WO2014021404A1 - エタノールアミンリン酸の利用 - Google Patents

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cell
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    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns

Definitions

  • This specification relates to the use of ethanolamine phosphate.
  • EP Ethanolamine phosphate
  • Ethanolamine phosphate is widely present in animal biological membranes and the like together with ethanolamine and phosphoglycerol ethanolamine.
  • EP is known to be a phospholipid precursor essential to cells such as phosphatidylcholine (lecithin), which is a major component of cell membranes, and phosphatidylethanolamine, which is abundant in nerve tissue.
  • EP and ethanolamine can be added to a medium as an enhancer of cell growth factor (Patent Documents 1, 2, and 3).
  • EP is also an active ingredient that enhances acetaldehyde dehydrogenase activity, and is also known to be useful for liver diseases such as hangover and intestinal mucosal disorders (Patent Documents 4, 5, and 6).
  • it has been reported that it may be a biomarker for depression.
  • JP-A-6-78759 Japanese National Patent Publication No. 4-501660 JP 2000-506374 A Japanese Patent Laid-Open No. 2002-104961 JP-A-8-310994 International Publication No. 99/39703
  • EP has various actions as described above.
  • the present specification provides new uses for EP.
  • not all the effects of EP have been clarified yet. It is not known at all what gene expression is promoted or suppressed when EP acts on cells. Elucidation of genes related to expression of action by EP enables searching for useful functions of EP, provision of new EP applications, and search for compounds that enhance EP action or act like EP on cells It becomes.
  • the present inventor has made various studies focusing on the action of EP on cells. As a result, the inventors have found that EP has a new function that has not existed in the past and that it can provide a new application based on the function. In addition, the inventor has clarified the expression level of genes related to the action of EP, and has further clarified the action of EP. The present specification provides the use of new EPs based on these findings.
  • the present inventors have discovered a new effect of EP on cells when EP is administered to cells, and analyzed genes whose expression by EP is promoted or suppressed. According to the gene expression analysis, it was confirmed that the expression of the specific gene group was promoted and the expression of the specific gene group was suppressed. Furthermore, a new action was found. The following means are provided based on these findings.
  • An animal cell function enhancer containing EP as an active ingredient (2) The animal cell function enhancer according to (1), which is a cell growth agent in the absence of serum and growth factors. (3) A cell proliferation agent of one or more animal cells selected from the group consisting of airway epithelial cells, lung fibroblasts, keratinous epithelial cells, and hair papilla cells, (1) or (2) The animal cell function enhancer described. (4) The animal cell function enhancer according to any one of (1) to (3), which is a cell proliferation agent that selectively proliferates normal cells over atypical cells. (5) The animal cell function enhancer according to (1), which is an epithelial cell barrier function promoter. (6) The animal cell function enhancer according to claim 1, which is an apoptosis inhibitor.
  • the animal cell function enhancer according to (1) which is an agent for producing a cultured cell structure.
  • a method for enhancing the function of an animal cell by contacting the animal cell with ethanolamine phosphate outside the animal body.
  • An inhibitor of inflammatory cytokine Caine comprising ethanolamine phosphate as an active ingredient.
  • An anti-inflammatory agent comprising ethanolamine phosphate as an active ingredient.
  • a composition for preventing or treating inflammatory diseases comprising ethanolamine phosphate as an active ingredient.
  • a first region in which a plurality of gene probes selected from the first gene group described in (5) are immobilized, and a plurality of configurations selected from the second gene group described in (5) A solid phase carrier for screening for a regulator of EP action, comprising a second region to which each gene is immobilized.
  • FIG. 6 shows cell proliferation / toxic effects by EP and its metabolic derivatives. It is a figure which shows the confirmation result of the cell growth inhibitory effect of a GABA receptor agonist. The left figure shows the results with GABA, and the right figure shows the results with homotaurine.
  • the present specification relates to an animal cell function enhancer comprising EP as an active ingredient, an animal cell function augmentation method using EP, and an agent or inhibitor screening method for animal cells.
  • EP is well known as a component of the cell membrane, but according to the present inventors, its action on cells is significantly different from the related compounds in the metabolic pathway, and it is effective by using EP.
  • the enhancement of the function of animal cells includes, for example, cell proliferation, suppression of apoptosis, improvement of barrier function, and the like.
  • This specification relates to the action on cells when EP is administered to the cells, and the promotion of expression and suppression of the expression of genes that cause the action.
  • the present inventor based on the knowledge about the new action of EP and the knowledge about the expression status of these genes, gene expression control by EP, EP-like compound, EP action enhancer, combination ingredients with EP, etc.
  • a solid phase carrier that can provide a screening method and is used for expression analysis of a gene related to the action of EP is also provided.
  • EP has various functions such as enhancement of the function of animal cells such as cell proliferation, suppression of apoptosis, and improvement of barrier function. It also has a hair-growing action. Furthermore, it has an inhibitory action, an anti-inflammatory action and an antioxidant action of inflammatory cytokines.
  • Animal cell function enhancer can be used as an active ingredient of an animal cell function enhancer.
  • EP may also be in the form of phosphate ions that form salts with monovalent metal ions such as sodium and potassium, divalent metal ions such as calcium and magnesium, etc. in the phosphate group.
  • Animal cells include, but are not limited to, human and non-human animal cells.
  • the type of cell is not particularly limited. Animal cells may be primary or established. Moreover, although origin is not specifically limited, the cell derived from a lung, an airway, and epidermis is mentioned.
  • the cell form may be an epithelial cell or a connective tissue cell such as a fibroblast.
  • the animal cell may be an ES cell, a universal cell (iPS cell) artificially derived from a somatic cell, or a cell differentiated from such a cell.
  • the animal cell may constitute a tissue or organ or a part thereof.
  • airway epithelial cells airway epithelial cells, lung fibroblasts, keratinous epithelial cells, and dermal papilla cells are preferred as cell proliferation targets by EP.
  • These cells may be primary cells or established cells.
  • the animal cell can be an animal cell collected from an animal individual.
  • EP is effective for animal cells, particularly mammalian cells including humans. Moreover, based on the action of such EP, EP itself is not only for external use but also for administration via vascular such as blood vessels, oral administration, administration by injection or injection, and various kinds of animal cells in various administration forms. It exhibits an action.
  • Cell proliferation function One function of animal cells enhanced by the cell function enhancer is a cell proliferation function.
  • One feature of the cell growth function of EP is that cell growth in the presence of growth factors such as serum or various growth factors, as well as EP ensures the growth of animal cells even in the absence of serum and growth factors. Can be mentioned. In other words, the growth of animal cells can be ensured by adding EP to a basic medium containing only a carbon source such as sugar and an inorganic salt. These effects cannot be obtained with ethanolamine, phosphorylcholine, CDP-choline, triethanolamine and diethanolamine, which are analogs of the metabolic pathway of EP.
  • serum is not particularly limited as long as it is derived from animal blood, but typically, blood from various animals such as bovine fetuses, newborn cattle, calves and adult cattle, goats, chickens and pigs. Serum derived from it.
  • the growth factor is not particularly limited, and examples thereof include endogenous proteins that can be used for known cell growth.
  • epidermal growth factor EGF
  • insulin-like growth factor IGF
  • TGF transforming growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • BDNF brain-derived nerve growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • PDGF platelet derived growth factor
  • EPO erythropoietin
  • TPO thrombopoietin
  • HGF hepatocyte growth factor
  • Another feature of the cell function enhancer is that it selectively promotes the proliferation of normal cells over deformed cells. By selectively exerting a proliferative function on normal cells over abnormal cells such as cancer cells, especially when applied to living bodies, there is no adverse effect based on the promotion of proliferation of abnormal cells and normal cells are proliferated. It is meaningful in treating diseases (for example, various cancers and diseases requiring wound healing) that have great therapeutic and prophylactic significance.
  • an atypical cell means a cell separated from the cell morphology normally observed in normal cells. Typically, when a test cell is observed using an optical microscope, it means a cell whose morphology is separated from normal.
  • normal cells differ depending on the type of cells, but can be determined by evaluation based on, for example, the size of the nucleus.
  • the distance from the normal cell which an atypical cell has also changes with cell types typically, a cancer cell etc. are mentioned.
  • EP When EP is used as a cell proliferating agent, it may be added within the range in which the cell proliferating function is exhibited.
  • the medium is in the range of 100 nM to 10 mM, preferably 1 ⁇ M to 1 mM, more preferably 10 ⁇ M to 1 mM. Etc.
  • An epithelial cell is a cell constituting a tissue that achieves a barrier function from a living body, and an epithelial cell means a cell that exhibits a barrier function as an epithelial cell by differentiation.
  • an epithelial cell By enhancing the barrier function of epithelial cells, epithelial cells and tissues that can suppress entry of harmful substances and allergens can be produced.
  • EP since EP also has a cell proliferation function of epithelial cells, such a tissue or cell population can be effectively constructed.
  • EP is used as a barrier function promoter, it is not particularly limited as long as the barrier function can be promoted.
  • EP can be contained in a medium or the like at the same concentration as when EP is used as a cell growth agent.
  • the barrier function in the present specification means an invasion prevention mechanism against the invasion of non-specific polymers and stimulating low molecules from the outside world.
  • the living body epithelium forms a structure for tight coupling called a tight junction between epithelial cells to suppress the movement of molecules between adjacent cells (cell gaps).
  • the barrier function in the present specification more specifically means an action of promoting the suppression of the entry of foreign matter, in other words, an action of improving the strength of tight junctions.
  • Such a barrier function that is, the strength of the tight junction, is evaluated by transepithelial electrical resistance (TRT) above and below the cell sheet.
  • TRT transepithelial electrical resistance
  • the increase in the strength of the tight junction is evaluated by the decrease in the permeation rate between cell sheets of a polymer such as dextran.
  • Apoptosis suppression function Another function of animal cells enhanced by the cell function enhancer is an apoptosis inhibitory function. By exhibiting an apoptosis inhibitory function, cell proliferation and functions can be exhibited.
  • EP is responsible for the proliferation function of normal cells, it can be said that the apoptosis suppression function is the apoptosis suppression function of normal cells.
  • EP can be contained in a medium or the like at a concentration similar to that used as a cell growth agent.
  • EP has the function of proliferating cells of fibroblasts in addition to epithelial cells, and has the function of promoting barrier function. Therefore, EP can proliferate epithelial cells, fibroblasts, and these two cells. It is useful as a preparation agent for various cultured cell structures formed in the above manner. For example, various forms of cultured cell structures including cell sheets serving as skin substitutes can be mentioned.
  • the form of the cultured cell structure is not particularly limited.
  • the form of the cell structure is not particularly limited, and is appropriately selected according to the use of the cell structure and the tissue or organ form to be applied. Examples thereof include a sheet shape, a rod shape, a tubular shape, and a spherical shape.
  • EP can be used as a preparation agent for cultured cell structures by containing an effective amount of EP in a medium for culturing cultured cell structures. .
  • it is not particularly limited as long as it can promote cell growth function and barrier function.
  • EP is included in the medium or the like at the same concentration as that used for cell growth agent. be able to.
  • EP can also be used as a hair growth agent.
  • EP has a proliferative effect on dermal papilla cells.
  • the proliferation of dermal papilla cells means the effect of hair growth. Therefore, the external hair growth agent applied to various skin containing scalp etc. which contains EP as an active ingredient is provided.
  • the form as a hair growth agent is not specifically limited,
  • the form of the external preparation applied to a well-known scalp and skin is employable.
  • lotion, cream, essence, shampoo, rinse and the like can be mentioned.
  • EP should just be contained in the range with the hair growth effect
  • the usage and dosage as an external preparation are not particularly limited, but for example, it can be used from 1 to 3 times / day for external use.
  • EP has an action to enhance its function on animal cells, it is a reagent for evaluating the action of the test compound on the cells by contacting the animal cell with the test compound in the presence of EP. Can be used. Since the action of the test compound can be evaluated with the cell function enhanced, more effective evaluation and screening are possible. The evaluation of action varies depending on the type of cell, the type of test compound, and the type of action, but those skilled in the art can appropriately set according to the purpose of the evaluation. Further, when EP is used as a reagent for evaluation or screening of a test compound, it is not particularly limited as long as EP is a concentration that enhances the function of the cell, such as a cell proliferation function and a barrier function. Can be contained in the medium or the like at the same concentration as that used for the cell growth agent.
  • the method for enhancing the function of an animal cell disclosed in the present specification is a method for enhancing the function of the animal cell by bringing the animal cell and EP into contact outside the body of the animal.
  • EP can enhance cell function. Outside the body of the animal, the animal individual can bring the animal cell from the self or other family into contact with the EP to effectively proliferate the animal cell, promote the barrier function, and suppress apoptosis. Therefore, this method is useful for growing cells when the cells are used for various uses (fermentation, medical treatment (including prosthesis and transplantation), drugs).
  • transplantation medical treatment such as collecting from an individual, proliferating as a cell with enhanced function using EP outside the body, and transplanting the cell into the individual again.
  • This method can also be carried out as a method for growing animal cells, a method for producing animal cells having an excellent barrier function, and a method for producing animal cells having an excellent apoptosis inhibiting function.
  • This method can also be carried out as a method for promoting hair in humans and non-human animals.
  • this method can also be implemented as a method for improving the barrier function of animal cells and a method for suppressing apoptosis of animal cells.
  • the screening method disclosed in the present specification is a method for screening an agent against animal cells, and the step of contacting the animal cells with a test compound in the presence of EP to measure the action on the animal cells.
  • a test compound in the presence of EP can be provided.
  • EP enhances the function of animal cells.
  • the test compound is not particularly limited, and examples thereof include polypeptides, nucleic acids such as DNA and RNA, lipids, other various organic compounds, and inorganic compounds including various inorganic salts such as metal salts.
  • EP can usually be included in the culture medium of animal cells. Test compounds can also typically be supplied to animal cell media temporarily, continuously, or intermittently.
  • concentration of EP with respect to the cells is not particularly limited, but can be appropriately set according to the purpose of screening. For example, EP can be contained in the medium or the like at the same concentration as that used for the cell growth agent.
  • the action of the test compound on animal cells is not particularly limited. It includes both the action of enhancing and reducing the various functions of cells. Those skilled in the art can appropriately set the method for measuring such an action according to the purpose of screening.
  • the gene expression method disclosed in the present specification promotes the expression of one or two or more genes selected from the first gene group by administering EP to animal cells.
  • a step of suppressing the expression of one or more selected genes can be provided.
  • the expression status of a specific gene can be established for an animal cell by administering EP to the animal cell.
  • the expression status of this gene is involved in enhancing the function of animal cells. Therefore, the present expression method is also a method for producing animal cells exhibiting such gene expression status.
  • Animal cells are as described above.
  • the method for administering EP to animal cells is not particularly limited. What is necessary is just to make it an animal cell contact EP.
  • a typical example is an embodiment in which animal cells are cultured in a medium containing EP.
  • the gene whose expression is increased by administration of EP has a gene function (GO: 0001568, 0048514, 0001944) involved in angiogenesis and differentiation as related to cell proliferation.
  • genes whose expression is decreased by administration of EP are gene functions related to cell death and apoptosis (GO: 0042981, 0043067, 0043070, 0010941, 0006917, 0012502, 0012503, 0043065, 0043068, 0043071, 0010942, 0006915) existed.
  • Table 9 shows genes (29 probes, 20 genes) as functional molecules (GO: 0001944) among the functional molecules obtained by GO analysis shown in Table 7. Further, according to GO analysis, genes (16 probes) that are not included in the top 20 but satisfy the expression increase of 1.5 times or more (p ⁇ 0.05) among the genes involved in cell proliferation (GO: 0008283). , 12 genes) are shown in Table 10.
  • the first gene group consists of genes whose expression is promoted by administering EP to animal cells. Examples of such genes include those shown in Table 9, Table 10, and Table 14. These genes are thought to be related to the expression of unique effects by EP.
  • the first gene group preferably consists of the gene groups shown in Table 9. Further, it preferably comprises the genes shown in Table 14.
  • the second gene group consists of genes whose expression is suppressed by administering EP to animal cells. Examples of such genes include those shown in Tables 11 to 13 and Table 15. These genes are thought to be related to the expression of unique effects by EP.
  • the second gene group preferably consists of the genes shown in Tables 11-13.
  • the second gene group preferably consists of the genes shown in Table 15.
  • an expression analysis method using an array provided with probes for normal human whole genome genes may be used, or expression analysis targeting a specific gene may be performed.
  • Arrays and necessary reagents are commercially available, and comprehensive gene expression analysis and expression analysis on specific genes are well-known techniques and can be appropriately performed by those skilled in the art.
  • Solid phase carrier for gene expression evaluation by EP Confirmation of the expression status of a specific gene in an animal cell by administration of EP is preferably performed by first immobilizing one or more probes for detecting one or more genes selected from the first gene group.
  • a solid phase carrier comprising: a region; and a second region on which one or more probes for detecting one or more genes selected from the second gene group are immobilized. preferable.
  • the gene detection probe belonging to the first gene group and the gene detection probe belonging to the second gene group are held at different positions on the carrier. It has become easier.
  • the solid phase alone to which such a probe is immobilized may be one in which a solid phase carrier is immersed in a solution containing so-called sample DNA to perform hybridization between the probe and the sample DNA.
  • a sample carrier and a probe may be hybridized by spreading on a phase carrier.
