KR101243345B1

KR101243345B1 - 돼지의 육질 증가 여부 확인용 ｄｎａ 표지인자

Info

Publication number: KR101243345B1
Application number: KR1020100114107A
Authority: KR
Inventors: 홍기창; 김준모; 임규상; 이영식
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2010-11-16
Filing date: 2010-11-16
Publication date: 2013-03-14
Also published as: KR20120052796A

Abstract

본 발명은 돼지의 육질 증가 여부 확인용 DNA 표지인자에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 서열번호 1의 염기서열에서 220번째 G 염기를 포함하는 15 내지 1000개의 연속서열로 구성되는 돼지의 육질 증가 여부 확인용 DNA 표지인자에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 돼지의 육질 특성에 관여하는 PPARGC1A 유전자의 새로운 유전적 변이(SNP) 부위를 발견하고, 이러한 유전적 변이에 따른 육질이 향상된 개체를 선별할 수 있는 표지인자를 개발하였다.

Description

돼지의 육질 증가 여부 확인용 ＤＮＡ 표지인자 {DNA markers for detecting increase of porcine meat quality}

본 발명은 돼지의 근섬유 특성을 통한 육질 증가 여부 확인용 DNA 표지인자에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 서열번호 1의 염기서열에서, 220번째 G 염기를 포함하는 15 내지 1000개의 연속서열로 구성되는 돼지의 근섬유 특성을 통한 육질 증가 여부 확인용 DNA 표지인자에 관한 것이다.

오랜 기간 돼지육종은 사료효율과 성장률을 증가시키는 방향으로 이루어져 왔으며, 등지방을 비롯한 지방량을 줄이고 적육비율을 높인 살코기형 돈육생산 방향으로 진행되어왔다. 현재 적육생산 효율면에서 상당한 발전을 가져왔으나 이는 주로 근세포의 크기 성장에 의한 결과로 해석되고 있으며, 이러한 결과로 스트레스에 민감한 돼지가 발생하고 이상돈육 발생이 증가하는 등 육질의 저하를 가져오게 되었다. 따라서, 기존의 적육생산능력과 함께 육질을 향상시키기 위한 개량체계의 마련은 시급하다.

골격근의 성장과 발달을 이해하는 것은 육용가축의 적육생산량과 육질적 측면에서 매우 중요한 의미를 지니고 있다. 근육은 근섬유로 이루어져 있으며 근육생산량은 근섬유의 수와 크기에 의해 결정되는데, 출생 전 결정되는 근섬유의 수와 출생 후 근섬유 크기 성장을 통해 적육생산량이 증가하게 된다. 그러나 육질의 경우는, 근섬유 수와 크기보다는 근섬유조성에 의해 크게 영향을 받는다 (Ryu, Y. et al. 2005. Meat Science 71: 351-357).

돼지의 근육내 근섬유는 ATPase 활성을 담당하는 미오신 중쇄(myosin-heavy chain)의 종류에 따라서 크게 세 가지 형태로 구분이 된다. 근섬유 타입 I의 경우는 느린 산화작용(slow-oxidative)의 성질을 띠어 사후 대사속도를 지연시켜 함량이 높을 경우 육질에 긍정적인 영향을 미치게 되며, 이와는 반대로 타입 IIb의 경우는 빠른 당분해(fast-glycolytic)의 성질을 갖게 되어 빠른 사후 대사속도로 인해 함량이 많을 경우 돈육질이 육색이 창백하고 조직이 흐물거리며 육즙이 많이 나오는(pale, soft, exudative; PSE) 이상육으로 판정될 가능성이 높아진다 (Klont, R. E. et al. 1998. Meat Science 49: S219-S229). 나머지 하나인 타입 IIa는 이들 둘과 중간의 성질인 느린 당분해(slow-glycolytic)의 성질을 갖는다. 이들 세 가지 형태의 근섬유형에 따라서 근섬유조성이 결정되며, 돼지의 등심근(longissimus dorsi)은 대부분 백색근 계열로서 타입 IIb의 비율은 80% 정도를 차지하여, 근육내 근섬유 조성중 타입 I의 비율을 높여주기 위한 연구가 필요하다고 볼 수 있다.

