PT1589987E - Uso do péptido ll-37 de catelicidina e seus derivados no tratmento de feridas crónicas - Google Patents

Description

ΡΕ1589987 1 DESCRIÇÃO "USO DO PEPTIDO LL-37 DE CATELICIDINA E SEUS DERIVADOS NO TRATMENTO DE FERIDAS CRÓNICAS" 0 presente invento refere-se ao péptido LL-37 para usar no tratamento de úlceras crónicas causadas por insuficiência venosa ou por diabetes.

FUNDAMENTO DO INVENTO 0 epitélio constitui a principal barreira entre o hospedeiro e o ambiente potencialmente nocivo e, consequentemente, a protecção desta interface é vital. Uma ferida representa uma barreira quebrada e imediatamente coloca em movimento uma série de eventos estreitamente orquestrados com o fim de rapidamente restaurar a integridade da barreira. 0 encerramento urgente da ferida evoluiu nos organismos superiores, divergindo do processo demorado da regeneração completa do tecido observado nas espécies inferiores. A incapacidade de cicatrização de feridas representa um desafio importante na medicina clínica, variando entre o atraso relativo na cicatrização "normal" observado com o aumento da idade até às úlceras patológicas não cicatrizantes.

As úlceras crónicas constituem um problema 2 ΡΕ1589987 clínico importante e nas últimas décadas, apesar da nossa compreensão do processo fisiológico da ferida ter aumentado, apenas foram atingidas pequenas melhorias terapêuticas. Distintas etiologias podem estar na base do desenvolvimento de ulcerações em diferentes condições clínicas mas, qualquer que seja a causa, as úlceras não cicatrizantes são caracterizadas por uma incapacidade do epitélio em migrar, proliferar e fechar o defeito da barreira. 0 tipo mais comum de úlceras crónicas da pele é as úlceras da perna causadas por insuficiência venosa. Estes doentes desenvolvem edema venoso periférico com subsequente ulceração da pele, enquanto a circulação arterial está intacta. As úlceras da perna e do pé causadas por deficiências arterioscleróticas são menos comuns.

Ainda, as úlceras da pele desenvolvem-se em associação com doenças imunes tais como pioderma gangrenoso e vasculite. 0 tratamento actual inclui imuno-supressão sistémica a longo prazo e nem sempre é eficaz. Os defeitos epiteliais e úlceras nas membranas das mucosas oral, genital e gastrointestinal são comuns e causam muito sofrimento. Os mecanismos patogénicos subjacentes nem sempre são claros, como seja nas aftas e líquen erosivo, e o tratamento é mau.

Os cuidados tradicionais com feridas envolvem remoção, mecânica ou enzimática, dos resíduos necróticos para permitir a formação do tecido de granulação. As feridas que estão extensamente colonizadas com bactérias 3 ΡΕ1589987 podem requerer o tratamento anti-séptico para prevenir a infecção invasiva. São usados numerosos agentes antimicro-bianos tópicos, tais como iodo, clorexidina, peróxido de hidrogénio, prata e antibióticos, mas o risco de efeitos tóxicos destes agentes na matriz e na neoepiderme deve ser considerado. Uma vez a ferida limpa de tecido necrótico, devem ser usados pensos para promover a formação de tecido de granulação. Existe uma grande variedade de tais pensos e numerosos estudos animais e ensaios clínicos demonstraram o seu efeito benéfico na cicatrização de feridas.

Uma certa proporção das feridas permanece resistente à terapia e existe a necessidade de tratamento adicional. Durante a última década houve grande foco no uso potencial de factores de crescimento para acelerar a reparação das feridas. Os factores de crescimento são moléculas, que controlam os processos celulares que são críticos na reparação de tecidos, incluindo migração e proliferação celulares, angiogénese e a síntese de novo de matrix extracelular. 0 efeito benéfico de tais factores de crescimento foi sugerido numa larga variedade de ensaios (Scharffeter-Kochanek et al., Basic Res Cardiol 93:1-3, 1999). No entanto, o tratamento com factores de crescimento das úlceras crónicas foi largamente desapontante na prática clínica. Actualmente a becaplemina (Regranex®), autorizada nos EUA e Europa, mas não na Suécia, é o único factor de crescimento para usar, de preferência, em úlceras diabéticas do pé. Pensa-se que os motivos da falência clínica dos factores de crescimento no tratamento de 4 ΡΕ1589987 úlceras crónicas envolvam problemas de entrega e degradação rápida.

Paralelamente, houve desenvolvimentos das terapias de tecidos usando materiais autólogos e alogénicos em equivalentes da pele humana resultantes de bioengenharia. Os queratinócitos epidérmicos cultivados constituem um tratamento que funciona na cobertura de grandes áreas de pele danificada em, e.g., doentes queimados, mas é dispendioso, demorado e requere instalações laboratoriais. Para proporcionar um substrato dérmico têm sido usadas múltiplas estratégias tais como colagénio acelular de cadáveres humanos ou bovino, com ou sem células. Todos os métodos disponíveis possuem desvantagens consideráveis tais como transmissão potencial de doenças e custos elevados e são dificilmente adequados para o tratamento básico de feridas.

Os péptidos antimicrobianos são moléculas efectoras do sistema imune inato, os quais servem para proteger o hospedeiro contra microrganismos potencialmente prejudiciais. São conservados ao longo da evolução e largamente distribuídos na natureza. Nos seres humanos, apenas meia dúzia foram identificados até agora; entre os quais as defensinas e o péptido antimicrobiano humano catelicidina hCAPl8 foram implicados na defesa epitelial (Selsted et al., J Biol Chem 258:14485-14489, 1983). WO 96/08508 está relacionado com o polipéptido humano FALL-39, assim como com composições farmacêuticas 5 ΡΕ1589987 contendo o referido péptido e tendo uma actividade antimicrobiana contra bactérias. 0 péptido foi designado FALL-39 de acordo com os quatro primeiros resíduos de aminoácidos e consiste em 39 aminoácidos da parte exterminai de uma pro-proteína simultaneamente identificada por três grupos separados (Cowland et al., FEBS, 1995; Agerberth et al., Proc Natl Acad Sei USA 1995; Larrick et al., FEBS Letter 1996). Mostrou-se que o péptido possui forte actividade antimicrobiana contra bactérias gram-positivas e gram-negativas. A caracterização adicional do péptido C-terminal demonstrou uma sequência mais pequena compreendendo 37 aminoácidos excluindo os primeiros dois (FA) resultando em LL-37, que é a designação actualmente aceite (Gudmundsson et al., Eur J Biochem 238:325-332, 1996). A pro-proteína foi designada hCAPl8, proteina antimicrobiana catiónica humana, e é um membro da familia de proteínas das catelicidinas que consiste em catelina, a qual se manteve conservada ao longo da evolução, e numa parte C-terminal, variável em diferentes espécies. No Homem, hCAPl8 é o único membro desta família de proteinas, enquanto noutras espécies, como o murganho e o porco, existem vários membros. Pensa-se que o péptido C-terminal LL-37 funcione extracelularmente e não existe evidência de clivagem intracelular da pro-proteína. hCAPl8/LL-37 está Pressente em leucócitos e em órgãos de barreira tais como pele, membranas mucosas, epitélio respiratório e órgãos reprodutores. A localização de hCAPl8/LL-37 no epitélio das 6 ΡΕ1589987 barreiras parece ser consistente com um papel protector do péptido na prevenção da infecção local e invasão microbiana sistémica. LL-37 está descrito como um péptido sem cisteinas que pode adoptar uma conformação de hélice a anfipática, ou por outras palavras anfifilica. Uma elevada cationicidade em combinação com uma estrutura de hélice α anfipática estabilizada parece ser necessária para o efeito antimicrobiano de tais péptidos contra bactérias gram-positivas e fungos, como foi demonstrado experimentalmente (Giangaspero et al., Eur J Biochem 268:5589-5600, 2001). A estrutura anfipática e de hélice oí parece ser menos critica para a morte de bactérias gram-negativas. Em associação com inflamação hCAPl8-LL-37 é regulada positivamente no epitélio da pele (Frohm et al., J Biol Chem 272:15258-15263, 1997) e membranas mucosas (Frohm Nilsson et al., Infect Immun 67:2561-2566, 1999).

TÉCNICA ANTERIOR

Dorschner et al., J Invest Fermatol 117:91-97, 2001, demonstraram que a expressão de catelicidinas aumentava em pele humana e murina após incisão e que a ausência do gene homólogo da catelicidina murina impedia a protecção contra a invasão de estreptococos do Grupo A em tais murganhos. WO 96/09322, Children's Medicai Center Corporation, descreve que o péptido antibacteriano PR-39 possui actividade indutora de sindecan-1 e -4 e assim 7 ΡΕ1589987 poderá reduzir simultaneamente a infecção e, tal como a sinducina, influenciar a acção de factores de crescimento, componentes da matriz e outros efectores celulares envolvidos na reparação de tecidos. As sinducinas poderão ser administradas num veiculo farmacêutico, como sejam lipossomas convencionais. EP 0 935 965 Al, Toray Industries, Inc., refere-se a um agente anti-pilori contendo um péptido antimicrobiano, como seja o péptido porcino PR-39, como um agente activo. Concluiu-se que a administração exógena de PR-39 possui actividade antimicrobiana contra Helicobacter pylori e acelera a cicatrização de úlceras gástricas no rato. FALL39 é referido como um dos membros da família das catelinas. US 6,255,282 Helix Biomedix, Inc., descreve novos péptidos líticos sintéticos que partilham propriedades estruturais e funcionais de diferentes péptidos líticos conhecidos. Especialmente, é descrito um péptido de 18 a cerca de 40 aminoácidos e tendo uma conformação de hélice a. Os péptidos líticos de catelicidina, no entanto, não são mencionados.

