FR2952539A1 - Preparation d'un concentre de facteur h - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé d'obtention d'une composition liquide injectable de Facteur H, comprenant (a) la fourniture d'une composition solide obtenue par lyophilisation d'un volume V d'une formulation liquide comprenant du Facteur H de concentration C1, de l'arginine ou l'un de ses sels, de concentration C2, du citrate de sodium, de concentration C3, puis (b) l'ajout d'un volume V/n d'eau, avec n>1, par ce en quoi on obtient une composition liquide injectable contenant du Facteur H à une concentration C=C1xn.

Description

L'invention concerne la préparation de formulations concentrées en Facteur H à usage thérapeutique.

Arrière-plan technologique de l'invention : Le complément joue un rôle essentiel dans la défense de l'organisme contre des agents infectieux et dans le processus inflammatoire. Il représente un système auxiliaire de l'immunité, en particulier de la réponse humorale et de la réponse innée.

Le complément comprend un ensemble d'environ 30 protéines plasmatiques et parfois membranaires, synthétisées essentiellement par le foie et les macrophages et qui peuvent être activées par des cascades protéolytiques. Il comprend à la fois des protéines plasmatiques, de nombreux récepteurs cellulaires de surface différents, certains présents sur les cellules inflammatoires et d'autres sur les cellules du système immunitaire, ainsi que des protéines membranaires de régulation qui protègent les cellules hôte d'une auto-attaque. Les protéines plasmatiques du complément fonctionnent soit comme des enzymes, soit comme des protéines de liaison, soit comme des régulateurs (inhibiteurs ou activateurs).

Il existe 3 voies de déclenchement de la cascade du complément : la voie classique déclenchée par les anticorps, la voie alterne déclenchée par des substances bactériennes en absence d'anticorps, la voie dépendante des lectines qui reconnaissent certains polysaccharides bactériens. Ces deux dernières voies sont mises en jeu dans la réponse innée et sont extrêmement importantes dans la défense de l'hôte contre les infections bactériennes.

Le Facteur H est le principal régulateur de la voie alterne du complément. Il agit en phase liquide comme à la surface des cellules. Initialement désignée « bêta 1 H globuline », cette glycoprotéine sérique de 155 kDa est également appelée Facteur H 1, FH, CFH, ou HF1. Le Facteur H est synthétisé dans le foie, les macrophages, les fibroblastes, les cellules endothéliales et les plaquettes. La forme sécrétée de la protéine est composée de 20 unités répétitives (ou « short consensus repeats », SCR) de 60 acides aminés.

L'activité anti-complémentaire du Facteur H se traduit par la régulation du taux de complexes immuns dans le sang, il participe par conséquent à l'équilibre entre les processus résultant en leur génération ou en leur dégradation. Le facteur H réduit la demi-vie de la C3 convertase (C3bBb) alterne en liant le C3b et en dissociant le Bb et sert de cofacteur au Facteur I dans la protéolyse du C3b, libre ou lié à la surface des cellules, en C3bi. Ainsi, les complexes immuns composés d'un complexe antigène-anticorps associé au composant du complément C3b ne peuvent plus activer la cascade subséquente du complément (composants C5-C9). Le Facteur H a été proposé dans le traitement du Syndrome Hémolytique et Urémique atypique (SHUa) associé à une anomalie héréditaire du système du complément (demande de brevet FR2894145). Par ailleurs, le Facteur H est indiqué pour le traitement de néphropathies chroniques (W02007/038995). 10 Une source appropriée pour la préparation d'un concentré de Facteur H à usage thérapeutique est du plasma sanguin. Le plasma sanguin est utilisé depuis longtemps pour la préparation de produits dérivés du sang de type albumine, préparations d'immunoglobulines, concentrés de facteur de la coagulation (Facteur VIII, Facteur IX 15 etc.), etc. Des méthodes de fractionnement du plasma sont connues, permettant d'enrichir certaines fractions en produits désirés. Les demandes de brevet WO2007/066017 et WO2008/113589 décrivent divers procédés de purification du Facteur H. Des schémas simplifiés du fractionnement plasmatique industriel Cohn/Oncley modifié, et du fractionnement plasmatique industriel Kistler/Nitschmann sont présentés dans la 20 demande de brevet WO2008/113589, qui concerne une préparation de facteur H à partir d'une fraction éthanolique.

