CN104906596A - p50基因在制备抗膀胱癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供p50基因在制备抗癌药物中的应用，特别是p50基因在制备抗膀胱癌药物中的应用。本发明通过构建p50基因的超表达载体，转染肿瘤细胞，结果表明：转染后的肿瘤细胞中p50基因的mRNA显著上调，肿瘤细胞出现变圆，贴壁性变差，细胞活性下降21.8％，最终出现死亡。本发明筛选得到一个高效抑制肿瘤细胞的基因，为新药靶的发现及肿瘤药物设计提供基础数据。

Description

p50基因在制备抗膀胱癌药物中的应用

技术领域：

本发明涉及p50基因的新用途，具体是p50基因在制备抗癌药物中的应用。

背景技术：

NF-κB是哺乳动物体内重要的转录因子蛋白家族，有5个成员组成：Rel(cRel)、p65(RelA)、RelB和p50(NF-κB 1)、p52(NF-κB 2)。该家族成员通过亚基结合形成同源或异源二聚体，与靶基因上特定的序列(-κB位点)结合调节基因转录，对不同基因的表达进行精细调节。其中p50含有N端Rel同源区(Rel homology domain,RHD)，不含C端的反式激活结构域(transactivation domain,TD)，其形成的同源二聚体并不能激活基因转录，常以其前体p105的形式作为抑制分子而存在。

在肿瘤研究中，通常认为NF-κB通路通过活化后对相关基因转录调控，促进肿瘤的发生、增殖、侵袭和转移。NF-κB活化后诱导RAS引起的致癌作用，也能激活人端粒末端转移酶的活性而促进致癌作用，在人类肝癌、T淋巴细胞白血病、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、甲状腺癌、恶性黑色素瘤的活化，NF-κB中的p65也在脑胶质瘤和脑转移癌的发展、侵袭和血管发生中具有重要作用。NF-κB在膀胱癌中通过与IL-8互作促进细胞的生长、侵袭和转移。

但NF-κB家族也具有抑制肿瘤的作用。NF-κB活化能可逆地抑制永生化的relA^-/-小鼠成纤维细胞的转化。RelA(p65)的失活能抑制p53诱导的凋亡，说明其活化可能促进凋亡而抑制肿瘤。在p53为野生型的肿瘤中抑制NF-κB活性，会降低化疗效果。但并没有对p50的肿瘤抑制作用进行报道。本发明首次提供p50基因对膀胱癌细胞的抑制作用，为膀胱癌抗癌药物的制备提供新思路。

发明内容：

本发明的目的在于提供p50基因的一种新用途。

本发明提供p50基因在制备抗癌药物中的应用，特别是p50基因在制备抗膀胱癌药物中的应用。所述的p50基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

本发明通过构建p50基因的超表达载体，转染肿瘤细胞，结果表明：转染后的肿瘤细胞中p50基因的mRNA水平均显著上调，肿瘤细胞出现变圆，贴壁性变差，细胞活性显著降低，最终出现死亡。

本发明筛选得到一个高效抑制肿瘤细胞的基因，为新药靶的发现及肿瘤药物设计提供基础数据。

附图说明：

图1：p50超表达后mRNA水平表达：qPCR结果(pcDNA3.1为空载体；pcDNA3.1-p50为带有p50基因的超表达载体)

图2：超表达p50后肿瘤细胞形态变化：A重组质粒pcDNA3.1-p50转染到T24细胞24h后细胞形态；B重组质粒pcDNA3.1-p50转染到T24细胞48h后细胞形态

图3：p50超表达后细胞活性检测

具体实施方式：

实施例1：p50基因抑制膀胱癌T24细胞

一、重组表达载体的构建

1、PCR产物的制备

以T24细胞RNA反转录的cDNA为模板，基于p50基因的全长cDNA序列(Gene ID:4971)设计用带有酶切位点的表达引物进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸3min，共35个循环，72℃保温10min，引物序列见表1。PCR产物回收过程严格按照OMEGA公司的Gel Extraction Kit的说明书进行。

表1 p50表达引物

2、目的基因全长验证

将PCR获得的目的基因连接到Zero Vector上，送往北京奥科生物公司进行测序。

3、PCR产物及表达载体的双酶切反应

选取测序成功的质粒，在2个eppendorf管中分别进行PCR产物和pcDNA3.1双酶切反应，反应体系参照Hind III、EcoR I说明书(NEB)进行。

4、胶回收酶切产物

将上述双酶切产物进行胶回收，回收过程严格按照OMEGA公司的Gel Extraction Kit的说明书进行。

5、目的基因p50与pcDNA3.1的连接

将含目的基因p50的胶回收产物连接到pcDNA3.1上，在离心管中建立如下反应体系：

轻轻混匀，瞬时离心收集液体于管底，置于16℃过夜连接。

二、重组表达载体的转化

1、将Trans-T1Phage Resistant感受态细胞置于冰上；

2、在离心管中依次加入50μL感受态细胞核5μL的连接产物，轻轻混匀，置于冰上30min；

3、42℃水浴热激30s，然后快速将管置于冰上，冰浴2min；

4、加入500μL不含抗生素的LB液体培养基，混匀后置于37℃200rpm振荡培养1h；

5、取200μL重悬菌液，均匀涂布于提前放置在37℃培养箱中氨苄抗性的平板上，过夜培养。

三、重组表达载体的验证

1、用灭菌的枪头小心挑取白色单菌落，将枪头置于1mL LB液体培养基(含有0.1％氨苄)中，在37℃、200rpm的振荡培养箱中培养1h。

2、菌液PCR检测(1)中菌液是否含有重组质粒，PCR体系为：

PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃30s，60℃40s，72℃3min 30s，35个循环；72℃5min，4℃保存。之后，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测目的片段，将检测到目的片段的对应菌液送往北京奥科生物公司进行测序。

四、重组质粒转染T24细胞

取对数生长期细胞，重悬于不含抗生素的RPMI1640培养基中，接种于6孔板中。实验分为2组，对照组：pcDNA3.1空质粒及EGFP-N1，实验组：pc DNA3.1-p50及EGFP-N1。每组3个重复。采用Invitroen公司Lipofectamine 2000将构建好的质粒pcDNA3.1-p50与EGFP-N1共转染到T24细胞，具体操作参照说明书。

五、qPCR检测转染后P50mRNA表达水平

将pcDNA3.1-p50与EGFP-N1共转染到T24细胞48h后，Trizol法提取总RNA，步骤按照RNAiso Plus(TaKaRa)说明书进行。反转录后qPCR检测p50mRNA表达水平(见图1)。

六、形态学观察

重组质粒转入T24细胞24h及48h后显微镜(OLYMPUS 1X71)观察细胞形态(见图2)。

七、MTT检测转染后细胞活性

转染24h后，对照组和处理组分别接种于96孔板中。每组设置3个复孔，继续培养。培养24h后，弃去培养液，加入180μL新鲜培养基，再加入20μL 5mg/mL MTT(终浓度为0.5mg/mL)，继续培养4h。待到时间后，终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μLDMSO，摇床低速振摇10min，使蓝紫色结晶充分溶解，在酶标仪490nm处读取吸光度值。处理数据，计算巴西苏木素对细胞的抑制率，绘制细胞生长曲线。每个样本均设置6个重复，取平均值为最终结果(见图3)。

Claims (2)

1.p50基因在制备抗癌药物中的应用；所述的p50基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

2.p50基因在制备抗膀胱癌药物中的应用；所述的p50基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。