Frohm Nilsson, Thesis, Karolinska Institutet, Stockholm 2001, concomitantemente, demonstraram que a proteína antimicrobiana catelicidina humana, hCAPl8, é induzida na cicatrização da pele humana, em níveis elevados e com libertação do péptido C-terminal activo, LL-37, na 8 ΡΕ1589987 cicatrização fisiológica mas não em úlceras crónicas não cicatrizantes. hCAPl8 foi detectada no leito da ferida e no epitélio durante a cicatrização normal da ferida mas estava ausente no epitélio de úlceras crónicas da perna e foi detectado apenas no leito da ferida e estroma. Especulou-se que níveis baixos de hCAPl8 e a sua ausência no epitélio de úlceras crónicas contribuem para impedir a cicatrização.

Zasloff, Nature 415:389-395, 2002, numa revisão dos péptidos antimicrobianos discute as diversas aplicações, que foram demonstradas para os referidos péptidos como agentes anti-infecciosos e são descritos péptidos antimicrobianos em desenvolvimento farmacêutico. EP 1 358 888 Al, Bals et al., tendo uma data de publicação de 5 de Novembro, 2003, está relacionada com o uso do péptido LL-37 na prevenção e no tratamento de feridas devido ao fornecimento reduzido de sangue arterial. É demonstrada a capacidade de LL-37 para induzir a formação de novos vasos sanguíneos e para estimular a proliferação de células endoteliais. O invento está relacionado totalmente com o efeito angiogénico e não há menção ao epitélio.

Apesar de um uso terapêutico dos péptidos antimicrobianos, em particular LL-37, ter sido sugerido, este até agora não foi posto em prática. Em concentrações elevadas do péptido, LL-37 exerce um efeito citotóxico, Os potenciais efeitos citotóxicos exercidos por LL-37 são, no entanto, inibidos na presença de soro, mas as formulações 9 ΡΕ1589987 farmacêuticas contendo soro deverão ser evitadas devido ao risco de transmissão de doenças, acessibilidade restringida e custos elevados.

SUMÁRIO DO INVENTO 0 pétido antimicrobiano humano hCAPl8 é regulado positivamente no epitélio da pele como uma resposta normal a lesões. No entanto, em úlceras crónicas não cicatrizantes da perna foram encontrados apenas níveis baixos de hCAPl8. Principalmente, nas úlceras crónicas da perna, hCAPl8 e LL-37, estavam totalmente ausentes no epitélio mas presentes no infiltrado inflamatório no leito da ferida e no estroma. Mostrámos agora que hCAPl8 é induzido durante a re-epitelialização de feridas da pele de órgãos em cultura e que esta re-epitelialização foi inibida por anticorpos contra LL-37 numa forma dependente de concentração. Estes resultados sugerem que LL-37 desempenha um papel crucial no fecho de feridas, funcionando como um factor de crescimento. O invento diz respeito ao uso de LL-37, para compensar a ausência de LL-37 natural produzido in vivo, no tratamento de úlceras crónicas causadas por insuficiência venosa ou por diabetes.

Foi igualmente demonstrado que a regulação positiva de hCAPl8 e/ou adição do péptido LL-37 estimula a proliferação de células normais epiteliais e do estroma, sugerindo que a cicatrização normal de feridas e a regeneração epitelial poderá ser igualmente estimulada. 10 ΡΕ1589987

Foi igualmente encontrado que a citotoxicidade de LL-37 poderá ser reduzida numa composição compreendendo determinados lípidos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 é um desenho esquemático da proteína hCAPl8 de 18 kDa consistindo num péptido sinal, S.P., a parte conservada de catelina e o péptido antimicrobiano LL-37, que é cortado enzimaticamente in vivo.

Figura 2 é um desenho esquemático da família de proteínas catelicidinas, ilustrando a diversidade dos péptidos C-terminais nas diferentes espécies.

As Figuras 3A, 3B e 3C mostram a sequência de cDNA do vector pIRES2-EGFP incluindo a sequência codificadora de hCAPl8, usada para a expressão transgénica de hCAPl8.

DESCRIÇÃO DO INVENTO O presente invento refere-se a um péptido LL-37, assim como a sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo. LL-37 possui a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 1: H-Leu-Leu-Gly-Asp-Phe-Phe-Arg-Lys-Ser-Lys-Glu-Lys-Ile-Gly-Lys-Glu-Phe-Lys-Arg-Ile-Val-Gln-Arg-Ile-Lys-Asp-Phe-Leu-Arg-Asn-Leu-Val-Pro-Arg-Thr-Glu-Ser-OH, para usar no tratamento de úlceras crónicas causadas por insuficiência venosa ou por diabetes. 11 ΡΕ1589987 A sequência de aminoácidos do péptido do invento é apresentada na tabela que se segue.

SEQ ID NO Péptido Sequência de aminoácidos 1 LL-37 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES 11-37 pode ser usado como um medicamento para a proliferação celular, regeneração epitelial, cicatrização de feridas normais ou crónicas e como agente anti-microbiano.

Pensamos que LL-37 possua o potencial de formar uma estrutura de hélice α em condições fisiológicas. 0 péptido tendo a sequência de aminoácidos a) SQ ID NO:1; e seus sais farmaceuticamente aceitáveis pode ser usado para estimular a proliferação de células epiteliais ou do estroma, através de um mecanismo não lítico, e na regeneração epitelial e cicatrização do epitélio e estroma de feridas em úlceras crónicas causadas por insuficiência venosa ou por diabetes. 0 presente invento refere-se especialmente ao uso do péptido LL-37 tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID N0:1, na forma de um sal, de preferência um sal de acetato. 12 ΡΕ1589987 LL-37 possui uma carga global positiva (+5 - +7) a pH neutro, devido aos resíduos de aminoácidos catiónicos de lisina e arginina na estrutura primária. Os outros resíduos de aminoácidos são não polares/hidrofóbicos ou polares e neutros ou, em menor grau, polares e carregados negativamente, o que torna toda a molécula peptídica antipática. Os péptidos deste tipo interagem electrostatica-mente com as paredes das células microbianas tendo fosfo-lípidos carregados negativamente e inserem a face hidro-fóbica na bicamada. Uma redução da hidrofobicidade e/ou carga reduz o efeito antimicrobiano dos péptidos. 0 efeito citotóxico exercido pelos péptidos contra as células hospedeiras, frequentemente considerado como actividade hemolítica, mostrou-se estar correlacionado com os seus efeitos antimicrobianos (Chen et al., FEBS Lett 236:462-466, 1988). Vários estudos confirmaram que isto também é verdadeiro para outros péptidos antimicrobianos de hélice α antipáticos.

Estudos com o péptido C-terminal, tendo um comprimento de 37 aminoácidos, de CAP18 de coelho (Capl8io6-142) demonstraram que o largo espectro de actividade antibacteriana é retido pela sequência N-terminal de 20 resíduos altamente básicos, mas não se o extremo N estiver truncado (Larrick et al., Antimicrob Agents Chemother 37:2534-2539, 1993). LL-37 pode ser sintetizado usando um sintetizador automático de péptidos e métodos convencionais para a síntese de péptidos. 13 ΡΕ1589987 0 invento refere-se ao uso do péptido LL-37 para a preparação de um medicamento para o tratamento de úlceras crónicas. As referidas úlceras crónicas podem ser devidas a insuficiência venosa, como sejam úlceras das pernas, ou devidas a diabetes. Os péptidos do invento podem também ser especialmente usados na regeneração de tecido epitelial e para estimular a regeneração epidérmica após micro-abrasão da derme.

Para além de ser tóxico para a célula, LL-37 é rapidamente degradado no ambiente da ferida. Recentemente, demonstrou-se que a proteinase serinica 3 é responsável pela clivagem extracelular de hCAPl8 (Sorensen et al., Blood 97:3951-3959, 2001).

Para prevenir a decomposição do péptido e também para reduzir a citotoxicidade intrínseca, o péptido pode ser formulado com um veículo lipídico polar. A referida formulação deverá facilitar a administração do péptido na ferida e ainda proporcionará uma libertação controlada do péptido após administração. A estabilidade do péptido será melhorada in vivo e in vitro. O péptido catelicidina pode, para além de LL-37 no Homem, ser derivado de espécies animais diferentes e é, por exemplo SC5 de carneiro, Bac5 de vaca, PR-39 de porco, CRAMP de murganho e pl5 de coelho, ver Figura 2. 14 ΡΕ1589987

Uma bicamada normalmente refere-se aos arranjos lamelares de lípidos polares em água. As cadeias acilo formam a parte hidrofóbica interna e os grupos das cabeças polares a parte hidrofílica da bicamada. Como exemplos de tais lipidos polares formadores de bicamadas, de origem natural ou sintética, podem ser referidos fosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, digalactosil-diacilglicerol, esfingo-mielina e similares. Dependendo da concentração dos referidos lipidos polares em solventes polares, tais como água, podem ser formados lipossomas ou géis viscosos do tipo liquido cristalino lamelar. A composição farmacêutica pode compreender um péptido tendo a sequência de aminoácidos de a) SEQ ID NO:1; na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis em combinação com um veiculo consistindo num lípido polar formador de bicamadas e uma solução aquosa.