근섬유조성을 포함하는 근섬유특성은 유전적인 요인에 의해 크게 영향을 받는다. 특히, 돼지의 경우 근세포조성의 유전력이 근섬유형별로 37~58%로써 높고, 육질관련 형질과의 유전상관 관계도 높기 때문에 유전적인 개량을 통해서 각 개체의 근세포조성의 조절이 가능할 것으로 판단되고 있다 (Larzul, C. et al. 1997. J. AnimSci. 75: 3126-3137.). DNA 표지인자를 이용한 선발방법인 MAS(Marker Assisted Selection)는 가축의 육종에 있어서 선발의 정확도를 높이고 개량속도를 증가시켜, 유전적 개량량을 극대화할 수 있는 방법으로서 최근 첨단분자육종기법으로 각광받고 있다. 근섬유조성의 변이가 대부분 유전적 요인에 의해 발생한다는 점은 MAS를 접목한 개량이 매우 효율적일 수 있음을 시사한다.

그러나 근세포 특성은 도체의 등심근에서만 측정이 가능한 형질로서, 생체에서의 측정이 불가능하다. 따라서 이를 위주로 한 선발과 개량을 위해서는 도축을 하지 않고도 개체의 근세포 특성을 예측할 수 있는 방법이 필요하다. 바로 이러한 점에서 DNA 표지인자의 개발이 근본적으로 요구되며, 후보유전자의 개발과 유전자 구조 분석을 통한 유전자원 확보가 필수적으로 선행되어야 한다.

포유동물의 근섬유 형성은 배 발달과정에서 결정되며 이에 관여하는 유전자로 현재 MyoD gene family가 제안되고 있는데, 근섬유조성에 관여하는 유전자에 관한 연구는 미미하다. 근섬유조성을 조절하는 생화학적인 기전은 현재까지 명확하게 밝혀지진 않았지만, 에너지흡수 및 대사에 따라서 좌우되는 것으로 보고되고 있다 (Berchtold, M. W. et al. 2000. Physiol. Rev. 80: 1215-1265).

PPARGC1A(Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1) 유전자는 PGC1의 전구체로서 적응대사량(adaptive thermogenesis)과 지방세포 분화(adipocyte differentiation)에 깊게 관여함으로써 동물의 에너지대사에 깊게 관여하여, 가축의 육질관련 후보유전자로 최근 거론되고 있다 (Erkens, T. et al. 2006. BMC Biotechnol 6: 41). 더욱이, 이 유전자가 근섬유 타입 I 형성을 유도하는 주요한 역할을 하는 것으로 보고됨으로써 (Lin, J. et al. 2002. Nature 418: 797-801), 본 발명자들은 PPARGC1A 유전자를 근섬유조성, 특히 타입 I 형성에 관여하고 육질향상과 관련이 있는 후보유전자로 선정하였다.

상기 PPARGC1A 유전자는 돼지 염색체 8번 p-arm에 위치하며, 최근 cDNA를 이용하여 엑손(exon) 영역에 한해서만 염기서열 및 유전자 구조가 분석되어 몇몇 SNP만 보고되었을 뿐, 그 외 5' upstream 이나 3' downstream 영역, 및 인트론(intron) 영역 등 유전자 전체 구조에 대한 연구결과는 보고되고 있지 않다. 또한, 이 유전자의 에너지 대사량에 관여하는 기능적 특성상, 엑손 영역에서의 변이에 의한 단백질 수준의 질적인 차이보다는 promoter 영역 등의 유전자 발현조절 부위에서의 양적인 발현차이가 더욱 유효할 것으로 사료되며, 이를 바탕으로 근섬유조성 및 육질에도 더욱 영향을 미칠 것으로 판단된다. 따라서 현재까지 밝혀지지 않은 PPARGC1A 유전자의 5’promoter 영역 등 발현조절 부위의 염기서열 및 구조분석에 관한 연구가 필요하며 새로이 발견된 변이들에 대해서 실제 선발대상 형질들, 특히 근섬유조성 및 육질관련 형질과의 연관성 분석을 실시함으로써, 변이의 실제적 기능을 구명하는 것이 반드시 필요하다.

