CN111926078A

CN111926078A - Art5在提高结直肠癌对奥沙利铂敏感度方面的应用

Info

Publication number: CN111926078A
Application number: CN202010685884.4A
Authority: CN
Inventors: 王允山; 焦沁连; 任一丹; 杜鲁涛; 王传新
Original assignee: Second Hospital of Shandong University
Current assignee: Second Hospital of Shandong University
Priority date: 2020-07-16
Filing date: 2020-07-16
Publication date: 2020-11-13
Anticipated expiration: 2040-07-16
Also published as: CN111926078B

Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种将ADP‑核糖基转移酶5(ART5)作为靶点来增强结直肠癌对奥沙利铂的敏感性的方法。本发明提供一种耐药基因,ART5序列为GAGAAAGGGAATTGCTCCTCAGTCCCTGCCCTGGCGCGCCCGCTCCCGGCCCCGCGTGCGGCGCTGGGAA。本发明首先通过RNA‑seq技术检测到ART5基因在耐药细胞HCT116OxR中的表达更高。在HCT116OxR中降低ART5的表达评估ART5对耐药细胞IC₅₀值的影响，提出了ART5作为靶基因在提高结直肠癌对奥沙利铂敏感度方面的应用。

Description

ART5在提高结直肠癌对奥沙利铂敏感度方面的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种将ADP-核糖基转移酶5(ART5)作为靶点来增强结直肠癌对奥沙利铂的敏感性的方法。

背景技术

结直肠癌是全球诊断出的第三大主要癌症，也是与癌症相关死亡率的重要原因。化疗在治疗结直肠癌方面起着举足轻重的作用。

奥沙利铂，第三代新型铂化合物，是用于治疗结直肠癌的常规药物。然而，耐药性的发展是化学疗法成功的主要障碍。目前关于奥沙利铂耐药性的原因还不得而知。因此，关于奥沙利铂在结直肠癌中的耐药性作用机制还需进行深入研究。

ADP-核糖基化在大量细胞过程中发挥重要作用，涉及信号转导，细胞周期调控，DNA修复和凋亡。在ADP核糖基化的过程中，ADP-核糖基转移酶ARTs是重要的催化酶，其可以将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的ADP-核糖基部分转化成氨基酸。有研究报道，ART5是结直肠癌患者生存状况的不良预后指标。但是，能否通过干扰ART5的表达来减弱结直肠癌对奥沙利铂的耐药性还未报道。

发明内容

本发明针对临床上结直肠癌对奥沙利铂不敏感存在的现象提出以ART5为靶点提高结直肠癌对奥沙利铂的敏感度的应用。

为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：

本发明提供一种肿瘤治疗新的靶点ART5，其序列为GAGAAAGGGAATTGCTCCTCAGTCCCTGCCCTGGCGCGCCCGCTCCCGGCCCCGCGTGCGGCGCTGGGAA。我们在耐药细胞HCT116OxR中降低ART5（ADP-核糖基转移酶5）的表达，通过检测IC₅₀（抑制细胞生长的一半的药物浓度）验证ART5的低表达显著升高耐药细胞对奥沙利铂的敏感性。

作为优选，所述肿瘤为结直肠癌。

作为优选，肿瘤治疗试剂采用高通量测序方法和/或定量PCR方法检测样本中ART5的表达情况。

作为优选，所述高通量测序方法是指illumina公司推出的二代测序技术。

作为优选，所述用于定量PCR方法包括特异性扩增ART5的引物。引物序列为：正向5,- CTGGCGGCTTTGATGATCG-3，反向5，-ACAACCCACATAGGTATCGTCA-3。

作为优选，所述用于降低ART5表达的方法包括RNA干预（RNA interference,RNAi）技术。RNA序列为： 5,-GGGAACUAGGACUUAGUGAA -3。

作为优选，所述样本为结直肠癌细胞HCT116和结直肠癌抗奥沙利铂细胞系HCT116OxR细胞系（购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心）。

所述基因在制备结直肠癌制剂中的应用。

(1)RNA-seq

大部分已知的mRNA都是通过cDNA克隆测序发现和鉴定的。该法需要先构建mRNA 的cDNA文库，再进行PCR扩增，扩增产物随后克隆到表达载体上测序。高通量测序又称下一代测序技术，是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，极大提高了测序效率。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序。

(2)实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR，RT-PCR)

荧光检测PCR仪可对整个PCR过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反应混合体系中靶序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的PCR循环数(一般用特定阈值循环数Ct来表达)越少。RT-PCR具有特异性高、灵敏度好、快速简单等多种优点。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本发明首先通过RNA-seq检测到ART5在HCT116OxR细胞中表达升高，并通过RT-PCR得到了验证（图1）。在HCT116OxR细胞中通过RNAi技术降低ART5的表达（图2），评估ART5对HCT116OxR的耐药性有何影响（图3），提出了ART5在结直肠癌耐药治疗的应用。

附图说明

图1为ART5在HCT116和HCT116OxR中的表达。

图2为ART5在HCT116OxR和si-HCT116OxR细胞中的表达。

图3为HCT116OxR和si-HCT116OxR细胞对奥沙利铂的IC₅₀值。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

一. 具体操作步骤

（一）RNA-seq

Total RNA样品检测：在Agilent 2100 pic600 上检测RNA的总量和片段分布。

文库构建：样品检测合格后，用带有 Oligo(dT)的磁珠，通过 A-T 互补配对与mRNA 的 ployA 尾结合的方式富集真核生物的 mRNA。随后加入 fragmentation buffer将 mRNA 打断成短片段，以 mRNA 为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs 和 DNA polymerase I 合成二链 cDNA，随后利用 AMPureXP beads 纯化双链 cDNA。纯化的双链 cDNA 再进行末端修复、加 A 尾并连接测序接头，然后用 AMPure XP beads 进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库。

