CN111944897B - S1pr4作为靶点增强结直肠癌对奥沙利铂敏感性的应用 - Google Patents

S1pr4作为靶点增强结直肠癌对奥沙利铂敏感性的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种耐药基因,S1PR4序列为CTCAGTCAGCCCCCGGGGGAGGCCATGAACGCCACGGGGACCCCGGTGGCCCCCGAGTCCTGCCAACAGC。本发明首先通过RNA‑seq技术检测到S1PR4基因在HCT116OxR中表达更高。在HCT116OxR中降低S1PR4的表达评估S1PR4对耐药细胞IC50值的影响，提出了S1PR4作为靶基因在降低结直肠癌耐药中的应用。

Description

S1PR4作为靶点增强结直肠癌对奥沙利铂敏感性的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种将鞘氨醇-1-磷酸受体4(S1PR4)作为靶点来增强结直肠癌对奥沙利铂的敏感性的方法。
背景技术
在中国，随着人民的生活水平不断提高，以及越来越多的人转向西方饮食和生活方式，结直肠癌的发病率逐年增加。病理生理学等基础学科的发展提高了人们对疾病的了解，使CRC的治疗从内窥镜、手术局部切除术和转移性疾病的广泛手术转向转移灶的局部消融治疗、姑息化疗、靶向治疗和免疫治疗等个性化治疗。尽管这些新的治疗方法使结直肠癌的总生存期有所提高，但转移、复发以及耐药结直肠癌患者的死亡率尚未得到显著改善。
奥沙利铂于2000年被引入治疗结直肠癌的研究中，结果显示奥沙利铂不仅显著提高客观缓解率，改善转移切除的百分比，而且还提高了患者的总体生存率。目前基于奥沙利铂的单独疗法或联合疗法的获得性耐药是治疗失败的主要原因，是结直肠癌患者面临的重大挑战。
鞘氨醇-1-磷酸受体4（S1PR4）已显示参与多种癌症的增殖和发展。但是， S1PR4在耐药中的作用仍未进行过系统研究。我们在耐药细胞HCT116OxR中降低S1PR4的表达，通过检测IC50验证S1PR4的低表达可显著升高耐药细胞对奥沙利铂的敏感性。
发明内容
本发明针对临床上结直肠癌对奥沙利铂不敏感存在的现象提出以S1PR4为靶点提高结直肠癌对奥沙利铂的敏感度的应用。
为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：
肿瘤治疗试剂,所述肿瘤治疗试剂能够检测样本中PRDM16的表达情况, S1PR4序列CTCAGTCAGCCCCCGGGGGAGGCCATGAACGCCACGGGGACCCCGGTGGCCCCCGAGTCCTGCCAACAGC。
作为优选，所述肿瘤为结直肠癌。
作为优选，肿瘤治疗试剂采用高通量测序方法和/或定量PCR方法检测样本中S1PR4的表达情况。
作为优选，所述高通量测序方法是指DLO Hi-C测序。
作为优选，所述用于定量PCR方法包括特异性扩增S1PR4的引物。引物序列为：正向5’- TAATACGACTCACTATAGGG-3’，反向5’- TAGAAGGCACAGTCGAGG-3’。
作为优选，所述用于降低S1PR4表达的方法包括RNA干预（RNA interference,RNAi）技术。RNA序列为： 5’-GGUUGUAGUGCAGAACAA -3’。
作为优选，所述样本为结直肠癌细胞HCT116和结直肠癌抗奥沙利铂细胞系HCT116OxR细胞系（购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心）。
所述基因在制备结直肠癌制剂中的应用。
(1)RNA-seq
大部分已知的mRNA都是通过cDNA克隆测序发现和鉴定的。该法需要先构建mRNA的cDNA文库，再进行PCR扩增，扩增产物随后克隆到表达载体上测序。高通量测序又称下一代测序技术，是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，极大提高了测序效率。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能， 所以又被称为深度测序。
(2)实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR，RT-PCR)
荧光检测PCR仪可对整个PCR过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反应混合体系中靶序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的PCR循环数(一般用特定阈值循环数Ct来表达)越少。RT-PCR具有特异性高、灵敏度好、快速简单等多种优点。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明首先通过RNA-seq技术检测到S1PR4基因在HCT116OxR细胞中表达得更高，并通过RT-PCR得到了验证（图1）。在HCT116OxR细胞中通过RNAi技术降低S1PR4的表达（图2），评估S1PR4对HCT116OxR的耐药性有何影响（图3），提出了S1PR4在结直肠癌耐药治疗的应用。
附图说明
图1 为S1PR4基因在HCT116和HCT116OxR中的表达。
图2为S1PR4在HCT116OxR和si-HCT116OxR细胞中的表达。
图3为HCT116OxR和si-HCT116OxR细胞对奥沙利铂的IC50值。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
一. 具体操作步骤
（一）RNA-seq
Total RNA样品检测：在Agilent 2100 pic600 上检测RNA的总量和片段分布。
文库构建：样品检测合格后，用带有 Oligo(dT)的磁珠，通过 A-T 互补配对与mRNA 的 ployA 尾结合的方式富集真核生物的 mRNA。随后加入 fragmentation buffer将 mRNA 打断成短片段，以 mRNA 为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs 和 DNA polymerase I 合成 二链 cDNA，随后利用 AMPureXP beads 纯化双链 cDNA。纯化的双链 cDNA 再进行末端修复、加 A 尾并连接测序接头，然后用 AMPure XP beads 进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库。