본 발명에서는 돼지의 품종별로 실제 근섬유 특성과 육질형질을 측정하고, PPARGC1A 유전자의 5' upstream 영역에서 유전자형 분석결과를 토대도 연관성 분석을 실시하였다. 이를 통해서 PPARGC1A 유전자의 5' upstream 영역에서 SNP를 탐색하고 그에 따른 육질 향상관련 기능을 규명하였고, 관련 DNA 표지인자로서 효용성을 검증하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 돼지의 PPARGC1A 유전자의 5' upstream 영역의 SNP를 이용하여 육질을 향상시키는 돼지 육질 증가 관련 DNA 표지인자 및 이를 이용한 SNP 분석용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열에서 220번째 G 염기를 포함하는 15 내지 1000개의 연속서열로 구성되는 돼지의 육질 증가 여부 확인용 DNA 표지인자를 제공한다. 본 발명자들은 서열번호 1로 표시된 PPARGC1A 유전자의 5' upstream 영역에서 돼지의 육질 특성과 관련된 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 찾아내고, 이러한 SNP에 따른 돼지 개체의 육질 특성 및 유전자형과의 연관성을 분석하였다. 상기 DNA 표지인자는 가축의 육질관련 후보유전자로 최근 연구되고 있는 PPARGC1A 유전자의 5' upstream 서열 중 일부로서, 특정부위에서 G 또는 A로 염기가 치환된 SNP(single nucleotide polymorphism) 부위를 포함한다.

본 발명은 PPARGC1A 유전자의 5' upstream 영역에서 육질의 증가를 일으키는 SNP (A→G 치환) 부위를 밝혀내고 이를 포함하는 DNA 단편의 “돼지의 육질 증가 여부 확인하기 위한 DNA 표지인자”로서의 신규한 용도에 관한 것이다.

상기 PPARGC1A 유전자는 포유동물에서 에너지 대사에 관여한다는 것이 이미 알려져 있고, 또한 가축의 육질관련 후보유전자로 다양한 연구가 진행되고 있으며, 특히 마우스의 근섬유 타입 I 형성을 유도하는 주요한 역할을 하는 것으로도 알려져 있다. 그러나, 돼지의 PPARGC1A 유전자의 5' upstream 영역에서 특정 부위의 SNP를 이용하여 육질이 향상된 개체를 선별하는 방법은 전혀 알려져 있지 않으며, 본 발명자들이 이러한 육질 증가 관련 SNP를 처음으로 밝혔다.

본 발명에 있어서, 상기 DNA 단편은 돼지의 육질 특성과 관련한 PPARGC1A 유전자의 5' upstream 영역의 새로운 유전적 변이 부위(SNP site)인 220번째 G 염기를 포함하는 DNA 표지인자이다. 이 유전적 변이 부위는 G→A로 염기가 치환되어 유전자의 발현에 차이를 주게 되어 결과적으로 육질 향상에 영향을 미친다. 상기 DNA 단편의 크기는 전체 유전자의 full length가 아닌 한 상기 SNP 부위를 포함하는 어떤 단편 크기일 수 있으나, 바람직하게는 15 내지 수백 염기일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 15 내지 1000 염기일 수 있다. 특히 15 내지 30 염기의 경우는 상기 SNP를 탐지하기 위한 프로브(probe)나 프라이머로 이용될 수 있으며, 그 이상의 크기를 갖는 염기의 경우는 본 발명의 실시예에서와 같이, PCR-RFLP 방법으로 탐지하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 도 2와 같이, 상기 SNP 부위를 포함하는 943 bp 크기(도 3)의 DNA 단편을 DNA 표지인자로 이용하였다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 DNA 표지인자는 돼지의 육질 관련 형질인 pH를 향상시키고 유리육즙(drip loss)은 감소시킴으로써 육질을 증가시키는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예 5에서와 같이, SNP에 따른 유전자형(AA, AG, GG)과 근섬유형질 및 육질의 연관성 분석을 분석하여 GG 유전자형이 향상된 육질을 나타냄을 확인하였다.

본 발명에서, “육질의 증가”란 SNP로 인한 개체별 유전자형(AA, AG, GG)에 따라 돼지의 육질 관련 형질인 pH가 높게 나타나고, 유리육즙이 적게 나타난 것을 의미한다. 즉, GG 유전자형 개체가 AG 유전자형 개체와 비교하여 pH가 증가하고 유리육즙이 감소된 상태를 의미한다.

본 발명에 사용된 “PCR-RFLP” 방법은 가축의 유전적 특성이나 능력개량을 위한 다양한 DNA 분석기술 중, PCR(Polymerase Chain Reaction)기술을 이용한 유전자 단편들의 다형성(Restriction Fragment length polymorphism)을 분석하는 기법으로, 특정 점 돌연변이(point mutation) 부위에 제한효소 인지부위가 존재할 경우, 각 개체의 유전자형 차이에 따라 제한효소에 의해 절단되어 생기는 절편의 길이가 다양하게 나타나는 DNA의 다형성을 비교하여 각 개체의 바람직한 유전자형을 보다 신속하고 정확하게 판정하는 방법이다.