Lipidos polares formadores de bicamadas preferidos, para serem misturados ou formulados com os péptidos, são aqueles que possuem carga neutra. São especialmente úteis os digalactosildiacilgliceróis e outros glicolipidos, tais como glicosilceramidas, naturais ou sintéticas, em que um grupo de açúcar não iónico constitui o grupo da cabeça polar. Menos preferidos, mas ainda úteis, são os lipidos polares, os quais são zuiteriónicos e neutros em condições fisiológicas, tais como fosfati- 15 ΡΕ1589987 dilcolina, fosfatidiletanolamina e esfingomielina. Menos preferidos são os lípidos polares, os quais são carregados negativamente e assim formam complexos fortes com o péptido carregado positivamente. 0 referido veiculo lipidico polar formador de bicamadas é, de preferência, seleccionado do grupo consistindo em fosfolipidos, galactolipidos e esfingolipidos.

Um lipido polar formador de bicamada especialmente preferido é digalactosildiacilglicerol ou misturas lipídicas polares ricas em digalactosildiacilgli-ceróis devido à tolerabilidade cutânea extremamente boa desta classe de lípidos polares. 0 digalactosildiacilglicerol é uma classe de lípidos pertencentes à família dos glicolípidos, constituintes bem conhecidos das membranas das células vegetais. Uma das classes mais abundantes possui duas unidades de galactose e a nomenclatura e abreviatura normalmente usadas desta é digalactosildiacilglicerol, DGDG, por vezes referida como galactolipidos. Os galactolipidos, principalmente DGDG e materiais ricos em DGDG foram estudados e encontrou-se serem material tensioactivo de interesse em aplicações industriais tais como alimentos, cosméticos e produtos farmacêuticos. WO 95/20944 descreve o uso de material rico em DGDG, um "material galactolípido", como um material formador de bicamadas em solventes polares para uso farmacêutico, nutricional e cosmético com péptidos e proteínas em geral, particularmente não um péptido do presente invento. 16 ΡΕ1589987

Pode ser usada a composição farmacêutica em que o veiculo lípido polar formador de bicamada é uma mistura de lipidos polares rica em digalactosildiacilgliceróis.

Um outro aspecto preferido do invento é uma composição farmacêutica em que o péptido está na forma de acetato. Um péptido preferido é LL-37 na forma de sal acetato. Pode ser usada a composição farmacêutica compreendendo uma combinação de um acetato de LL-37 e CPL-galac-tolípido como veiculo lipidico formador de bicamadas. CPL-galactolípido é uma marca registada para uma fracção de galactolipido consistindo em 50-70% por peso de digalactosildiacilgliceróis e 30-50% de outros lipidos polares. A razão entre o péptido na forma de um sal e um veiculo galactolipido na composição farmacêutica deverá preferencialmente ser 1:5 a 1:50, especialmente 1:10-1:25 por peso.

Para além do lípido formador da bicamada, o veículo também possui uma solução aquosa. Uma solução aquosa refere-se a uma solução tendo propriedades fisio-logicamente ou farmaceuticamente aceitáveis relativamente ao pH, força iónica, isotonicidade, etc. Como exemplos podem ser mencionadas soluções isotónicas de água e outros solventes biocompatíveis, soluções aquosas, tais como soro fisiológico e soluções de glucose, e materiais formadores de hidrogel. A solução aquosa pode ser tamponada, como seja soro fisiológico tamponado com fosfatos, PBS. 17 ΡΕ1589987 A composição farmacêutica pode ainda compreender excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como conservantes para evitar o crescimento microbiano na composição, antioxidantes, agentes de isotonicidade, agentes corantes e similares. Nas suspensões aquosas, as composições podem ser combinadas com agentes de suspensão e estabilizadores. A natureza coloidal da composição torna possível preparar a composição assepticamente através da utilização de um passo final de esterilização por filtração.

Para formar um gel, o péptido pode ser de preferência formulado com um material formador de hidrogel. Exemplos de materiais formadores de hidrogel são os polímeros sintéticos, tais como álcool polivinílico, poli-vinilpirolidona, ácido poliacrílico, polietilenoglicol, co-polímeros de blocos de poloxâmeros e similares; polímeros semi-sintéticos, tais como éteres de celulose, incluindo carboximetilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipropilce-lulose, metilcelulose, metil-hidroxipropilcelulose e etil-hidroxietilcelulose e similares; gomas naturais, tais como acácia, carragenano, quitosano, pectina, amido, goma xantana e similares. É vantajoso usar um hidrogel que é muco-adesivo. Nesse aspecto é particularmente útil usar ácido hialurónico e seus derivados, ácidos poliacrílicos interligados dos tipos carbómero e policarbofilo, polímeros que facilmente 18 ΡΕ1589987 formam géis, os quais são conhecidos por aderirem fortemente a membranas mucosas. É igualmente vantajoso usar copolímeros de bloco do tipo poloxâmero, i.e. polímeros consistindo em poli-etilenoglicol em blocos de polietilenoglicol e polipro-pilenoglicol. Determinados poloxâmeros dispersos em água são termo-reversíveis: à temperatura ambiente possuem baixa viscosidade mas apresentam um aumento marcado da viscosidade a temperaturas elevadas, resultando numa formação de gel à temperatura ambiente. Assim, o tempo de contacto de uma formulação farmacêutica administrada na ferida relativamente quente pode ser prolongado e consequentemente a eficácia do péptido incorporado pode ser melhorada. A composição farmacêutica para usar de acordo com o invento pode ser formulada para administração tópica ou entérica, ou seja oral, bucal, sublingual, mucosal, nasal, brônquica, rectal e vaginal.

Exemplos não limitantes de composições farmacêuticas para administração tópica são soluções, nebuli-zadores, suspensões, emulsões géis e membranas. Caso se pretenda, pode-se usar uma ligadura, penso ou emplastro, ao qual foi adicionada a composição farmacêutica. Para administração entérica podem ser usados comprimidos, cápsulas, soluções ou suspensões. 0 péptido tendo a sequência de aminoácidos de 19 ΡΕ1589987 a) SEQ ID NO:1; na forma de sais farmaceuticamente aceitáveis ou seus derivados pode ser usado para a proliferação in vitro de células epiteliais e/ou do estroma através de um mecanismo não litico. A referida proliferação pode ser especialmente usada para a proliferação in vitro de células humanas autólogas epiteliais e de estroma. 0 meio de crescimento para a cultura de células eucariotas, como sejam células epiteliais e/ou células de estroma, compreende LL-37 em combinação com um meio basal. Um agente redutor da citotoxicidade pode ser adicionado, como seja soro. Encontrou-se que a apolipoproteína A-I (apoa-I) é a principal proteína de ligação a LL-37 em plasma humano e funciona como um captor de LL-37 (Wang et al., J Biol Chem 273:33115-3318, 1998; Sorensen et al., J Biol Chem 274:22445-22451, 1999), sugerindo um mecanismo envolvido na regulação de um péptido catelicidina. 0 agente redutor de citotoxicidade pode também ser um lipido polar formador de bicamada, como seja um lipido seleccionado do grupo consistindo em fosfolípidos, galactolipidos e esfingolipidos, como descrito atrás. piruvato de sódio, 0 meio basal do meio de crescimento baseia-se em água destilada e numa série dos seguintes ingredientes: sais inorgânicos, vermelho de fenol, glucose, timidina, hipoxantina, HEPES, piruvato de sódio, aminopterina, 20 ΡΕ1589987 aminoácidos e vitaminas. Para a cultura de células epiteliais, tais como e.g. queratinócitos, o meio de crescimento in vitro pode consistir em meio basal e num kit promotor do crescimento incluindo a) péptido LL-37 numa solução salina, b) penicilina + estreptomicina, c) insulina, d) transferrina, e) tri-iodotironina, f) hidrocorti-sona, g) coleratoxina e um agente redutor da citotoxicidade seleccionado, como seja soro ou um lípido polar. Para a cultura de células do estroma, como sejam e.g., fibroblas-tos, in vitro, um meio de crescimento pode consistir em meio basal e num kit promotor do crescimento incluindo a) péptido LL-37 numa solução salina, b) penicilina + estreptomicina e um agente redutor da citotoxicidade seleccionado, como seja soro ou um lípido polar.

No método de estimulação da expansão in vitro de células autólogas humanas epiteliais e de estroma para transplante de células in vivo, as células são isoladas a partir de um fragmento excisado de pele saudável, as referidas células isoladas são cultivadas in vitro no referido meio de crescimento e as células cultivadas são subsequentemente colhidas e podem ser usadas no tratamento de feridas, tais como lesões de queimaduras e úlceras.

Pode ser usado o kit promotor do crescimento compreende o péptido LL-37 ou um péptido como descrito e um lípido polar formador de bicamada e redutor da citotoxicidade, facultativamente em combinação com antibióticos, meio basal e outros aditivos convencionais em recipientes separados. 21 ΡΕ1589987

Pode ser realizada transfecção de uma construção de cDNA hCAPl8 de tamanho completo em queratinócitos humanos autólogos para transplante de células em úlceras e queimaduras. A construção de cDNA foi projectada para permitir a regulação da expressão do gene hCAPl8 através de um mecanismo de interruptor (Resnitzky et al., Mol Cell Biol 14:1669-1679, 1994). Queratinócitos humanos autólogos foram obtidos de um pedaço de pele saudável retirada do doente. Os queratinócitos foram isolados e expandidos na cultura celular descrita. A construção de cDNA foi transfectada em queratinócitos. Os queratinócitos transfec-tados foram ainda expandidos in vitro e transferidos para o doente.

