JP2002220342A - インターロイキン−１媒介疾患および腫瘍壊死因子媒介疾患の治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 腫瘍壊死因子(「TNF」)媒介疾患またはイン
ターロイキン-１(「IL-1」)媒介疾患である疾患を治療
または予防するための薬学的組成物を提供する。 【解決手段】 腫瘍壊死因子(「TNF」)媒介疾患もしく
はインターロイキン-１(「IL-1」)媒介疾患である疾患
を治療または予防するための薬学的組成物であって、TN
Fインヒビターの投与と同時に、または逐時的に投与さ
れるための、IL-1レセプターアンタゴニストおよび薬学
的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】（発明の背景）本発明は、一
般的に疾患を予防する方法、および治療する方法、更に
詳細には特定の腫瘍壊死因子(TNF)媒介疾患およびイン
ターロイキン−１(IL-1)媒介疾患を予防する方法および
治療する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】炎症は、機械的な損傷、感染、または抗
原刺激によって引き起こされる疾患のような障害に対す
る生体の防御反応である。炎症反応は、炎症が自己抗原
のような不適切な刺激により誘導される場合に病理学的
に発現され得、肥大して発現され得、または障害因子の
除去後もかなり持続する。これらの状況下で、炎症は慢
性的に発現され得る。敗血症性ショックのような急性炎
症性疾患ならびに慢性関節リュウマチおよび炎症性腸疾
患のような慢性炎症性疾患の媒介は、IL-1およびTNFの
前炎症性活性に関連付けられてきた。

【０００３】TNFおよびIL-1は天然に見出される化合物
であり、しばしばサイトカインといわれる。サイトカイ
ンは細胞外タンパク質であり、細胞、特にサイトカイン
の合成および放出の即時型領域にあるそれらの細胞のふ
るまいを改変する。

【０００４】最も有効な炎症性サイトカインの１つはま
だ発見されておらず、多くの疾患および医学的な症状に
おけるキーメディエーターであると考えられるサイトカ
インはIL-1である。IL-1はマクロファージ／単球系の細
胞により作られるが単一ではなく、２つの形、IL-1アル
ファ(IL-1α)およびIL-1ベータ(IL-1β)、で生成され得
る。

【０００５】腫瘍壊死因子(TNF)は、単球およびマクロ
ファージを含む多くの細胞型により生成される１種のサ
イトカインである。少なくとも２つのTNF、特にTNFアル
ファ(TNFα)およびTNFベータ(TNFβまたはリンホトキシ
ン)が以前に記載されてきた。これらの公知のTNFは、炎
症応答に含まれる多くの異なる標的細胞において重要な
生理学的効果を有する。そのタンパク質は、フィブロブ
ラストおよび滑膜細胞の両方に潜在性コラゲナーゼおよ
びプロスタグランジンE2の分泌を引き起こし、骨細胞に
骨吸収の刺激を引き起こす。これらのタンパク質は好中
球への上皮細胞の表面粘着特性を増加する。それらはま
た、上皮細胞に凝集活性の分泌およびそれらの凝塊溶解
能の低下を引き起こす。さらにそれらは、リポタンパク
質リパーゼ酵素の発現を阻害することで脂肪細胞の活性
を脂質の貯蔵から向けなおす。

【０００６】TNFは肝細胞に「急性期反応物質」として
知られる１種のタンパク質の合成を引き起こし、それは
発熱物質として視床下部で作用する。これらの活性を通
して、TNFは感染および障害のような種々の兆候に対し
て生体反応で重要な役割を果たす。例えば、P.J.Selby
ら、Lancet、1988年2月27日、483ページ；H.F.Starnes,
Jr.ら、J.Clin.Invest.、82巻、1321ページ(1988)；A.O
liffら、Cell、50巻、555ページ(1987)；およびA.Waage
ら、Lancet、1987年2月14日、355ページの記事を参照。

【０００７】IL-1およびTNFの両方の活性はヒトの炎症
性疾患において採取した血清および他の体液中に検出さ
れる。実験系では、短時間の障害性の刺激後、IL-1およ
びTNFの循環への放出のキネティクスはよく特徴付けら
れたパターンに従う。細菌の生成物、リポ多糖(LPS)を
ヒヒにボーラス投与すると、TNFおよびIL-1が合成およ
び放出され、投与後それぞれ２時間および６時間で順に
ピークを迎える。IL-1およびTNFの細胞材料は異なる。T
NFは主として単球によってのみ合成され、IL-1は、実質
的に全ての有核細胞型により生成され得る。しかし炎症
反応の初期段階において、おそらくIL-1の生成に含まれ
る細胞は、上皮細胞、内皮細胞および単球／マクロファ
ージ系の細胞である。

【０００８】IL-1およびTNFの合成は、通常、細菌生成
物、レクチン、免疫複合体、および組織障害を生じる種
々の有害刺激により刺激される。IL-1およびTNFは次の
前炎症活性を共有する：(1)好中球の血管内皮への粘着
の増加、(2)好中球および単球におけるレスピラトリー
バーストの活性化、(3)軟骨マトリックスおよび骨の吸
収の刺激、(4)多くの細胞型からのプロスタグランジン
の放出および多くの細胞型の増加の刺激、および(5)発
熱、悪液質、食欲不振および急性期タンパク質の刺激。

【０００９】共通の炎症特性に加えて、(1)IL-1およびT
NFを同じ炎症刺激に応答させて合成することおよび(2)T
NF自身がIL-1の放出を誘導することが観察され、それは
２つのサイトカイン系の間に密接な関係が存在すること
を示す。実際、IL-1とTNFとの組合せ刺激の相乗効果
が、多くの炎症の実験系において観察された。相乗効果
は組合せた２つの薬剤の効果がそれらの個々の効果の総
和より大きい場合に起こると定義される。例えば、最大
下(submaximum)投与量のIL-1およびTNFをウサギ膝関節
に注射すると結果、多形核好中球の蓄積の面で著名な相
乗が得られた(Henderson,B., Clin.Exp.Immunol. 75:30
6-310(1989))。さらに、個々には半致死量の投与量での
IL-1およびTNFのマウスへの組合せ投与は、100％のマウ
スに致死の敗血症性ショック様症状の相乗的な誘導を引
き起こす(Everaerdt,B., Biochem.Biophys.Res.Commu
n., 163:378(1989):Waageら、J.Exp.Med. 167:1987-199
2(1988))。従って、疾病状態における場合、IL-1および
TNFの両方は相乗的な相互作用を介して十分な病理学的
応答を引き出すのに必要とされ、従ってIL-1インヒビタ
ーまたはTNFインヒビターのいずれかの投与は炎症応答
を最大限に阻害するのに十分であると考えられた。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】（発明の要旨）本発明
に関する驚くべき不測の結果の発見は、IL-1媒介疾患お
よびTNF媒介疾患の治療におけるいくつかの場合に、相
加的だけではなく相乗的にも作用するIL-1インヒビター
およびTNFインヒビターの能力である。従って、本発明
は投与の必要な被験体に治療効果のある量のIL-1インヒ
ビターおよびTNFインヒビターの組合せを投与すること
による、IL-1媒介疾患およびTNF媒介疾患の予防および
治療の方法に関する。さらに詳細には、本発明はIL-1お
よびTNFの両方に媒介される特定の疾患および医学的な
症状(多くは炎症性疾患として特徴付けられ得る)の治療
の方法に関する。本発明の方法に従って治療され得る適
用には、敗血症性ショック、関節炎、炎症性腸疾患、成
人呼吸促進症候群、肺繊維症、虚血性障害、および再潅
流障害(reperfusion injury)がある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明のTNF媒介疾患ま
たはIL-1媒介疾患である疾患を治療または予防する方法
は、治療効果のある量のIL-1インヒビターおよびTNFイ
ンヒビターを、その必要のある被験体に投与することを
含む。