본 발명에서, 돼지의 육질특성은 고기의 질을 pH, 육색, 근내지방도, 지방색, 조직감, 성숙도 등에 따라 등급을 구분하게 되는데, 이 중 특히 pH와 유리육즙은 돼지고기의 육질 특성을 나타내는데 중요한 판별 기준이 된다. 최근 돼지고기의 가격이 급등하고 있기 때문에 육질이 우수한 돼지를 선발하고 육종 및 생산함으로써 품질이 향상된 고급육의 개발이 중요하다. 따라서 본 발명의 DNA 표지인자를 이용하면 육질이 향상된 개체를 조기에 진단하고 선별하여 육질이 향상된 고급육을 손쉽게 선별할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 6과 서열번호 7로 표시된 올리고뉴클레오티드로 구성되는, 돼지 PPARGC1A 유전자의 육질 증가 여부 관련 SNP를 탐색하기 위한 프라이머를 제공한다. 본 발명의 실시예에서는 Genebank (accession no. AB106108)에 등록된 유전자 서열에 기초하여 본 발명의 PPARGC1A 유전자에 존재하는 SNP를 탐색할 수 있는 프라이머를 제작하였다. 본 발명의 프라이머는 종래 밝혀지지 않은 SNP를 포함하는 유전자 단편을 증폭하기 위한 것으로, 돼지 PPARGC1A 유전자 서열 중 특정 부위(서열번호 1에서 220번째 염기)에서 SNP를 포함하는 유전자 단편을 제조할 수 있게 해준다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머와 PCR 반응혼합물 및 RFLP 분석용 제한효소인 PshAI을 포함하는 돼지의 육질 증가 여부 관련 SNP 분석용 키트를 제공한다. 본 발명의 SNP 분석용 키트는 PCR-RFLP 기법을 이용하는 것으로, PPARGC1A 유전자의 발현 조절 즉, 육질 특성에 관여하는 유전자의 다양한 발현을 분석하기 위하여 특정한 제한효소인 PshAI을 포함한다. 이러한 특정 제한효소는 본 발명자들이 육질 특성의 변화를 일으키는 SNP를 밝혀내고 이 SNP에 기초하여 선택된 것이다. 따라서 본 발명의 SNP를 탐색하기 위한 키트는 상기 구성요소를 반드시 포함하여야 한다.

본 발명의 실시예에서는 구체적으로, 본 발명의 상기 SNP 부위를 인식할 수 있는 제한효소인 PshAI의 처리에 따라서 다르게 나타나는 밴드 패턴을 파악하여 유전자형을 구분하였다. 예를 들어, 서열번호 6와 서열번호 7의 프라이머로 증폭하였을 경우 유전자형은 AA, AG, GG로 나타나며, A allele는 943 bp의 밴드가, G allele는 597 bp, 346 bp의 밴드가 나타남을 확인하였다 (도 2 참조).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 돼지의 육질 증가 여부를 확인하는 방법을 제공한다:

a) 돼지로부터 게노믹 DNA를 분리하는 단계;

b) 상기 a)단계의 DNA를 주형으로 하여 서열번호 1로 표시된 PPARGC1A 유전자 upstream 영역의 220번째 염기를 포함하는 특정부위를 증폭시키는 단계;

c) 상기 b)단계에서 증폭된 DNA를 제한효소 PshAI로 처리하는 단계; 및

d) 상기 c)단계에서 얻어진 유전자 단편들에서 다형성(RFLP; restriction fragment length polymorphism)을 비교하는 단계.