Finalmente, pode também ser usada uma construção genética compreendendo a sequência de cDNA completa de hCAPl8 tendo a sequência SEQ ID NO:20 para transfecção de células epiteliais e/ou estroma de forma a estimular a proliferação das referidas células.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Preparação de péptidos sintéticos 0 péptido LL-37 foi sintetizado de acordo com a síntese em fase sólida com estratégia de 9-fluoro-fenilmetoxicarbonilo/tert-butilo. 0 péptido bruto, como o sal trifluoro-acetato, foi purificado por HPLC e finalmente isolado por liofilização (lote 971/26, dos PolyPeptide 22 ΡΕ1589987

Laboratories A/S, Hillerod, Denmark). A pureza foi determinada por meio de HPLC e a integração da área encontrada foi de 99%. A massa molecular foi analisada usando espectrometria de massa e correspondeu ao valor teórico de 4493 g/mol como a base livre. A análise da composição de aminoácidos mostrou que a quantidade relativa de cada aminoácido correspondia aos valores teóricos para LL-37. 0 teor em péptido foi calculado a partir dos resultados da análise de aminoácidos e encontrou-se ser 73%, o restante sendo contra-iões e solvente residual.

Foram sintetizados vários lotes de LL-37 e o péptido LL-37 usado nos Exemplos 2 e 5 que se seguem foi na forma do sal acetato.

Os péptidos LL-36 e LL-38 foram sintetizados de forma correspondente, na forma de acetato.

Os diferentes péptidos usados nos exemplos e testes seguintes foram como se segue. Péptido Contra-ião Lote Área de pureza % Teor em péptido % (P/P) Usado em Ano da produção LL-37 Trifluoro- acetato YS 5253 98 Ex. 3, 4, 5, 6, 7 Teste 3 1997 LL-37 Trifluoro- acetato 971/26 99 73 Teste 5 2002 LL-37 Acetato 990/37/A 99 83 Ex. 2, 5 Teste 4 2003 LL-38 Acetato 990/38 Teste 4 2003 LL-36 Acetato 990/39 Teste 4 2003 23 ΡΕ1589987

Exemplo 2. Preparação de uma composição farmacêutica compreendendo uma mistura do péptido LL-37 e veículo lipídico

Uma composição farmacêutica foi preparada usando os seguintes ingredientes:

Ingrediente Concentração LL-37 100 ppm* CPL-galactolípido 0,20% 2,6% glicerol em água estéril Ad 100% *ppm = partes por milhão (em peso) 0 péptido LL-37, como sal acetato (lote 990/37/A) e o veículo lipídico, CPL-Galactolípido, obtido da Lipocore Holding AB, um material lipídico rico em digalactosil-diacilgliceróis e preparado a partir de aveia, foram pesados num frasco de vidro de 50 ml. A mistura foi agitada vigorosamente durante 120 min e depois deixada em repouso durante 1 h. A composição resultante foi uma dispersão homogénea e fina. Foi mantida refrigerada até ser usada.

Exemplo 3. Preparação de misturas aquosas compreendendo o péptido LL-34 e um veículo lipídico

Prepararam-se misturas de LL-37, como sal trifluoroacetato (lote 971/26) e um veículo lipídico polar, formador de bicamadas, usando os seguintes ingredientes (percentagens em peso por peso): ΡΕ1589987 24

Tabela 1.

Ingrediente AI A2 BI B2 Cl C2 LL-37 100 ppm - 90 - 92 _ CPL-Galactolípido 0.19% 0,20% - — _ _ Epikuron 200 - - 0,19% 0,19% _ CPL-esfingomielina - - - — 0,19% 0,19% EMEM Ad 100% Ad 100% Ad 100% Ad 100% Ad 100% Ad 100% CPL-galactolípido, adquirido à Lipocore Holding AB, é uma fracção de galactolípidos purificados por cromatografia derivados de aveia, Epikuron 200, adquirido a Lucas Meyer GmbH, é uma f osf atidilcolina de soja e CPL-esfingomielina, adquirida à Lipocore Holding AB, é esfingo-mielina purificada por cromatografia de leite bovino. DMEM, Meio de Eagle modificação de Dulbecco, da Invitrogen Corp. é uma solução aquosa contendo sais inorgânicos, glucose, vermelho de fenol, aminoácidos e vitaminas. O péptido LL-37 e o veículo lipídico foram pesados num frasco de vidro e adicionado depois o DMEM. As dispersões resultantes foram fortemente agitadas, usando um misturador Heidolph Promax numa frequência de 200/min durante 1,5 h, e deixado a equilibrar e em repouso durante cerca de 3 h à temperatura ambiente. Uma avaliação a olho nu foi então feita e obtiveram-se os seguintes resultados: Todas as amostras eram dispersões turvas e não houve quaisquer diferenças na turbidez entre qualquer uma das 25 ΡΕ1589987 amostras Bl, B2, Cl e C2. A única diferença observada foi entre as amostras Al e A2: a primeira, contendo o péptido, estava significativamente menos turva que a última, sem o péptido. A amostra 2 estava ligeiramente menos turva do que, por sua vez, as amostras Bl, B2, Cl e C2. Estas observações indicam uma interacção mais forte entre os dois componentes na amostra Al, o que resulta num tamanho médio das partículas da dispersão, comparativamente com a amostra A2 sem péptido, mas também comparado com o resto das amostras correspondentes. Após um dia de armazenamento à temperatura ambiente, as amostras Al e A2 estavam inalteradas, i.e. ambas eram dispersões homogéneas e Al menos turva que A2, enquanto as outras quatro amostras tinham um sedimento considerável no fundo dos frascos de vidro.

As três misturas de péptido e veículo lipídico polar são úteis para vários fins, e.g. como sistemas de libertação controlada e para testes em culturas celulares; no entanto, uma vez que a vida de prateleira das misturas de péptido e galactolípido é consideravelmente mais longa (sem sedimentação) que a das outras, as referidas misturas são as mais preferidas para uso prático.

Exemplo 4. Preparação de misturas aquosas compreendendo uma mistura de péptido LL-37 e veículo lipídico

As amostras de LL-37 como trifluoroacetato (lote 26 ΡΕ1589987 971/26) e um veículo lipídico polar, formador de bicamadas, foram preparadas usando os seguintes ingredientes (percentagens em peso por peso):

Tabela 2.

Ingrediente Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra Amostra D E F G H I J LL-37 96 ppm 100 ppm 100 ppm 103 ppn 100 ppm 100 ppm 100 ppm CPL-Galactolípido 0,21% _ _ - 0,20% - - PC de soja, 40% - 0,21% _ - - - PC de gema de ovo, 60% - _ 0,21% - - - _ DOPC, 99% - _ _ 0,20% - - PC de soja, 70% - - - - - 0,20% - PC de soja 70% - _ _ - - - 0,20% PBS Ad 100% Ad 100% Ad 100% Ad 100% Ad 100% Ad 100% Ad 100% CPL-galactolípido, fabricado pela LTP Lipid Technologies Provider AB, é uma fracção de galactolípidos derivados de aveia purificados por cromatografia. Os vários fosfolípidos usados foram fosfatidilcolina (PC) de soja, aproximadamente 40% (Sigma; P-3644) ; PC de gema de ovo seca, aproximadamente 60% (Sigma; P-5394); dioleilfos-fatidilcolina (DOPC) sintética, aproximadamente 99% (Sigma; P-6354); PC de soja, aproximadamente 70% (Lipoid S75); e PC de soja, aproximadamente 94% (Lipoid S100) . PBS é soro fisiológico tamponado com fosfatos da Invitrogen Corp. (Dulbecco's; Cat. n° 14190-094).

Todos os lípidos polares investigados possuem 27 ΡΕ1589987 temperaturas de transição de fase de fusão das cadeias abaixo de 0°C, i.e., na gama de -10 a -15°C, quando totalmente hidratados. O péptido LL-37 e o veiculo lipidico foram pesados num frasco de vidro de 100 ml e depois adicionou-se PBS. O volume total foi cerca de 30 ml. As amostras foram agitadas fortemente, usando um misturador ST (tipo Bl, E. Buchler, Tubingen) configurado para 5,5 (correspondendo a uma frequência aproximada de 150/min) durante 2 h e deixado a equilibrar e em repouso durante cerca de 30 min à temperatura ambiente. A turbidez das dispersões resultantes foi então registada a 400-800 num espectrofotómetro UV-160a Shimadzu UV-VIS. As medições foram feitas contra água pura, à temperatura ambiente, usando uma cuvete de 10 mm. Os dados de turbidez na Tabela 3 estão apresentados como % de transmissão a 600 nm. As avaliações visuais das dispersões foram igualmente feitas. As medições de turbidez foram repetidas após um a dois dias de armazenamento à temperatura ambiente das dispersões.

Tabela 3. Dados de turbidez

Turbidez (λ=600 nm) Amostra D Amostra E Amostra F Amostra G Amostra H Amostra I Amostra J 30 min 64,1% 70,9% 5,1% 1,7% 68,6% 18,6% 1,4% 1 dia 57,3% 65,6% - _ 67,0% 19,8% _ 2 dias 57,2% 65,5% - - 66, 9% 20,5% - 28 ΡΕ1589987 A partir das avaliações a olho nu, concluiu-se que todas as misturas formaram dispersões mais ou menos turvas; as amostras D, E, H e I formaram as dispersões menos turvas, manifestado pela maior transmissão de luz na Tabela 3, enquanto as amostras F, G e J formaram as dispersões mais turvas e consequentemente deram oriqem às transmissões de luz mais baixas detectadas pelo espectrofo-tómetro. Após um dia de armazenamento à temperatura ambiente, as amostras F, G e J com a turbidez inicialmente elevada (transmissão baixa) tinham todas sedimentado e não foram medidas. As amostras D, E, H e I eram todas dispersões estáveis e resultaram em dados de turbidez reprodutível, após um e dois dias após a preparação.

As amostras D e H são duplicados, ambas contendo CPL-galactolípido mas a amostra H tinha uma proporção de peso de péptido para galactolípido ligeiramente mais elevada. Isto resultou numa turbidez ligeiramente mais baixa (maior transmissão) na amostra H, sugerindo que a interacção entre o péptido e o lípido nesta amostra é mais forte que na amostra D, levando a complexos/agregados mais pequenos que dão origem a turbidez mais baixa.