【００１２】本発明の方法の好ましい実施形態では、前
記IL-1インヒビターがIL-1raである。

【００１３】本発明の方法の好ましい実施形態では、前
記IL-1raが以下からなる群から少なくとも１つの化合物
を含む：IL-1raα、IL-1raβ、およびIL-1raX。

【００１４】本発明の方法の好ましい実施形態では、前
記TNFインヒビターが、以下からなる群より選択される
化合物を少なくとも１つ含む：30kDa TNFインヒビタ
ー、40kDa TNFインヒビター、40kDa TNFインヒビターΔ
51、および40kDa TNFインヒビターΔ53。

【００１５】本発明の方法の好ましい実施形態では、前
記IL-1raがヒト組換えIL-1raである。

【００１６】本発明の方法の好ましい実施形態では、前
記TNFインヒビターがヒト組換え30kDa TNFインヒビター
である。

【００１７】本発明の方法の好ましい実施形態では、前
記IL-1インヒビターがヒト組換えIL-1raであり、そして
前記TNFインヒビターがヒト組換え30kDa TNFインヒビタ
ーである。

【００１８】本発明の方法の好ましい実施形態では、前
記IL-1インヒビターおよび前記TNFインヒビターが薬学
的に許容されるキャリア中で投与される。

【００１９】本発明の方法の好ましい実施形態では、前
記疾患が以下からなる群より選択される：関節炎、炎症
性腸疾患、敗血症性ショック、虚血性障害、再潅流障
害、骨粗鬆症、喘息、インスリン性糖尿病、骨髄性白血
病、他の白血病、乾癬、成人呼吸促進症候群、悪液質／
食欲不振、および肺繊維症。

【００２０】さらに本発明は、薬学的に許容されるキャ
リア中にIL-1インヒビターおよびTNFインヒビターを含
む薬物組成物に関する。

【００２１】本発明の薬物組成物の好ましい実施形態で
は、前記IL-1インヒビターがIL-1raである。

【００２２】本発明の薬物組成物の好ましい実施形態で
は、前記IL-1raが以下からなる群から少なくとも１つの
化合物を含む：IL-1raα、IL-1raβ、およびIL-1raX。

【００２３】本発明の薬物組成物の好ましい実施形態で
は、前記TNFインヒビターが以下からなる群より選択さ
れる少なくとも１つの化合物を含む：30kDa TNFインヒ
ビター、40kDa TNFインヒビター、40kDa TNFインヒビタ
ーΔ51、および40kDa TNFインヒビターΔ53。

【００２４】本発明の薬物組成物の好ましい実施形態で
は、前記TNFインヒビターがヒト組換え30kDa TNFインヒ
ビターである。

【００２５】本発明の薬物組成物の好ましい実施形態で
は、前記IL-1インヒビターがヒト組換えIL-1raである。

【００２６】

【発明の実施の形態】本発明で用いられ得るTNFインヒ
ビターは天然に見出されるタンパク質および天然に見出
されるタンパク質の切断型である。治療される被験体に
おいて不測の副作用を生じる危険が比較的低いため、天
然に見出されるタンパク質は有用である。本発明の他の
実施態様において、天然タンパク質の配列とは少数のア
ミノ酸残基のみが異なるTNFインヒビターの変異タンパ
ク質もまたTNFインヒビターという。

【００２７】TNFインヒビターは、TNFレセプタータンパ
ク質の可溶性フラグメントであり得る。本発明において
有用なTNFインヒビターは、ヒトTNF結合タンパク質(TNF
bp)、特に例えば30kDa TNFインヒビターおよび40kDa TN
Fインヒビターを包含する、TNFレセプタータンパク質の
可溶性フラグメントを包含する。40kDa TNFインヒビタ
ーは、全長の40kDa TNFインヒビター、または切断型の4
0kDa TNFインヒビターΔ51および40kDa TNFインヒビタ
ーΔ53であり得る。例えばポリエチレングリコール(PE
G)または他のあらゆる反復ポリマーの付加により修飾さ
れて、その循環半減期が増加および／または免疫原性が
減少したタンパク質もまた有用である。TNFに対するレ
セプターアンタゴニストとして作用するTNFインヒビタ
ーもまた本発明の範囲に含まれる。

【００２８】TNFインヒビターの生成はヒト尿からの単
離のような天然に得られる材料からの抽出により達成さ
れ得るが、TNFインヒビター生成の好ましい方法は組換
えDNA技術による。組換えDNA技術は、比較的大量のTNF
インヒビターを高純度で生成し得るので幾分好ましい。

【００２９】さらにTNFインヒビターは、30kDa TNFイン
ヒビターの選択されたアミノ酸がシステインで置換され
る30kDa TNFインヒビターの変異タンパク質を包含す
る。そのような変異タンパク質はTNFインヒビターとし
て使用され得るか、またはそれらをポリエチレングリコ
ール(PEG)と反応させてTNFインヒビターPEG化合物を形
成し得る。この化合物は、１分子あたり１つまたは２つ
のTNFインヒビターを含む。好ましい実施態様では、TNF
インヒビターは変異30kDa TNFインヒビターと二官能性P
EG前駆体との間の反応で形成された二価の種である。好
ましい変異タンパク質はC105 30kDa TNFインヒビターで
あり、30kDa TNFインヒビターの105位の残基がシステイ
ン残基に置換する。

【００３０】本発明で有用なIL-1インヒビターはタンパ
ク質でり、さらに詳細には天然に見出されるタンパク質
である。天然に見出されるタンパク質は、治療される被
験体において不測の副作用を生じる危険が比較的低いた
め特に有用である。

【００３１】有用なクラスのインターロイキン−１イン
ヒビターは、天然インターロイキン−１レセプターアン
タゴニスト(IL-1ra)として作用するヒトタンパク質であ
る。好ましくは、本発明の実施において好ましいIL-1ra
は、IL-1raα、IL-1raβ、IL-1rax、またはこれらのIL-
1raのN-末端メチオニン誘導体からなる群より選択され
る。例えば、ポリエチレングリコール(PEG)または他の
反復ポリマーの付加により修飾されて、それらの循環半
減期が増加および／またはそれらの免疫原性が減少した
タンパク質もまた好ましい。

【００３２】IL-1raの生成は、培養ヒト単球の調製培地
からの単離によるように、天然に得られる材料からの抽
出により達成され得るが、IL-1ra生成の好ましい方法は
組換えDNA技術による。組換えDNA技術は、比較的大量の
IL-1raを高純度で生成し得るので幾分好ましい。

【００３３】本発明はまた、治療法に用いる薬学的に受
容可能なキャリア中に、IL-1インヒビター(特に組換え
ヒトIL-1ra)およびTNFインヒビターを含む薬物組成物に
関する。

【００３４】（発明の詳細な説明）上記のように、本発
明はIL-1媒介疾患およびTNF媒介疾患に冒された被験体
においてその疾患を予防および治療する方法に関する。
この方法は、治療効果のある量のTNFインヒビターおよ
びIL-1インヒビターをTNF媒介疾患またはIL-1媒介疾患
に冒された被験体に投与することを包含する。理論に限
定されないが、TNFおよびIL-1の間に存在することが知
られている相互関係は、全てではなくともほとんどのTN
F媒介疾患はまたIL-1媒介疾患でもあることが見出さ
れ、逆もまた真であることを示唆する。