  • the material for the solid phase carrier is appropriately selected, and the arrangement for fixing the probe is also appropriately selected.
  • detection of the hybridized product not only a fluorescent dye but also a label that can be visually recognized can be used.
  • a hybridization technique of a DNA sample derived from RNA or DNA extracted from a cell or the like and a probe for detecting a specific gene is well known to those skilled in the art.
  • a solid phase carrier can be prepared to detect the genes specified in the group and the second gene group.
  • this type of solid phase carrier includes a solid phase carrier for screening for a regulator of EP action, a method for evaluating the reactivity of animal cells to EP, an EP-like compound, It can also be used for screening methods.
  • the expression of a specific gene group can be promoted and / or suppressed by administering EP to animal cells.
  • animals cells of such expression By obtaining animal cells of such expression, cells with enhanced cell function can be created and used to develop further functions and uses of such cells.
  • EP is administered to animal cells (somatic cells, etc.), ES cells, and iPS cells that are autologous cells derived from a specific animal individual to enhance the function of animal cells (improvement of barrier function, suppression of apoptosis). Alternatively, it may be a proliferating cell for cell proliferation and transplanting it into the home. You may differentiate as needed. Note that such cells, particularly somatic cells and differentiated cells, may be cell structures in a specific three-dimensional form (sheets, tubular bodies, etc.). The transplant site is appropriately determined according to the state of the animal individual, for example, a defective site or a damaged site. Autotransplantation includes various organs such as skin, cartilage, bone, nerve tissue, and liver. When cells are used for various uses (fermentation, medical treatment (including prosthesis and transplantation), drugs), they are useful for growing cells.
  • the method for evaluating the reactivity of an animal cell to EP comprises a step of administering EP to an animal cell, and one or more selected from the first gene group in the animal cell administered with EP Based on the expression level of the gene and / or the expression level of one or more genes selected from the second gene group, and the expression level of the one or more genes obtained in the step, And evaluating the reactivity of the animal cell to EP.
  • the reactivity of the EP with respect to the animal cell is evaluated, and the cell proliferation ability, barrier functionality, and suppression of apoptosis are effectively enhanced by EP administration.
  • Capable cells can be selected.
  • administration of EP to animal cells, first gene group and second gene group, and detection thereof the aspects already described in connection with this expression method can be applied to this method as they are.
  • a method for screening a compound that modulates the action of EP comprises a step of administering EP and one or more test compounds to an animal cell, and a method comprising: A step of measuring the expression level of one or more genes selected and / or the expression level of one or more genes selected from the second gene group, and one or more of the one or more obtained in the measurement step And a step of evaluating an inhibitory action or an enhancing action on the EP action of the one or more test compounds based on the expression level of the gene.
  • a compound that further enhances or suppresses the cell function enhancing action of EP can be screened.
  • a compound that can be used together with EP it is possible to provide a compound that can be used together with EP to further enhance cell function.
  • compounds that reduce the cell function enhancing action of EP can be identified, and such compounds can be avoided.
  • the aspects already described in relation to the present expression method can be applied to the present method as they are.
  • Test compounds include hormones, cytokines, and other low molecular weight organic compounds containing biological membrane components including lipids, as well as high molecular organic compounds such as peptides, proteins, saccharides, DNA, RNA, and complexes thereof. May be. It may be an inorganic compound containing various inorganic salts such as metal salts.
  • the method for administering the test compound and EP to animal cells is not particularly limited. Typically, animal cells are cultured in a medium containing a test compound and EP. The test compound can typically be supplied temporarily, continuously, or intermittently to the animal cell culture medium.
  • the number (ratio) of genes that have confirmed a certain level of increase in the expression of genes belonging to the first gene group, and the expression intensity of the gene that has confirmed the increase in expression can be mentioned.
  • the greater the ratio of genes and the intensity of gene expression the more positive the action of enhancing EP.
  • the lower the gene ratio and the intensity of gene expression the more positive the inhibitory action against the action of EP.
  • the number (ratio) of genes that confirmed a certain decrease in expression related to the genes belonging to the second gene group, and the low expression intensity of the genes that confirmed the decrease in expression can be mentioned.
  • the greater the gene ratio and the lower the expression intensity of the gene the more positive the enhancing effect on the action of EP.
  • the lower the gene ratio and the intensity of gene expression the more positive the inhibitory action against the action of EP.
  • the EP-like compound screening method disclosed herein comprises an expression product of one or more genes selected from the first gene group, a compound that promotes the expression of the gene, and One or more test compounds selected from the group consisting of a compound that suppressively acts on an expression product of one or more genes selected from the second gene group and a compound that suppresses the expression are expressed as animal cells Administering to Measuring one or more cell functions of the animal cells; Can be provided.
  • a test compound is selected from the group consisting of an expression product of a gene related to the action of EP, a compound that promotes its expression, a compound that suppresses the expression product, and a compound that suppresses the expression of the gene.
  • Examples of gene expression products include RNA and protein.
  • Examples of the expression promoting compound include a transcription factor and a compound that activates the transcription factor.
  • Examples of the compound that acts to suppress the expression product include siRNA that digests mRNA that is the expression product, and proteins that antagonize the protein that is the expression product.
  • Examples of gene expression-inhibiting compounds include siRNA and constructs for knockout. The administration method of such a compound is appropriately determined according to the type of the compound. For example, in the case of a protein, it is necessary to administer it as an expression construct of the protein to be introduced into a cell. In the case of siRNA, siRNA constructs may be introduced into cells, or siRNA itself may be introduced into cells. In the case of a compound that permeates the cell membrane of an animal such as a low molecular weight organic compound, it may be added to the medium.
  • Evaluation of cell function can be performed based on the function when EP is used as an animal cell function enhancer, which has already been described. That is, the evaluation of action varies depending on the type of cell, the type of test compound, and the type of action, but those skilled in the art can appropriately set according to the purpose of the evaluation.
  • EP can also be used as a cytokine inhibitor. Suppression of the expression of genes encoding cytokines and chemokines has been confirmed by administering EP to cells.
  • the cytokines and chemokines whose expression is reduced by EP administration are already shown in Table 15. These cytokines and chemokines are both inflammatory cytokines.
  • EP is an inhibitor of cytokines, more specifically inflammatory cytokines.
  • inflammatory cytokines examples include AREG, BMP7, CCL27, CSF1, CXCL14, GDF15, IL11, IL18, IL23A, IL31, IL4, IL5, TNFSF15, VEGFA, and the like.
  • EP can also be used as an anti-inflammatory agent. That is, EP can be used as a composition for preventing or treating inflammatory diseases caused by inflammatory reactions. As already described, EP suppresses the expression of genes encoding inflammatory cytokines and suppresses the induction of inflammatory cytokines IL-8 and TNF- ⁇ in animal cells given LPS stimulation (Singh et al. Depending on the method). The anti-inflammatory evaluation of these EPs is performed using human monocyte-like cultured cell THP-1, which is a cell line that has long been studied as a model cell for macrophages.
  • this cell line has also been useful in the determination of an allergen that is called h-CLAT (Toxicol In Vitro, 2006 Aug; 20 (5): 763-73).
  • Singh Chem. 2005 Dec; 51 (12): 2252-6) et al. Have shown that this cell line can be applied to anti-inflammatory compounds and foods that do not use individual animals.
  • Inflammatory diseases include, for example, multiple organs (eg, systemic lupus erythematosus (SLE) and scleroderma), specific tissues or organs (eg, musculoskeletal tissues (rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis)), Gastrointestinal tract (Crohn's disease and ulcerative colitis), central nervous system (Alzheimer's disease, multiple sclerosis, motor neuron disease, Parkinson's disease, and chronic fatigue syndrome), pancreatic ⁇ cells (insulin-dependent diabetes), adrenal gland (Addison) Disease), kidney (Goodpasture syndrome, IgA nephropathy, interstitial nephritis), exocrine glands (Sjogren's syndrome and autoimmune pancreatitis), and skin (psoriasis and atopic dermatitis) autoimmune diseases; chronic inflammation Sex diseases (e.g.
  • osteoarthritis periodontal disease, diabetic nephropathy, diabetic ulcer, retinopathy, chronic obstructive pulmonary disease, arteriosclerosis, graft-versus-host disease, Including inflammatory pelvic inflammatory diseases, endometriosis, chronic hepatitis, and tuberculosis); including IgE-mediated (type I) hypersensitivity (eg, rhinitis, asthma, anaphylaxis, dermatitis, and eye diseases) It can be used to treat, but not limited to, inflammatory diseases.
  • type I type I
  • hypersensitivity eg, rhinitis, asthma, anaphylaxis, dermatitis, and eye diseases
  • the pathologies of dermatitis include actinic keratosis, acne rosacea, acne vulgaris, allergic contact dermatitis, angioedema, atopic dermatitis, bullous pemphigoid, dermatological reaction, multiple Erythema erythema, lupus erythematosus, photodermatitis, psoriasis, psoriatic arthritis, scleroderma, and urticaria.
  • Ocular symptoms include age-related macular degeneration (ARMD), dry eye, uveitis, and glaucoma.
  • EP is used according to the present invention when another therapeutic agent selected from known anti-inflammatory agents, antibiotics, etc. used for inflammatory diseases is also administered or in combination with these therapeutic agents be able to.
  • Any appropriate administration route can be used for use as a composition for preventing or treating an inflammatory disease of EP.
  • any of the oral, topical, parenteral, intraocular, rectal, intravaginal, inhalation, buccal, sublingual, and intranasal delivery routes may be appropriate.
  • any suitable pharmaceutical composition can be used.
  • compositions containing the active ingredients are in forms suitable for oral use, such as tablets, troches, lozenges, aqueous or oil suspensions, dispersible powders or granules, emulsions, hard or soft capsules, or syrups Alternatively, it may be an elixir.
  • the composition may be in immediate release form or controlled release form.
  • compositions intended for oral use can be prepared according to any method known to those skilled in the art for the manufacture of pharmaceutical compositions, such compositions comprising sweeteners, flavoring agents, One or more substances selected from the group consisting of a colorant and a preservative may be included, and those skilled in the art can use them in appropriate combinations.
  • EP may be formulated as a suppository, or as a cream, ointment, jelly, solution, or suspension for topical use. Topical applications include mouth washes and gargles.
  • Effective doses of EP will vary depending on the individual being treated and the method of administration.
  • formulations intended for oral administration in humans can vary between about 1 to about 99% of the total amount of the composition.
  • dosage unit forms generally contain from about 1 mg to about 1 mg of active ingredient.
  • the dosage level of EP for any individual is determined by the individual's age, weight, general health, sex, diet time associated with administration, diet route, excretion rate, drug combination, and treatment. It will be appreciated that it depends on a variety of factors, including the severity of the particular disease received.
  • EP also increases the resistance of cells to oxidation. For this reason, EP can also be used as an antioxidant stress agent. That is, it can be used as a preventive or therapeutic agent for diseases caused by oxidation in a living body.
  • antioxidants such as thioredoxin (TXN) and hydrogen peroxide-degrading enzyme (CAT) was observed, and as described in the examples described later, It has been found to reduce toxicity. From the above, EP can impart resistance to oxidative stress to cells.
  • Diseases caused by oxidation or oxidative stress include Parkinson's disease, angina pectoris, myocardial infarction, Alzheimer's disease, amyotrophic lateral cord, such as arteriosclerosis such as atherosclerosis and angina related to arteriosclerosis Sclerosis, cerebral infarction, schizophrenia, bipolar disorder, fragile X syndrome, chronic fatigue syndrome, dyslipidemia, diabetes, hypertension, heart failure, liver cancer.
  • arteriosclerosis such as atherosclerosis and angina related to arteriosclerosis Sclerosis
  • cerebral infarction such as schizophrenia, bipolar disorder, fragile X syndrome, chronic fatigue syndrome, dyslipidemia, diabetes, hypertension, heart failure, liver cancer.
  • the above-mentioned inflammatory diseases can be mentioned.
  • EP can also be used as a food or nutritional supplement composition or as an additive for expression of various functions. It does not specifically limit as foodstuffs, Various liquid foods other than various solid foods (including gel-like foods) are mentioned.
  • EP can be prepared using any suitable method known in the art. That is, EP is commercially available or is readily obtained from commercially available materials by those skilled in the art of synthetic organic chemistry.
  • a 96-well plate was seeded with normal human airway epithelial cells (BEAS-2B cells) (ATCC) at 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • the medium used was 10% FBS RPMI-1640. After 24 hours, cells were gently washed with PBS at 200 ⁇ l / well and replaced with 0, 0.125, 0.25, and 0.5% FBS (90 ⁇ l / well). After medium change, add EP solution at 10 ⁇ l / well.
  • a proliferation test (WST-8 assay) was performed after 96 hours. The operation of the WST-8 assay was as follows. (1) The medium was removed from the 96-well plate by decantation and tapping.
  • BEAS-2B cells proliferated depending on the EP concentration. Even in the high concentration range at the mM level, no obvious toxicity considered to be caused by EP was observed. Moreover, EP was able to grow cells even under conditions that did not contain any FBS, and the cells could be grown as much as 0.5% FBS. As shown in FIG. 1 (b), when FBS is not contained in the medium, the cells die by low serum stress (see EP 0 ⁇ M). However, by adding EP, cell growth of up to 11 times was recognized (FIG. 1 (b)).
  • FIG. 2 shows cell growth state images of EP 0 ⁇ M and EP 1000 ⁇ M. As shown in FIG. 2, in EP0 ⁇ M, cell death or atrophy into fibroblasts occurred, whereas in EP1000 ⁇ M, cells proliferated to cover the bottom of the container. In addition, the cells developed concentrically and adhered to each other.
  • HBEpC primary normal human airway epithelial cells
  • a 96-well plate was seeded with HBEpC cells (IWAKI) at 3 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • the medium used was BEGM (Takara Bio, complete medium). After 24 hours, the cells were gently washed with HEPES buffer at 200 ⁇ l per well, and basal medium (pituitary extract, medium without peptide growth factor) BEBM was supplemented with antibiotic GA-1000 alone. Replaced (90 ⁇ l per well). After exchanging the medium, 10 ⁇ l of a 10-fold concentration EP solution was added per well, and 96 hours later, a proliferation test (WST-8 assay) was performed. The WST-8 assay was performed as in Example 1. The results are shown in FIG.
  • EP also had a proliferation promoting effect on primary normal human airway epithelial cells.
  • the basal medium does not contain pituitary extract or peptide growth factor, it can grow against primary normal human airway epithelial cells even in serum-free medium without depending on the combination or synergistic effect with these.
  • EP has a growth promoting effect in a concentration-dependent manner, shows no toxicity even at the mM level, and exerted a growth promoting effect about twice as high even at 7 ⁇ M.
  • EP also exerts a growth promoting effect in primary human fibroblasts.
  • Lung fibroblast proliferation plays a major role in airway remodeling formation in asthma.
  • airway remodeling was thought to be involved in pathogenesis such as asthma and chronic obstructive pulmonary disease, but fibroblast proliferation has been shown to play an important role in the wound healing process of damaged epithelium It is becoming one of the asthma healing effects of EP.
  • HEKa cells (Proliferation effect in primary normal keratinocytes (keratinocytes, HEKa)) HEKa cells (Takara Bio) were seeded in a 48-well plate at 2 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • HKGS Kit S-001-K, Invitrogen
  • M-EPI-500-CA basic medium Epilife
  • This HKGS Kit contains bovine pituitary extract, bovine insulin, hydrocortisone, bovine transferrin and human EGF. After 24 hours, cells were gently washed with 400 ⁇ l PBS per well, replaced with 252 ⁇ l basal medium Epilife per well, and cultured for 24 hours.
  • EP also exerted a proliferation promoting effect in the primary human keratinocytes.
  • the growth promoting effect is almost maximized at the minimum concentration of 15.6 ⁇ M.
  • Keratinocytes are cells constituting the skin, and substances that proliferate and add functions to these cells are extremely useful.
  • EP can be applied when producing a skin sheet in regenerative medicine, and can be used as a medium component for producing a tissue piece that does not contain animal protein and has less allergic action.
  • HHDPC primary normal human dermal papilla cells
  • EP exhibited a proliferation effect equivalent to or higher than that of minoxidil, which has been clinically recognized for hair growth.
  • the effective concentration of minoxidil is in the narrow range of several tens to 400nM. Toxicity is observed at higher concentrations, but this component has been shown to have a proliferative effect in a very wide concentration range and is a highly safe compound. It was.
  • Minoxidil exhibits cytotoxicity at a high concentration, but EP is advantageous in that it is an intracellular endogenous substance and does not exhibit toxicity.
  • a correlation between the proliferation effect in HHDPC cells and the hair growth / hair growth action in humans has already been observed, and it has been found that EP can be used as a hair growth / hair growth agent.
  • A549 and HEK293 cells adherent cells A549 (human type II alveolar epithelial cells: adenocarcinoma) and HEK293 (adenovirus immortalized human fetal kidney cells) were placed in a 96-well plate at 1 ⁇ 10 4 cells / cm. 2 sowed.
  • the medium used was 0% FBS RPMI-1640. 24 hours after seeding, the cells were washed with 20 ⁇ l of PBS per well and replaced with 0% FBS RPMI-1640. After exchanging the medium, 10 ⁇ l of a 10-fold concentration EP solution was added per well.
  • a proliferation test (WST-8 assay) was performed 96 hours after the addition of EP. The WST-8 assay was performed as in Example 1. The results are shown in FIG.