As amostras D, E, H e I foram ainda monitorizadas relativamente à estabilidade coloidal a 2-8°C durante 2 meses. ΡΕ1589987 29

Tabela 4. Dados de estabilidade

Amostra Aspecto Estabilidade D Dispersão fina turva, sedimentação ligeira, sedimento fácil de redispersar Aceitável E Dispersão turva, sedimentação ligeira,, crescimento microbiano Não aceitável H Dispersão fina turva, sedimentação ligeira, sedimento fácil de redispersar Aceitável I Dispersão turva, sedimentação ligeira,, crescimento microbiano Não aceitável

Estes dados e observações mostram que duas misturas de péptidos e veiculo lipídico polar são melhores que o resto das misturas testadas. Os veículos contendo CPL-Galactolípido (amostras D e H) e PC de soja, ca 40% (amostra E) deram origem a sistemas finamente dispersos com a maior estabilidade coloidal; no entanto, é apenas o CPL-Galactolípido que é aceitável para uso farmacêutico, uma vez que o material fosfolipídico com apenas 40% de fosfatidilcolina pode ser usado para aplicações técnicas apenas. Estes dados novamente demonstram a utilidade do material galactolípido em várias aplicações farmacêuticas, e.g. como um sistema veículo para péptidos.

Exemplo 5. Preparação de misturas aquosas compreendendo vários teores do péptido LL-37 e vários teores de galactolípido

Preparou-se uma solução stock de péptido LL-37 30 ΡΕ1589987 (sal acetato; lote 990/37/A) em PBS, 995 ppm e uma solução stock de CPL-galactolípido, 1,00%, em PBS. Alíquotas das soluções stock mais PBS adicional foram misturados em frascos de vidro de 20 ml com tampas de borracha e cápsula de alumínio. As composições das misturas estão apresentadas na Tabela 5. Após equilíbrio à temperatura ambiente durante 1 h, os frascos foram agitados na posição horizontal num misturador ST (tipo Bl, E. Buchler, Tubungen), configirado para 7,5 (correspondendo a uma frequência aproximada de 190/min) durante 1 h. As misturas foram então deixadas a equilibrar e em repouso durante a noite à temperatura ambiente. Os aspectos das misturas após um e cinco dias a 4°C foram avaliados como: coloidal translúcida, ligeiramente turvo, turvo, leitosos e os resultados estão resumidos na Tabela 5.

Tabela 5. Número da LL-37 Galactolipido Péptido:Lípido Aspecto após Aspecto após amostra (ppm) (%) (p/p) 1 dia 5 dias 01 247 0,135 1:5,5 Dispersão turva, Dispersão turva, sedimento sedimento 02 181 0,133 1:7,4 Solução coloidal Solução coloidal translúcida translúcida, ligeiro sedimento 03 116 0,133 1:11 Solução coloidal Solução coloidal translúcida translúcida 04 50,5 0,135 1:27 Solução coloidal Solução coloidal translúcida translúcida 05 16,5 0,133 1:81 Dispersão Dispersão ligeiramente ligeiramente turva, homogénea turva, homogénea ΡΕ1589987 31 (continuação) Número da amostra LL-37 (ppm) Galactolípido (%) Péptido:Lípido (p/p) Aspecto após 1 dia Aspecto após 5 dias 06 8,2 0,135 1:165 Dispersão turva, homogénea Dispersão turva, homogénea 07 - 0,133 - Dispersão turva, homogénea Dispersão turva, homogénea 08 248 0,266 1:11 Solução coloidal translúcida Solução coloidal translúcida, ligeiro sedimento 09 182 0,267 1:15 Solução coloidal translúcida Solução coloidal translúcida 10 116 0,266 1:23 Solução coloidal translúcida Solução coloidal translúcida 11 49,8 0,268 1:54 Dispersão ligeiramente turva, homogénea Dispersão ligeiramente turva, homogénea 12 17,1 0,266 1:156 Dispersão ligeiramente turva, homogénea Dispersão ligeiramente turva, homogénea 13 8,9 0,265 1:298 Dispersão ligeiramente turva, homogénea Dispersão ligeiramente turva, homogénea 14 0,265 Dispersão ligeiramente turva, homogénea Dispersão ligeiramente turva, homogénea 15 247 0,532 1:22 Solução coloidal translúcida Solução coloidal translúcida 16 182 0,532 1:29 Dispersão ligeiramente turva, homogénea Dispersão ligeiramente turva, homogénea 17 116 0,533 1:46 Dispersão turva, homogénea Dispersão turva, homogénea 18 49,2 0,533 1:108 Dispersão turva, homogénea Dispersão turva, homogénea ΡΕ1589987 32 (continuação) Número da LL-37 Galactolipido Péptido:Lípido Aspecto após Aspecto após amostra (ppn) (%) (P/P) 1 dia 5 dias 19 16,5 0,534 1:324 Dispersão turva, Dispersão turva, homogénea homogénea 20 8,2 0,532 1:649 Dispersão turva, Dispersão turva, homogénea homogénea 21 - -0,533 - Dispersão turva, Dispersão turva, homogénea homogénea 22 248 0,799 1:32 Dispersão turva, Dispersão turva, homogénea ligeiro sedimento 23 182 0,802 1:44 Dispersão Dispersão leitosa, leitosa, ligeiro homogénea sedimento 24 115 0,801 1:70 Dispersão Dispersão leitosa, leitosa, ligeiro homogénea sedimento 25 50,1 0,799 1:159 Dispersão Dispersão leitosa, leitosa, ligeiro homogénea sedimento 26 16,8 0,799 1:476 Dispersão Dispersão leitosa, leitosa, ligeiro homogénea sedimento 27 8,6 0,798 1:928 Dispersão Dispersão leitosa, leitosa, ligeiro homogénea sedimento 28 - 0,798 - Dispersão Dispersão leitosa, leitosa, ligeiro homogénea sedimento É claro que determinadas proporções do péptido LL-37 e galactolipido dão origem ao aspecto da solução, o que indica a presença de pequenos complexos, de tamanho mais pequeno que as partículas das amostras correspondentes 33 ΡΕ1589987 sem LL-37. Uma solução translúcida indica uma estabilidade coloidal superior.

Exemplo 6. Medições conformacionais

As medições de dicroismo circular (CD) de LL-37 em solução podem revelar informação acerca das alterações conformacionais. A actividade antibacteriana de LL-37 é dependente da conformação: um teor elevado de estrutura helicoidal resulta numa acção antibacteriana forte e numa actividade citotóxica elevada (Johansson et ai., J Biol Chem 273:3718-3724, 1998). Encontrou-se que a conformação de hélice α de LL-37 está dependente do contra-ião, do pH e da concentração do péptido (Johansson et al, J Biol Chem 273:3718-3724, 1998). É igualmente conhecido que uma determinada fracção do péptido possui uma estrutura de hélice α em solução aquosa e que esta estrutura pode ser promovida pela presença de aditivos tais como lipidos, transformando-a de um enrolamento aleatório em hélice α (Turner et al. , Antimicrob Agents Chemother 42:2206-2214, 1998).

As amostras para as medições de dicroismo circular (CD) foram preparadas em solução aquosa de tampão fosfato 10 mM, pH 7,0, contendo 200 ppm LL-37 (como trif luoroacetato, lote 971/26), com e sem 0,40% de CPL-Galactolípido. As amostras, 20 ml em frascos de vidro de 50 ml, foram agitadas fortemente com um misturador ST (tipo Bl, E. Buchler, Túbingen) configurado para 7,5 (corres- 34 ΡΕ1589987 pondendo a uma frequência aproximada de 220/min) durante 2 horas. Foram depois deixadas a equilibrar e em repouso durante a noite a 2-8°C.

Os espectros CD foram registados num espectro-polarímetro Jasco J-720 (Jasco Inc.). 0 compartimento da amostra com a cuvete (profundidade 1 mm) foi colocado perto do fotomultiplicador, de forma a reduzir os efeitos da difracção da luz pelas dispersões. As amostras foram medidas à temperatura ambiente e varridas de 280 a 200 nm a uma velocidade de 20 nm/min, com uma resolução de 1 nm e 3 acumulações por corrida. Os resultados são expressos como a elipticidade média de resíduos, [□] e a percentagem da conformação de hélice α a 222 nm foi estimada pela seguinte fórmula: ( [□] 222 + 3900).100/41900.

As medições de CD em LL-37, 200 ppm em solução tampão de fosfatos 10 mM, pH 7,0, revelaram uma estrutura secundária de hélice α através de mínimos dicróicos duplos a 208 e 222 nm. O mínimo a 222 nm foi usado para calcular a percentagem de estrutura hélice a, a qual se encontrou ser 63%. Quando o galactolípido foi adicionado numa concentração de 0,40% (p/p) na mesma solução tampão, a estrutura de hélice α de LL-37 ficou praticamente inalterada, com uma estrutura de hélice oí aproximada de 64%. A conformação helicoidal potenciada está relacionada com o aumento da actividade antibacteriana. Especulou-se que a estrutura secundária também é relevante 35 ΡΕ1589987 para a capacidade de cicatrização de feridas de LL-37, onde uma percentagem elevada de estrutura de hélice a significa aumento de actividade. Numa solução tampão aquosa isto também significa citotoxicidade elevada, mas na presença de galactolipido a estrutura secundária é mantida e assim a actividade não é afectada, enquanto a citotoxicidade é reduzida.