본 발명의 방법에서, 상기 b)단계에서 서열번호 6과 서열번호 7로 표시된 프라이머를 이용하여 증폭시키는 것을 특징으로 한다. 상기 b)단계의 DNA 증폭은 PPARGC1A 유전자 upstream 영역의 220번째 염기인 SNP가 포함된 특정부위를 증폭시킬 수 있는 어떤 프라이머일 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 6와 서열번호 7로 표시된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머를 이용하여 증폭시킬 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 유전자 단편들의 다형성은 상기 SNP 부위를 인식할 수 있는 어떠한 제한효소로 처리하는 것이 가능하나, 바람직하게는 제한효소 PshAI으로 처리하는 것이 적당하다. 본 발명은 상기 SNP 부위 인식에서 표지유전자를 한 번의 PCR 반응과 효소처리로서 탐색하고 진단해 낼 수 있는 가장 효율적인 방법의 하나로 PCR-RFLP 방법을 이용한 탐색기법을 개발하였다. 구체적으로, 본 발명의 상기 SNP 부위를 인식할 수 있는 제한효소인 PshAI의 처리에 따라 다르게 나타나는 밴드 패턴을 파악하여 유전자형을 구분하였다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 PPARGC1A 유전자 upstream 영역의 SNP는 돼지의 육질 특성인 pH 및 유리육즙의 형성에 영향을 미치는 것으로 판단할 수 있다. 따라서 본 발명의 유전적 변이(SNP)는 돼지의 육질 특성과 관련한 기능을 가지며, 이러한 특성을 통해서 육질 개량과 관련한 DNA 마커로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a와 1b는 근세포 조성에 관여하는 것으로 알려진 돼지 PPARGC1A 유전자의 5' upstream 영역을 염기서열 분석한 결과이다. 220번째 염기가 새로이 발견한 단일염기변이부위(SNP)이다.
도 2는 본 발명에 따른 프라이머를 이용하여 PCR-RFLP를 실시한 결과이다. PPARGC1A 유전자의 5' upstream 영역에서 발견된 SNP 중 PshAI 위치를 증폭시켜줄 수 있게 제작되었고, 제한효소 PshAI을 이용한 RFLP(restriction fragment length polymorphism) 방법에 의해 유전자형은 각각 AA, AG, GG 세 가지로 나타나며, A allele은 943bp, G allele은 597 bp, 346 bp로 band가 관찰되었다.
도 3은 본 발명에 따른 DNA 표지인자의 일예로서, 본 발명에 따른 프라이머를 이용한 PCR-RFLP 분석에 사용된 DNA 단편을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 돼지 PPARGC1A 유전자 5' upstream 영역 탐색

돼지 PPARGC1A 유전자의 5' upstream 영역을 포함하고 있는 BAC clone을 Korean native pig bacterial artificial chromosome (BAC) library (Jeon et al., 2003. Mol Cells. 16:113-116)로부터 PCR 스크리닝 방법을 통해 확보하였다. PCR 스크리닝을 실시하기 위해, 기존에 알려진 돼지 PPARGC1A 유전자의 cDNA 염기서열(AB106108, http://www.ncbi.nlm.nig.Gov/BLAST)을 토대로 exon1 영역의 서열을 PCR 할 수 있는 특이 프라이머로서 Forward primer(5'-CCT GCA TGA GTG TGT GCT CT-3', 20mer; 서열번호 2)와 Reverse primer(5'-TAC TTT GCT GCC TCC TCT CC-3', 20mer; 서열번호 3)를 제작하였다. 이러한 방법을 통해 5' promoter 영역과 함께 각각 exon1 ~ exon8 영역과 exon1 영역을 포함하고 있는 2개의 positive BAC clone 233H2와 689A10을 선발하였다. 선발된 BAC clone에 대해서 ABI PRISMBigDyeTM Terminator Cyle Sequencing Kit (AppliedBiosystems, USA)와 ABI PRISM3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 염기서열 분석을 실시하였다. 염기서열을 심층 분석하기 위해 Phred / Phrap / Consed package를 사용하였고, 최종 서열비교는 Seqman program (DNASTAR, USA)을 사용하였으며, 이를 통해서 최종적으로 돼지 PPARGC1A 유전자의 5' upstream 영역에 대한 3 kb의 염기서열을 확보하였다 (서열번호 1).

실시예 2. 5' upstream 영역에 대한 염기서열 분석 및 변이 탐색

실시예 1에서 선발된 BAC clone에 대한 염기서열 분석을 통해 확보된 돼지 PPARGC1A 유전자의 5' upstream 영역은 번역개시 코돈(codon)으로부터 5' upstream 방향으로 3113 bp (서열번호 1)이다. 이 기초 염기서열을 바탕으로 돼지 6개 품종(Yorkshire, Landrace, Meishan, Duroc, Berkshire, Gminiature pig)에 대해 각각 15두씩, 총 90두의 실험군에 대한 직접염기서열분석을 실시하였다. 특이 제작된 Forward primer( 5'-CTG TCA TTC CCC CAA ATT GT-3', 20mer; 서열번호 4)와 Reverse primer: 5'-CTA TGT CGT GGC GGT TTT CT-3', 20mer; 서열번호 5)로 구성된 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 통해 만들어진 699 bp길이의 앰플리콘(amplicon)에 대해 염기서열을 분석함으로써, 본 발명자들은 돼지 PPARGC1A 유전자의 5' upstream에 대한 염기서열을 밝혔으며, 염기서열 분석결과를 품종별로 비교(alignment)하여 돼지 품종내 및 품종별 변이를 탐색하여 단일염기서열변이(SNP)를 발견하였다. 서열번호 1로 표시되는 돼지 PPARGC1A 유전자의 5' upstream 영역에서 220번째 A 염기가 G 염기로 치환된 SNP임을 확인하였다 (도 1a와 1b).