Le Facteur H purifié doit être ensuite formulé sous une forme appropriée pour être lyophilisée et stockée, puis reconstituée pour une injection. Cette formulation doit 25 préserver la fonctionnalité du Facteur H, et doit être la plus stable possible, pour pouvoir être conservée et manipulée avec facilité. Or les formulations proposées jusqu'à maintenant ne répondent que partiellement à ces contraintes. Surtout, elles ne sont qu'insuffisamment concentrées en Facteur H, ce qui impose des injections de volumes importants, représentant un inconvénient majeur, en particulier pour le traitement des 30 enfants.

L'invention vise à résoudre ces problèmes.

Résumé de l'invention : 35 L'invention fournit maintenant un procédé de préparation d'un concentré de Facteur H, et les formulations concentrées ainsi obtenues, qui présentent une stabilité chimique et physique avantageuse.5 Plus précisément, l'invention fournit un procédé d'obtention d'une composition liquide injectable de Facteur H, comprenant a. la fourniture d'une composition solide obtenue par lyophilisation d'un volume V d'une formulation liquide comprenant du Facteur H de concentration Cl, de l'arginine ou l'un de ses sels, de concentration C2, du citrate de sodium de concentration C3, b. l'ajout d'un volume V/n d'eau, avec n>1, par ce en quoi on obtient une composition liquide injectable contenant du Facteur H à une concentration C=Clxn.

De préférence n est égal à 2.

De cette manière, la concentration C en Facteur H dans la composition liquide injectable peut être comprise entre 0,5 et 50g/L, de préférence entre 1 et 30g/L, de préférence encore entre 5 et 20g/L, ou encore entre 10 et 20g/L.

L'invention fournit également une composition liquide injectable de Facteur H, comprenant, outre du Facteur H à une concentration comprise entre 0,5 et 50g/L, de préférence entre 1 et 30g/L, de préférence encore entre 5 et 20g/L, ou encore entre 10 et 20g/L, Arginine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 24g/L Isoleucine 6g/L Glycine 1,2g/L Lysine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 1,2g/L Citrate de sodium, de préférence sous forme dihydratée 1,5g/L

L'invention fournit aussi une composition solide de Facteur H obtenue par lyophilisation d'une formulation comprenant, outre du Facteur H à une concentration comprise entre 0,5 et 50g/L, de préférence entre 1 et 30g/L, de préférence encore entre 5 et 20g/L, ou encore entre 10 et 20g/L, Arginine ou ses sels 12g/L Isoleucine 3g/L Glycine 0,6g/L Lysine*HCI 0,6g/L Citrate de sodium, de préférence sous forme dihydratée 0,75g/L Description détaillée de l'invention :

Définitions Le Facteur H est le principal régulateur de la voie alterne du complément. Il agit en phase liquide comme à la surface des cellules. Initialement désignée « bêta 1 H globuline », cette glycoprotéine sérique soluble de 155 kDa est également appelée Facteur H 1, FH, CFH, ou HF1. Le Facteur H est synthétisé dans le foie, les macrophages, les fibroblastes, les cellules endothéliales et les plaquettes. La forme sécrétée de la protéine est composée de 20 unités répétitives (ou « short consensus repeats », SCR) de 60 acides aminés. Par « Facteur H » on entend ici toute protéine ayant la séquence en acides aminés du Facteur H natif humain ou provenant d'une autre espèce (par exemple bovin, porcin, canin, murin). Le terme comprend également tout recombinant, dérivé ou mutant ayant une séquence substantiellement homologue au facteur H natif. L'expression « séquence substantiellement homologue » comprend toute séquence soumise à une ou plusieurs substitutions, additions et/ou délétions, de préférence conservatives. Les expressions « substitutions, additions et/ou délétions conservatives » expriment tout remplacement, ajout ou suppression de résidu acide aminé par un autre, sans altération majeure de la conformation générale et/ou de l'activité biologique du Facteur H. La substitution conservative inclut, sans s'y limiter, le remplacement par un acide aminé ayant des propriétés similaires (comme par exemple la forme, la polarité, le potentiel de liaison hydrogène, l'acidité, la basicité, l'hydrophobicité et autres). Les acides aminés ayant des propriétés similaires sont bien connus dans l'art.