Um fosfolipido aniónico sintético, palmitoil-oleoil-fosfatidilglicerol (POPG; Sigma-Aldrich, P6956) foi usado como referência e testado usando as mesmas condições experimentais descritas atrás. Uma percentagem mais baixa da estrutura de hélice a, 58%, foi encontrada quando este lipido estava presente, indicando que a conformação e assim a actividade de LL-37 é mais influenciada pelo lipido carregado negativamente que pelo galactolipido neutro. No entanto, mais importante, após um mês de armazenamento a 4°C, a amostra tinha-se separado parcialmente, com sedimentos no fundo do recipiente. A agitação suave resultou numa dispersão grosseira. Nos mesmo ponto de tempo, foram também observado os sedimentos na amostra correspondente baseado em galactolipido, mas em menor grau, o qual pôde ser novamente disperso para dar uma dispersão fina através da agitação suave.

Exemplo 7. Testes de citotoxicidade

Os ensaios de citotoxicidade in vitro são importantes para a avaliação da toxicidade de materiais, os quais entram em contacto estreito com tecidos vivos. 36 ΡΕ1589987

Formulações seleccionadas foram testadas relativamente à citotoxicidade in vitro em células de mamífero em cultura (fibroblastos de murganho L929). 0 desenho do teste baseou-se na US Pharmacopeia 26th Edition, Método <87> e no padrão ISSO 10993-5.

As formulações D e E (ver Exemplo 4, Tabela 2) foram misturadas com meio de cultura de células completo (meio HAM F12 com 10% de soro fetal bovino) em concentrações de 10, 2, 0,4 e 0,08% (v/v). Estas soluções a testar foram usadas para tratar culturas celulares em triplicado durante 24 horas. Foram incluídas culturas não tratadas, em triplicado, controlos negativos (tratados com um extracto de polipropileno) e controlos positivos (tratados com um extracto de cloreto de polivinilo estabilizado com estanho).

Ambas as formulações mostraram ausência de toxicidade ou ligeira toxicidade (grau de citotoxicidade ΟΙ) quando testadas a 10% (v/v) e ausência de toxicidade (grau de citotoxicidade 0) a 2%, 0,4% e 0,08% (v/v). 0 teste de citotoxicidade com uma solução controlo positiva contendo 100 ppm de LL-37 em PBS causou toxicidade ligeira (grau de citotoxicidade 2) em todas as 4 concentrações testadas (misturas a 10, 2, 0,4 e 0,08% da solução em meio de cultura de células) . Este nível de toxicidade é definido como 20-50% das células mortas ou com 37 ΡΕ1589987 sinais morfológicos de toxicidade. A escala tem uma gama de 0 a 4 e quando os extractos a testar dos dispositivos médicos são testados, os graus 3 e 4 falham o teste. Esta solução de controlo positivo é consideravelmente mais tóxica que as formulações D e E que não mostraram toxicidade ou toxicidade apenas ligeira.

Experiências biológicas

Com base nos nossos resultados recentes que - hCAPl8/LL-37 é induzido na pele e membranas mucosas em associação com inflamação e ferimento e -hCAPl8/LL-37 está ausente no epitélio de úlceras crónicas apesar da inflamação massiva, colocámos a hipótese que hCAPl8/LL-37 esteja envolvido na capacidade regenerativa do epitélio da pele. Para testar esta hipótese foram realizadas as experiências que se seguem.

Teste 1. Investigação do padrão de expressão de hCAPl8/LL-37 na cicatrizaçâo de feridas não inflamatórias humanas

Amostras de tecidos A pele humana foi obtida a partir de cirurgia de redução abdominal ou da mama realizada de rotina. Em condições de esterilidade, foram feitas feridas a toda a 38 ΡΕ1589987 profundidade, no lado da epiderme, com um punção de biópsia de 3 mm. Estas feridas ex vivo foram excisadas com um punção de biópsia e subsequentemente transferidas para placas de 24 alvéolos e cobertas com 2 ml de meio. Tais feridas re-epitelizam reprodutivelmente dentro de 4-7 dias (Kratz et al., Scand J Plast Reconstr Surg Hand Surg 28:107-112, 1994; Inoue et al., J Invest Dermatol 104:479-

483; Kratz et ai., Microsc Res Tech 42:345-350, 1998). O meio, DMEM (meio de Eagle modificação de Dulbecco, GIBCO) contendo 10% de soro fetal de vitela (FCS) e antibióticos (PEST = penicilina 50U/ml e estreptomicina 50 mg/ml, foi mudado cada três dias. As feridas foram colhidas diferentes tempos, aos 2, 4 e 7 dias pós-cicatrização congeladas rapidamente. No total, a experiência f repetida quatro vezes. Foram usados quatro dadores diferentes e fizeram-se feridas em triplicado para cada condição em todas as experiências. Em cada experiência, foi usada pele de apenas um dador.

Preparação de sondas de RNA

Para detectar mRNA do gene hCAPl8 e imunorreactividade para hCAPl8/LL-37, realizámos hibridação in situ e imuno-histoquímica em amostras de feridas representando todos os pontos de tempo de re-epitelização sequenciados. Para a hibridação in situ usámos sondas de RNA anti-sentido e com sentido marcadas com 35S e a experiência foi realizada como descrito (Frohm Nilsson et al., Infect Immun 67:2561-2566, 1999). 39 ΡΕ1589987

Preparaçao de anticorpo contra LL-37

Para imuno-histoquímica induzidos e preparámos um anticorpo policlonal contra LL-37 como se segue: péptido LL-37 (lote YS 5253, EuroDiagnostica AB, Malmõ, Suécia) foi preparado com sal trifluoroacetato de acordo com a estratégia F-moc usando síntese em fase sólida (Fields e Noble, 1990) e purificado por HPLC até uma pureza de 98%. A actividade biológica do péptido foi confirmada num ensaio antibacteriano. O péptido foi usado para imunização de três coelhos de acordo com um protocolo convencional (Agrisera, Vánnãs, Suécia). O anti-soro policlonal foi purificado por afinidade usando o péptido sintético LL-37 e o anti-soro purificado foi avaliado com ELISA. A concentração de IgG do soro imune foi diluída para 0,5 mg/ml. O soro pré-imune foi colhido de cada coelho e a concentração de IgG era de 2 mg/ml.

Imuno-histoquímica

Todas as biópsias foram congeladas rapidamente e processadas de forma idêntica. Resumindo, secções de criostato de 6-7 ym foram incubadas com o anticorpo contra LL-37 em diluições de 1:1000 e 1:2000 e coradas de acordo com o método indirecto com peroxidase usando um kit Vectastain (Vector Laboratories, Burlingame, USA) e seguindo as instruções do fabricante. As secções foram contrastadas com solução de hematoxilina de Mayer. Todas as 40 ΡΕ1589987 experiências foram repetidas no mínimo três vezes para assegurar reprodutibilidade. Como controlos, secções seriadas de tecido foram processadas em paralelo sem adição de anticorpo primário e usando IgG de coelho pré-imune (DAKO, Glostrup, Denmark) como anticorpo primário.

No tempo Oh havia expressão moderada de mRNA de hCAPl8 e proteína LL-37 na camada basal da epiderme ao longo do tecido, consistente com os nossos resultados anteriores de uma expressão constitutiva de hCAPl8 na epiderme basal. As feridas colhidas em diferentes tempos durante a re-epitelização demonstraram um sinal distinto do mRNA de hCAPl8 e da proteína LL-37 no epitélio em migração para cobrir a superfície da ferida. Nenhumas células na matriz da derme subjacente eram positivas para hCAPl8/LL-37. Estes resultados indicam que a síntese de novo de hCAPl8 ocorre em queratinócitos durante a re-epitelização sem inflamação e suporta a nossa hipótese de hCAPl8 poder estar ligado à regeneração epitelial.

Teste 2. Inibição da re-epitelização de feridas de pele humana ex vivo com anticorpo contra LL-37. O anticorpo contra LL-37, preparado no Teste 1, foi adicionado em 2 ml de meio por alvéolo (DMEM + 10% FCS e PEST) para uma diluição final de anticorpo de 1:10, 1:100 e 1:1000. Como controlo usámos o correspondente soro pré-imune numa concentração final de IgG igual à da diluição 41 ΡΕ1589987 1:10 do anti-soro contra LL-37 e uma série de feridas tratadas apenas com o meio. Cada condição experimental foi feita em triplicado e repetida duas vezes. 0 meio foi mudado cada três dias e o anticorpo contra LL-37 ou soro pré-imune foi adicionado como descrito atrás. As feridas ex vivo foram colhidas 2, 4 e 7 dias após ferimento. Todas as amostras foram congeladas rapidamente, cortadas na totalidade e montadas em lâminas Superfrost Plus antes da coloração com hematoxilina-eosina. Secções representando o máximo de re-epitelização no centro das feridas foram seleccionadas para avaliação. A capacidade de proliferação dos queratinócitos foi investigada através de imuno-histoquímica com o marcador de proliferação KI67 (anticorpo monoclonal de murganho Kl 67 (DAKO, Glostrup, Dinamarca) numa diluição de 1:25) em feridas representando todas as condições de tratamento.