【００３５】上記のように、TNFインヒビターがTNF媒介
疾患を予防または治療するのにうまく用いられ得るこ
と、および、IL-1インヒビターがIL-1媒介疾患を予防ま
たは治療するのにうまく用いられ得ることが知られてい
る。本発明者らにより発見された驚くべき不測の結果
は、IL-1媒介疾患およびTNF媒介疾患の治療において相
乗的に作用するIL-1インヒビターおよびTNFインヒビタ
ーの能力である。本明細書中の「相乗的に」は、インヒ
ビターの組合せ投与により示された利益が組合せの成分
の個別の投与の結果得られた効果の総和より大きい状況
をいうのに用いる。

【００３６】本発明はヒトの疾患の予防および治療の方
法に関するが、ガイダンスが一般的な病理学的用途に提
供されるため、獣医学的な用途もまた本発明の範囲に含
まれる。

【００３７】自然発生的な疾患または実験的な疾患が体
内の疾患または兆候の焦点付近の体液または組織中のTN
Fの上昇レベルと関連付けられる場合、疾患または医学
的な症状は「TNF媒介疾患」であると考えられる。TNF媒
介疾患はまた次の２条件により認められ得る：(1)疾患
と関連した病理学的所見が、TNFの投与により動物で実
験的に似せ得る；および(2)疾患の実験動物モデルにお
いて誘導される病因がTNFの作用を阻害する薬剤での治
療により阻害または廃止され得る。多くのTNF媒介疾患
はこれらの３条件の内２つを満足し、そして他は３つ全
ての条件を満足する。TNF媒介疾患の限定されないリス
トは、成人呼吸促進症候群、肺繊維症、関節炎、炎症性
腸疾患、および敗血症性ショックを含む。

【００３８】自然発生的または実験的である、疾患また
は医学的な症状が体液または組織中のIL -1の上昇レベ
ルと関連付けられる場合、あるいは、体内から得られた
細胞または組織が培養中のIL-1の上昇レベルを生じる場
合、疾患または医学的な症状は「インターロイキン−１
媒介疾患」であると考えられる。多くの場合、そのよう
なインターロイキン−１媒介疾患はまた、次の２条件に
より認識される：(1)疾患または医学的な症状と関連す
る病理学的所見が、IL-1の投与により動物で実験的に似
せ得る；および(2)疾患または医学的な症状の実験動物
モデルにおいて誘導される病因が、IL-1の作用を阻害す
る薬剤での治療により阻害または廃止され得る。ほとん
どの「インターロイキン−１媒介疾患」では３つの条件
の内少なくとも２つが適合し、そして多くの「インター
ロイキン−１媒介疾患」では３つ全ての条件が適合す
る。インターロイキン−１が媒介する疾患または医学的
な症状のリストは、関節炎、炎症性腸疾患、敗血症性シ
ョック、虚血性障害、再潅流障害骨粗鬆症、喘息、イン
シュリン糖尿病、骨髄性白血病および他の白血病、乾
癬、および悪液質／食欲不振を含むが、それに限定され
ない。

【００３９】天然に見出されるインヒビタータンパク質
は、それにより治療される被験体において不測の、そし
て望ましくない病理学的副作用を生じる危険が比較的低
いため幾分好ましい。

【００４０】明細書および請求の範囲の目的のために、
そのタンパク質または実質的に等しいタンパク質が、健
常なヒトに通常存在することが見出され得る場合に、タ
ンパク質は「天然に見出される」であると考えられる。
「天然に見出される」タンパク質は特に、健常なヒト中
ではグリコシル化された型で存在するタンパク質の非グ
リコシル化型に加え、健常なヒトに存在することが分か
ったタンパク質の、そのようなタンパク質のカルボキシ
ル末端で部分的に切断される形態を包含する。「天然に
見出される」タンパク質は、組換えDNA法および普通に
それらを生成する細胞からの単離により得られ得る。
「天然に見出される」はまた、E.coli.の発現の結果の
ようにN末端メチオニン基を含むタンパク質も包含す
る。

【００４１】明細書および請求の範囲にわたって用いら
れる「実質的に同じ」は、非常に高度のアミノ酸残基ホ
モロジーを有すること、および、同等の生物学的活性を
有することを意味すると定義される(一般的にM.Dayhof
f, Atlas of Protein Sequence and Structure,５巻,12
4ページ,(1972) National Biochemical Research Found
ation, Washington,D.C.,本明細書中に参照として特に
援用した)を参照)。

【００４２】本発明で有用なTNFインヒビターは、TNFの
結合タンパク質としてインビボで存在する天然に見出さ
れるタンパク質であり、ヨーロッパ出願第90 113 673.9
号（欧州公報番号第EP 422 339号）の「腫瘍壊死因子(T
NF)インヒビターおよびそれを得る方法」、1990年7月17
日出願、に記載され、この開示内容は本明細書に参考と
して援用されている。

【００４３】２つの異なる型の好ましいTNFインヒビタ
ーがあり、それぞれヨーロッパ出願第90 113 673.9号
（欧州公報番号第EP 422 339号）で開示および記載され
ている。これらのうち第一の型は、30kDa TNFインヒビ
ターであり、ヒトU937細胞により調整された培地および
ヒト尿から同定され、単離されている。30kDa TNFイン
ヒビターは、SDS-PAGEでおよそ30kDaであり、トリス緩
衝液(pH7.5)中の約80ミリモルのNaClでDEAE CL6Bカラム
から溶出される。30kDa TNFインヒビターは、TNFαの活
性を阻害し、TNFβの活性にはほとんど影響しないこと
が示された。天然に見出されるタンパク質はグリコシル
化されている。非グリコシル化30kDa TNFインヒビター
もまたTNF阻害活性を示す。

【００４４】TNFインヒビターの第二の型は、40kDa TNF
インヒビターであり、これもまた、少なくともヒトU937
細胞により調整された培地およびヒト尿から同定され、
単離されている。全長の40kDa TNFインヒビターは糖タ
ンパク質であり、SDS-PAGEでおよそ40kDaであり、トリ
ス緩衝液( pH7.5)中の約100ミリモルのNaClでDEAEカラ
ムから溶出される。この40kDa TNFインヒビターはTNFα
およびTNFβの両方の活性を阻害することが示されてい
る。非グリコシル化タンパク質はTNF阻害活性を示す。

【００４５】40kDa TNFインヒビターの３つの型が、E.c
oli.中の発現により組換え生成された。これらの型のそ
れぞれは、全長40kDa TNFインヒビター、40kDa TNFイン
ヒビターΔ51、および40kDa TNFインヒビターΔ53と呼
ばれ(ヒトU937細胞により調整された培地およびヒト尿
より単離されたグリコシル化全長40kDa TNFインヒビタ
ーとともに、グリコシル化型および非グリコシル化型
で、その全ては本明細書中ではひとまとめにして40kDa
TNFインヒビターと呼ばれる)、これらはヨーロッパ出願
第90 113 673.9号（欧州公報番号第EP 422 339号）に記
載される。Δ51タンパク質は、天然タンパク質の切断型
であり、成熟タンパク質のカルボキシル末端で51個のア
ミノ酸残基が切り離されている。Δ53タンパク質は、成
熟タンパク質の切断型であり、天然タンパク質のカルボ
キシル末端で53個のアミノ酸残基が切り離されている。
天然に見出される40kDa TNFインヒビター(グリコシル
化)および非グリコシル化インヒビター(天然全長(nativ
e full length)、Δ15およびΔ53)は実質的に同じTNF阻
害活性を有する。

【００４６】30kDa TNFインヒビターおよび40kDa TNFイ
ンヒビターの両方をコードする遺伝子の核酸配列および
これらのタンパク質のアミノ酸配列は、ヨーロッパ出願
第90113 673.9号（欧州公報番号第EP 422 339号）に示
されている。本発明は、上記のように、TN Fインヒビタ
ーの非グリコシル化型および天然に見出されるタンパク
質の特定の切断型を含む。さらなる実施態様では、TNF
インヒビターは、下記のように１つ以上のポリエチレン
グリコール(PEG)または他の反復ポリマー部分の結合に
より修飾される。