库检：将cDNA用Qubit2.0定量，稀释至1ng/ul，使用Agilent 2100检测文库的insert size，检测结果符合预期后，使用PCR方法对文库的有效浓度进行定量（文库有效浓度 ＞2nM），保证文库质量。
上机测序：把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求 pooling 后进行HiSeq测序。
（二）HCT116和HCT116OxR细胞中Total RNA样品制备
根据飞捷总RNA极速抽提试剂盒说明书提取细胞内总RNA。
取生长状态良好的HCT116和HCT116OxR细胞各一瓶，消化脱落后离心收集，留下细胞团块和100μl 上清，充分震荡至没有细胞团块；在处理好的样本管中，加入RA2液500μl，充分颠倒混匀5-10次，室温静置1min；将裂解物全部吸入内套管，12000rpm离心1min；取出内套管，吸弃外套管中液体后放回内套管，加入Wash buffer 500μl，12000rpm离心1min；再洗一次；取出内套管，吸弃外套管中液体后，不加洗液再离心一次；将内套管移入新的1.5mlEP管中，在膜中央加入洗脱液50μl；室温静置1min后，12000rpm离心1min，获得总RNA。
(三)RT-PCR检测HCT116和HCT116OxR细胞中S1PR4的表达
根据PrimeScript TM RT reagent Kit试剂盒说明书进行逆转录，37℃反转录反应15min，85℃失活反应5sec。设置反应体系如下：
5×PrimeScriptTM Buffer (for real time) 2µl
PrimeScriptTM RT Enzyme Mix Ⅰ 0.5µl
Oligo dT Primer(50µM) 0.5µl
Random 6 mers(100µM) 0.5µl
Total RNA 500ng
RNase Free ddH2O 加至10µl
然后以合成的cDNA为模板, 根据TB Green TM Premix Ex Taq TM Ⅱ试剂盒说明书进行RT-PCR。反应条件如下:42℃5min,95℃预变性30s; 95℃变性5s, 60℃30s,共40个循环。反应体系如下:
TB Green 5µl
ROX Reference Dye Ⅱ 0.2µl
PCR Forward Primer (10µM) 0.2µl
PCR Reverse Primer (10µM) 0.2µl
ddH2O 3.4µl
模板cDNA 1µl
总体积 10µl
在PCR实验中, 进行重复与阴性对照实验(阴性对照实验中不加入cDNA模板),每个样品在定量实验中重复3次。S1PR4的相对表达量以GAPDH为内参用2-ΔΔCt法计算。
（四）RNAi技术
将5×105个细胞接种在6孔板中，使细胞第二天汇合达到70%；在250μl Opti-MEM中加入5μl Lipofectamine 2000，室温静置5min；在250μl Opti-MEM中加入5μl的siRNA；将稀释好的Lipofectamine 2000和siRNA轻轻混匀，室温静置20min；将混匀液加至前一天铺好的孔板中，孵育4-6h后，除去混匀液，更换为含血清的正常培养基。48h后提取总RNA，使用RT-PCR检测S1PR4的表达。
（五）IC50的测定
取生长状态良好的HCT116和HCT116OxR细胞，消化，计数，按每孔5×103个细胞接种到96孔板中，每孔加培养基至100μl，在培养箱中培养48h。将终浓度为0，5，10，15，20，25，30μM的奥沙利铂（购自齐鲁制药）依次加入每孔，继续培养48h。在避光条件下每孔加入10μlCCK-8，在培养箱中孵育2h。使用酶标仪在450nm波长下测每孔的光吸收值。使用GraphPadPrism软件绘制各组的生长曲线。
二.结果分析
通过RNA-seq技术检测到S1PR4基因在耐药细胞HCT116OxR中表达升高，并通过RT-PCR验证，见图1。从图1中可以看出， S1PR4在HCT116OxR细胞中的表达量更高。
在HCT116OxR细胞中通过RNAi技术降低S1PR4的表达，并通过RT-PCR验证，见图2。从图2中可以看出，转染S1PR4的小干扰RNA后，S1PR4的表达下降。
降低S1PR4的表达后，HCT116OxR细胞对奥沙利铂的IC50值为10μM，见图3。从图3中可以看出，转染S1PR4的小干扰RNA后，耐药细胞的IC50下降至10μM。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学第二医院
<120> S1PR4作为靶点增强结直肠癌对奥沙利铂敏感性的应用
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctcagtcagc ccccggggga ggccatgaac gccacgggga ccccggtggc ccccgagtcc 60
tgccaacagc 70
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
taatacgact cactataggg tagaaggcac agtcgagg 38
<210> 3
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
gguuguagug cagaacaa 18

Claims (2)

1.用于降低S1PR4表达的小干扰RNA在制备提高结直肠癌患者对奥沙利铂敏感性的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，小干扰RNA序列为： 5’-GGUUGUAGUGCAGAACAA-3’。
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