용 유전자 마커를 이용하여 돼지의 육질형질 중 하나인 근섬유소 형태에 대한 분자생물학적 수준에서의 해석이 가능하며, 돼지의 근섬유소 형태를 진단할 수 있는 분자표지인자로서 종돈을 선발 및 돼지고기의 육질과 밀접한 관계가 있는 근섬유소 형태를 진단함으로써 돼지고기의 육질 개량에 활용이 가능하다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Genetic marker for diagnosis of muscle fiber type within porcine muscle and diagnosis method using the same <130> NPF-22580 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 2018 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 1 gtccactgga atatcatggt ttcttttaga gactttaaga actgaatgag gaggtctcgt 60 cgtggctcag cagaaatgaa cccaactagg aaccatgagg ttgcagtttc aatccatggc 120 ctcctggctc ggtgggttaa gggtccagca tcatcatgag ctgtggtgta ggtcgcagac 180 acggctcaga tcccacactg ctgtccctgt ggggtaggca ggggctacag ctttgatttg 240 acccctagcc tgggaacctc catatgccat gggtacggcc ctaaaaagac aacaacaaca 300 aaaaatcctc attagctgta ctgtgtaact cagcctatgc gtcttggtct catccgtgat 360 ttcttctttt aactttcagt tccaaagata gcacatgcgt ctgataatat ttatgtttat 420 aatgtagaca ttaagtttca aaaggagtaa aaataaatga gttgtgaaat cttaaattag 480 agaaaaatca gaagacatct cttctttctg gcttagagcc taacactttg ggtaagtcac 540 taaacttctg tgaatcattt ccatggagac tggggggaaa aaaaaagcct gatcatctat 600 tccacagtat tgtatcaaaa gaaataaaaa ctataaaaga ttcaatctct gaaggtatga 660 aaaagaaatt ctatgtcagt aggatgcttg caaacagtga tcatattagt cagtaactta 720 agctaggaga tgacagccaa aaatattaca tcagatctag gtgacacact tagcgtggac 780 agatttgctg ttacattcag cagcagctgt gtctgtggca aaaccaccaa aacccaattt 840 acaagcatcg tgggcatatg tgatagcccc cttatgttct caacccacaa agagtcctgt 900 gggtatcaca tctctcctcc caccttaaat aaaaatacgt attacccacc tcattagagc 960 tactgctagt catgaggatt tgcctgtgaa ctaggaatgc atattgatgc ctccttccat 1020 cattatgcgg tagaaacaca catagaacat cacacggact cctgcagtcc ccccagtgaa 1080 aacatgtgag ctcaagacag ccacggcaag ctctccagaa aaggaaaaga agtgtttcta 1140 tctattctaa atcccttatg gctcccccac tggtctgtca ccatggctta gcccgagaat 1200 ctgcctaaac tttctccttc atgcttagtc ttttagactt taaaaaaatc tatcatcagt 1260 atttctaaaa tccagaccca ggctaggagt tttctgcttt aataccaatc atgttgtcag 1320 agctaaaact catcccagct cctcaatggc cctaagcact aacaaatcaa ttagttctca 1380 actcctcgtg tctggctcat tctgtcggac caattttaca ggcaggagag taagtgggaa 1440 cctggctttc aactcagtga tgaatgatgg aacagcaaag ctggagaaat agccttagaa 1500 gccctgaatc tccatcccta tcaaatgcct caaaagaacc ctagatgatc ctctgtcaaa 1560 ttatttatag gtgtcaagaa atatttctaa ttatatccat tcacagccac agtcagtgaa 1620 tattgtgcaa agagattgcc aaaaaaggtt tgccaagtag gttcccagct gggacagctg 1680 aggtggctgc tgtgtttgca aaatggtctc tataaaagtg gagctgagat gcctctgtcc 1740 tgtccttcct caaaacactt taaggtatgt atatgtagaa gaacacttgg ctagctttgc 1800 atccctcaca caaacaatta ttcacttaag ggagatggcc actgtttccc aaattttaat 1860 ttttctttct aacattccta aggatgacgt catacacaat atagtttcta gtactatgtg 1920 attaaaatgg aaaaaataaa ataaaagaat ccacattctc ttgtttgttt tttctttcaa 1980 cagtagttgt ctgccttgag cctgccaccg tcttcatc 2018

Claims

서열번호 1로 표시되는 염기서열에서, 621번째 염기에서 G/T인 SNP를 포함하는 서열번호 1 내의 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 돼지 근섬유소 형태 진단용 유전자 마커.
서열번호 1로 표시되는 염기서열에서, 621번째 염기에서 G/T인 SNP를 포함하는 서열번호 1 내의 10 내지 100개의 연속적인 염기로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이들에 대한 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지 근섬유소 형태 진단용 조성물.
제2항의 폴리뉴클레오티드 또는 이들에 대한 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지 근섬유소 형태 진단용 마이크로 어레이.
제2항의 폴리뉴클레오티드 또는 이들에 대한 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지 근섬유소 형태 진단용 키트.
서열번호 1로 표시되는 염기서열에서, 621번째 염기에서 G/T인 SNP가 TT 유전자형인 경우를 GG와 GT 유전자형인 경우보다 돼지 근섬유소 타입Ⅱ a의 발현량이 더 낮은 것으로 판정하는 돼지 근섬유소 형태 진단방법.