【００４７】TNFインヒビターを生成する方法もまたヨ
ーロッパ出願90 113 673.9号（欧州公報番号第EP 422 3
39号）に開示される。１つの開示された方法は、ヒト尿
およびヒトU937細胞により調整された培地のような種々
の材料からインヒビターを単離することも包含する。第
二の開示された方法は、インヒビターをコードする遺伝
子を単離し、適切なベクターおよび細胞型に遺伝子をク
ローニングし、そして遺伝子を発現させてインヒビター
を生成することを包含する。後者の方法は、一般的に典
型的な組換えDNA方法であり、本発明の好ましい方法で
ある。組換えDNA方法は、より高い純度で比較的多量を
得ることができるため幾分好ましい。

【００４８】好ましくは、上記のTNFインヒビターは、
上記の方法により「実質的に純粋な」型で生成される。
「実質的に純粋な」により、インヒビターは、非修飾型
において、比較的高い比活性を有することを意味する。
しかし、TNFインヒビターの誘導体は異なる比活性を有
し得ることが理解されるべきである。

【００４９】さらに、TNFインヒビターは、TNFレポータ
ー部位についてTNFと競合し得る化合物を包含する。そ
のような化合物はレセプターアンタゴニストを包含す
る。他のTNFインヒビターは、インビボでTNFの合成また
は細胞外放出を妨害する化合物およびタンパク質を包含
する。そのような化合物は、TNF遺伝子の転写または翻
訳あるいはTNFプレタンパク質のプロセッシングに影響
する因子を包含する。

【００５０】本発明の特に好ましいIL-1raは天然に見出
されるタンパク質であり、インターロイキン−１の制御
因子としてインビボで存在する。これはHannumらにより
米国特許第5,075,222号、「インターロイキン−１イン
ヒビター」にすでに記載されている。この米国特許は、
本明細書では’222特許というが、参考として本明細書
中に特に援用する。本発明の特に好ましいIL-1raは、ア
ミノ酸の１文字表記で表される以下のアミノ酸配列：

【００５１】

【化１】 （ここで、（Ｕ）は、何もないか、Ｍであり、（Ｘ）
は、ＲまたはＰである）、または上記アミノ酸配列に少
なくとも約70％相同な配列である。

【００５２】３つの好ましいIL-1ra型は、それぞれは同
じDNAコード配列由来であるが、’222特許に開示および
記載される。これらのうち第一の型のIL-1raαは、およ
そ4.8の等電点を有する、SDS-PAGEで22-23kDaの分子で
あり、トリス緩衝液(pH7.6)中の52mMのNaClあたりでMon
oQ FPLCカラムから溶出される。第二の型のIL-1raβ
は、22-23kDaのタンパク質(p.I=4.8)であり、MonoQカラ
ムから60mMのNaClで溶出される。第三の型のIL-1rax
は、20k Daのタンパク質であり、MonoQカラムから48mM
のNaClで溶出される。これらのインターロイキン−１イ
ンヒビターの３つ全てが、類似の機能活性および免疫活
性を有する。本発明はまた、修飾IL-1raも包含する。１
つの実施態様では、IL-1raは、下記のように、１つ以上
のポリエチレングリコール(PEG)または他の反復ポリマ
ー部分の結合により修飾される。他の実施態様では、IL
-1raは、E.coli.での発現の結果としてのN-末端メチオ
ニン基を含む。

【００５３】これらのIL-1インヒビター、特にIL-1ra、
を生成する方法もまた、’222特許に開示される。１つ
の開示された方法は、ヒト単球(天然に生成される)から
インヒビターを単離することを包含する。第二の開示さ
れた方法は、インヒビターをコードする遺伝子を単離
し、適切なベクターおよび細胞型に遺伝子をクローニン
グし、遺伝子を発現させてインヒビターを生成し、そし
てインヒビターを採取することを包含する。後者の方法
は、一般に典型的な組換えDNA方法であり、本発明の好
ましい方法である。組換えDNA方法は、より高い純度で
比較的多量を得ることができるため幾分好ましい。

【００５４】さらに、インターロイキン−１インヒビタ
ーは、IL-1への細胞性レセプターの活性化を特異的に妨
害し得る化合物を含む。そのような化合物は、可溶性レ
セプターおよびモノクローナル抗体のようなIL-1結合タ
ンパク質を包含する。そのような化合物はまた、レセプ
ターアンタゴニストおよびレセプターに対するモノクロ
ーナル抗体を包含する。

【００５５】IL-1raの第二のクラスは、インビボでの合
成および／またはIL-1の細胞外放出を妨害する化合物お
よびタンパク質を包含する。そのような化合物は、IL-1
遺伝子の転写またはIL-1プレタンパク質のプロセッシン
グに影響する因子を包含する。特定の条件下で、IL-1ra
はIL-1誘導性IL-1生成を妨害する。

【００５６】好ましくは、上記のIL-1raは、上記の方法
により「実質的に純粋な」型で生成される。「実質的に
純粋な」により、インヒビターは、非修飾型において、
比較的高い比活性、好ましくは約150,000-500,000レセ
プター単位／mgの範囲、を有することを意味する。この
範囲は、Hannumら、Nature 343:336-340(1990)、およ
び、Eisenbergら、Nature 343:341-346(1990)で定義さ
れ、両方とも本明細書に参考として特に援用される。し
かし、IL-1raインヒビターの誘導体は異なる比活性を有
し得ることが理解されるべきである。

【００５７】修飾TNFおよびIL-1インヒビターもまた、
本発明の範囲に含まれる。修飾インヒビターは、例え
ば、そのシステイン残基が天然に見出されるインヒビタ
ーのアミノ酸配列の１つ以上の部位でアミノ酸に置換さ
れるようなインヒビターの変異タンパク質を包含する。
次いで、そのような変異タンパク質、は機能化ポリエチ
レングリコール(PEG)ユニットまたは他のスルフヒドリ
ル含有ポリエーテルと部位特異的に反応させ、TNFイン
ヒビターPEG種またはIL-1インヒビターPEG種を生成し得
る。PCT公開公報番号WO 92/16221(参考として本明細書
に援用する)は、多くの修飾したTNFインヒビター種およ
びIL-1インヒビター種ならびにそのようなPEG修飾イン
ヒビターを生成する方法を開示する。30kDa TNFインヒ
ビターの105位でアスパラギンがシステインと置換され
ている30kDa TNFインヒビター変異タンパク質(本明細書
中では「C105変異タンパク質」または「C105」と呼ぶ)
は、特に有用である。さらに１つの実施態様では、変異
タンパク質は二官能性PEGユニットと反応し得、二価の
「唖鈴」種を形成する。ここで２つのサイトカイン種
は、一本鎖のPEG鎖を介して結合し、例えば２つのC105
変異タンパク質がポリエチレングリコール(PEG)部分、
特に約20,000の分子量を有するPEG、に結合する。

【００５８】好ましいインヒビターの阻害機能は、１つ
以上の別個の分離可能な部分により分けて与えられ得る
ため、本発明の方法は、インターロイキン−１またはTN
F阻害を制御するTNFインヒビターまたはIL-1インヒビタ
ーの部分を活性成分として有する治療組成物を投与する
ことにより実施され得ることもまた推察される。

【００５９】本発明の治療組成物は、注射により非経口
的に投与され得る。しかし、関節内注射、吸入剤ミス
ト、経口活性処方物、経皮イオン導入法、または坐剤の
ような他の有効な投与剤形もまた推察される。１つの好
ましいキャリアは生理的食塩水溶液であるが、他の薬学
的に受容可能なキャリアもまた用いられ得ることが予期
され得る。