  • THP-1 human acute monocytic leukemia cells
  • HL-60 human myeloid leukemia cells
  • WST-8 assay for suspension cells, 10 ⁇ l per well of WST-8 assay reagent was directly dispensed into the cell suspension in culture, and after 1 hour, the absorbance at 450 nm and 600 nm was plated. Measurement was performed with a reader, and data analysis was performed in the same manner as in the above examples. The results are shown in FIG.
  • EP showed no cell proliferation ability even at a high concentration range.
  • THP-1 showed a slight cell growth ability in a high concentration range of 125 ⁇ M or more.
  • a normal human airway epithelial cell line BEAS-2B was seeded in a 96-well plate at 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • 10% FBS RPMI-1640 was used.
  • 90 ⁇ l / well of 0.1% FBS RPMI-1640 containing the MEK1 / 2 inhibitor U0126 (Cayman) was replaced.
  • 2.5 ⁇ M EP solution was added at 10 ul / well (final concentration 250 nM).
  • a proliferation test (WST-8 assay) was performed.
  • the WST-8 assay was performed as in Example 1. The results are shown in FIG.
  • EP Proliferation effect due to higher / lower EP metabolism
  • EP is known to be a phospholipid precursor essential to cells such as phosphatidylcholine (lecithin), a major component of cell membranes, and phosphatidylethanolamine, which is abundant in nerve tissue.
  • phosphatidylcholine lecithin
  • phosphatidylethanolamine a major component of cell membranes
  • phosphatidylethanolamine which is abundant in nerve tissue.
  • a normal human airway epithelial cell line BEAS-2B was seeded in a 96-well plate at 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • 10% FBS RPMI-1640 was used.
  • 90 ⁇ l per well of 0.1% FBS RPMI-1640 was replaced.
  • EP and EP metabolic derivatives were added at 10 ⁇ l / well.
  • a proliferation test (WST-8 assay) was performed.
  • the WST-8 assay was performed as in Example 1. The growth / toxic effects of EP and its derivatives are shown in FIG.
  • EP produced a proliferation effect in a dose-dependent manner, but no significant growth promotion effect was observed with other components. Further, it was found that the action of ethanolamine, which is higher in the metabolism of EP, is extremely weaker than that of EP. From the above, it was found that the proliferation effect of EP is not due to supplementation of lipid precursors but a specific action of EP.
  • GABA-A and GABA-B receptor agonist GABA and EP structural analog GABA-A receptor agonist homotaurine did not produce a statistically significant proliferative effect.
  • the proliferation effect of EP was not inhibited by the GABA-A receptor antagonist BM. From the above, it has been found that the proliferation effect of EP is brought about by a mechanism not mediated by GABA receptors.
  • EP Inhibition of serum-free induced caspase 3/7 activity increase by EP
  • EP alone causes cell proliferation in the absence of serum.
  • animal cells cannot survive without the presence of multiple growth factors.
  • suicide function called programmed apoptosis (programmed cell death) is activated.
  • caspase 3/7 Several intracellular pathways of apoptosis are known, but all known apoptotic pathways are concentrated in an increased activity of peptidase called caspase 3/7. Therefore, the presence or absence of the apoptosis-regulating action of this component can be estimated by measuring caspase 3/7 activity. Therefore, the following experiment was conducted.
  • BEAS-2B cells are seeded in a 96-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • the medium used was 10% FBS RPMI-1640. After 24 hours, cells were gently washed with 200 ⁇ l PBS per well and replaced with 90 ⁇ l 0% FBS RPMI-1640 per well. After the medium exchange, 10 ⁇ l of EP or FBS solution was added per well. After 24 hours, proliferation tests (WST-8 assay) and caspase 3/7 assay (Caspase-Glo 3/7 assay, Promega) were performed. WST-8 assay was performed as in Example 1 and caspase 3/7 assay was performed as per the package insert.
  • the caspase 3/7 activity was measured by a luminescence test, and the caspase 3/7 per cell was calculated by dividing the blank average value by the corrected absorbance of the WST-8 assay (corresponding to the relative cell number). Activity was calculated. The results are shown in FIG.
  • the permeability test was performed as follows. [Permeability test] Add 4 K Dalton fluorescent dextran molecule (SIGMA) to cell culture insert to 0.1 mg / ml, and after 1 hour, remove 20 ⁇ l of well-side medium and estimate the amount of fluorescent dextran penetrating from the fluorescence intensity at each concentration did.
  • HEKa human primary normal keratinocyte, adult HEKa was seeded on a cell culture insert (3531044, BD FALCON) at 6 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • the medium is cultured in a complete medium in which HKGS Kit (S-001-K, Invitrogen) is added as an additional factor to the basic medium Epilife (M-EPI-500-CA, Invitrogen).
  • the medium was replaced with one containing the specific compound under the same conditions 1 to 3 as Calu-3, and the medium was changed once a day.
  • TER was measured in the same manner as in Example 11. The results are shown in FIG.
  • both Calu-3 and HEKa showed a statistically significant increase in TER value with respect to the control (2.0 and 2.3 times, respectively). From these results, it was found that the barrier function enhancing action by EP is an action generally observed in epithelial cells. Further, in the case of keratinocytes constituting human skin, EP promotes cell proliferation and improves TER value. Therefore, it is a powerful adjuvant in the production of high-quality grafts in the field of regenerative medicine, or the cosmetics field. Can be used as an additive for rough skin, sensitive skin, etc., or as an active ingredient for anti-atopic drugs.
  • the DNA microarray experimental data were subjected to statistical analysis and gene function analysis (Gene Ontology [GO] analysis) from the altered genes using the dedicated analysis software GeneSpring (Agilent).
  • Gene Ontology [GO] analysis probabilistically determines how well a statistically significant variation of a gene set fits into a known functional class gene set.
  • the calculated p-value is a function classification that can be inferred from those genes when the number of genes that have actually fluctuated is arbitrarily extracted from the total number of genes given (approximately 40,000 genes in this DNA microarray). It shows how much you can happen by chance.
  • the formula for calculating the p-value is as follows.
  • N total number of array genes Np; total number of genes in a functional class in the array Nq; total number of genes not included in a functional classification x; Number of functional genes in the variable gene n; total number of variable genes
  • the probe is a fragmentary DNA sequence of a gene mounted in the DNA microarray.
  • the same gene may have a plurality of probes (there is an overlap), the number of gene types is less than the number of probes.
  • Table 17 shows the effect of promoting or suppressing apoptosis-regulated genes whose expression was statistically significantly increased (1.5 times or more, p ⁇ 0.05) by EP.
  • EP (Comparison of gene expression kinetics in H 2 O 2 treated samples of genes whose expression was reduced by EP) EP was identified as a small molecule induced by oxidative stress. On the other hand, when EP was administered to cells, it was found that, in addition to cell proliferation function, it also exerts an apoptosis inhibitory action. Because of this, since EP may have some protective function against oxidative stress, a correlation analysis of gene expression by hydrogen peroxide H 2 O 2, which is a representative oxidative stress reagent, was performed.
  • the gene expression data of EP is that of Example 13.
  • Cell preparation and H 2 O 2 administration were carried out in the same manner as in Experiment 13, and a sample treated with a final concentration of 125 ⁇ M H 2 O 2 for 6 hours was used as a gene expression analysis sample using a DNA microarray.
  • apoptosis-related genes apoptosis, GO: 0006915, all 734 probes
  • signals can be detected in EP and H 2 O 2 (Present with microarray analysis software GeneSpring) or Marginal)
  • H 2 O 2 Present with microarray analysis software GeneSpring
  • FIG. Apoptosis-related genes whose expression was decreased by EP were generally increased by oxidative stress reagent H 2 O 2 , and it became clear that EP has an effect opposite to oxidative stress on cells.
  • FIG. 17 shows a scatter plot for the effective data 611 probe with sufficient signal in EP and H 2 O 2 for all apoptosis related genes (apoptosis, GO: 0006915, all 734 probes).
  • heme oxygenase-1 A_23_P120883, HMOX1, heme oxygenase (decycling) 1, NM_002133
  • p 0.017
  • thioredoxin A_24_P175519, TXN, thioredoxin, NM_003329
  • p 0.021
  • EP particularly reduces the expression of many cytokines, and the function of suppressing the inflammatory reaction is to reduce cytokines and chemokines shown in Table 15.
  • examples of proinflammatory cytokines include AREG, BMP7, CCL27, CSF1, CXCL14, GDF15, IL11, IL18, IL23A, IL31, IL4, IL5, TNFSF15, VEGFA, and the like.
  • EP since molecules that vary depending on EP and the oxidative stress substance H 2 O 2 have an inverse correlation, EP may have a protective action against cells (antioxidant action) against oxidative stress. Be expected.
  • oxidation reduction GO: 0055114
  • cell redox homeostasis cell redox homeostasis, Focusing on GO: 0045454
  • the 250 ⁇ M and 500 ⁇ M EP pretreatments are more toxic at high concentrations of H 2 O 2 than the group without EP pretreatment, and have acquired resistance to oxidative stress. Indicated. In general, the strength of cytotoxic compounds proportional to the reciprocal of the 50% cell death concentration EC 50. Table 19 shows the EC 50 and relative toxicity at each EP pretreatment.
  • Example 15 From Example 15, it was revealed that EP can suppress the expression of many cytokines and chemokines. This suggests that EP may have an anti-inflammatory effect. Inflammation is an acute reaction that can occur in all tissues due to stimulation of foreign substances such as bacteria, followed by increased vascular permeability, infiltration of immune cells such as lymphocytes into the inflamed site, and inflammation-inducing activity from immune cells It leads to the expansion of the inflammatory response by cytokine secretion.
  • the cells used in Example 15 are airway epithelial cells, and it is necessary to confirm the same effect on immunocompetent cells.
  • Example 15 is an effect of the gene expression level, and in order to show an anti-inflammatory action, it is necessary to show secretion suppression at the protein level where the proinflammatory cytokines and chemokines secreted from the inflammatory cells are functional bodies. is there.
  • the anti-inflammatory action of EP was confirmed by the method of Singh et al. (Clin Chem, 2005 Dec; 51 (12): 2252-6).
  • Logarithmic growth culture was performed as follows using human monocyte-like cultured cells THP-1 as growth medium with 10% FBS RPMI-1640. 24 well plate was seeded at 4 ⁇ 10 5 / ml (500 ⁇ l / well), and a growth medium containing EP was additionally added to adjust the final EP concentration (0.1 mM, 1 mM). . Two hours after administration of EP, a growth medium containing LPS (liposaccharide) was further administered to adjust to 0.1 ⁇ g / ml and 1 ⁇ g / ml.
  • LPS liposaccharide
  • IL-8 which is a chemokine that attracts proinflammatory cytokines TNF ⁇ and inflammatory cells, was used as an ELISA measurement index, as reported by Singh et al. The results are shown in FIGS. 22 and 23.
  • Singh et al. Have reported that anti-inflammatory drugs can be screened by suppressing TNF ⁇ secretion by short-term LPS treatment (previously described). This is because TNF ⁇ secretion promotion by LPS stimulation usually peaks in about 2 to 6 hours. As shown in FIG. 22, the amount of TNF ⁇ induced by 1 ⁇ g / ml LPS stimulation was about 260 pg / ml (no EP) in the 4-hour stimulation, but decreased to about 70 pg / ml (EP 1 mM) in the 24-hour stimulation. The result was similar to the evaluation in Singh et al. Moreover, as shown in FIG. 22, EP suppresses secretion of TNF ⁇ induction in a dose-dependent manner in both 4 hours and 24 hours stimulation.
  • IL-8 tended to be more secreted at 24 hours than at 4 hours in response to LPS stimulation, but the effect of suppressing IL-8 secretion by EP clearly appeared after 24 hours stimulation.
  • EP suppresses secretion of TNF ⁇ and IL-8 even for cells not treated with LPS. It was. That is, 1 mM EP for 26 hours suppressed secretion of TNF ⁇ by about 78% and IL-8 by about 43%. This indicates that a constant secretion suppressing effect of cytokines and chemokines from immunocompetent cells such as macrophages is exhibited even without stimulation such as LPS.
  • EP is not only expected to have anti-inflammatory effects, but also for diseases caused by cytokines and chemokines induced by inflammation (arteriosclerosis or obstructive vascular injury such as myocardial infarction and cerebral infarction). It was also found that there may be a preventive / therapeutic effect.