실시예 3. 돼지의 genomic DNA 추출

본 실험을 위해서 실험축군(resource population)으로 선정된 경기도 안성시 소재 (주)다비육종의 Duroc, Landrace, Yorkshire 품종으로 구성된 총 252두를 대상으로 genomic DNA를 추출했다. 실험군 돼지의 경정맥으로부터 혈액을 채취하여, DNA 추출에 이용하였다.

상기 유전자 다형성 분석을 위한 genomic DNA의 분리는 Sambrook 등 (1989)의 방법에 준하여 실시하였다. 돼지의 경정맥에서 10 ml의 혈액을 채취한 후, 응고를 방지하기 위해서 ACD 용액 (citric acid 0.48 g, sodium citrate 1.32 g, glucose 1.47 g to H₂O 100 ml) 2 ml을 첨가하여 4℃ 유지하여 실험실까지 운반하였다. 50 ml 원심분리용 튜브에 옮긴 후 1,300 g에서 15분간 원심분리하여 buffy coat을 모아 15 ml의 DNA extraction buffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.0; 0.1 M EDTA, pH 8.0; 0.5% SDS; 20% μg/ml)를 넣고 잘 섞은 후 37℃ 항온수조에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 Proteinase K (200 μg/ml, BRL)를 혼합하여 37℃ 항온수조에서 12시간 동안 반응시켰다. 여기에 동량의 0.5M Tris-Cl (pH 8.0)으로 준비된 페놀(Phenol)에 넣고 30분 동안 섞어 추출한 후 실온에서 15분간 5,000 g로 원심분리하여 층이 생기도록 하였다. 이 과정을 3번 반복한 후, 직경이 0.3 cm 되는 피펫(pippet)으로 상징액을 취하여 50 ml Tris-Cl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0) 4L에서 18시간 동안 4℃에서 투석하여 chromosomal DNA를 분리하였다. 분리된 DNA 순도는 spectrophotometer (Beckman, USA)를 이용하여 흡광도 A₂₆₀과 A₂₈₀의 비율로 측정하였으며, 0.8% 아가로즈 겔 전기영동을 시행하여 DNA의 분자량을 확인하였다.

실시예 4. PCR-RFLP 분석

돼지 PPARGC1A 유전자의 5' upstream 영역에서 발견한 단일염기변이에 대해 보다 효율적인 유전자형 분석을 위해, PCR 및 restriction fragment length polymorphism (RFLP) 기법을 이용한 유전자형 진단기법을 개발하였다. 돼지 genome내에서 실시예 2에서 발견한 염기서열변이위치를 인식하는 제한효소 PshAI을 Restriction mapper software program (http://www.restrictionmapper.org/)이용하여 탐색하였다. 그렇게 찾아낸 제한효소인 PshAI의 처리에 따라서 다르게 나타나는 밴드(band) 형태를 파악하여 유전자형을 구분할 수 있었다.

실시예 2에서 염기서열분석용 프라이머(서열번호 4, 5)를 이용한 PCR 산물에서 본 발명의 염기서열변이가 한쪽 끝부분에 위치하고 있으므로, PCR 반응시 제한효소 PshAI을 이용한 RFLP 기법에 효율적인 적용을 위해 Forward primer(5'-TGG AAC ATT ATG GGC ACT CA-3', 20mer; 서열번호 6)와 Reverse primer(5'-AAC CTG TTT GCT CTA TGT CGT G-3', 22mer; 서열번호 7)로 구성된 특이 프라이머 쌍을 신규하게 제작하였다. 유전자형 분석을 위한 PCR을 위해 프라이머는 각 1 μl (5 pmol/μl)씩 첨가하였고, 그 외의 반응 첨가물은 10×PCR buffer(100 mM Tris-Cl; pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM Mg₂Cl) 2 μl, 10×dNTP mix(each 25 mM) 2 μl, Taq DNA polymerase(5 unit/μl; Intron bio.) 0.2 μl과 ddH₂O 12.8 μl, Template DNA 1 μl(약 100 ng)을 반응시켰다. PCR 반응조건은 94℃에서 10분간 pre-denaturation한 후, 94℃에서 1분간 denaturation, 61℃에서 1분간 annealing, 72℃에서 1분간 extension을 한 cycle로 하여 35 cycle을 반복한 후, 마지막으로 72℃에서 10분으로 PCR 반응을 종료하였다.