【００６０】１つの実施態様では、キャリアおよびTNF
インヒビターおよびIL-1インヒビターは、生理的に適合
性であり、遅延放出性の処方物を構成することが推察さ
れる。そのようなキャリア中の基本の溶媒は、天然では
水系または非水系であり得る。さらにそのキャリアは、
処方物のpH、モル濃度、粘稠度、透明度、色調、無菌
性、安定性、分解の速度、または香りを改変または維持
するための他の薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。
同様に、そのキャリアは、TNFインヒビターおよび／ま
たはIL-1インヒビターの安定性、分解の速度、放出、あ
るいは吸収のための、さらに他の薬学的に受容可能な賦
形剤を含み得る。そのような賦形剤は、通常または習慣
的に、単位投与量または複数投与量のいずれかで、非経
口投与の投与量を処方するために用いられるそれらの物
質である。

【００６１】一度治療組成物が処方されると、溶液、懸
濁液、ゲル、乳濁液、固体、あるいは乾燥粉末または凍
結乾燥粉末として無菌のバイアルに保存され得る。その
ような処方物は、使用可能な型または投与の直前に再生
を必要とするかのいずれかで保存され得る。そのような
処方物の好ましい保存は、少なくとも４℃程度の低い温
度であり、そして好ましくは-70℃である。そのようなT
NFインヒビターおよびIL-1インヒビターを含む処方物
を、生理的pHでまたはその付近で保存し、投与すること
が好ましい。高pH(すなわち８より高い)または低pH(す
なわち５未満)での処方における投与は好ましくないと
現在考えられている。

【００６２】好ましくは、全身送達のためのTNFインヒ
ビターおよびIL-1インヒビターを含む処方物を投与する
様式は、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、または膣また
は直腸の坐剤を介する。好ましくは、局所送達のための
TNFインヒビターおよびIL-1インヒビターを含む処方物
の投与様式は、関節内、気管内、点滴注入または気道へ
の吸入を介する。さらに、消化管の特定の部分に、適切
な処方またはデバイス中のTNFインヒビターおよびIL-1
インヒビターの経口投与、あるいは坐剤または浣腸のい
ずれかにより、TNFインヒビターおよびIL-1インヒビタ
ーを投与することが望まれ得る。

【００６３】TNF媒介疾患およびIL-1媒介疾患を治療す
るさらに好ましい形態では、初めにTNFインヒビターお
よびIL-1インヒビターの静脈内のボーラス注射を行った
後、次いでTNFインヒビターおよびIL-1インヒビターを
持続的に静脈内注入する。

【００６４】敗血症性ショックの治療の開始は、敗血症
または敗血症の可能性が診断された後できるだけすぐに
開始するべきである。例えば、治療は、手術または事故
または敗血症性ショックの開始の危険性をもたらし得る
他の出来事に続いてすぐ始められ得る。

【００６５】TNF媒介疾患またはIL-1媒介疾患の治療、
およびさらに特に関節炎の治療の好ましい形態は以下を
含む：(1)関節炎の再発の予防または治療に必要である
として定期的に行われるTNFインヒビターおよびIL-1イ
ンヒビターの一回の関節内注射；および(2)TNFインヒビ
ターおよびIL-1インヒビターの定期的な皮下注射。

【００６６】TNF媒介疾患またはIL-1媒介疾患の治療お
よびさらに特に成人呼吸促進症候群の治療の好ましい形
態は以下を含む：1)TNFインヒビターおよびIL-1インヒ
ビターの１回または数回の気管内投与；および2)TNFイ
ンヒビターおよびIL-1インヒビターのボーラスまたは持
続的な静脈内注入。 TNFインヒビターおよびIL-1イン
ヒビターを含む特定の処方物は経口的に投与されるべき
であることもまた考えられる。好ましくは、このように
投与されるTNFインヒビターおよびIL-1インヒビターは
カプセル化されている。カプセル化TNFインヒビターお
よびIL-1インヒビターは、固体の剤形の調剤で習慣的に
用いられるそれらのキャリアとともに、あるいはキャリ
アなしで処方され得る。好ましくは、カプセルは、生物
学的利用率が最大になり、そして全身にゆきわたる前の
分解(pre-systemic degradation)が最小となる場合、処
方物中の活性部分が胃腸管中のその地点で放出されるよ
うに設計される。添加の賦形剤が、TNFインヒビターお
よびIL-1インヒビターの吸収を促進するために含まれ得
る。希釈剤、フレーバリング、低融点ワックス、植物
油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた
用いられ得る。

【００６７】投与の様式に関わらず、およそ被験体の体
重に従って特定の投与量が計算される。ある実施態様で
は、投与は、被験体の血流中であらかじめ選択した濃度
範囲のTNFインヒビターおよびIL-1インヒビターにする
ように設計される。0.01ng/ml血漿未満のTNFインヒビタ
ーおよびIL-1インヒビターの循環濃度の維持は、効果的
な組成物ではあり得ないと考えられる。10μg/mlを超え
る循環レベルの長期の維持は、望ましくない副作用を有
し得る。

【００６８】さらに、上記の処方物のそれぞれを含む治
療のための適正な投与量を決定するのに必要な精妙な計
算は、当業者によりルーチン的に行われ、そして必要以
上に実験を行うことなく(特に本明細書で開示された投
与量の情報およびアッセイの観点で)、当業者によりル
ーチン的に行われる手始めの仕事の中に含まれる。これ
らの投与量は、適正な用量−応答データと組合せて、用
いられる投与量を決定するための確立されたアッセイの
使用により確認され得る。

【００６９】本明細書中に記載されたTNFインヒビター
およびIL-1インヒビターの処方物は、ヒトの適用と同様
に獣医用にも用いられ得ること、そして用語「被験体」
は限定したように解釈されないことに注意するべきであ
る。獣医用の適用の場合では、投与量の範囲は上記で特
定したのと同じである。

【００７０】インターロイキン−１レセプターアンタゴ
ニスト(IL-1ra)および腫瘍壊死因子結合タンパク質(TNF
bp)は、IL-1およびTNFにより媒介される炎症性疾患の治
療用に開発された。２つの実験系、ラットにおける慢性
関節リュウマチおよびヒヒにおける敗血症性ショック、
において、IL-1またはTNFのいずれかのみの作用の遮断
は、炎症性応答をかなり阻害するのに十分であった。げ
っ歯類の関節炎において、関節腫脹は、ペプチドグリカ
ン-多糖(PG/PS)によって誘導される再活性化関節炎に冒
されたラットにおいて、IL-1raまたはTNFbpのいずれか
単独の投与により最大限に阻害された。敗血症性ショッ
クにおいて、Escherichia coliで感染させたヒヒは、IL
-1raまたはTNFbpのいずれか単独の投与により、致死率
および血流力学変化に対して同様の程度に防御された。

【００７１】いずれかのインヒビターの単独投与の有効
な効果を示す実験系でのこれらの結果は、IL-1およびTN
Fの間の相乗的な相互作用が十分な病理学的応答を引き
出すのに望ましいこと、および、これらのキーメディエ
ーターの１つの作用の阻害が炎症プロセスの程度を最大
限に低下させるのに十分であることを示唆する。IL-1ra
またはTNFbpのいずれかの単独の投与は、IL-1媒介疾患
およびTNF媒介疾患の他の動物モデルにおいて炎症効果
を最大限に低下させるのに十分であること、および、上
記インヒビターの組合せ投与は特別な利点を与えないこ
とが考えられた。しかし、予期されないことに、LPS再
活性化関節炎、LPS刺激性肺胞炎、およびLPS刺激性全身
性炎症応答に冒されたラットのIL-1raおよびTNFbpの組
合せでの治療は、それぞれ関節腫脹、気管支肺胞の好中
球放出、および致死率に相乗的に阻害効果を引き起し
た。以下の実施例は、慢性関節リュウマチ、成人呼吸促
進症候群(ARDS)、および敗血症のようなIL-1媒介炎症性
疾患およびTNF媒介炎症性疾患をIL-1raおよびTNFbpでの
組合せ治療により治療する方法を記載する。