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Abstract

　本明細書はエタノールアミンリン酸の新たな用途を提供する。このため、本明細書は、エタノールアミンリン酸を有効成分とする、動物細胞機能増強剤を提供する。エタノールアミンリン酸を含有することで、血清及び増殖因子の非存在下であっても動物細胞の機能を増強できる。また、本明細書は、ＥＰの作用に関連する遺伝子の発現レベルを明らかにすることにより、こうしたＥＰ作用発現関連遺伝子の利用を提供する。

Description

エタノールアミンリン酸の利用
　本願は２０１２年７月３１日出願の日本国特許出願である特願２０１２－１６９３２２、２０１３年７月２９日出願の日本国特許出願である特願２０１３－１５６７６０、２０１３年７月３０日出願の日本国特許出願である特願２０１３－１５８２５９を優先権の主張の基礎とするものであって、その全内容は、引用により本明細書に組み込まれるものとする。
　本明細書は、エタノールアミンリン酸の利用に関する。
　エタノールアミンリン酸（Ethanolamine phosphate、以下、単にＥＰという。）は、エタノールアミンやホスホグリセロールエタノールアミンとともに動物の生体膜などにおいて広く存在している。また、ＥＰは、細胞膜の主要成分であるホスファチジルコリン（レシチン）および神経組織に多く存在するホスファチジルエタノールアミンなど細胞に必須なリン脂質の前駆体であることが知られている。
　一方、ＥＰやエタノールアミンは、細胞成長因子の増強剤として培地に添加できることが知られている（特許文献１、２、３）。また、ＥＰは、アセトアルデヒド脱水素酵素活性を増強する活性成分であり二日酔いなどの肝臓系疾患や腸粘膜障害に有用であることも知られている（特許文献４、５、６）。さらに、うつ病のバイオマーカーである可能性があることが報告されている。
特開平６－７８７５９号公報 特表平４－５０１６６０号公報 特表２０００－５０６３７４号公報 特開２００２－１０４９６１号公報 特開平８－３１０９９４号公報 国際公開第９９／３９７０３
　ＥＰの作用は、以上のように多様である。本明細書は、ＥＰの新たな用途を提供する。また、ＥＰの作用は、未だ全てが明らかになっているわけではない。ＥＰが細胞に作用するとき、いかなる遺伝子の発現を促進しあるいは抑制しているかは全く知られていない。ＥＰによる作用発現に関連する遺伝子を明らかにすることで、ＥＰの有用機能の探索や新たなＥＰの用途の提供や、ＥＰの作用を増強しあるいは細胞に対するＥＰ様に作用する化合物の探索が可能となる。
　本発明者は、ＥＰが有する細胞への作用に着目して種々検討した。その結果、ＥＰには、従来にない新規な機能があること及び当該機能に基づき新たな用途を提供できるという知見を得た。また、本発明者は、ＥＰの作用に関連する遺伝子の発現レベルを明らかにするとともに、ＥＰの作用をさらに明らかにした。本明細書はこれらの知見に基づき、新たなＥＰの利用を提供する。
　本発明者らは、ＥＰを細胞に投与した際に、ＥＰが細胞にもたらす新たな作用を見出すとともに、ＥＰによる発現が促進又は抑制される遺伝子を解析した。遺伝子発現解析によれば、特定の遺伝子群の発現促進と特定遺伝子群の発現抑制を確認できた。さらに、新たな作用を見出した。こうした知見に基づき以下の手段を提供する。
（１）ＥＰを有効成分として含有する、動物細胞機能増強剤。
（２）血清及び増殖因子不存在下での細胞増殖剤である、（１）に記載の動物細胞機能増強剤。
（３）気道上皮細胞、肺線維芽細胞、角質上皮細胞及び毛乳頭細胞からなる群から選択される１種又は２種以上の動物細胞の細胞増殖剤である、（１）又は（２）に記載の動物細胞機能増強剤。
（４）異形性細胞よりも正常細胞を選択的に増殖する細胞増殖剤である、（１）～（３）のいずれかに記載の動物細胞機能増強剤。
（５）上皮系細胞のバリア機能促進剤である、（１）に記載の動物細胞機能増強剤。
（６）アポトーシス抑制剤である、請求項１に記載の動物細胞機能増強剤。
（７）培養細胞構造体の作製剤である、（１）に記載の動物細胞機能増強剤。
（８）エタノールアミンリン酸を有効成分とする、毛髪育成剤。
（９）動物の体外において、動物細胞とエタノールアミンリン酸とを接触させて、前記動物細胞の機能を増強する方法。
（１０）動物細胞に対する作用剤のスクリーニング方法であって、
　エタノールアミンリン酸の存在下で前記動物細胞と被験化合物とを接触させて、前記動物細胞における影響を測定する工程、
を備える、方法。
　また、本明細書は以下の手段も提供する。
（１）エタノールアミンリン酸を有効成分とする、炎症性サイトカインカインの抑制剤。
（２）エタノールアミンリン酸を有効成分とする、抗炎症剤。
（３）エタノールアミンリン酸を有効成分とする、抗酸化剤。
（４）エタノールアミンリン酸を有効成分とする、炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
（５）遺伝子の発現方法であって、ＥＰを動物細胞に投与することにより、以下に示す第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現を促進し、以下に示す第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現を抑制する、発現方法。
（第１の遺伝子群）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（第２の遺伝子群）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
（６）ＥＰに対する動物細胞の反応性を評価する方法であって、
　ＥＰを動物細胞に投与する工程と、
　ＥＰを投与した前記動物細胞における（５）に記載の第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベル及び／又は（５）に記載の第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程と、
　前記工程で得た１又は２以上の遺伝子の発現レベルに基づいて、ＥＰに対する前記動物細胞の反応性を評価する工程と、
を備える、方法。
（７）ＥＰの作用を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
　動物細胞に対してＥＰと１又は２以上の試験化合物とを投与する工程と、
　前記動物細胞における（５）に記載の第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベル及び／又は（５）に記載の第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程と、
　前記測定工程で得た１又は２以上の遺伝子の発現レベルに基づいて、前記１又は２以上の試験化合物のＥＰの作用に対する抑制作用又は増強作用を評価する工程と、
を備える、スクリーニング方法。
（８）（５）に記載の第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現産物及び当該遺伝子の発現を促進する化合物、並びに、
　（５）に記載の第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現産物に対して抑制的に作用する化合物及び発現を抑制する化合物
からなる群から選択される１又は２以上の試験化合物を動物細胞に投与する工程と、
　前記動物細胞の１又は２以上の細胞機能を測定する工程と、
を、備える、ＥＰ様化合物のスクリーニング方法。
（９）（５）に記載の第１の遺伝子群から選択される複数の遺伝子プローブを固定化した第１の領域と、（５）に記載の第２の遺伝子群から選択される複数の構成遺伝子をそれぞれ固定化した第２の領域と、を備える、ＥＰの作用の調節剤のスクリーニング用固相担体。
異なるＦＢＳ濃度下における株化正常ヒト気道上皮細胞に対するＥＰの増殖効果を示す図であり、左図は、絶対値で表し、右図は、コントロールに対する比で表す。 無血清時における細胞画像を示す図であり、左図は、ＥＰ０μＭの場合であり、右図は、ＥＰ１０００μＭの場合である。 初代ヒト気道上皮細胞に対するＥＰの増殖作用を示す図である。 初代ヒト肺線維芽細胞におけるＥＰの増殖作用を示す図である。 初代ヒト毛乳頭細胞に対するＥＰの増殖作用を示す図である。 初代ヒト毛乳頭細胞に対するＥＰ及びミノキシジルの増殖作用を示す図である。 がん細胞（Ａ５４９、ＴＨＰ－１、ＨＬ－６０）及びモデル細胞（ＨＥＫ２９３）におけるＥＰの増殖作用を示す図である。 ＥＰによる細胞増殖効果のＭＥＫ１／２阻害薬による抑制を示す図である。 ＥＰ及びその代謝誘導体からの細胞構成成分に至る代謝マップを示す図である。 ＥＰ及びその代謝誘導体による細胞増殖／毒性効果を示す図である。 ＧＡＢＡ受容体作動薬の細胞増殖抑制効果の確認結果を示す図である。左図はＧＡＢＡによる結果を示し、右図はホモタウリンによる結果を示す。 ＧＡＢＡ受容体拮抗薬の細胞増殖抑制効果の確認結果を示す図である。 ＦＢＳ及びＥＰによる、無血清ストレス誘導カスパーゼ３／７活性上昇の阻害効果確認結果を示す図である。 ＥＰによる株化正常気道上皮細胞のバリア機能促進効果の確認結果を示す図である。 ヒト気道上皮細胞がん細胞株Calu-3（左図）及びヒト正常初代ケラチノサイトＨＥＫａ（右図）に対するＥＰのバリア機能向上効果の確認結果を示す図である。 ＥＰにより２倍以上発現減少したアポトーシス関連遺伝子のＨ2Ｏ2処理サンプルとの比較を示すボックスプロットである。 全アポトーシス関連プローブのＥＰ及びＨ2Ｏ2処理による発現比の散布図である。 ＥＰにより２倍以上発現減少した酸化還元関連遺伝子のＨ2Ｏ2処理サンプルとの比較を示すボックスプロットである。 酸化還元遺伝子関連プローブのＥＰ及びＨ2Ｏ2処理による発現比の散布図である。 ＥＰにより有意に発現変化した遺伝子の数（１．５倍以上あるいは１／１．５倍以下、ｐ＜０．０５） ＥＰ前処理有無による過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）による細胞毒性を示す図である。 ＥＬＩＳＡ法を用いた各ＥＰ濃度前処理によるＴＨＰ－１から分泌されたＬＰＳ誘導ＴＮＦ－αの定量結果を示す図である。 ＥＬＩＳＡ法を用いた各ＥＰ濃度前処理によるＴＨＰ－１から分泌されたＬＰＳ誘導ＩＬ－８の定量結果を示す図である。
　本明細書は、ＥＰを有効成分とする動物細胞の機能増強剤、ＥＰを利用し動物細胞の機能増強方法及び動物細胞への作用剤又は阻害剤のスクリーニング方法等に関する。ＥＰは、細胞膜の成分として周知であるが、本発明者らによれば、その細胞に対する作用は、代謝経路において近縁の化合物とは格別に異なっており、ＥＰを利用することにより効果的に動物細胞の機能を増強できる。動物細胞の機能増強は、例えば、細胞増殖、アポトーシス抑制、バリア機能向上など多種にわたる。
　また、本明細書は、種々の細胞活性化作用を有するＥＰの作用に関連する遺伝子の発現レベルを明らかにすることにするとともに、ＥＰの新たな利用を提供する。
　本明細書は、ＥＰを細胞に投与した際の細胞に対する作用及び当該作用の起因となる遺伝子群の発現促進と発現抑制に関する。本発明者によれば、ＥＰの新たな作用に関する知見とこれらの遺伝子の発現状況とに関する知見により、ＥＰによる遺伝子の発現制御、ＥＰ様化合物やＥＰ作用増強剤、ＥＰとの合剤成分などのスクリーニング方法を提供できる、また、ＥＰの作用に関連する遺伝子の発現解析に用いるための固相担体も提供される。
　さらに、ＥＰは、動物細胞の機能増強例えば、細胞増殖、アポトーシス抑制、バリア機能向上など多種にわたる。また、毛髪育成作用も有している。さらに、炎症性サイトカインの抑制作用、抗炎症作用及び抗酸化作用を有している。
　以下、本明細書の開示について詳細に説明する。
（動物細胞機能増強剤）
　ＥＰは、動物細胞機能増強剤の有効成分として用いることができる。ＥＰは、またそのリン酸基においてナトリウム、カリウムなどの一価の金属イオン、カルシウム、マグネシウムなどの二価の金属イオン等との塩を形成するリン酸イオンの形態であってもよい。
　動物細胞としては、特に限定しないで、ヒト及び非ヒト動物の細胞が挙げられる。細胞の種類も特に限定されない。動物細胞は初代であっても株化細胞であってもよい。また、由来も特に限定されないが、肺、気道、表皮に由来する細胞が挙げられる。また、細胞形態として、上皮細胞であってもよいし、線維芽細胞などの結合組織の細胞であってもよい。さらに、動物細胞は、ＥＳ細胞ほか、体細胞から人工的に誘導された万能細胞（ｉＰＳ細胞）であってもよいし、こうした細胞から分化させた細胞であってもよい。また、動物細胞は、組織又は器官又はその一部を構成していてもよい。
　動物細胞としては、なかでも、気道上皮細胞、肺線維芽細胞、角質上皮細胞及び毛乳頭細胞がＥＰによる細胞増殖対象として好ましく挙げられる。これらの細胞は、初代細胞であっても株化細胞であってもよい。また、動物細胞は、動物個体から採取された動物細胞とすることができる。
　ＥＰの作用は、動物細胞、特には、ヒトを含む哺乳類動物細胞に有効である。また、こうしたＥＰの作用に基づけば、ＥＰはそれ自体、外用のほか、血管等の脈管経由による投与、経口投与、注入や注射による投与のほか、各種投与形態において、動物細胞に対して各種作用を発現するものである。
（細胞増殖機能）
　細胞機能増強剤が増強する動物細胞の一つの機能としては、細胞増殖機能が挙げられる。ＥＰの細胞増殖機能の一つの特徴は、血清又は各種成長因子などの増殖因子の存在下での細胞増殖のほか、血清及び増殖因子の非存在下であってもＥＰは動物細胞の増殖を確保することができることが挙げられる。換言すれば、糖などの炭素源と無機塩のみを含む基本培地にＥＰを添加することで動物細胞の増殖を確保することができる。これらの作用は、ＥＰの代謝経路の類縁化合物であるエタノールアミン、ホスホリルコリン、ＣＤＰ－コリン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミンでは得られない作用である。
　なお、ここで血清とは、動物の血液由来であれば特に限定されないが、典型的には、牛胎児、牛新生児、仔牛、成牛などのウシ、ヤギ、ニワトリ及びブタなどの各種動物の血液由来の血清が挙げられる。増殖因子も、特に限定されないで、公知の細胞増殖にもちいられうる内因性タンパク質が挙げられる。典型的には、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経成長因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等が挙げられる。
　細胞機能増強剤の他の一つの特徴は、異形細胞よりも正常細胞の増殖を選択的に促進することが挙げられる。がん細胞などの異形細胞よりも正常細胞に対して選択的に増殖機能を発揮することで、特に、生体に適用した場合において、異形細胞の増殖促進に基づく悪影響がないこと及び正常細胞を増殖させることが治療上や予防上の意義が大きい疾患（例えば、各種のがんが挙げられる。また、創傷治癒が必要な疾患が挙げられる。）において有意義である。
　なお、異形細胞としては、正常細胞で通常観察される細胞形態から隔たっている細胞を意味している。典型的には、被験細胞を光学顕微鏡を使って観察した場合に、形態が正常から隔たっている細胞を意味している。ここで正常細胞とは、細胞の種類によって異なるが例えば核の大きさ等などによる評価によって決定されうる。また、異形細胞が有する正常細胞からの隔たりも細胞種類によっても異なるが、典型的には、がん細胞等が挙げられる。
　ＥＰを細胞増殖剤として用いるとき、細胞増殖機能が発揮される範囲で添加されればよいが、例えば、１００ｎＭ以上１０ｍＭ以下、好ましくは１μＭ以上１ｍＭ以下、より好ましくは１０μＭ以上１ｍＭ以下の範囲で培地等に含めることができる。
（バリア機能促進機能）
　細胞機能増強剤が増強する動物細胞の他の一つの機能としては、上皮系細胞のバリア機能促進機能が挙げられる。上皮細胞は、生体からのバリア機能を達成する組織を構成する細胞であり、上皮系細胞とは、分化により上皮細胞としてのバリア機能を発揮する細胞を意味している。上皮系細胞のバリア機能を増強することで、有害物質やアレルゲンの進入を抑制できる上皮細胞及び組織を作製できる。なお、ＥＰは、上皮系細胞の細胞増殖機能も有していることから、効果的にこうした組織や細胞集団を構築できる。ＥＰをバリア機能促進剤として用いるときは、バリア機能を促進できる範囲であれば特に限定されないが、例えば、ＥＰを細胞増殖剤として用いるのと同様の濃度で培地等に含めることができる。
　本明細書におけるバリア機能とは、より具体的には、外界からの非特異的な高分子及び刺激性の低分子の侵入に対する侵入防止機構を意味している。生体の上皮は、異物侵入を抑制するために、上皮細胞間にタイトジャンクションと呼ばれる密接結合のための構造体を形成して隣接する細胞間（細胞間隙）の分子の移動を抑制している。本明細書におけるバリア機能とはより具体的にこうした異物侵入の抑制促進作用、換言すればタイトジャンクションの強度向上作用を意味している。こうしたバリア機能は、すなわち、タイトジャンクションの強度は、細胞シート上下の経上皮電気抵抗（transepthelial electrical resistance; TRT）により評価される。また、そのタイトジャンクションの強度の上昇はデキストラン等の高分子の細胞シート間の透過速度の低下により評価される。
（アポトーシス抑制機能）
　細胞機能増強剤が増強する動物細胞の他の一つの機能は、アポトーシス抑制機能である。アポトーシス抑制機能を発揮することで、細胞の増殖や機能を発揮させることができる。なお、既に説明したように、ＥＰは、正常細胞の増殖機能を担っているので、アポトーシス抑制機能は、正常細胞のアポトーシス抑制機能であるといえる。アポトーシス抑制剤として用いるときは、アポトーシス抑制機能を促進できる範囲であれば特に限定されないが、例えば、ＥＰを細胞増殖剤として用いるのと同程度の濃度で培地等に含めることができる。
（培養細胞構造体の作製剤）
　ＥＰは、上皮細胞のほか線維芽細胞の細胞増殖機能を有していること、及びバリア機能促進機能を有していることから、上皮細胞、線維芽細胞、及びこれらの二つの細胞を増殖させて形成する各種の培養細胞構造体の作製剤として有用である。例えば、皮膚代替物となる細胞シートを始めとする各種形態の培養細胞構造体が挙げられる。培養細胞構造体の形態は特に限定されない。細胞構造体の形態は特に限定されないで、細胞構造体の用途や適用する組織や臓器形態に応じて適宜選択される。例えば、シート状、棒状、管状等、球形状等が挙げられる。また、培養細胞構造体の作製方法自体は、当業者において周知であり、ＥＰの有効量を培養細胞構造体を培養する培地に含有させることにより、ＥＰを培養細胞構造体の作製剤として利用できる。培養細胞構造体の作製剤として用いるときは、細胞増殖機能及びバリア機能を促進できる範囲であれば特に限定されないが、例えば、ＥＰを細胞増殖剤として用いるのと同程度の濃度で培地等に含めることができる。
（毛髪育成剤）