이렇게 확보된 PPARGC1A 유전자의 PCR product(943 bp; 서열번호 8)를 restriction mapper software program을 이용해서 찾아낸 PshAI 제한효소로 처리하였다. PshAI enzyme 처리 첨가물은 PshAI enzyme 0.4 μl(2.5 unit/μl, NEB(New England BioLabs)), 10×Enzyme buffer 1μl, 10×BSA 1μl, ddH₂O 2.6μl, PCR product 5 μl로 총 volume이 10 μl였다. 이 혼합물을 37℃ 인큐베이터에서 약 5시간 동안 반응시키고, 2% 아가로즈 겔에 100V로 30분 동안 전기영동(electrophoresis) 하여 그 밴드 패턴을 확인하였다 (도 2). 제한 부위(restriction site)의 유전자형은 소화되지 않은(undigested) 대립유전자는 A allele, 소화된(digested) 대립유전자는 G allele로 나타내었다.

도 2는 PPARGC1A 유전자의 5' upstream 영역에 위치한 PshAI site에 대한 PCR-RFLP 판단을 나타낸다. 사이즈 마커는 1kb plus ladder size marker (invitrogen, USA)를 이용하였다. AA 유전자형의 경우 943 bp의 밴드가 나타나고, GG 유전자형의 경우 943 bp가 절단되어 597 bp와 346 bp의 단편이 만들어진다. 또한 이형접합체(AG)의 경우 943 bp와 597 bp, 346 bp의 단편이 모두 나타난다.

전체 252두에 대한 유전자형 및 유전자 빈도는 하기 표 2와 같다. 유전자형(Genotypes)은 AG 유전자형과 GG 유전자형을 가진 개체가 높았으며, 유전자 빈도(Gene)는 G allele가 높은 빈도로 분포하였다.

실시예 5. 표지유전자형 별 근섬유조성 및 육질차이 확인

1) 근섬유특성 분석

근섬유특성 분석을 위하여, 사후 45분이 지난 8번 흉추의 등심근의 근육샘플을 수집하였고, 0.5-×0.5-×1.0-cm의 조각으로 자르고, 액체질소로 재빠르게 얼리고, 분석 전까지는 -80℃에서 보관되었다. 횡단부분(10 μm thick)은 20℃상에서 크라이오스태트(cryostat; CM1850, Leica, Germany) 기계로 준비되었고, 근섬유형 식별 분석을 위해 타입 I, IIa와 IIb 섬유를 프리인큐베이션(acid preincubation, pH 4.35)을 처리한 액토미오신(actomyosin) ATPase 방법으로 염색하여 분류하였다. 모든 샘플은 CCD 카메라(charge-coupled device color camera; IK-642K, Toshiba, Japan)와 이미지 분석 시스템(the image analysis system; Image-Pro Plus, Media Cybernetics, USA) 장치를 이용하여 근섬유 특성이 분석되었다.

2) 육질 분석

근육의 pH는 사후 45분에 스피어-형 전극(spear-type electrode)의 사용으로 등뼈 13번/14번 부분에서 측정되었다. 육색(Lightness)은 색도계(chromameter; CR-300, Minolta Camera Co., Japan)를 사용하여 등심근의 사후 45분경에 측정하였다. 유리육즙량(drip loss)은 2℃에서 48시간 동안 플라스틱 백에서 표면에 있는 근육 샘플의 양의 차이를 측정하는 방법으로 분석되었다 (Honikel, K. O. (1987). Martinus Nijhoff, In P. V. Tarrant, G. Eikelenboom, & G. Monin (Eds.): 129142). 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

3) 유전자형과 형질과의 연관성 분석

도 2에서 보는 바와 같이, AA, AG, GG의 세 가지 유전자형을 확인할 수 있으며, 전체 252마리 공시돈에 대해 근섬유특성 및 육질형질과의 연관성 분석을 실시하였다. 전체 252마리의 분석 결과 중에서 유전자형이 AA인 개체는 8마리밖에 관찰되지 않아서 분석대상에서 제외하였고, AG와 GG 유전자형을 비교 분석하였다. 통계분석 프로그램으로는 SAS 9.13 package에서 제공되는 MIXED model procedure를 이용하였다. 이 모델에서 품종, 성별, 도축차수는 고정효과로, 모돈효과는 임의효과로, 도체중은 공분산효과로 분석되었다. 분석결과는 최소제곱평균(Least Squares Means)과 표준오차로 나타냈으며 이를 통해 유의차를 평가하고 연관성을 분석하였다.