库检：将cDNA用Qubit2.0定量，稀释至1ng/ul，使用Agilent 2100检测文库的insert size，检测结果符合预期后，使用PCR方法对文库的有效浓度进行定量（文库有效浓度＞2nM），保证文库质量。

上机测序：把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求 pooling 后进行HiSeq测序。

（二）HCT116和HCT116OxR细胞中Total RNA样品制备

根据飞捷总RNA极速抽提试剂盒说明书提取细胞内总RNA。

取生长状态良好的HCT116和HCT116OxR细胞各一瓶，消化脱落后离心收集，留下细胞团块和100μl 上清，充分震荡至没有细胞团块；在处理好的样本管中，加入RA2液500μl，充分颠倒混匀5-10次，室温静置1min；将裂解物全部吸入内套管，12000rpm离心1min；取出内套管，吸弃外套管中液体后放回内套管，加入Wash buffer 500μl，12000rpm离心1min；再洗一次；取出内套管，吸弃外套管中液体后，不加洗液再离心一次；将内套管移入新的1.5mlEP管中，在膜中央加入洗脱液50μl；室温静置1min后，12000rpm离心1min，获得总RNA。

(三)RT-PCR检测HCT116和HCT116OxR细胞中PRDX6的表达

根据PrimeScript TM RT reagent Kit试剂盒说明书进行逆转录，37℃反转录反应15min，85℃失活反应5sec。设置反应体系如下：

5×PrimeScriptTM Buffer (for real time) 2µl

PrimeScriptTM RT Enzyme Mix Ⅰ 0.5µl

Oligo dT Primer(50µM) 0.5µl

Random 6 mers(100µM) 0.5µl

Total RNA 500ng

RNase Free ddH2O 加至10µl

然后以合成的cDNA为模板, 根据TB Green TM Premix Ex Taq TM Ⅱ试剂盒说明书进行RT-PCR。反应条件如下:42℃5min,95℃预变性30s; 95℃变性5s, 60℃30s,共40个循环。反应体系如下:

TB Green 5µl

ROX Reference Dye Ⅱ 0.2µl

PCR Forward Primer (10µM) 0.2µl

PCR Reverse Primer (10µM) 0.2µl

ddH2O 3.4µl

模板cDNA 1µl

总体积 10µl

在PCR实验中, 进行重复与阴性对照实验(阴性对照实验中不加入cDNA模板),每个样品在定量实验中重复3次。ART5的相对表达量以GAPDH为内参用2^-ΔΔCt法计算。

（四）RNAi技术

将5×10⁵个细胞接种在6孔板中，使细胞第二天汇合达到70%；在250μl Opti-MEM中加入5μl Lipofectamine 2000，室温静置5min；在250μl Opti-MEM中加入5μl的siRNA；将稀释好的Lipofectamine 2000和siRNA轻轻混匀，室温静置20min；将混匀液加至前一天铺好的孔板中，孵育4-6h后，除去混匀液，更换为含血清的正常培养基。48h后提取总RNA，使用RT-PCR检测PRDX6的表达。

（五）IC₅₀的测定

取生长状态良好的HCT116OxR和si-HCT116OxR细胞，消化，计数，按每孔5×10³个细胞接种到96孔板中，每孔加培养基至100μl，在培养箱中培养48h。将终浓度为0，5，10，15，20，25，30μM的奥沙利铂依次加入每孔，继续培养48h。在避光条件下每孔加入10μl CCK-8，在培养箱中孵育2h。使用酶标仪在450nm波长下测每孔的光吸收值。使用GraphPad Prism软件绘制各组的生长曲线。

二.结果分析

通过RNA-seq检测到ART5基因在HCT116OxR细胞中表达明显升高，并通过RT-PCR得到验证，见图1。

在HCT116OxR细胞中通过RNAi技术降低ART5的表达，并通过RT-PCR验证，见图2。

降低ART5的表达后，HCT116OxR细胞对奥沙利铂的IC₅₀值为15μM（对照例为25μM），见图3。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学第二医院

<120> ART5在提高结直肠癌对奥沙利铂敏感度方面的应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gagaaaggga attgctcctc agtccctgcc ctggcgcgcc cgctcccggc cccgcgtgcg 60

gcgctgggaa 70

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctggcggctt tgatgatcga caacccacat aggtatcgtc a 41

<210> 3

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

gggaacuagg acuuagugaa 20

Claims

1.一种治疗肿瘤用的奥沙利铂耐药性相关靶基因,其特征在于，所述靶基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的靶基因，其特征在于，所述肿瘤为结直肠癌。

3.根据权利要求1所述的靶基因，其特征在于，采用高通量测序方法和/或定量PCR方法检测细胞中ADP-核糖基转移酶5的表达情况。

4.根据权利要求3所述的靶基因，其特征在于，所述高通量测序方法是指二代测序技术。

5.根据权利要求3所述的靶基因，其特征在于，所述用于定量PCR方法包括特异性扩增ADP-核糖基转移酶5的引物。

6.根据权利要求3所述的靶基因，其特征在于，引物序列为：正向5’-CTGGCGGCTTTGATGATCG-3’,反向5’-ACAACCCACATAGGTATCGTCA-3’。

7.用于降低ART5表达的RNAi在制备治疗结直肠癌药物中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述RNAi序列为5’-GGGAACUAGGACUUAGUGAA-3’。

9.ADP-核糖基转移酶5作为靶基因在提高结直肠癌对奥沙利铂敏感度方面的应用。