　ＥＰは、毛髪育成剤としても利用できる。ＥＰは、毛乳頭細胞の増殖効果を有している。毛乳頭細胞の増殖は、毛髪の育成効果を意味している。したがって、ＥＰを有効成分として含む、頭皮などを含む各種の皮膚に適用する外用の毛髪育成剤が提供される。毛髪育成剤としての形態は特に限定されないで、公知の頭皮や皮膚に適用される外用剤の形態が採用可能である。例えば、ローション、クリーム、エッセンス、シャンプー、リンス等が挙げられる。ＥＰは、毛髪育成作用がある範囲で含まれればよく、例えば、０．０００００１質量％以上１質量％の範囲で含めることができる。好ましくは０．０００１質量％以上０．１質量％以下である。また、外用剤としての用法・用量も特に限定されないが、例えば、１回以上３回以下／日を外用で用いることができる。
（評価又はスクリーニング用の試薬）
　ＥＰは、動物細胞に対してその機能を増強する作用を有していることから、ＥＰの存在下で動物細胞と被験化合物を接触させて、当該被験化合物の前記細胞に対する作用を評価する試薬として用いることができる。細胞機能を増強させた状態で被験化合物の作用を評価できるので、より効果的な評価やスクリーニングが可能となる。作用の評価は、細胞の種類や被験化合物の種類や作用の種類によって種々に異なるが、当業者であれば、評価の目的に応じて適宜設定することができる。また、ＥＰを、被験化合物の評価又はスクリーニング用の試薬として用いるときは、細胞増殖機能、バリア機能等、ＥＰが細胞に対してその機能を増強させる濃度であれば特に限定されないが、例えば、ＥＰを細胞増殖剤として用いるのと同様の濃度で培地等に含めることができる。
（動物細胞の機能増強方法等）
　本明細書に開示される動物細胞の機能の増強方法は、動物の体外において、動物細胞とＥＰとを接触させて、前記動物細胞の機能を増強する方法である。既に説明したように、ＥＰは、細胞機能を増強することができる。動物の体外において、当該動物個体とは自家又は他家由来の動物細胞とＥＰとを接触させることで、動物細胞を効果的に増殖させ、バリア機能を促進させ、アポトーシスを抑制することができる。したがって、この方法は、細胞を各種用途（発酵、医療（補綴や移植を含む）、薬剤）に用いる場合において、細胞を増殖等させるのに有用である。特に、個体から採取し、体外でＥＰを用いて機能を増強した細胞として増殖して、その細胞を再び個体に移植するなどの移植医療に有用である。
　本方法は、動物細胞の細胞増殖方法、バリア機能の優れた動物細胞の生産方法、アポトーシス抑制機能に優れた動物細胞の生産方法としても実施できる。また、本方法は、ヒト及び非ヒト動物の毛髪促進方法としても実施できる。さらに、本方法は、動物細胞のバリア機能の向上方法、動物細胞のアポトーシス抑制方法としても実施できる。
（スクリーニング方法等）
　本明細書に開示されるスクリーニング方法は、動物細胞に対する作用剤のスクリーニング方法であり、ＥＰの存在下で前記動物細胞と被験化合物とを接触させて、前記動物細胞における作用を測定する工程、を備えることができる。ＥＰは、動物細胞の機能を強化する。ＥＰの存在下で動物細胞と被験化合物とを接触させることで、精度よくあるいはより現実的に被験化合物の動物細胞に対する作用をインビトロでも測定できる。
　被験化合物は、特に限定されないで、ポリペプチド、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、脂質、そのほかの各種の有機化合物、金属塩などの各種の無機塩類を含む無機化合物等が挙げられる。ＥＰは、通常、動物細胞の培地に含めることができる。また、被験化合物も典型的には、動物細胞の培地に一時的に、継続的に、あるいは断続的に供給することができる。細胞に対するＥＰの濃度は、特に限定されないが、スクリーニングの目的に応じて適宜設定できる。例えば、ＥＰを細胞増殖剤として用いるのと同様の濃度で培地等に含めることができる。
　被験化合物の動物細胞に対する作用は特に限定されない。細胞の各種機能を亢進する作用及び低下させる作用の双方を含んでいる。こうした作用の測定方法は、当業者であればスクリーニングの目的に応じて適宜設定することができる。
（遺伝子の発現方法）
　本明細書に開示される遺伝子の発現方法は、ＥＰを動物細胞に投与することにより、第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現を促進し、第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現を抑制する工程を備えることができる。本方法によれば、動物細胞に対するＥＰの投与により、動物細胞に対して特定の遺伝子の発現状況を構築できる。この遺伝子の発現状況は、動物細胞の機能増強に関与している。したがって、本発現方法は、こうした遺伝子の発現状況を呈する動物細胞の製造方法でもある。
　動物細胞については、既に説明したとおりである。動物細胞にＥＰを投与する方法は特に限定されない。動物細胞がＥＰを接触するようにすればよい。典型的には、ＥＰを含有する培地において動物細胞を培養する態様が挙げられる。
　動物細胞にＥＰを投与して全ヒトゲノムを対象とした発現解析において１．５倍以上あるいは１／１．５倍以下（ｐ＜０．０５）に変化した遺伝子（プローブ）はそれぞれ８０１個及び１９３９個であった。これらの遺伝子につき、機能解析（ＧＯ解析）した結果を以下の表７及び表８に示す。表７は、発現上昇した遺伝子の機能の抽出結果のうち上位２０種であり、表８は、発現減少した遺伝子の機能の抽出結果であり上位２０種である。なお、発現解析には、専用解析ソフトＧｅｎｅ ｓＳｒｉｎｇ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いた。
（ＥＰにより有意に発現上昇した遺伝子の機能の分類、上位２０種、ｐ値に基づく順位）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
（ＥＰにより有意に発現減少した遺伝子の機能の分類、上位２０種、ｐ値に基づく順位）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表７に示すように、ＥＰの投与により発現が上昇する遺伝子は、細胞増殖に関連するものとして血管形成や分化に関与する遺伝子機能（ＧＯ:0001568、0048514、0001944）が存在していた。
　また、表８に示すように、ＥＰの投与により発現が減少する遺伝子は、細胞死、アポトーシスに関連する遺伝子機能（ＧＯ：0042981、0043067、0043070、0010941、0006917、0012502、0012503、0043065、0043068、0043071、0010942、0006915）が存在していた。
　表７に示すＧＯ解析によって得られた機能分子のうち、機能分子（ＧＯ：0001944）としての遺伝子（２９プローブ、２０遺伝子）を表９に示す。また、ＧＯ解析によれば、上位２０位に含まれないが、細胞増殖（ＧＯ:0008283）に関与する遺伝子のうち発現上昇１．５倍以上（ｐ＜０．０５）を満たす遺伝子（１６プローブ、１２遺伝子）を表１０に示す。
（ＥＰにより有意に発現上昇した増殖関連遺伝子（血管形成関連遺伝子ＧＯ：0001944））
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
（ＥＰにより有意に発現上昇した増殖関連遺伝子（細胞増殖関連遺伝子ＧＯ：0008283））
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
（ＥＰにより有意に発現減少したアポトーシス関連遺伝子（アポトーシス制御関連遺伝子ＧＯ：0042981）のうちアポトーシス促進作用を有する遺伝子）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
（ＥＰにより有意に発現減少したアポトーシス関連遺伝子（アポトーシス制御関連遺伝子ＧＯ：0042981）のうちアポトーシス促進作用を有する遺伝子）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
（ＥＰにより有意に発現減少したアポトーシス関連遺伝子（アポトーシス制御関連遺伝子ＧＯ：0042981）のうちアポトーシス促進作用を有する遺伝子）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
（ＥＰにより有意に発現上昇したアポトーシス制御遺伝子（アポトーシス制御関連遺伝子ＧＯ：0042981）のうちアポトーシス抑制作用を有する遺伝子）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
（ＥＰにより有意に発現減少したサイトカイン又はケモカイン関連遺伝子）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
（第１の遺伝子群）
　第１の遺伝子群は、ＥＰを動物細胞に投与することにより、その発現が促進される遺伝子からなる。こうした遺伝子としては、表９、表１０及び表１４に示す遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は、ＥＰによる特有の作用の発現に関連があると考えられる。第１の遺伝子群は、好ましくは表９に示す遺伝子群からなる。また、好ましくは表１４に示す遺伝子からなる。
（第２の遺伝子群）
　第２の遺伝子群は、ＥＰを動物細胞に投与することにより、その発現が抑制される遺伝子からなる、こうした遺伝子としては、表１１～表１３及び表１５に示す遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子は、ＥＰによる特有の作用の発現に関連があると考えられる。第２の遺伝子群は、好ましくは表１１～１３に示す遺伝子からなる。また、第２の遺伝子群は、好ましくは表１５に示す遺伝子からなる。
　こうした遺伝子の発現の確認は、通常のヒト全ゲノム遺伝子についてのプローブを備えるアレイ等を用いた発現解析手法を用いてもよいし、特定の遺伝子を標的とした発現解析を行ってもよい。アレイ等や必要な試薬は、商業的に入手できるほか、網羅的な遺伝子発現解析や特定遺伝子に関する発現解析は、周知技術であり、当業者であれば適切に実施することができる。
（ＥＰによる遺伝子発現評価用の固相担体）
　ＥＰ投与による動物細胞における特定遺伝子の発現状況の確認は、好ましくは、第１の遺伝子群から選択される１又は２以上遺伝子を検出するための１又は２以上のプローブを固定化した第１の領域と、第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子を検出するための１又は２以上のプローブを固定化した第２の領域と、を備える、固相担体を用い行うことが好ましい。
　この固相担体によれば、第１の遺伝子群に属する遺伝子検出用のプローブと第２の遺伝子群に属する遺伝子検出用のプローブとが担体上の異なる位置に保持されているため、検出判定が容易になっている。なお、こうしたプローブを固定化した固相単体は、いわゆるサンプルＤＮＡを含んだ溶液に固相担体を浸漬してプローブとサンプルＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行うものであってもよいし、こうした溶液を固相担体上を展開させてサンプルＤＮＡとプローブとのハイブリダイゼーションを行うものであってもよい。ハイブリダイゼーションの形態に応じて、適宜固相担体の材料が選択されるほか、プローブを固定する配置も適宜選択される。さらに、ハイブリダイズ産物の検出についても、蛍光色素を用いるのみならず、目視にて視認可能な標識を用いることができる。細胞等から抽出したＲＮＡやＤＮＡに由来するＤＮＡサンプルと特定遺伝子を検出するプローブとのハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、当業者であれば、周知技術に基づいて、第１の遺伝子群及び第２の遺伝子群で特定される遺伝子を検出するため固相担体を作製することができる。
　この種の固相担体は、また、本明細書に開示される発現方法のほか、ＥＰの作用の調節剤のスクリーニング用固相担体、ＥＰに対する動物細胞の反応性の評価方法、ＥＰ様化合物のスクリーニング方法等にも利用できる。
　本方法によれば、ＥＰを動物細胞に投与することにより、特定の遺伝子群の発現を促進及び／又は抑制できる。こうした発現の動物細胞を得ることにより、細胞機能が増強した細胞を創出して、こうした細胞のさらなる機能や用途を開発するのに用いることができる。
　本方法によれば、特定の動物個体に由来する自家細胞である動物細胞（体細胞等）、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞にＥＰを投与して動物細胞の機能強化（バリア機能向上、アポトーシスの抑制）や細胞増殖を図って、それを自家に移植するための増殖細胞としてもよい。必要に応じて分化させてもよい。なお、こうした細胞、特に体細胞や分化させた細胞は、特定の３次元形態（シート、管状体等）の細胞構造体であってもよい。移植部位は、動物個体における状態に応じて、例えば欠損部位や損傷部位など、適宜決定される。自家移植は、皮膚、軟骨、骨、神経組織、肝臓等の各種臓器等が挙げられる。細胞を各種用途（発酵、医療（補綴や移植を含む）、薬剤）に用いる場合において、細胞を増殖等させるのに有用である。
（ＥＰに対する動物細胞の反応性の評価方法）
　本明細書に開示されるＥＰに対する動物細胞の反応性の評価方法は、ＥＰを動物細胞に投与する工程と、ＥＰを投与した前記動物細胞における第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベル及び／又は第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程と、前記工程で得た１又は２以上の遺伝子の発現レベルに基づいて、ＥＰに対する前記動物細胞の反応性を評価する工程と、を備えることができる。
　本方法によれば、ＥＰを動物細胞に投与することにより、その動物細胞に対するＥＰの反応性を評価して、効果的に、ＥＰ投与により細胞の増殖能、バリア機能性、アポトーシスの抑制を強化できる細胞を選択することができる。動物細胞、動物細胞へのＥＰの投与、第１の遺伝子群及び第２の遺伝子群及びその検出については、既に本発現方法に関して説明した態様をそのまま本方法にも適用できる。
　反応性の評価にあたっては、第１の遺伝子群に属する遺伝子に対する一定以上の発現上昇を確認できた遺伝子数（比率）、発現上昇を確認できた遺伝子の発現強度が挙げられる。こうした遺伝子比率や遺伝子の発現強度が大きいほど、ＥＰに対する高感度の反応性を肯定することができる。反対に、こうした遺伝子比率や遺伝子の発現強度が低いほど、ＥＰに対する低感度の反応性を肯定できる。
　同様に、反応性の評価にあたっては、第２の遺伝子群に属する遺伝子に関する一定以上の発現減少を確認できた遺伝子数（比率）、発現減少を確認できた遺伝子の発現強度の低さが挙げられる。こうした遺伝子比率や遺伝子の発現強度の低さが大きいほど、ＥＰに関する高感度の反応性を肯定することができる。反対に、こうした遺伝子比率や遺伝子の発現強度が低いほど、ＥＰに対する低感度の反応性を肯定できる。
（ＥＰの作用を調節する化合物のスクリーニング方法）
　本明細書に開示されるＥＰの作用を調節する化合物のスクリーニング方法は、動物細胞に対してＥＰと１又は２以上の試験化合物とを投与する工程と、前記動物細胞における第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベル及び／又は第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程と、前記測定工程で得た１又は２以上の遺伝子の発現レベルに基づいて、前記１又は２以上の試験化合物のＥＰの作用に対する抑制作用又は増強作用を評価する工程と、を備えることができる。
　本スクリーニング方法によれば、ＥＰの細胞機能増強作用をさらに増強するあるいは抑制する化合物をスクリーニングすることができる。こうした化合物を取得することで、ＥＰとともに用いて一層細胞機能を増強できる化合物を提供できる。また、ＥＰとともに用いるとＥＰの細胞機能増強作用を低下させてしまう化合物を特定して、こうした化合物を回避できる。なお、動物細胞、動物細胞へのＥＰの投与、第１の遺伝子群及び第２の遺伝子群及びその検出については、既に本発現方法に関して説明した態様をそのまま本方法にも適用できる。
　試験化合物としては、ホルモンやサイトカインカインなどのほか脂質を含む生体膜成分を含む低分子有機化合物のほか、ペプチド、タンパク質、糖類、ＤＮＡ、ＲＮＡ等、あるいはこれらの複合体など高分子有機化合物であってもよい。金属塩などの各種の無機塩類を含む無機化合物等であってもよい。試験化合物とＥＰとを動物細胞に投与する方法は特に限定されない。典型的には、試験化合物とＥＰとを含む培地で動物細胞を培養すること等が挙げられる。なお、被験化合物は典型的には、動物細胞の培地に一時的に、継続的に、あるいは断続的に供給することができる。
　ＥＰの作用に対する増強作用の評価にあたっては、第１の遺伝子群に属する遺伝子に関する一定以上の発現上昇を確認できた遺伝子数（比率）、発現上昇を確認できた遺伝子の発現強度が挙げられる。こうした遺伝子比率や遺伝子の発現強度が大きいほど、ＥＰの作用に対する増強作用を肯定することができる。反対に、こうした遺伝子比率や遺伝子の発現強度が低いほど、ＥＰの作用に対する抑制作用を肯定できる。
　同様に、ＥＰの作用に対する増強作用の評価にあたっては、第２の遺伝子群に属する遺伝子に関する一定以上の発現減少を確認できた遺伝子数（比率）、発現減少を確認できた遺伝子の発現強度の低さが挙げられる。こうした遺伝子比率や遺伝子の発現強度の低さが大きいほど、ＥＰの作用に対する増強作用を肯定することができる。反対に、こうした遺伝子比率や遺伝子の発現強度が低いほど、ＥＰの作用に対する抑制作用を肯定できる。
（ＥＰ様化合物のスクリーニング方法）
　本明細書に開示されるＥＰ様化合物のスクリーニング方法は、第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現産物及び当該遺伝子の発現を促進する化合物、並びに、
　第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現産物に対して抑制的に作用する化合物及び発現を抑制する化合物
からなる群から選択される１又は２以上の試験化合物を動物細胞に投与する工程と、
　前記動物細胞の１又は２以上の細胞機能を測定する工程と、
を、備えることができる。
　本スクリーニング方法によれば、ＥＰの作用に関連する遺伝子の発現産物やその発現促進化合物、発現産物に対して抑制的に作用する化合物、遺伝子発現抑制化合物からなる群から試験化合物を選択し細胞に投与して細胞機能を評価することで、ＥＰの作用の少なくとも一部を実現する化合物を効率的にスクリーニングできる。