【００７２】以下の実施例は本発明を例示する事を意図
し、限定するものではない。

【００７３】

【実施例】（実施例Ｉ）本実施例は、LPS誘導性のSCW誘
導性関節炎の再活性化におけるIL-1raおよびTNFbpの組
合せ治療の相乗効果を示す。

【００７４】慢性関節リュウマチおよび関連の関節炎の
病因の現在の理論は、免疫学的媒介関節炎症の２つの可
能性のあるメカニズムを仮定する：(a)関節に局在する
微生物成分、または(b)関節性自己抗原。Wilder、Exper
imental Animal Models of Chronic Arthritis.２つの
微生物成分(リポ多糖(LPS)およびペプチドグリカン-多
糖(PG/PS))により誘導される慢性関節リュウマチの動物
モデルを用いて、関節炎の治療にヒト組換え30kDa TNF
インヒビター(hrTNF/inh30)およびヒト組換えIL-1レセ
プターアンタゴニスト(hrIL-1ra)を用いる組合せ治療の
使用を研究した。R.L.Wilder,Immunopathogenetic Mech
anisms of Arthritis、streptococcus細胞壁誘導性関節
炎に関する、第９章「Experimental Animal Models of
Chronic Arthritis」によると、「実験的関節疾患の臨
床的、組織学的、および放射線学的特徴は、成人および
若年性関節炎で観察される特徴に密接に類似してい
る。」 次の実験において、Schwab,Experimental Medicine,168
8-1702,(1987)に記載の動物モデルを用いて正常ラット
の足根の関節に関節炎を誘導した。簡単にいうと、関節
炎を２つの微生物成分の順次投与により誘導した：(1)
まず、ペプチドグリカン-多糖(PG/PS)を含むstreptococ
cus細胞壁(SCW)生成物を関節内に注射し、そして(2)21
日後にSalmonella typhimurium由来のリポ多糖(LPS)を
静脈内に注射した。

【００７５】（Ａ．実験１）それぞれ140〜160gの重さ
のLewisラット(Charles River)には、足首の関節へ関節
あたり３μgのラムノース投与量でSCWを関節内注射し
た。生理食塩水を反対側性の関節に注射してコントロー
ルを提供した。SCWの関節内注射は、注射後１〜２日で
ピークをむかえる関節の腫脹を伴う、比較的短期間の急
性関節炎を引き起こす。急性炎症反応がおさまる20日間
の後、リポ多糖(LPS)を45μg/ラットの投与量で静脈注
射により投与した。その投与量のLPSはあらかじめSCWを
注射した足首の関節で炎症を十分に再活性化し、生理食
塩水を注射した足首においてはほとんど効果がなかっ
た。LPSの静脈注射後72時間の炎症の程度を評価するた
めに、足首の関節の面積を関節炎の再活性化後０、24、
36、48、および72時間で測定した。

【００７６】単独および組合せで投与された場合の、IL
-1raおよびTNFbpの効果を、関節炎の活性化の間の関節
腫脹の発達について試験した。インヒビターおよび溶媒
をLPSの静脈内注射に関して０、２、６、12、18、24、3
0、36、および42時間で首の背部で皮下に投与した。第
一の実験において、ラットを以下のように処置した： 第Ｉ群−溶媒(クエン酸ナトリウム、NaCl、およびEDTA) 第ＩＩ群−IL-1ra(2mg/kg) 第ＩＩＩ群−TNFbp(1mg/kg) 第ＩＶ群−IL-1ra(2mg/kg)＋TNFbp(1mg/kg) 再活性化後72時間の関節の直径における最大の増加を表
１に示す。その結果により、IL-1raおよびTNFbpの組合
せ治療はLPS再活性化関節炎においてさらに阻害効果を
引き起こしたことが示される。IL-1raおよびTNFbp単独
ではそれぞれ31％および16％で関節腫脹を阻害したが、
組合せ治療は41％で腫脹を阻害した。

【００７７】

【表１】 （Ｂ．実験２）第二の実験において、インヒビターをLP
S誘導性再活性化後、０、２、６、12、18、24、30、3
6、および42時間に皮下注射により単独および組合せで
再び投与した。IL-1raの投与量は実験１で用いた投与量
に比較して減少した。一方TNFbpの投与量は変更しなか
った。ラットは以下のように処置した： 第Ｉ群−溶媒 第ＩＩ群−IL-1ra(0.1mg/kg) 第ＩＩＩ群−TNFbp(1mg/kg) 第ＩＶ群−IL-1ra(0.1mg/kg)＋TNFbp(1mg/kg) 表２に第Ｉ群、第ＩＩ群、第ＩＩＩ群、および第ＩＶ群
のラットの関節の直径における変化の時間経過を示す。
ラットの関節腫脹はIL-1raおよびTNFbp単独での治療の
関節腫脹における効果の欠失に比較して、IL-1raおよび
TNFbpの組合せ治療により減少した。組合せ治療の相乗
的な阻害効果は図１および表３に明確に示される。図１
に、LPS誘導性再活性化後72時間の関節の直径における
最大の増加を示す。IL-1raおよびTNFbpの組合せ治療は
関節腫脹の有意な抑制(35％)を引き起こしたが、いずれ
かの薬剤単独での治療は有意な減少は引き起こさなかっ
た。表３で、表２にあげた値についての曲線下面積［直
径変化(mm)対時間(hr)］を示す。再活性化の72時間でIL
-1raおよびTNFbpでの組合せ治療は全体的な関節腫脹に
有意な減少(53％)を引き起こし、いずれかの薬剤単独で
の治療は有意な減少を引き起こさなかった。

【００７８】

【表２】

【００７９】

【表３】 組合せ治療での腫脹の減少を反映する割合は、実験１お
よび２で似ていた(それぞれ、41％および35〜53％)。関
節腫脹におけるIL-1raおよびTNFbpの阻害作用の相乗作
用を利用して、実験２で同様のレベルの治療効果が、IL
-1raの投与量が10倍減少したにもかかわらず達成され
た。

【００８０】（実施例ＩＩ）本実施例は成人呼吸促進症
候群(ARDS)を治療する方法として、LPS刺激性好中球肺
胞におけるIL-1raおよびTNFbpの組合せ治療の相乗効果
を示す。

【００８１】本実験は敗血症刺激剤のエンドトキシンを
用いて急性好中球媒介肺障害を誘導した。それは本明細
書に参考として特に援用したUlichらのAmerican Journa
l ofPathology 138:1485-1496(1991)で開示されたモデ
ルに従った。本モデルは以下のように簡単にまとめられ
る：麻酔したラットの気管の中央首部分にエンドトキシ
ンを気管内注射する。６時間の潜伏期の後、肺の気管支
肺胞洗浄(BAL)を停止の方法として行う。総および個別
の白血球細胞の計数をBAL液で行う。発熱物質フリーの
生理食塩水の気管内注射により、少数の優勢な肺胞マク
ロファージ(約99％)を有するBAL液が生じる。エンドト
キシンの気管内注射で、BAL細胞および優勢な好中球数
の大きな増加が引き起こされる。肺胞空間への急性好中
球の流入は６〜12時間にピークをむかえ、肺胞空間への
タンパク質含有水腫液の蓄積を伴う。IL-1およびTNF
は、エンドトキシンでの刺激後BAL液中に存在する。肺
胞マクロファージはサイトカイン合成の材料であると考
えられる。さらに外因性IL-1およびTNFの気管内注射
は、急性肺胞内好中球滲出液を誘導し、この滲出液はエ
ンドトキシンにより誘導される液と質的に同様である。