하기 표 3은 돼지에서 PPARGC1A 유전자의 SNP와 근섬유 특성 및 육질 특성 간의 연관성을 분석한 결과이다.

표 3의 결과에서, 유전자형에 따른 각 개체들에서 총 섬유수(total fibers number)는 차이가 없었다. GG 유전자형은 근섬유단면적(Mean CSA of fibers)이 크게 나타났고 (P < 0.01), 근섬유 밀도(the density of total fibers)는 작게 나타났다 (P < 0.05). 근섬유 수 조성(fibers number composition)은 GG 유전자형에서 근섬유 타입 I이 높게 나타났고 (P < 0.05), 근섬유 타입 II는 낮게 나타났다(P < 0.05).

또한 육질 특성에서 GG 유전자형은 AG 유전자형에 비해 육질의 가장 중요한 특성인 pH_45min(P < 0.05)는 높고, Drip loss(P < 0.05)는 낮게 나타냄으로써 향상된 육질을 갖는 우수한 개체로 판단할 수 있었다. 이상육(PSE 돈육) 발생빈도에서도 GG 유전자형이 10.4％로 AG 유전자형(31.0％)에 비해 낮게 나타났다.

기존 연구에 따르면, 근섬유 타입 I의 경우는 느린 산화작용(slow- oxidative)의 성질을 띠어 사후 대사속도를 지연시켜 함량이 높을 경우 육질에 긍정적인 영향을 미치게 되며, 이와는 반대로 타입 IIb의 경우는 빠른 당분해(fast- glycolytic)의 성질을 갖게 되어 빠른 사후 대사속도로 인해 함량이 많을 경우 돈육질이 육색이 창백하고 조직이 흐물거리며 육즙이 많이 나오는(pale, soft, exudative; PSE) 이상육으로 판정될 가능성이 높아진다고 (Klont, R. E. et al. 1998. Meat Science 49: S219-S229) 보고된 바 있다. 본 발명에서도 근섬유 타입 I의 비율이 높게 나타나고 타입 IIb가 적게 나타난 GG 유전자형이 AG유전자형에 비해 육질이 우수하고 이상육 발생빈도도 낮게 나타남을 확인할 수 있었다.

따라서 근섬유 조성에 관여하는 것으로 알려진 PPARGC1A 유전자의 5’upstream 영역 PshAI site의 SNP (서열번호 1의 220번째에서 A염기가 G염기로 치환)는 근섬유 조성에 영향을 미치게 되며, 최종적으로 돼지의 육질을 향상시킬 수 있는 선발 지표로서 활용될 수 있음이 확인되었다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 염기서열에서, 220번째 G 염기를 포함하는 15 내지 1000개의 연속서열로 구성되는 돼지의 육질 증가 여부 확인용 DNA 표지인자.
제 1항에 있어서, 상기 DNA 표지인자는 돼지의 육질 관련 형질인 pH를 향상시키고 유리육즙(drip loss)은 감소시킴으로써 육질을 증가시키는 것을 특징으로 하는 DNA 표지인자.
서열번호 6과 서열번호 7로 표시된 올리고뉴클레오티드로 각각 구성되는, 돼지 PPARGC1A 유전자의 육질 증가 여부 관련 SNP를 탐색하기 위한 프라이머 쌍.
제 3항의 프라이머 쌍과 PCR 반응혼합물 및 RFLP 분석용 제한효소인 PshAI을 포함하는 돼지의 육질 증가 여부 관련 SNP 분석용 키트.
하기 단계들을 포함하는, 돼지의 육질 증가 여부를 확인하는 방법:
a) 돼지로부터 게노믹 DNA를 분리하는 단계;
b) 상기 a)단계의 DNA를 주형으로 하여 서열번호 1로 표시된 PPARGC1A 유전자 upstream 영역의 220번째 염기를 포함하는 특정부위를 증폭시키는 단계;
c) 상기 b)단계에서 증폭된 DNA를 제한효소 PshAI로 처리하는 단계; 및
d) 상기 c)단계에서 얻어진 유전자 단편들에서 다형성(RFLP; restriction fragment length polymorphism)을 비교하는 단계.
제 5항에 있어서, 상기 b)단계에서 서열번호 6과 서열번호 7로 각각 표시된 프라이머 쌍을 이용하여 증폭시키는 것을 특징으로 하는 방법.