　遺伝子の発現産物としては、ＲＮＡ、タンパク質が挙げられる。また、その発現促進化合物といては、転写因子や転写因子を活性化する化合物等が挙げられる。発現産物に対して抑制的に作用する化合物としては、例えば、発現産物であるｍＲＮＡを消化するｓｉＲＮＡ等や発現産物であるタンパク質と拮抗するタンパク質等が挙げられる。遺伝子発現抑制化合物としては、ｓｉＲＮＡほか、ノックアウトのためのコンストラクト等が挙げられる。こうした化合物の投与方法は、その化合物の種類に応じて適宜決定される。例えば、タンパク質の場合には、細胞に導入する当該タンパク質の発現コンストラクトとして投与する必要がある。また、ｓｉＲＮＡの場合には、ｓｉＲＮＡコンストラクトを細胞内に導入してもよいし、ｓｉＲＮＡ自体を細胞に導入するようにしてもよい。低分子有機化合物等動物の細胞膜を透過する化合物の場合には、培地に添加してもよい。
　細胞機能の評価は、既に説明した、ＥＰが動物細胞機能増強剤として使用される場合の機能に基づいて評価することができる。すなわち、作用の評価は、細胞の種類や被験化合物の種類や作用の種類によって種々に異なるが、当業者であれば、評価の目的に応じて適宜設定することができる。
（サイトカインカインの抑制剤及び抗炎症剤）
　ＥＰは、サイトカインの抑制剤としても利用できる。ＥＰを細胞に投与することで、サイトカイン及びケモカインをコードする遺伝子の発現の抑制を確認できている。ＥＰ投与による発現が減少しているサイトカイン及びケモカインについては、既に表１５に示した。これらのサイトカイン及びケモカインは、いずれも炎症性サイトカインである。また、後述する実施例においても示すように、ＬＰＳ刺激を付与した動物細胞においては、ＩＬ－８及びＴＮＦ－αの誘導が明らかに抑制されていた。したがって、ＥＰは、サイトカイン、より具体的には、炎症性サイトカインの抑制剤である。炎症性サイトカイン（炎症誘発性サイトカイン）としては、ＡＲＥＧ、ＢＭＰ７、ＣＣＬ２７、ＣＳＦ１，ＣＸＣＬ１４、ＧＤＦ１５、ＩＬ１１、ＩＬ１８、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３１、ＩＬ４、ＩＬ５、ＴＮＦＳＦ１５、ＶＥＧＦＡ等が挙げられる。
　ＥＰは、抗炎症剤としても利用できる。すなわち、ＥＰは、炎症反応に起因する炎症性疾患の予防又は治療用組成物として用いることができる。既に記載したように、ＥＰは炎症性サイトカインをコードする遺伝子の発現を抑制し、ＬＰＳ刺激を付与した動物細胞において炎症性サイトカインであるＩＬ－８及びＴＮＦ－αの誘導を抑制する（Singhらの方法による）。これらのＥＰの抗炎症性の評価は、マクロファージのモデル細胞として長く研究の対象とされてきた細胞株であるヒト単球様培養細胞THP-1を用いて行っている。この細胞株は、近年h-CLATと呼ばれるアレルギー誘発物質の判定においても、その有用性が認められている（Toxicol In Vitro, 2006 Aug; 20 (5):763-73）。また本細胞株は、動物個体を使わない抗炎症作用のある化合物や食品評価に応用できることがSingh（Clin Chem. 2005 Dec;51 (12):2252-6）らによって示されている。
　炎症性疾患としては、例えば、多臓器（例えば、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）および強皮症など）、特定の組織または臓器（例えば、筋骨格組織（関節リウマチ、強直性脊椎炎））、消化管（クローン病および潰瘍性大腸炎）、中枢神経系（アルツハイマー病、多発性硬化症、運動ニューロン疾患、パーキンソン病、および慢性疲労症候群）、膵β細胞（インスリン依存性糖尿病）、副腎（アジソン病）、腎臓（グッドパスチャー症候群、ＩｇＡ腎症、間質性腎炎）、外分泌腺（シェーグレン症候群および自己免疫性膵炎）、および皮膚（乾癬およびアトピー性皮膚炎）に関連する自己免疫疾患；慢性炎症性疾患（例えば、変形性関節症、歯周病、糖尿病性腎症、糖尿病性潰瘍、網膜症、慢性閉塞性肺疾患、動脈硬化症、移植片対宿主病、慢性骨盤内炎症性疾患、子宮内膜症、慢性肝炎、および結核など）；ＩｇＥ媒介性（Ｉ型）過敏症（例えば、鼻炎、喘息、アナフィラキシー、皮膚炎、および眼の疾患など）を含むが、これらに限られない、炎症性疾患を治療するのに用いられ得る。皮膚炎の病状としては、光線性角化症、酒さ性ざ瘡、尋常性ざ瘡、アレルギー性接触皮膚炎、血管性浮腫、アトピー性皮膚炎、水疱性類天疱瘡、皮膚薬剤反応、多形性紅斑、紅斑性狼瘡、光線皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、強皮症、および蕁麻疹が挙げられる。眼の症状としては、加齢黄斑変性症（ＡＲＭＤ）、ドライアイ、ブドウ膜炎、および緑内障が挙げられる。
　ＥＰは、炎症性疾患に用いられる公知の抗炎症剤、抗生物質等から選択される別の治療剤もまた投与される場合又はこれらの治療剤と組み合わせて投与される場合に、本発明に従って用いることができる。
　ＥＰの炎症性疾患の予防又は治療用組成物としての使用に際しては、任意の適切な投与経路を用いることができる。例えば、経口、局所的、非経口、眼内、直腸、膣内、吸入、口腔、舌下、および鼻腔内の送達経路のいずれもが、適切となり得る。この目的のために、適切な医薬組成物を用いることができる。
　有効成分を含む医薬組成物は、経口使用に適する形態、例えば錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁液、分散性の散剤もしくは顆粒剤、乳剤、硬質もしくは軟質カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤であって良い。組成物は、即時放出形態または制御放出形態であって良い。
　なお、経口使用を意図する組成物は、医薬組成物の製造のための、当業者に知られている任意の方法に従って調製することができ、このような組成物は、甘味剤、矯味剤、着色剤、および保存剤からなる群より選択される１以上の物質を含み得るものであり、これらは当業者であれば適宜組み合わせて用いることができる。
　その他、ＥＰを有効成分とする水性懸濁液、油性懸濁液、散剤もしくは顆粒剤、乳剤、硬質もしくは軟質カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤等の公知の製剤形態を、当業者は適宜必要な添加剤を選択して製造することができる。
　ＥＰは、坐剤として製剤化されてもよいし、局所使用のためのクリーム、軟膏、ゼリー、溶液、または懸濁剤などとして製剤化されてもよい。局所適用には、洗口液および含嗽剤が含まれる。
　ＥＰの有効な投与量は、治療される個体及び投与方法により変化するものである。例えば、ヒトの経口投与を意図される製剤は、組成物の総量の約１～約９９％の間で変化し得る。例えば、投与単位形態は一般的に、約１ｍｇ～約１ｍｇの活性成分を含む。任意の個体についてのＥＰの投与レベルは、個体の年齢、体重、一般的健康状態、性別、投与に関連する食事時間(diet time of administration)、投与経路、排泄速度、薬物の組合せ、および治療を受ける特定の疾患の重篤度を含む様々な因子に因ることが理解されるであろう。
（抗酸化剤又は抗酸化ストレス剤）
　また、ＥＰは、酸化に対する細胞の抵抗性を高める。このため、ＥＰは、抗酸化ストレス剤としても利用できる。すなわち、生体における酸化に起因する疾患の予防又は治療剤として用いることができる。ＥＰを細胞に投与すると、抗酸化物質であるチオレドキシン（ＴＸＮ）や過酸化水素分解酵素（ＣＡＴ）の発現上昇が認められたこと、並びに後述する実施例でも説明するように、過酸化水素による細胞毒性を低減することがわかった。以上のことから、ＥＰは、細胞に対して酸化ストレスに抵抗性を付与できる。
　酸化や酸化ストレスに起因する疾患としては、アテローム動脈硬化症などの動脈硬化症及び動脈硬化に関連する狭心症などの、パーキンソン病、狭心症、心筋梗塞、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、脳梗塞、統合失調症、双極性障害、脆弱Ｘ症候群、慢性疲労症候群、脂質異常症、糖尿病、高血圧、心不全、肝癌。例えば、上記した炎症性疾患が挙げられる。
　ＥＰは、また、食品又は栄養補助組成物としてあるいはこれらに対する各種機能発現のための添加物として用いることができる。食品としては特に限定しないで、各種の固形食品（ゲル状食品を含む）のほか各種の液状食品が挙げられる。
　ＥＰは、当技術分野で知られている任意の適切な方法を用いて調製することができる。すなわち、ＥＰは、市販で入手可能であるか、または有機合成化学の分野における当業者によって市販で入手可能な物質から容易に得られる。
　なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　以下、本明細書の開示を具現化した実施例について説明するが、以下の実施例は本明細書の開示を限定するものではない。
（ホスホエタノールアミンの細胞増殖効果）
　９６ウェルプレートに株化正常ヒト気道上皮細胞（ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞）（ＡＴＣＣ）を１×１０4cells/ｃｍ2となるように播種した。培地は、１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０を使用した。２４時間後に、細胞をＰＢＳで２００μｌ／ウェルで穏やかに洗浄し、０、０．１２５、０．２５、及び０．５％ＦＢＳに置換した（９０μｌ／ウェル）。培地交換後、１０μｌ／ウェルでＥＰ溶液を加える。９６時間後に増殖試験（ＷＳＴ－８アッセイ）を実施した。ＷＳＴ－８アッセイの操作は以下のとおりとした。
（１）９６ウェルプレートからデカンテーション及びタッピングにより培地を除去した。
（２）予め３７℃で加温した無血清培地（ＲＰＭＩ－１６４０）に、１０分の１の割合になるように、ＷＳＴ－８試薬（同仁化学）を混和し、培地を除去したウェルに添加した。
（３）ＣＯ2インキュベータ内で１時間呈色反応を行い、吸光プレートリーダーで４５０ｎｍ及び６５０ｎｍの吸光度を測定した。
（４）各ウェル間の補正として、吸光度４５０ｎｍ－吸光度６５０ｎｍを求める。
（５）ブランクの４ウェルの平均値を全ウェルの補正値から差し引いて、これを相対的な細胞数相当値とした。結果を図１及び図２に示す。
　図１（ａ）及び（ｂ）には、異なるＦＢＳ濃度下におけるＢＥＡＳ－２Ｂ細胞に対するＥＰの細胞増殖効果を示す。（ａ）は、絶対値で示し、（ｂ）は、ＥＰ０μＭ時の吸光度に対する比として表している。
　図１（ａ）に示すように、ＥＰ濃度依存的にＢＥＡＳ－２Ｂ細胞は増殖した。ｍＭレベルでの高濃度域でも、ＥＰに起因すると考えられる明らかな毒性は認められなかった。また、ＦＢＳを一切含まない条件でも、ＥＰは細胞を増殖させることができ、０．５％ＦＢＳの時とさほど変わらず細胞を増殖させることができた。図１（ｂ）に示すように、ＦＢＳが培地に含まれていないと、低血清ストレスで細胞は死滅する（ＥＰ ０μＭ参照）。しかしながら、ＥＰを添加することで、最大１１倍の細胞増殖が認められた（図１（ｂ））。
　また、図２には、ＥＰ０μＭとＥＰ１０００μＭとの細胞増殖状態画像を示す。図２に示すように、ＥＰ０μＭでは、細胞死を起こしたりあるいは線維芽細胞状に萎縮したりしていたのに対し、ＥＰ１０００μＭでは容器底面を覆うように細胞が増殖した。また、細胞は同心円方向に進展し互いに密着した。
（初代正常ヒト気道上皮細胞（ＨＢＥｐＣ）での増殖効果）
　９６ウェルプレートにＨＢＥｐＣ細胞（IWAKI）を３×１０4cells/ｃｍ2となるように播種した。培地はＢＥＧＭ（タカラバイオ、完全培地）を使用した。２４時間後に、細胞をＨＥＰＥＳバッファーで１ウェルあたり２００μｌで穏やかに洗浄し、基礎培地（下垂体抽出物、ペプチド増殖因子を含まない培地）ＢＥＢＭに対し、抗生物質ＧＡ－１０００のみを添加したものに置換した（１ウェルあたり９０μｌ）。培地交換後、設定濃度の１０倍濃度のＥＰ溶液を１ウェルあたり１０μｌ加え、９６時間後に、増殖試験（ＷＳＴ－８アッセイ）を実施した。ＷＳＴ－８アッセイは、実施例１と同様に行った。結果を図３に示す。
　図３に示すように、初代正常ヒト気道上皮細胞に対してもＥＰは増殖促進効果を有していた。また、基礎培地には、下垂体抽出物やペプチド増殖因子を含まないため、こうしたものとの組み合わせあるいは相乗効果に依拠せず無血清培地であっても、初代正常ヒト気道上皮細胞に対して増殖促進効果があった。また、ＥＰは、濃度依存的に増殖促進効果を有しており、ｍＭレベルでも毒性を示さず７μＭでも２倍程度の増殖促進効果を発揮した。
（初代正常ヒト肺線維芽細胞　（NHLF）での増殖効果）
　９６ウェルプレートにＮＨＬＦ細胞（タカラバイオ）を３×１０4cells/ｃｍ2となるように播種した。培地は、１０％ＦＢＳＤＭＥＭを使用した。２４時間後に、細胞をＰＢＳで１ウェルあたり２００μｌで穏やかに洗浄し、０％ＦＢＳ ＤＭＥＭに置換した（１ウェルあたり９０μｌ）。培地交換後、１０μｌ／ウェルのＥＰ溶液を加え、１２４時間後に、増殖試験（ＷＳＴ－８アッセイ）を実施した。ＷＳＴ－８アッセイは、実施例１と同様に行った。結果を図４に示す。
　図４に示すように、初代ヒト線維芽細胞においても、ＥＰは、増殖促進効果を発揮することを確認した。肺の線維芽細胞の増殖は、喘息における気道リモデリング形成に大きな役割を果たす。これまで気道リモデリングは、喘息や慢性閉塞性肺疾患などの病態形成に関与すると思われていたが、線維芽細胞の増殖は損傷した上皮の創傷治癒過程における重要な役割を果たすことが明らかになりつつあり、ＥＰの喘息治癒効果の１つとして挙げられる。
（初代正常ケラチノサイト（角化細胞、HEKa）での増殖効果）
　４８ウェルプレートにＨＥＫａ細胞（タカラバイオ）を２×１０4cells/ｃｍ2になるように播種した。培地は、基礎培地Epilife（M-EPI-500-CA, Invitrogen）に対し、添加因子としてHKGS Kit (S-001-K, Invitrogen)を使用した。なお、このHKGS Kitには、ウシ下垂体抽出物、ウシインシュリン、ヒドロコルチゾン、ウシトランスフェリン及びヒトＥＧＦを含んでいる。２４時間後に、細胞を１ウェルあたり４００μｌのＰＢＳで穏やかに洗浄し、１ウェルあたり２５２μｌの基礎培地 Epilife に置換し、２４時間培養した。培養後、ＥＰ溶液を１ウェルあたり２８μｌ加え、ＥＰ投与後２１日後に、増殖試験（ＷＳＴ－８アッセイ）を実施した。ＷＳＴ－８アッセイは、試薬及び培地量を２．８倍とする以外は実施例１と同様に行った。結果を図５に示す。
　図５に示すように、初代ヒトケラチノサイトにおいても、ＥＰは増殖促進効果を発揮した。増殖促進効果は、最低濃度15.6μＭでほぼ最大効果が得られている。ケラチノサイトは皮膚を構成する細胞であり、この細胞を増殖および機能付加を行う物質は極めて有用性が高い。再生医療における、皮膚シートの作製時に、ＥＰを応用することが可能であり、動物性のタンパクを含まない、アレルギー作用の少ない組織片作製のための培地成分として利用が可能である。
（初代正常ヒト毛乳頭細胞　（HHDPC）での増殖効果）
　９６ウェルプレートにＨＨＤＰＣ細胞（コスモバイオ）を１×１０4cells/ｃｍ2となるように播種した。培地は、完全培地ＭＳＣＭ（500、ScienCell）を使用した。２４時間後に、細胞を１ウェルあたり２００μｌのPBSで穏やかに洗浄し、１ウェルあたり９０μｌの０％ＦＢＳ ＤＭＥＭに体積比１％の完全培地ＭＳＣＭを添加したものに置換して24時間培養した。培養後、ＥＰ溶液を１ウェルあたり１０μｌ加え、ＥＰ投与後６日後に、増殖試験（ＷＳＴ－８アッセイ）を実施した。ＷＳＴ－８アッセイは、実施例１と同様に行った。臨床で発毛作用が認められているミノキシジルについても同様に試験した。結果を図６に示す。
　図６に示すように、ＥＰは、臨床で発毛作用が認められているミノキシジルと同等あるいはそれ以上の増殖効果を発揮した。ミノキシジルの有効濃度は数十～４００ｎＭの狭い範囲であり、それ以上では毒性が出るが、本成分は非常に広い濃度域で増殖効果が認められており、安全性の高い化合物であることがわかった。また、ミノキシジルは高濃度であると細胞毒性を呈するが、ＥＰは細胞内内在性物質であり毒性を呈しない点において有利である。ＨＨＤＰＣ細胞における増殖効果とヒトにおける発毛／育毛作用との相関が既に認められており、ＥＰは、発毛／育毛剤として利用可能であることがわかった。
（がん細胞、および不死化モデル細胞での増殖効果）
（１）Ａ５４９およびＨＥＫ２９３細胞；付着系細胞の場合
　９６ウェルプレートにＡ５４９(ヒトII型肺胞上皮細胞：腺癌）及びＨＥＫ２９３（アデノウイルス不死化ヒト胎児腎細胞）を１×１０4cells/ｃｍ2になるように播種した。培地は０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０を使用した。播種から２４時間後に、１ウェルあたり２０μｌのＰＢＳで細胞を洗浄し、０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０に置換した。培地交換後、設定濃度の１０倍濃度のＥＰ溶液を１ウェルあたり１０μｌ加えた。ＥＰ添加後９６時間後に、増殖試験（WST-8 アッセイ）を実施した。ＷＳＴ－８アッセイは、実施例１と同様に行った。結果を図７に示す。
（２）ＴＨＰ－１、ＨＬ－６０細胞；浮遊経系胞の場合
　ＥＰ投与前に対数増殖状態になるように、１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０にて２～１０×１０5cells/ｃｍ2となるように１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０にてＴＨＰ－１（ヒト急性単球性白血病細胞）およびＨＬ－６０（ヒト骨髄性白血病細胞）を対数増殖培養した。その後、１０００ｒｐｍで細胞培養液を遠心・沈殿させ、０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０に２×１０4cells/ｃｍ2になるように、１ウェルあたり９０μｌを９６ウェルプレートに分注した。次いで、ＥＰ溶液を１ウェルあたり１０μｌ加えて、７２時間後に、増殖試験（ＷＳＴ－８アッセイ）を行った。浮遊系の細胞に対するＷＳＴ－８アッセイは、培養中の細胞懸濁液に対して、直接ＷＳＴ－８アッセイ試薬を１ウェルあたり１０μｌずつを分注し、１時間後に、４５０ｎｍ、６００ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定し、以上の実施例と同様にデータ解析を行った。結果を図８に示す。
　図７に示すように、Ａ５４９、ＨＬ６０及びＨＥＫ２９３については、ＥＰは高濃度域でも全く細胞増殖能を示さなかった。これに対して、ＴＨＰ－１については、１２５μＭ以上の高濃度域においてわずかに細胞増殖能が認められた。
　以上の結果から、ＥＰは、正常細胞に対して高い選択性で増殖効果を発揮し、がん細胞に対してはほとんど増殖効果を発揮しないことがわかった。
（ＭＥＫ１／２阻害剤による本成分の増殖効果の抑制確認実験）
　細胞増殖の調節はいくつもの細胞内シグナルが介在することが知られている。一般的には細胞外からの増殖シグナル（ホルモン）が、細胞膜レセプターに結合し、細胞内のタンパクを数段階の階層シグナルで活性化し、最下層の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（Mitogen-activated Protein Kinase；ＭＡＰＫ）が細胞核内に移行し、次いで細胞増殖に必要な遺伝子の発現調節を行う事が知られている。ＭＡＰＫはいくつかのファミリーが知られており、ＥＲＫ１／２、ＪＮＫ、ｐ３８，ＥＲＫ５，ＥＲＫ７などが同定されている。ＥＰの増殖効果のメカニズムとして上記のいずれかが想定された。予備検討を実施したところＥＲＫ１／２の上位階層にあるＭＥＫ１／２（ＥＲＫ１／２を活性化（リン酸化する分子））阻害薬により増殖効果が抑制されることが分かった。