【００８２】肺実質の障害の急性期の間の肺水腫変化、
リンパ球の隔離、および低酸素血症に似る多くの動物モ
デルが、Murrayら、American Review of Respiratory D
isease 138:720-723(1991)に従ってARDSの間に用いられ
る。ARDSの急性型は、敗血症、吸引、または多くの輸血
のような特定の同定できる危険因子の存在下で起こる。
現在の研究は、ARDSの病態生理学における好中球媒介障
害の主な役割を強調する[Tate, Am.Rev.Resp.Dis. 128:
552-559(1983)]。活性化好中球により放出された毒性生
成物が肺胞の毛細血管膜を損傷すると考えられる。損傷
した膜の浸透性が大きく増加し、肺胞空間への血漿タン
パク質および炎症性細胞の移動を刺激する。敗血症起源
のARDSの実験ウシモデルにおいて、好中球の枯渇が肺障
害の発達に対して防御した[Heflin, J.Clin.Invest. 6
8:1253-1260(1981)]。

【００８３】ラットの好中球性肺胞炎のTNFbp(組換えヒ
ト30kDa TNFインヒビター)およびIL-1ra(組換えヒトIL-
1ra)の組合せ治療の気管内投与による治療法を記載す
る。肺障害は、外科的に曝された気管の中央首領域中の
気管リングの間に進入された27ゲージ1/2インチの針を
通してエンドトキシン、Salmonella typhimurium由来の
リポ多糖(LPS)の総量0.5mlの無菌PBS中の５μg/ラット
の投与量での投与により誘導された。接種物をラットの
呼吸の速さおよび深さをモニターしながら気管にゆっく
りと投与した。６時間後、ラットを肺の洗浄を容易にす
るために開腹を行い得るようにイソフルランで麻酔し
た。尾静脈の大静脈を切断して肺の血液含量を減少し
た。横隔膜を開けて肺を洗浄の間広げ得るようにした。
BALは、血管カテーテル(angiocath catheter)を介して
気管支肺胞空間に40mlのハンクス調製塩溶液(Hank’s b
alanced salt solution)を注入して行った。血管カテー
テルは、首の中央の気管切開の部位に差し込み、固定し
た。炎症性細胞流入を1500rpmで15分間BAL液を遠心して
得られた沈殿から回収した。リンパ球の総数をCoulter
カウンターで計数した。多形核好中球の割合を、染色細
胞のスライド上で異なる細胞の計数を手動で行うことに
より測定した。

【００８４】IL-1raおよびTNFbpの気管支肺胞空間へのL
PS刺激性流入における効果を、気管内にインヒビターを
投与し、同時にLPSの気管内点滴注入を行うことにより
測定した。TN F/inhを0.1μg/ラット〜10μg/ラットの
範囲の投与量で１回で投与した。結果を表４にまとめ
た。0.1μg/ラットの投与量でのTNFbpは肺胞空間への好
中球の流入を減少しなかった。しかし、2.5μg/ラット
〜10μg/ラットの間の投与量でのTNF/inhの気管内投与
は、30〜40％の範囲で肺胞空間への好中球の流入におい
て最大限の減少を引き起こす。IL-1raを0.75μg/ラット
〜10μg/ラットの範囲の投与量で投与した(表５)。0.75
〜2.5μgの間の投与量でのIL-1raは、肺胞空間への好中
球の流入を減少しなかった。しかし、５μg/ラットおよ
び10μg/ラットの投与量でのIL-1raの気管内投与は、そ
れぞれ57％および47％の有意な割合の阻害を引き起こし
た。

【００８５】

【表４】

【００８６】

【表５】 予備実験において、最大阻害用量のIL-1ra(100μg/ラッ
ト)およびTNF/inh(10μg/ラット)での組合せ治療は、い
ずれかの薬剤単独の効果より有意に異ならなかった好中
球の流入において阻害効果を引き起こした。

【００８７】実験１および２において、組合せ治療の効
果を、最大下投与量または閾下投与量のIL-1raおよびTN
F/inhを用いて気管支肺胞への好中球流入について試験
した。実験１において、IL-1raおよびTNF/inhを次の投
与量でLPSと同時に気管内に与えた： 第Ｉ群−溶媒 第ＩＩ群−TNF/inh(0.1μg/ラット) 第ＩＩＩ群−IL-1ra(2.5μg/ラット) 第ＩＶ群−TNF/inh(0.1μg/ラット)＋IL-1ra(2.5μg/ラ
ット) 気管支肺胞空間へ移動した好中球の数を表６に示す。そ
の結果により、IL-1raおよびTNF/inhの組合せ治療がLPS
刺激性好中球肺胞炎においてさらに阻害効果を引き起こ
したことが示された。TNF/inhおよびIL-1raはそれぞれ1
9％および29％で好中球流入を阻害したが、組合せ治療
は47％で腫脹を阻害した。

【００８８】

【表６】 実験２において、インヒビター(単独および組合せ)を実
験１のようにLPS障害と同時に気管内の経路により投与
した。IL-1raは前の実験において2.5μg/ラットで好中
球流入に最大下阻害効果を引き起こしたので、IL-1raの
投与量を閾値下阻害効果を引き出し得る投与量に減少し
た。その目的は、インヒビターが単独では有意な減少を
引き出さないが、組み合わせて投与された場合に相乗作
用をするレベルに、投与量を操作することであった。TN
F/inhの投与量は変えなかった。

【００８９】 第Ｉ群−溶媒 第ＩＩ群−TNF/inh(0.1μg/ラット) 第ＩＩＩ群−IL-1ra(0.75μg/ラット) 第ＩＶ群−TNF/inh(0.1μg/ラット)＋IL-1ra(0.75μg/
ラット) 表７に、第Ｉ群、第ＩＩ群、第ＩＩＩ群、および第ＩＶ
群のラットの気管支肺胞に移動する好中球の数を示す。
好中球流入は、TNF/inhおよびIL-1ra単独の治療では好
中球流入に影響を示さなかったのに比較して、TNF/inh
およびIL-1raの組合せ治療により減少した。組合せ治療
の相加的および相乗的な阻害効果は、急性肺障害におけ
る明らかな証拠である。IL-1raおよびTNF/inhの組合せ
治療は、40％の好中球流入における有意な減少を引き起
こしたが、TNF/inhおよびIL-1ra単独の治療はそれぞれ1
2％および７％であり、好中球流入に有意な減少を引き
起こさなかった。

【００９０】

【表７】 （実施例ＩＩＩ）IL-1raおよびTNFbpを個々におよび組
合せて試験し、敗血症を誘導する高用量のエンドトキシ
ンを投与した動物の生存期間の強化における効果を測定
した。この実験系において、ラット(n=６/群)を実施例
ＩＩの方法に従って25mg/kgのLPSを注射した。PEG化し
た(pegylated)TNFbp(ポリエチレン-20KでPEG化した30kD
a TNFインヒビターのC105変異タンパク質)または溶媒単
独をLPSと同時に静脈注射した。一方、IL-1raを表８で
同定した投与量で０、４、８、12、および18時間に皮下
に注射した。最終生存評価をエンドトキシンの投与後96
時間で行った。

【００９１】各試験群の生存率もまた表８に与える。そ
の結果により、IL-1raおよびTNFbpの組合せは生存の相
乗的な強化を生じたが、IL-1raまたはTNFbpは単独では
十分な防御は行われなかったことが示される。