Resultados O tratamento com o anticorpo contra LL-37 produziu uma inibição da re-epitelização dependente da dose. Todas as feridas tratadas com a concentração mais elevada do anticorpo contra LL-37 (1:10) falharam a re-epitelização. Nestas feridas apenas os queratinócitos isolados com aspecto achatado frágil tinham migrado de cada extremo da ferida. As feridas tratadas com LL-37 em concentração média (1:100) mostraram re-epitelização retardada, estas feridas estavam maioritariamente cicatrizadas por volta do dia 7 mas não por volta do dia 4. 42 ΡΕ1589987

Ainda, o epitélio estava mais fino e os queratinócitos tinham um aspecto frágil. As feridas tratadas com anticorpo anti-LL-37na concentração mais baixa (1:1000) não diferiram das feridas controlo, as quais tinham todas cicatrizado por volta do dia 4 com um epitélio robusto de 2-3 camadas. As feridas controlo tratadas apenas com meio e o com o anticorpo IgG controlo cicatrizaram igualmente. Nas feridas controlo a maioria das células na língua em re-epitelização eram positivas para o marcador de proliferação KI67, enquanto não havia células positivas para KI67 nas feridas tratadas com LL-37 a 1:10. Concluímos desta experiência que LL-37 pode estar envolvido de forma crítica na re-epitelização da pele e que a capacidade de proliferação parecia preferencialmente afectada, uma vez que o bloqueio com o anticorpo contra LL-37 permitiu a migração inicial de células isoladas a partir da periferia da ferida, mas inibiu eficazmente mais proliferação dos queratinócitos.

Tabela 3. Proliferação de células HaCat através do tratamento com péptido sintético biologicamente activo LL-37 per se e em combinação com um veículo lipídico polar.

As células HaCat foram usadas nestas experiências. As células HaCat são uma linha celular de queratinócitos humanos imortalizados (Boukamp et al., J Cell Biol 106:761-771, 1988), a qual é adequada para a pesquisa experimental de queratinócitos. As células HaCat foram cultivadas em meio (DMEM + 10% FCS e PEST). Ambos os tipos de culturas celulares foram tratados com LL-37 43 ΡΕ1589987 sintético bioactivo (lote YS 5253). Ainda, uma mistura de LL-37 (114 pg/ml) e CPL-Galactolípido (0,2%) em meio contendo soro a 2 ou 10% foi adicionada para avaliar a capacidade para aumentar a proliferação e inibir a citotoxicidade. As células foram colhidas em diferentes tempos (24 h, 48 h, 72 h e 96 h) e contadas por citometria de fluxo (Becton-Dickinson) e coradas com azul tripano para avaliar a viabilidade. A positividade para o azul tripano indica que a membrana celular foi danificada. A proliferação e a viabilidade foi igualmente avaliadas medindo a actividade mitocondrial (WST-1, Roche, Cook et al. Anal Biochem 179:1-7, 1989).

Tabela 6. Proliferação de células HaCat às 96 h avaliada por citometria de fluxo. EGF (nM) LL-37 (gg/ml) Cone. Soro (%) Número de células (Média) Azul Tripano + (%) Aumento da proliferação (%) _ _ 10 32270 <1 0 1,7 _ 10 42000 <1 30 - 25 10 36470 <1 13 - 50 10 40950 <1 27 _ 100 10 66430 <1 100 - 25 2 32130 <1 0 - 50 2 53620 30-50 Efeito citotóxico não relevante - 100 2 15120 100 Efeito citotóxico não relevante 0 aumento na proliferação celular foi calculado em comparação com a linha de base (-EGF). São apresentados 44 ΡΕ1589987 os valores médios de amostras em triplicado/condição em três experiências separadas.

Tabela 7. Prolferação e viabilidade de células HaCat às 48 h medidas através da actividade mitocondrial (WST-1). EGF (nM) LL-37 (yg/ml) Cone. Soro (%) Absor- vância Azul Tri-pano + (%) Aumento da proliferação (%) — — 10 0,622 <1 0 1,7 — 10 1,107 <1 77 - 100 10 1,110 <1 78 0 aumento na proliferação celular foi calculado comparativamente com a linha de base (-EGF) . São apresentados os valores médios de 6 amostras/condição numa experiência.

Tabela 8. Proliferação de células HaCat às 72 h avaliada por citometria de fluxo. EGF (nM) LL-37 (pg/ml) Lípido (0,2%) Cone. Soro (%) Absorvância Azul Tripano + (%) Aumento da proliferação (%) - - - 10 55207 <1 0 1,7 - - 10 85050 <1 54 1,7 - + 10 87640 <1 58 - 100 - 10 88853 <1 61 - 100 + 10 91980 <1 66 - 100 - 2 150500 100 Efeito citotóxico não relevante - 100 + 2 87360 <1 58 45 ΡΕ1589987 0 aumento na proliferação celular foi calculado em comparação com a linha de base (-EGF). São apresentados os valores médios de amostras em triplicado/condição numa experiência.

Resultados 0 tratamento de células HaCat com o péptido LL-37 resultou num aumento da proliferação dependente da concentração. Isto indica que o péptido LL-37 tem capacidade para estimular a proliferação de queratinócitos num nivel que igual ou ultrapassa o de EGF, o padrão de ouro para a proliferação de células epiteliais. Usámos EGF a 1,7 nM uma vez que este foi estabelecido como óptimo para estimular a proliferação de queratinócitos em cultura e tornou-se uma condição de cultura padrão (Cohen et al., Dev Biol 12:394-407, 1965). As células HaCat são células epiteliais com proliferação elevada e é interessante que LL-37 pode aumentar a proliferação destas células mesmo ainda mais. O efeito citotóxico induzido por LL-37 a 100 yg/ml, em 2% de soro foi totalmente abolido quando o lípido foi adicionado à mistura, indicando que o lipido é capaz de substituir o soro nesta condição experimental. O teste demonstrou que LL-37 sintético bioactivo (25-100 yg/ml) adicionado às culturas celulares de células HaCat, em meio com 10% de soro fetal de vitela (FCS) , aumenta a proliferação numa forma dependente da 46 ΡΕ1589987 concentração. No entanto, se o péptido (100 yg/ml for adicionado a uma cultura de queratinócitos num meio contendo 2% FCS , , todos os queratinócitos tornam-se positivos por coloração com azul tripano, indicando um efeito citotóxico nestas células. A actividade citotóxica de catelicidina foi inibida pela presença de soro, um mecanismo que se pensa proteger as células hospedeiras de efeitos potencialmente nocivos. Os nossos dados confirmam que o efeito citotóxico de LL-37 é inibido na presença de soro (10%) . Ainda, a mistura de LL-37 (25 μΜ) e de veiculo lipídico polar (0,2%), em meio contendo a concentração mais baixa de soro (2% FCS), inibe o efeito citotóxico e aumenta a proliferação. Estes dados sugerem que o veículo lípido polar possui capacidade protector semelhante ao soro, sem interferir com a bioactividade de LL-37.

Os principais dados mostram que os queratinócitos humanos proliferam na mesma forma que as células HaCat.

Teste 4. Proliferação de células HaCat por tratamento com os péptidos sintéticos LL-36, LL-37 e LL-38

As células HaCat foram cultivadas em meio (DME + 10% FCS e PEST). As células HaCat foram semeadas em placas de 96 alvéolos (Falcon, USA) numa concentração de 2000 células por alvéolo). As células foram semeadas às -48 47 ΡΕ1589987 horas e estimuladas com diferentes concentrações de péptido LL-37, LL-36 e LL-38 na hora 0 e após 48 horas. 0 teste foi feito numa experiência com 6 alvéolos em cada condição. 1 Ci/mmol de 3H-timidina (THYMIDINE, [METHYL-3H] -740, 0 GBq/mmol (20,00 Ci/mmol) 1,0 ml de etanol:Água, 7:3, Perkin Elmer Life Sciences Inc. Boston MA., USA) foi adicionado a cada alvéolo e incubado durante 12-17 horas. A proliferação foi avaliada através da incorporação de 3H-timidina num contador de cintilação liquida (MicroBeta Perkin Elmer Life Sciences Inc. Boston MA., USA) após 72 e 96 horas.

Tabela 9. Proliferação de células HaCat por LL-37 às 96 h avaliada por incorporação de 3H-timidina após 72 e 96 horas. LL-37 (pg/ml) Cone. Soro (%) Contagens por minuto Média) Desvio padrão ( + /-) Aumento da proliferação (%) 0 10 52774 11639 0 1,00 10 75445 32827 43 5, 00 10 102353 33808 94 10,00 10 73548 8424 39 25, 00 10 76510 10550 45 50,0 10 65119 8565 23 O aumento da proliferação celular (índice de Proliferação) foi calculado por comparação com a linha de base (Controlo = 0 pg/ml) . São apresentados os valores médios de quatro amostras por condição numa experiência. 48 ΡΕ1589987

Tabela 10. Células HaCat estimuladas pelo péptido LL-36. Proliferação avaliada por incorporação de 3H-timidina após 96 horas. LL-37 (pg/ml) Cone. Soro (%) Contagens por minuto (Media) Desvio padrão (+/-) Aumento da proliferação (%) 0 10 69323 7511 0 1,00 10 86253 10770 24 5,00 10 116381 14570 68 10,00 10 70157 3660 1 25,0 10 72674 7965 5 50,00 10 68560 11699 -1 O aumento da proliferação celular (índice de Proliferação) foi calculado por comparação com a linha de base (Controlo = 0 yg/ml) . São apresentados os valores médios de quatro amostras por condição numa experiência.

Tabela 11. Células HaCat estimuladas pelo péptido LL-38. Proliferação avaliada por incorporação de 3H-timidina após 96 horas. LL-37 Cone. Soro (%) Contagens por Desvio padrão Aumento da (pg/ml) minuto (Média) (+/-) proliferação (%) 0 10 79191 15277 0 1,00 10 82008 7911 4 5,00 10 68694 16599 -13 10,00 10 57293 8512 -28 25,00 10 54294 14335 -31 50,00 10 48701 6080 -39 49 ΡΕ1589987 0 aumento da proliferação celular (índice de Proliferação) foi calculado por comparação com a linha de base (Controlo = 0 yg/ml) . São apresentados os valores médios de quatro amostras por condição numa experiência.