　株化正常ヒト気道上皮細胞ＢＥＡＳ－２Ｂを１ｘ１０4cells/ｃｍ2になるように、９６ウェルプレートに播種した。培地には１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０を使用した。２４時間後にＭＥＫ１／２ 阻害薬Ｕ０１２６（Ｃａｙｍａｎ）を含む１ウェルあたり９０μｌの０．１％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０で置換した。その後、２．５μＭのＥＰ溶液を１０ｕｌ／ウェルで加えた（最終濃度２５０ｎＭ）。７２時間経過後、増殖試験（ＷＳＴ－８アッセイ）を実施した。ＷＳＴ－８アッセイは、実施例１と同様に行った。結果を図８に示す。
　図８に示すように、ＭＥＫ１／２阻害薬で添加しないとき、ＥＰ２５０μＭによる処理によって、細胞が３倍程度に増殖した。一方、異なるＭＥＫ１／２阻害薬を投与したとき、当該薬剤の単独処理により細胞数の減少が認められるが、２５μＭのＥＰによる増殖抑制効果はそれよりも上回っていた。以上のことから、ＥＰの増殖メカニズムの一つとして、ＭＥＫ１／２およびその下流のＭＡＰＫであるＥＲＫ１／２を介した増殖シグナルが関与していることがわかった。
（ＥＰの代謝上位／下位物質による増殖効果）
　ＥＰは細胞膜の主要成分ホスファチジルコリン（レシチン）および神経組織に多く存在するホスファチジルエタノールアミンなど細胞に必須なリン脂質の前駆体であることが知られている。ＥＰの増殖効果が、これら細胞構成物質の補給に起因するかどうかを確認するための実験として、ＥＰの代謝上位および下位の物質による増殖効果有無の検討を行った。ＥＰ及びＥＰの上位／下位成分の上記細胞構成成分に至る代謝マップを図９に示す。
　株化正常ヒト気道上皮細胞ＢＥＡＳ－２Ｂを１ｘ１０4cells/ｃｍ2になるように、９６ウェルプレートに播種した。培地には１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０を使用した。２４時間後に、１ウェルあたり９０μｌの０．１％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０で置換した。ＥＰおよびＥＰ代謝誘導体を１０μｌ／ウェルで加えた。７２時間後に、増殖試験（ＷＳＴ－８アッセイ）を実施した。ＷＳＴ－８アッセイは、実施例１と同様に行った。ＥＰ及びその誘導体による増殖／毒性作用を図１０に示す。
　図１０に示すように、ＥＰは用量依存的に増殖作用をもたらしたが、その他の成分では大きな増殖促進作用は認められなかった。また、ＥＰの代謝上位にあるエタノールアミンの作用は、ＥＰに比べて極めて微弱であることがわかった。以上のことから、ＥＰの増殖作用は脂質前駆体の補給によるものではなく、ＥＰの特異的作用であることがわかった。
（ＧＡＢＡ受容体作動薬による増殖効果およびＧＡＢＡ‐Ａ受容体拮抗薬による増殖抑制作用）
　本成分を包括的化合物データベースであるＰｕｂＣｈｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）にて構造類似化合物を検索すると、生理活性物質ＧＡＢＡ‐Ａ受容体作動薬のｈｏｍｏｔａｕｒｉｎｅが該当する。本成分による細胞増殖効果がＧＡＢＡ受容体を介するかどうかを確認するために、ＧＡＢＡ作動薬および拮抗薬による介入実験を実施した。
　株化正常ヒト気道上皮細胞 ＢＥＡＳ－２Ｂを１ｘ１０4cells/ｃｍ2になるように、９６ウェルプレートに播種した。培地には１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０を使用した。２４時間後に、１ウェルあたり９０μｌの０．１％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０に置換した。次いで、ＧＡＢＡ （ＧＡＢＡ－ＡおよびＧＡＢＡ－Ｂ受容体作動薬）およびｈｏｍｏｔａｕｒｉｎｅ（ホモタウリン）（ＧＡＢＡ－Ａ作動薬）を１ウェルあたり１０μｌ加えた。７２時間後に増殖試験（ＷＳＴ－８アッセイ）を実施した。ＷＳＴ－８アッセイは実施例１と同様に行った。結果を図１１に示す。
　株化正常ヒト気道上皮細胞ＢＥＡＳ－２Ｂを１ｘ１０4cells/ｃｍ2になるように９６ウェルプレートに播種した。培地には１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０を使用した。２４時間後に、１ウェルあたり、ＧＡＢＡ－Ａ阻害薬（（－）－Ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅ Ｍｅｔｈｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，＃１４３４３ ＳＩＧＭＡ；ＢＭと略）を含む９０μｌの０．１％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０で置換した。ＥＰ溶液を１ウェルあたり１０μｌ加えた。７２時間後に増殖試験（ＷＳＴ－８アッセイ）を実施した。ＷＳＴ－８アッセイは実施例１と同様に行った。結果を図１２に示す。
　図１１に示すように、ＧＡＢＡ－ＡおよびＧＡＢＡ－Ｂ受容体作動薬ＧＡＢＡおよびＥＰ構造類似物質ＧＡＢＡ－Ａ受容体作動薬ホモタウリンは統計的に有意な増殖作用をもたらさなかった。また、図１２に示すように、ＧＡＢＡ－Ａ受容体拮抗薬ＢＭによりＥＰの増殖作用は阻害されなかった。以上のことから、ＥＰの増殖作用はＧＡＢＡ受容体を介さないメカニズムによりもたらされることがわかった。
（ＥＰによる無血清誘導カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）３／７活性上昇阻害効果）
　ＥＰは無血清において、単独で細胞増殖をもたらす。一般的に動物細胞は複数の増殖因子の存在がなければ生存できない。これらが欠如すると、細胞に備わったアポトーシスと呼ばれる自殺機能（プログラムされた細胞死）が稼動する。アポトーシスの細胞内経路はいくつか知られているが、知られている全てのアポトーシス経路はｃａｓｐａｓｅ３／７とよばれるペプチダーゼの活性上昇に集約される。よって、本成分のアポトーシス調節作用の有無はｃａｓｐａｓｅ３／７活性を測定する事により推定が可能となる。そこで以下の実験を行った。
　株化正常ヒト気道上皮細胞ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞を５ｘ１０4cells/ｃｍ2になるように９６ウェルプレートに播種する。培地は、１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０を使用した。２４時間後に、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳで細胞を穏やかに洗浄し、１ウェルあたり９０μｌの０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０で置換した。培地交換後、ＥＰあるいはＦＢＳ溶液を１ウェルあたり１０μｌ加えた。２４時間後に、増殖試験（ＷＳＴ－８アッセイ）及びｃａｓｐａｓｅ３／７アッセイ（Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ３／７アッセイ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を実施した。ＷＳＴ－８アッセイは実施例１と同様に行い、ｃａｓｐａｓｅ３／７アッセイは、添付文書どおり行った。ｃａｓｐａｓｅ　３／７活性は発光試験により測定し、ブランク平均値を引いた値から、ＷＳＴ－８アッセイの補正吸光度（相対的な細胞数に相当）で除算することにより、細胞あたりのｃａｓｐａｓｅ　３／７活性を算出した。結果を図１３に示す。
　図１３左のＦＢＳ濃度とカスパーゼ３／７活性との関係に示すように、無血清培地に交換する事により上昇したカスパーゼ３／７活性はＦＢＳ添加により濃度依存的に低下した。一方、図１３右のＥＰ濃度とカスパーゼ３／７活性との関係に示すように、ＥＰ１０００μＭでカスパーゼ３／７活性は０．７２倍程度に低下した。回帰曲線により、ＥＰ１０００μＭは、ＦＢＳ２．２％の効果に相当する。以上のことから、ＥＰは細胞増殖能に加え、アポトーシス経路の最終シグナル経路であるｃａｓｐａｓｅ３／７を強く阻害することがわかった。したがって、ＥＰはアポトーシス抑制剤として機能することがわかった。
（ＥＰによる株化正常気道上皮細胞のバリア機能（経上皮電気抵抗・物質透過性）
　株化正常ヒト気道上皮細胞ＢＥＡＳ２Ｂをセルカルチャーインサート（３５３１０４，ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ）に１ｘ１０5cells/ｃｍ2となるように播種した（図１４参照）。使用培地は１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０とした。培地量は、インサート側２００μｌ、ウェル側を７５０μｌとした。翌日、１％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０に以下４条件の試薬を調製したものに１日１回置換／培地交換し、ＭｉｌｌｉＣｅｌｌ（ミリポア）にて経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）を測定した。
　　　条件１；　コントロール
　　　条件２；　ＥＰ　１ｍＭ
　　　条件３；　デキサメタゾン　１μＭ　（デキサメタゾン（Ｄｅｘ）：バリア機能を高めることを知られる陽性対照物質）
　　　条件４；　ＥＰ　１ｍＭ　およびＤｅｘ　１μＭ
　細胞播種から７日後に、透過性試験を以下のとおり実施した。
[透過性試験]
　４Ｋダルトンの蛍光デキストラン分子（ＳＩＧＭＡ）を０．１ｍｇ／ｍｌになるようにセルカルチャーインサートに加え、１時間後、ウェル側の培地を２０μｌ取り出し、各濃度における蛍光強度から浸透した蛍光デキストラン量を推定した。インサート側からウェル側への物質の浸透速度Ｐａｐｐは一般的に下記の式で求められる。結果を図１４に示す。
　　　　　Ｐａｐｐ＝（ウェル側培地の体積／インサート面積×初期インサート濃度）×（ウェル側の変化濃度／経過時間）
　図１４左に示すように、ＥＰを投与した株化正常ヒト気道上皮細胞ＢＥＡＳ２Ｂでは４９％のＴＥＲの上昇が認められた。上皮のバリア機能は、一般的には、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）に相関することが知られており、物質の透過速度はＴＥＲと逆相関の関係にある。図１４右に示すように、蛍光デキストラン分子の透過速度Ｐａｐｐを測定したところ、ＥＰを投与した細胞においては、２５％もの透過速度の低下、すなわち、バリア機能の亢進が認められた。また、この細胞においては、陽性対照物質であるデキサメタゾン単独処理、及びデキサメタゾンとＥＰとの共処理ではＴＥＲ上昇、Ｐａｐｐの低下は認められなかった。以上のことから、ＥＰには、バリア機能の亢進および上皮細胞の増殖効果により、喘息患者の損傷した気道域においてアレルゲン等の透過が妨げられることにより、喘息治療効果が期待できる。
（ＢＥＡＳ－２Ｂ以外の細胞におけるＥＰのバリア機能修飾作用）
（Ｃａｌｕ－３　ヒトがん化気道上皮細胞）
　Ｃａｌｕ－３をセルカルチャーインサート（３５３１０４，　ＢＤ　ＦＡＬＣＯＮ）に３ｘ１０5cells/ｃｍ2になるように播種した。１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０にてコンフルエントになるまで培養し、コンフルエントになった時点で、０．１％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０に下記を含むものに置換し、１日１回培地交換した。実施例１１と同様にＴＥＲを測定した。結果を図１５に示す。
　　　条件１；　コントロール
　　　条件２；　デキサメタゾン　１μＭ
　　　条件３；　ＥＰ　１ｍＭ
（ＨＥＫａ　ヒト初代正常ケラチノサイト、成人）
　ＨＥＫａをセルカルチャーインサート（３５３１０４，ＢＤ ＦＡＬＣＯＮ）に６ｘ１０4cells/ｃｍ2になるように播種した。培地は基礎培地Ｅｐｉｌｉｆｅ（Ｍ－ＥＰＩ－５００－ＣＡ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対し、添加因子としてＨＫＧＳ Ｋｉｔ（Ｓ－００１－Ｋ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた完全培地で培養し、コンフルエントになった時点で、完全培地にＣａｌｕ－３と同様の条件１～３で特定化合物を含むものに置換し、１日１回培地交換した。実施例１１と同様にＴＥＲを測定した。結果を図１５に示す。
　図１５左に示すように、Ｃａｌｕ－３、ＨＥＫａともにコントロールに対して統計的に有意なＴＥＲ値の上昇が認められた（それぞれ２．０および２．３倍）。これらの結果から、ＥＰによるバリア機能亢進作用は上皮細胞に一般的に認められる作用であることがわかった。また、ヒトの皮膚を構成するケラチノサイトの場合、ＥＰにより細胞増殖の促進およびＴＥＲ値の向上がみられるため、再生医療分野での質の高い移植片作製の際の有力な補助剤、あるいは化粧品分野における肌荒れ、敏感肌などに対する添加剤、あるいは抗アトピー薬有効成分として利用することが可能である。
　本実施例はＥＰの各種作用に関連してDNAマイクロアレイによる網羅的な遺伝子発現解析を実施した。
（細胞、アレイ、試薬等）
　実験には正常株化気道上皮細胞BEAS-2Bを用いた。この細胞は10% FBS RPMI-1640で拡大培養し、24ウェルプレートに1x105/cm2の密度で播種した。24時間後に0.1% FBS RPMI-1640に置換し、最終濃度0 もしくは1mM EPになるように投与した（n=４）。24時間後、細胞をDNAマイクロアレイのサンプルとした。RNA抽出はQIAGEN社のRNeasy Mini Kitを使用した。DNAマイクロアレイ実験はWhole Human Genome  DNA マイクロアレイ 4x44K（Agilent)を利用し、DNAマイクロアレイ実験に必要なラベリング試薬等は全てAgilent社のものを用いた。
（DNAマイクロデータの解析）
　DNAマイクロアレイ実験データは専用解析ソフトGeneSpring (Agilent)にて統計解析および変動した遺伝子から遺伝子の機能解析（Gene Ontology [GO]解析）を実施した。GO解析は統計的に有意に変動した遺伝子セットが既知の機能分類遺伝子セットにどれぐらい当てはまるかを確率的に求めるものである。計算されたp値は与えられた全ての遺伝子数(本DNAマイクロアレイでは約4万の遺伝子数)から実際に変動した遺伝子の数だけ任意に取り出した時に、それらの遺伝子から類推される機能分類が、どれぐらいの確率で偶然起き得るかを示すものである。p値の計算式は下記の通り。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000022
N;　全アレイ遺伝子数
Np; アレイ中のある機能分類に含まれる遺伝子の総数
Nq; ある機能分類に含まれない遺伝子の総数
x; 変動遺伝子の中にある機能分類が含まれていた数
n; 変動遺伝子の総数
　細胞を1mM EP処理24時間後に変動した遺伝子のうち、1.5倍以上および1/1.5倍以下（p<0.05）に発現変化したプローブ*（遺伝子）は801および1939個であった。それぞれGO解析を実施し、一つの機能分類に関して、3個以上の遺伝子を含みかつp<0.05を満たすものをそれぞれ表７及び表８に示した（p値による上位20機能）。EP処理により、BEAS-2Bおよび多くの細胞の増殖が促進された。この時、EPにより発現上昇した遺伝子の中で細胞増殖に関連する機能に該当するものとしては、血管形成や分化に関与する遺伝子機能（GO:0001568, GO:0048514, GO:0001944）などが多く含まれていた。EPの細胞増殖を担う機能分子としてこれらの遺伝子（29プローブ*、20遺伝子）が挙げられる（表９）。また、GO解析では上位20位に含まれないが、細胞増殖(cell proliferation: GO:0008283)に関与する遺伝子のうち、1.5倍以上, p<0.05を満たす遺伝子（16プローブ*、12遺伝子）を表１０に示した。これらの遺伝子はEPの細胞増殖機能を担う実行分子となりうることがわかった。
　なお、プローブは、DNAマイクロアレイ中に搭載されている遺伝子の断片的なＤＮＡ配列である。なお、同じ遺伝子が複数プローブを持つ（重複がある）場合があるため、遺伝子の種類はプローブ数よりも少ない。
　EPにより、アポトーシス（細胞の自殺機能）が抑制されることをこれまでに見出した。これを裏付けるように、発現低下した遺伝子の中にはアポトーシス関連機能が際立っていた（上位20機能分類中9個、表８）。アポトーシス制御（regulation of apoptosis, GO: 0042981)に関して発現減少していた遺伝子は147プローブ（123遺伝子）存在した。「アポトーシス制御」はアポトーシスを促進あるいは抑制する機能を含む。また本GO解析は、コンピュータによる自然言語処理により抽出されており、一部該当機能との関連が認められないものが含まれる可能性がある。よって、本147プローブに関して、アポトーシスとの関連を医学生物学文献データベースであるPubMedにより調査し、その結果を表１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　GO解析では主要なEP機能として挙がらなかったが、EPにより統計的に有意に発現上昇（1.5倍以上、p<0.05)したアポトーシス制御遺伝子の促進あるいは抑制効果を表１７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　EPにより、アポトーシスが抑制されることから、発現減少した遺伝子でアポトーシス抑制に重要なのはアポトーシス促進効果のある遺伝子であり、逆に発現上昇した遺伝子のうちアポトーシスを抑制する遺伝子がEPによるアポトーシス抑制機能をもたらす実効分子として挙げられる（表１１～１４）。
　特に、主要な細胞死リガンドであるFASLGのレセプターであるFAS(A_23_P63896, TNF receptor superfamily, member 6) (FAS), transcript variant 1, NM_000043）は0.36倍 (p=0.0046)発現減少しており、有力なアポトーシス抑制実行分子として挙げられる。
（EPにより発現減少した遺伝子のH2O2処理サンプルでの遺伝子発現動態比較）