【００９２】

【表８】 （実施例ＩＶ）特定の症状、例えば敗血症および火傷の
被験体のような症状と関係のあるコルチコステロンレベ
ルの上昇は、これらの症状で観察される免疫抑制効果お
よび悪液質の効果にかなり寄与すると考えられる。血清
コルチコステロンレベルにおけるIL-1raおよびTNFbpの
効果を、個々におよび組合せて、ラットにおけるエンド
トキシン誘導性敗血症について測定した。

【００９３】Lewisラットに、実施例ＩＩの方法に従っ
て10mg/kgのLPSを投与した。実施例ＩＩＩのPEG化TNFbp
(1.5mg/kg)をLPSと同時に静脈注射した。一方、hrIL-1r
a(100mg/kg)をエンドトキシンの投与後０、４、８、1
2、および18時間で皮下注射した。

【００９４】血清コルチコステロンレベルをコルチコス
テロン-³Hキット(ICN Biomedicals,Inc., Costa Mesa,
California)を用いて、製造者の指示に従ってラジオイ
ッムノアッセイにより24時間で試験した。表９にアッセ
イの結果をまとめる。

【００９５】

【表９】 表９に示すように、コルチコステロンレベルは、IL-1ra
およびTNFbp単独で得られるレベルに比較して、IL-1ra
およびTNFbpの組合せが与えられた動物で有意に減少し
た。組合せ治療は、IL-1raおよびTNFbpとも血清コルチ
コステロンレベルの減少にさらに影響を引き起こすこと
を示した。これらの結果は、組合せ治療が抗免疫抑制効
果および抗悪液質効果を有し得、その結果、敗血症およ
び火傷の被験体の治療のために治療的に有効な方法とな
ることを示唆する。

【００９６】（実施例Ｖ）血小板数もまた、内毒素血症
を誘導するエンドトキシンを注射したラットで試験し
た。血小板は内毒素血症の間に使い尽くされ、その結果
血小板がかなりの減少することが知られている。

【００９７】Lewisラットに、実施例ＩＩの方法に従っ
て10mg/kgのLPSを投与した。実施例ＩＩＩのPEG化TNFbp
(1.5mg/kg)をLPSと同時に各ラットに静脈注射した。一
方、hrIL-1ra(100mg/kg)をエンドトキシンの投与後０、
４、８、12、および18時間で皮下注射した。

【００９８】血小板数を当該分野で既知の標準法に従っ
て24時間で測定した(粒子サイズに基づく自動化カウン
ター)。表１０にアッセイの結果をまとめる。

【００９９】

【表１０】 両方の実験において、組合せ治療の値は、IL-1raまたは
TNFbpの単独治療の値とかなり異なる。これらの結果
は、内毒素血症の間、組合せ治療が血小板の消耗を減少
することを示唆する。

【０１００】本発明の上記の記載は、例示および説明の
目的のための例である。変更および修飾が本発明の範囲
および趣旨からはずれることなく可能であることは、当
業者に明らかである。次の請求の範囲は、全てのそのよ
うな変更および修飾を包含するのを妨げないことが意図
される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、LPS誘導性再活性化後72時間の関節の
直径における最大増加を示す(^*=片側(unpaired)ｔ検定
による以下の間の有意な差異、TNFbp＋IL-1ra対溶媒(Ve
hicle)、p<0.025；TNFbp＋IL-1ra対TNFbp、p<0.025；お
よびTNFbp＋IL-1ra対IL-1ra、p<0.010)。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１３年１２月２６日（２００１．１２．
２６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【数１】 ここで、(U)は、何もないか、Mであり、(X)は、Ｒまた
はＰである； (ii)(i)のアミノ酸配列に、少なくとも約70％相同な配
列；または (iii)IL-1raα、IL-1raβ、もしくはIL-1rax、の、全て
またはIL-1阻害フラグメントを含むポリペプチドのアミ
ノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 11/00 11/00 11/06 11/06 17/02 17/02 17/06 17/06 19/02 19/02 19/10 19/10 25/00 １０１ 25/00 １０１ 31/04 31/04 35/00 35/00 35/02 35/02 37/02 37/02 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA03 BA44 DA13 DA25 MA02 NA05 NA14 ZA022 ZA602 ZA962 ZB072 ZB112 ZC022 ZC202 4C085 AA13 BB07 EE03

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 腫瘍壊死因子(「TNF」)媒介疾患もしく
   はインターロイキン-１(「IL-1」)媒介疾患である疾患
   を治療または予防するための、IL-1レセプターアンタゴ
   ニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的
   組成物であって、ここで該組成物は、TNFインヒビター
   の投与と同時に、別々に、または逐時的に投与される薬
   学的組成物であり、ただし、該薬学的組成物は、以下：
   腫瘍壊死因子(「TNF」)媒介疾患もしくはインターロイ
   キン-１(「IL-1」)媒介疾患である疾患を治療または予
   防するための、IL-1レセプターアンタゴニストおよび薬
   学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物であっ
   て、ここで該組成物は、TNFインヒビターの投与と同時
   に、または逐時的に投与され、そして、該腫瘍壊死因子
   媒介疾患もしくは該インターロイキン-１媒介疾患は、
   関節炎、成人呼吸促進症候群、敗血症、敗血症もしく火
   傷の免疫抑制の影響および悪液質の影響、ならびに内毒
   素血症から選択され、ここで、該IL-1レセプターアンタ
   ゴニストは、 (a) IL-1raα、IL-1raβ、またはIL-1rax； (b）(a)のいずれかに記載のN-末端メチオニン誘導体；
   ならびに (c) 循環半減期を増加および／または免疫原性を減少す
   るように修飾された(a)および(b)、からなる群から選択
   され、そしてここで、該TNFインヒビターは、 (i) TNFレセプタータンパク質の可溶性フラグメント； (ii) 循環半減期を増加および／または免疫原性を減少
   するように修飾された(i)；ならびに (iii）TNFに対する抗体、からなる群から選択される、
   薬学的組成物ではない、薬学的組成物。
2. 【請求項２】 腫瘍壊死因子(「TNF」)媒介疾患もしく
   はインターロイキン-１(「IL-1」)媒介疾患である疾患
   を治療または予防するための、TNFインヒビターおよび
   薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物であっ
   て、ここで該組成物は、IL-1レセプターアンタゴニスト
   の投与と同時に、別々に、または逐時的に投与される薬
   学的組成物であり、ただし、該薬学的組成物は、以下：
   腫瘍壊死因子(「TNF」)媒介疾患もしくはインターロイ
   キン-１(「IL-1」)媒介疾患である疾患を治療または予
   防するための、TNFインヒビターおよび薬学的に受容可
   能なキャリアを含む薬学的組成物であって、ここで該組
   成物は、IL-1レセプターアンタゴニストの投与と同時
   に、または逐時的に投与され、そして、該腫瘍壊死因子
   媒介疾患もしくは該インターロイキン-１媒介疾患は、
   関節炎、成人呼吸促進症候群、敗血症、敗血症もしく火
   傷の免疫抑制の影響および悪液質の影響、ならびに内毒
   素血症から選択され、ここで、該IL-1レセプターアンタ
   ゴニストは、 (a) IL-1raα、IL-1raβ、またはIL-1rax； (b）(a)のいずれかに記載のN-末端メチオニン誘導体；
   ならびに (c) 循環半減期を増加および／または免疫原性を減少す
   るように修飾された(a)および(b)、からなる群から選択
   され、そしてここで、該TNFインヒビターは、 (i) TNFレセプタータンパク質の可溶性フラグメント； (ii) 循環半減期を増加および／または免疫原性を減少
   するように修飾された(i)；ならびに (iii）TNFに対する抗体、からなる群から選択される、
   薬学的組成物ではない、薬学的組成物。