Teste 5. proliferação de fibroblastos humanos por tratamento com o péptido LL-37 0 péptido LL-37 usado neste teste e nos seguintes foi como descrito no Exemplo 1 (lote 971/26). Os fibroblastos, um tipo de células do estroma, foram obtidos a partir de pele lesionada e não lesionada com úlceras crónica da perna devido a insuficiência venosa. As biópsias com punção (4 mm) foram retiradas da margem da ferida incluindo 50% da área epitelizada e da pele não lesionada na região do joelho. Os indivíduos com uma história de diabetes melitus, insuficiência arterial ou doença inflamatória crónica foram excluídos. Os doentes com sinais de eczema na margem da úlcera, sinais clínicos de infecção ou com tratamento antibiótico, sistémico ou tópico, em curso na altura da biópsia foram também excluídos. Os doentes incluídos foram todos tratados com ligaduras locais inertes e pensos de compressão convencionais.

Os fibroblastos foram colocados em cultura usando a técnica de explante (Hehenberger et al., Cell Biochem Funct 15:197-201, 1997). Os fibroblastos foram semeados em placas de 96 alvéolos (Falcon, USA) numa concentração de 50 ΡΕ1589987 2000 células por alvéolo. As células foram semeadas às ~48 horas e estimuladas com diferentes concentrações de péptido LL-37 sintético na hora 0. O teste foi realizado numa experiência com 6 alvéolos para cada condição. A proliferação e a viabilidade foram avaliadas medindo a actividade mitocondrial (WST-1, Roche) após 24 hh e 48 h. Ver Tabela 12 e Tabela 13 abaixo. O aumento na proliferação celular (índice de proliferação) foi calculado por comparação com a linha de base (Controlo = 0 yg/ml) . São apresentados os valores médios de seis amostras por condição numa experiência.

Tabela 12. Fibroblastos de ferida humana estimulados por LL-37. A proliferação e viabilidade dos fibroblastos humanos medidas através da actividade mitocondrial (WST-1) às 48 horas LL-37 (pg/ml) Lipido (0,2%) Cone. Soro (%) Absorvância Desvio padrão (+/-) Aumento da proliferação (%) - - 10 0,785 0,020 0 25 - 10 1,171 0,242 49 50 - 10 1,073 0,199 37 100 - 10 0,955 0,187 22 100 + 2 0,960 0,122 22

Tabela 13. Fibroblastos normais humanos estimulados pelo péptido LL-37. A proliferação e viabilidade dos fibroblastos humanos medidas através da actividade mitocondrial (WST-1) às 48 horas 51 ΡΕ1589987 LL-37 Cone. Soro Absorvância Desvio padrão Aumento da (yg/ml) (%) (+/-) proliferação (%) 10 0,580 0,019 0 25 10 0,597 0,067 7 50 10 0,626 0,076 12 100 10 0,669 0,051 19 Teste 6. Expressão transgénica dehCAPl8 em célu- las HEK293 e proliferação de células HEK93-hCAPl8

Um fragmento Bfal do Image clone 3057931 (ref) contendo toda a sequência codificadora de hCAPl8 incluindo os 16 pb da região 5' não traduzida, foi subclonado no local Smal do vector bicistrónico pIRES2-EGFP (BD Biosciences, Bedford, MA). Células de rim embrionário humano, HEK293, foram transfectadas usando Fugene (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) em condições convencionais e seleccionadas durante duas semanas com 400 ng/ml do antibiótico G418 (Invitrogen, Paisley, UK) . As células foram separadas de acordo com a expressão de EGFP com um citómetro de fluxo com separação de células a alta velocidade MoFlo® (DakoCytomation, Fort Collins, CO) usando o programa Summit™ para análise dos dados e a sua expressão de CAP18 foi quantificada por imunotransferência. As linhas celulares de controlo foram estabelecidas de forma semelhante através da transfecção com o vector que expressa apenas EGFP. 52 ΡΕ1589987

Para o ensaio de proliferação, as linhas celulares foram colhidas a 70% de confluência e semeadas em placas de 24 alvéolos. Após 24 horas, o meio foi mudado e as células foram cultivadas em 2 ml de meio (OPTIMEM, Gibco BRL, Life Technologies, Sctotland) suplementado com 5% FCS e PEST. Todas as condições foram realizadas em triplicados, o meio foi mudado ao segundo dia. As linhas celulares foram então colhidas no dia 6 e contadas por citometria de fluxo. A viabilidade celular foi medida com azul tripano; em todas as condições <5% das células eram positivas para o azul tripano. O aumento na proliferação celular (índice de proliferação) foi calculado por comparação com a linha de base (HEK293-EGFP). São apresentados os valores médios de amostras em triplicado por condição numa experiência.

Tipo de célula Cone. Soro Número de Desvio padrão Aumento da (%) células (Média) (+/-) proliferação (%) HEK293-EGFP 5 169063 63726 0 HEK293-hCAP18 5 485884 88168 187 A proliferação das células HEK293-hCAPl8 foi também avaliada por incorporação de 3H-timidina e os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 15 abaixo. O aumento na proliferação celular (índice de proliferação) foi calculado por comparação com a linha de base (HEK293-EGFP) . São apresentados os valores médios de quatro amostras por condição numa experiência. 53 ΡΕ1589987

Tipo de célula Cone. Soro (%) Contagens por minuto (Media) Desvio padrão (+/-) Aumento da proliferação (%) HEK293-EGFP 0,1 364 118 0 HEK293-hCAP18 0,1 796 206 111 HEK293-EGFP 0,5 811 459 0 HEK293-hCAP18 0,5 2271 792 180 HEK293-EGFP 1 744 433 0 HEK293-hCAP18 1 2303 359 209 HEK293-EGFP 2 767 334 0 HEK293-hCAP18 2 3483 771 354 HEK293-EGFP 5 958 414 0 HEK293-hCAP18 5 6088 1783 534 HEK293-EGFP 10 1806 664 0 HEK293-hCAP18 10 6541 2827 262

Teste 7. Cultura de células humanas para transplante em diferentes meios de crescimento

Cultura de células epiteliais

Um fragmento de pele, lxl cm, foi removido de pele saudável do doente. A pele foi finamente cortada e tratada com tripsina/EDTA (0,05/0,01%) e 2-5xl06 dos queratinócitos recrutados foram adicionados a l,5xl06 células 3T3 pré-tratadas com mitomicina (4 yg/ml, 2 h) em frascos de cultura de 75 cm2. Adicionou-se Meio de Crescimento A contendo o péptido LL-37. As células foram colhidas por tripsinização como camadas e transplantadas para o doente. 54 ΡΕ1589987 0 Meio de Crescimento A foi usado para a cultura de células epiteliais tais como, e.g., queratinócitos in vitro e consiste em Meio Basal e um kit promotor do crescimento (GPK) incluindo a) péptido LL-37 numa solução salina, b) penicilina + estreptomicina, c) insulina, d) transferrina, e) tri-iodotironina, f) hidrocortisona, g) coleratoxina, e um agente redutor da citotoxicidade, como seja soro ou um lípido polar.

Cultura de células de estroma

As células de estroma foram obtidas a partir de uma biópsia de 4 mmm de pele, limpas de tecido subcutâneo e semeadas em placas de cultura de células usando a técnica de explante para obter fibroblastos primários. 0 Meio de Crescimento B foi usado para a cultura da biópsia. As células foram colhidas através de tripsinização e transferidas novamente para o doente. 0 Meio de Crescimento B foi usado na cultura de células do estroma tais como e.g., fibroblastos in vitro e consiste em meio Basal e kit promotor do crescimento incluindo a) péptido LL-37 numa solução salina, b) penicilina + estreptomicina e c) um agente redutor da citotoxicidade, como seja soro ou um lipido polar. 0 Meio Basal baseia-se em água destilada contendo sais inorgânicos, vermelho de fenol, glucose, timidina, 55 ΡΕ1589987 hipoxantina, HEPES, piruvato de sódio, aminopterina, aminoácidos e vitaminas.

Sumário das experiências

Resumindo, foi demonstrado que LL-37 é produzido no epitélio da pele durante a cicatrização normal de feridas e que LL-37 LL-37 é necessário para que ocorra re-epitelização. Demonstrámos também que LL-37 endógena está ausente no epitélio de úlceras crónicas. Propomos portanto que o tratamento com LL-37, assim como com os fragmentos N-terminais do referido péptido e derivados funcionais dos mesmos proporciona uma estratégia racional para promover a cicatrização de úlceras. Ainda, a adição de LL-37 e a expressão transgénica de hCAPl8/LL-37 também estimula a proliferação de células saudáveis indicando que LL-37 pode ser usado para estimular a reparação epitelial normal e deficiente in vivo e a proliferação de células epiteliais in vitro para o transplante de células autólogas. Identificámos também um veiculo e sistema de entrega adequados que reduz a citotoxicidade e possui potencial para proteger da degradação rápida in vivo de LL-37 e de outros péptidos e outros péptidos de catelicidina.

Losboa, 20 de maio de 2014

Claims (4)

1. ΡΕ1589987 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um péptido LL-37 tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou um seu sal aceitável em termos farmacêuticos, para usar no tratamento de úlceras crónicas devidas a insuficiência venosa.
2. 2. 0 péptido para usar no tratamento de úlceras crónicas de acordo com a reivindicação 1, em que a referida úlcera crónica é uma úlcera da perna.
3. 3. Um péptido LL-37 tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou um seu sal aceitável em termos farmacêuticos, para usar no tratamento de úlceras crónicas devidas a diabetes.
4. 4. 0 péptido para usar no tratamento de úlceras crónicas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o referido péptido LL-37 está na forma de um sal acetato. Losboa, 20 de maio de 2014