　EPは酸化ストレスにより誘導される低分子として同定された。一方EPを細胞に投与すると細胞増殖機能の他、アポトーシス抑制作用をもたらす事を見出した。このことからEPは酸化ストレスに対して何らかの保護的な機能をもたらしている可能性があるため、代表的な酸化ストレス試薬である過酸化水素H2O2による遺伝子発現の相関解析を行った。
　EPの遺伝子発現データは実施例１３のものを使用する。細胞調整およびH2O2投与は実験１３と同様の方法で行い、最終濃度125μＭ H2O2を6時間処理したものをDNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析サンプルとした。
　EPにより2倍以上発現減少（p<0.05）したアポトーシス関連遺伝子（apoptosis, GO:0006915, 全734プローブ）のうち、EPおよびH2O2においてシグナルが検出可能な（マイクロアレイ解析ソフトGeneSpringにてPresent or Marginal）有効データ30プローブに関してボックスプロットを図１６に示した。EPにより発現減少したアポトーシス関連遺伝子は、酸化ストレス試薬H2O2により概ね発現上昇しており、EPは細胞に対して酸化ストレスと相反する作用をもたらすことが明らかになった
（全アポトーシス関連遺伝子のEPおよびH2O2処理サンプル間の遺伝子発現動態比較）
　全アポトーシス関連遺伝子（apoptosis, GO:0006915, 全734プローブ）を、EPおよびH2O2において十分なシグナルが得られた有効データ611プローブに関する散布図を図１７に示す。アポトーシス関連遺伝子は発現上昇・減少含めゲノムレベルにおいて、統計的に有意な負の相関にあることが示された（ピアソン相関係数0.48, p=3x10-37）。
（酸化還元関連遺伝子のEPおよびH2O2処理サンプル間の遺伝子発現動態相関解析）
　上記散布図からアポトーシス関連遺伝子におけるEPとH2O2の発現変動は負の相関が認められた。このことから、EPにより細胞内が酸化ストレスに対して保護的（還元的）な環境がもたらされている可能性がある。酸化還元関連遺伝子は、細胞内の酸化・還元状態に対して発現が調節されており、EPにより細胞内が還元的な作用がもたらされているとすると、これらの遺伝子は酸化ストレスにおける動態と逆相関となる。
　酸化ストレス関連遺伝子（oxidation reduction GO:0055114 ）に関して、EP-H2O2間の遺伝子発現相関解析を行ったもの（ボックスプロット:21プローブ、散布図; 614プローブ）を図１８及び図１９に示した。アポトーシス関連遺伝子同様、酸化還元関連遺伝子はEPおよびH2O2処理間で負の相関があることが、EPにより有意に発現減少したセットならびにゲノムレベルにおいて示された（ピアソン相関係数 -0.19,  p=2x10-6）。
　個別の遺伝子に着目すると、酸化ストレス指標として一般的に利用されるヘムオキシゲナーゼ-1 （A_23_P120883, HMOX1, heme oxygenase (decycling) 1, NM_002133)が1/2.3倍（p=0.017）に発現減少しており、EPによる細胞内の還元化が示唆された。また、この還元化に関して遺伝子発現産物であり抗酸化物質であるチオレドキシン（A_24_P175519, TXN, thioredoxin, NM_003329)の発現が1.4倍(p=0.021)に発現上昇しており、EPの抗酸化ストレス機能の実行分子のひとつとして挙げられる。
（サイトカイン・ケモカイン類のEP-H2O2処理による遺伝子発現動態比較）
　EPは酸化ストレスでもたらされるアポトーシス、酸化還元関連遺伝子の発現動態と負の相関にあることを示した。酸化ストレスは細胞死の他に、サイトカイン類など炎症を誘発する遺伝子や炎症などをもたらす免疫細胞を誘引するケモカイン類を発現誘導することが知られている。EPおよびH2O2により統計的に有意に発現変化（1.5倍以上あるいは1/1.5倍以下に発現変化、p<0.05）した遺伝子の数を図２０に示した。H2O2処理ではサイトカイン、ケモカインともに発現誘導がもたらされた。一方、ＥＰは特にサイトカイン類を多く発現減少させており、炎症反応を抑える機能としては表１５に示すサイトカイン類およびケモカイン類を減少させることが挙げられる。なかでも、炎症誘発性サイトカインとしては、ＡＲＥＧ、ＢＭＰ７、ＣＣＬ２７、ＣＳＦ１，ＣＸＣＬ１４、ＧＤＦ１５、ＩＬ１１、ＩＬ１８、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３１、ＩＬ４、ＩＬ５、ＴＮＦＳＦ１５、ＶＥＧＦＡ等が挙げられる。
　以上の結果から、EPおよび酸化ストレス物質H2O2によって変動する分子は逆相関にあることから、EPが細胞に対して酸化ストレスに対して保護的な作用（抗酸化作用）をもたらすことが期待される。EPによるこのような細胞保護効果の作用機序を明らかにするために、抗酸化に関連する遺伝子機能分類である酸化還元（oxidation reduction, GO:0055114）および細胞酸化還元恒常性(cell redox homeostasis, GO:0045454)に着目し、酸化ストレスに対して防御的な遺伝子の変動の抽出を行った。結果を表１８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　表１８に示すように、酸化還元（oxidation reduction, GO:0055114）および細胞酸化還元恒常性(cell redox homeostasis, GO:0045454)に関する遺伝子のうち、EPにより1.4倍以上発現上昇し、p<0.05以下を満たすプローブの数は34個あった。うち、遺伝子の発現上昇により、細胞保護作用・抗酸化作用あるいは酸化ストレスに起因する疾患に対する組織保護作用が推定される。あるいは、遺伝子の発現減少あるいは機能欠失により、酸化ストレスやそれに起因する疾患などがもたらされる遺伝子に関して、医学生物学文献データベースであるPubMedにより調査し、関連が認められるものに関して文献IDを表１８最右列に付した。
　酸化還元（oxidation reduction, GO:0055114）および細胞酸化還元恒常性(cell redox homeostasis, GO:0045454)に該当する遺伝子セットのうち、上述のようにTXNの他、カタラーゼ（A_23_P105138, CAT, catalase (CAT), mRNA [NM_001752], NM_001752）やNADPH:キノンレダクターゼ-1(A_23_P206661, NQO1, NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1 (NQO1), transcript variant 1, mRNA, NM_000903)などの活性酸素除去酵素や解毒代謝酵素の発現上昇をもたらす。特にCATは過酸化水素の除去酵素として機能するため、本遺伝子の発現上昇は活性酸素による細胞損傷に対して保護的に機能する。またNOQ1はキノン類の還元に関わる酵素であり、活性酸素の産生を抑制する抗酸化酵素としても知られている。
（ＥＰ処理による酸化ストレス耐性獲得の確認）
　EPによるによる遺伝子発現変化は、酸化ストレスによるそれと逆の相関にある。特に酸化ストレス指標HMOX1の発現減少は、細胞内が定常状態よりも還元的な環境をもたらされている事を示唆し、それを裏付けるように抗酸化物質であるTXNの発現上昇が認められている。一方で、上記のことは遺伝子発現変化からの機能類推であり、実際に酸化ストレスによる細胞毒性がEPにより減弱されることを示す必要がある。このため、以下の実験を行った。
　正常株化気道上皮細胞BEAS-2Bを96 ウェルプレートに1x105/cm2の密度で播種し、24時間後に最終濃度0, 250, 500μＭ EPを含む0.5% FBS RPMI-1640に置換した。培地交換からさらに24時間後に0.5% FBS RPMI-1640に置換し、段階希釈したH2O2を投与した (n=4)。H2O2投与から24時間後に細胞毒性試験WST-8 アッセイ（Cell Counting Kit-8, 同仁化学研究所）を実施した。データ解析は統計解析ソフトGraphPad Prism 5を用い、50%細胞死濃度EC50を算出した。0, 250μＭ, 500μＭ EPを前処理した細胞におけるH2O2による細胞死の用量応答曲線を図２１に示した。
　図２１に示すように、250μＭ および500μＭ EP前処理はEP前処理のないグループに比べ、高濃度H2O2で毒性が現れており、酸化ストレスに対して耐性能を獲得していることが示された。一般的に、化合物の細胞毒性の強さは50%細胞死濃度EC50の逆数に比例する。各EP前処理におけるEC50およびその時の相対毒性を表１９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　表１９に示すように、２５０－５００μＭＥＰ処理によりＨ２Ｏ２の細胞毒性はおよそ３割程度減弱していることが示された。このことは、ゲノムレベルでの遺伝子発現変化のみならず、細胞の表現型として酸化ストレスに対して耐性能がＥＰにより付与されたといえるものである。
　実施例１５より、ＥＰにより多くのサイトカイン・ケモカインの発現抑制をもたらされることが明らかになった。このことはＥＰに抗炎症作用の可能性を示唆するものである。炎症は細菌などの異物の刺激によって、全ての組織で生じうる急性反応であり、次いで血管透過性の亢進や、リンパ球などの免疫担当細胞の炎症部位への浸潤、免疫担当細胞から炎症誘発性サイトカイン分泌による炎症反応の拡大に繋がる。実施例１５で使用した細胞は気道上皮細胞であり、免疫担当細胞における同様の効果を確認する必要がある。また、実施例１５は遺伝子発現レベルの効果であり、抗炎症作用を示すには炎症担当細胞からの分泌される炎症誘発性サイトカインやケモカインが機能体であるタンパクレベルでの分泌抑制を示す必要がある。以下の実施例では、Singhら（Clin Chem, 2005 Dec; 51(12):2252-6）の方法によりＥＰの抗炎症作用を確認した。
　ヒト単球様培養細胞ＴＨＰ－１を１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０を増殖培地として、以下のように対数増殖培養を行った。２４ｗｅｌｌｐｌａｔｅに４ｘ１０5／ｍｌになるように播種し（５００μｌ／ｗｅｌｌ）、ＥＰを含む増殖培地を追加的に添加し、最終的に目的のＥＰ濃度（０．１ｍＭ、１ｍＭ）になるように調整した。ＥＰ投与２時間後、さらにＬＰＳ（リポサッカライド）を含む増殖培地を投与して、０．１μｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌとなるように調整した。
　リポサッカライドを投与後４時間及び２４時間後に、培地を回収し遠心により細胞を沈殿させ、培地上清をＥＬＩＳＡの試料とした。なお、ＥＬＩＳＡの測定指標として、Ｓｉｎｇｈらの報告と同じく炎症誘発性サイトカインＴＮＦα及び炎症担当細胞を誘引するケモカインであるＩＬ－８を用いた。結果を図２２及び図２３に示す。
　Ｓｉｎｇｈらは短時間のＬＰＳ処理によるＴＮＦαの分泌抑制により抗炎症薬のスクリーニングが可能であると報告している（既出）。これはＬＰＳ刺激によるＴＮＦαの分泌促進が、通常なら２～６時間程度でピークとなるためである。図２２に示すように、１μｇ／ｍｌ ＬＰＳ刺激による誘導ＴＮＦα量が４時間刺激では約２６０ｐｇ／ｍｌ（ＥＰなし）であったのに対し、２４時間刺激では約７０ｐｇ／ｍｌ（ＥＰ１ｍＭ）に減少しており、Ｓｉｎｇｈらにおける評価と同様の結果となっていた。また、図２２に示すように、ＥＰは、４時間及び２４時間刺激の双方において、ＴＮＦα誘導を用量依存的に分泌抑制している。
　また、図２３に示すように、ＩＬ－８においても用量依存的な分泌の抑制がＥＰによりもたらされていた。ＩＬ－８はＬＰＳ刺激に対して４時間よりも２４時間において分泌促進されやすい傾向にあったが、２４時間刺激後においてＥＰによるＩＬ－８分泌抑制効果が明確に現れていた。
　さらに、図２２及び図２３において、２４時間目（２時間の前処理を含むとＥＰ処理２６時間目）ではＥＰはＬＰＳ未処理の細胞に対しても、ＴＮＦα、ＩＬ－８の分泌を抑制していた。すなわち、１ｍＭＥＰ２６時間処理でＴＮＦαを約７８％、ＩＬ－８を約４３％分泌抑制した。これは特にＬＰＳなどのような刺激がなくとも、マクロファージのような免疫担当細胞からのサイトカインやケモカインの恒常的な分泌抑制効果が発揮されることを示すものである。
　近年、メタボリックシンドロームに見られるように、肥満により特に外傷や感染症がない状態でも血中のＴＮＦαなどの炎症性サイトカインの濃度上昇が動脈硬化のような疾患へ繋がることが報告されている（Isr Med Assoc J. 2008 Jul; 10(7):494-8）。また、肥満時に血中に増加する酸化ＬＤＬによりマクロファージファージよりＴＮＦ－αが産生され、動脈硬化が促進されると考えられている（Artrioscler Thromb Vasc Biol. 1996 Dec; 16(12); 1573-9）。
　以上のことから、ＥＰは抗炎症効果が期待されるだけでなく、炎症によって誘発されるサイトカインやケモカインによりもたらされる疾患（動脈硬化またはそれによる心筋梗塞や脳梗塞のような閉塞性血管傷害）に対しても予防・治療的な効果をもたらす可能性があることがわかった。
　以上、本発明の実施形態および実施例について詳細に説明したが、これらは例示に過ぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。
　本明細書または図面に説明した技術要素は、単独であるいは各種の組合せによって技術的有用性を発揮するものであり、出願時請求項記載の組合せに限定されるものではない。また、本明細書または図面に例示した技術は複数目的を同時に達成し得るものであり、そのうちの一つの目的を達成すること自体で技術的有用性を持つものである。

Claims (19)

  1. 　エタノールアミンリン酸を有効成分として含有する、動物細胞機能増強剤。
  2. 　血清及び増殖因子不存在下での細胞増殖剤である、請求項１に記載の動物細胞機能増強剤。
  3. 　気道上皮細胞、肺線維芽細胞、角質上皮細胞及び毛乳頭細胞からなる群から選択される１種又は２種以上の動物細胞の細胞増殖剤である、請求項１又は２に記載の動物細胞機能増強剤。
  4. 　異形性細胞よりも正常細胞を選択的に増殖する細胞増殖剤である、請求項１～３のいずれかに記載の動物細胞機能増強剤。
  5. 　上皮系細胞のバリア機能促進剤である、請求項１に記載の動物細胞機能増強剤。
  6. 　アポトーシス抑制剤である、請求項１に記載の動物細胞機能増強剤。
  7. 　培養細胞構造体の作製剤である、請求項１に記載の動物細胞機能増強剤。
  8. 　エタノールアミンリン酸を有効成分とする、毛髪育成剤。
  9. 　動物の体外において、動物細胞とエタノールアミンリン酸とを接触させて、前記動物細胞の機能を増強する方法。
  10. 　動物細胞に対する作用剤のスクリーニング方法であって、
    　エタノールアミンリン酸の存在下で前記動物細胞と被験化合物とを接触させて、前記動物細胞における影響を測定する工程、
    を備える、方法。
  11. 　エタノールアミンリン酸を有効成分とする、炎症性サイトカインカインの抑制剤。
  12. 　エタノールアミンリン酸を有効成分とする、抗炎症剤。
  13. 　エタノールアミンリン酸を有効成分とする、抗酸化剤。
  14. 　エタノールアミンリン酸を有効成分とする、炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
  15. 　遺伝子の発現方法であって、エタノールアミンリン酸を動物細胞に投与することにより、以下に示す第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現を促進し、以下に示す第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現を抑制する、発現方法。
    （第１の遺伝子群）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
     （第２の遺伝子群）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
      
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  16. 　エタノールアミンリン酸に対する動物細胞の反応性を評価する方法であって、
    　エタノールアミンリン酸を動物細胞に投与する工程と、
    　エタノールアミンリン酸を投与した前記動物細胞における請求項１５に記載の第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベル及び／又は請求項１５に記載の第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程と、
    　前記工程で得た１又は２以上の遺伝子の発現レベルに基づいて、ＥＰに対する前記動物細胞の反応性を評価する工程と、
    を備える、方法。
  17. 　エタノールアミンリン酸の作用を調節する化合物のスクリーニング方法であって、
    　動物細胞に対してエタノールアミンリン酸と１又は２以上の試験化合物とを投与する工程と、
    　前記動物細胞における請求項１５に記載の第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベル及び／又は請求項１５に記載の第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程と、
    　前記測定工程で得た１又は２以上の遺伝子の発現レベルに基づいて、前記１又は２以上の試験化合物のエタノールアミンリン酸の作用に対する抑制作用又は増強作用を評価する工程と、
    を備える、スクリーニング方法。
  18. 　請求項１５に記載の第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現産物及び当該遺伝子の発現を促進する化合物、並びに、
    　請求項１５に記載の第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子の発現産物に対して抑制的に作用する化合物及び発現を抑制する化合物からなる群から選択される１又は２以上の試験化合物を動物細胞に投与する工程と、
    　前記動物細胞の１又は２以上の細胞機能を測定する工程と、
    を、備える、エタノールアミンリン酸様化合物のスクリーニング方法。
  19. 　請求項１５に記載の第１の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子を検出するための１又は２以上のプローブを固定化した第１の領域と、請求項１５に記載の第２の遺伝子群から選択される１又は２以上の遺伝子を検出するための１又は２以上を固定化した第２の領域と、を備える、エタノールアミンリン酸の作用の調節剤のスクリーニング用固相担体。
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