Le terme « Facteur H » comprend en outre les variations alléliques naturelles et/ou les isoformes du Facteur H trouvées naturellement chez les individus d'une même espèce, et toute forme ou degré de glycosylation ou autre modification post-traductionnelle. Sont aussi compris les homologues ou dérivés du Facteur H qui présentent la même ou une activité biologique supérieure par rapport à l'activité de la forme sauvage et/ou qui présentent une identité de séquence d'au moins 80%, de préférence au moins 85%, de préférence encore d'au moins 90%. De préférence, le Facteur H provient de plasma humain.

Le terme « activité biologique » du Facteur H inclut la capacité à inhiber la C3 convertase et/ou à servir de co-facteur du Facteur I, résultant à l'inhibition de l'activation de la cascade du complément. L'activité du Facteur H peut être mesurée de différentes manières, bien connues de l'homme du métier. 4

Le terme "composition stable" signifie ici que la formation d'agrégats (insolubles ou solubles) est minimisée, et/ou que la dégradation chimique est réduite, le pH est maintenu et la conformation de la protéine n'est pas substantiellement modifiée pendant la production ou la conservation des compositions de l'invention, de telle sorte que l'activité biologique et la stabilité de la protéine soient conservées. Lorsque les compositions sont soumises à une lyophilisation, la stabilisation des compositions impliquent une lyoprotection et une cryoprotection de la protéine.

Le terme "stabilité physique" du Facteur H se réfère à la réduction ou l'absence de formation d'agrégats insolubles ou solubles des formes dimériques, oligomériques ou polymériques du Facteur H, ainsi qu'à la réduction ou l'absence de toute dénaturation structurale de la molécule.

Le terme "stabilité chimique" se réfère à la réduction ou l'absence de toute modification chimique du facteur H pendant le stockage, à l'état solide ou sous forme dissoute, dans des conditions accélérées. Par exemple, les phénomènes d'hydrolyse, déamination, et/ou oxydation sont évités ou retardés. L'oxydation des acides aminés contenant du soufre est limitée.

Une composition lyophilisée préparée selon l'invention présente aussi une stabilité structurale, c'est-à-dire qu'elle est capable de former un gâteau (« cake » ou « plug ») qui ne s'effrite pas spontanément, et qui est facilement soluble dans de l'eau avant utilisation.

Purification du Facteur H Le Facteur H, de préférence humain, peut être préparé par toutes les techniques classiques de purification, par synthèse peptidique, à savoir notamment par synthèse chimique, ou génie génétique.

Dans un mode de réalisation préféré, le Facteur H est obtenu à partir du sérum, de fractions plasmatiques, ou de fraction non cryoprécipitable du plasma, de préférence humain, par des procédés de purification classiques bien connus de l'homme du métier, ou par un procédé décrit dans l'exemple 1.

Par exemple le Facteur H peut être purifié à partir de plasma sanguin selon les protocoles décrits dans les demandes de brevet WO2007/066017 et WO2008/113589.

La demande de brevet WO2007/066017 décrit un procédé de purification du Facteur H comprenant une chromatographie par échange d'anions, suivie par deux étapes de chromatographie d'affinité de type héparine, puis, dans l'ordre, une chromatographie par échange de cations, et une chromatographie par échange d'anions. La demande de brevet WO2008/113589 décrit l'obtention d'un Facteur H purifié par une chromatographie d'affinité avec héparine à partir d'une fraction éthanolique de plasma sanguin, suivie d'une chromatographie par échange d'anions, et une chromatographie par échange de cations. 10 De manière générale, une chromatographie consiste à mettre en contact le Facteur H en solution - avec une matrice à laquelle le Facteur H se lie, éventuellement laver la matrice dans des conditions appropriées pour que le Facteur H reste lié, puis appliquer à 15 la matrice une solution qui provoque l'élution du Facteur H de la matrice, - ou de manière alternative avec une matrice qui lie les impuretés mais pas le Facteur H

Un autre procédé de purification est en outre décrit ci-après. 20 Le Facteur H peut ainsi être obtenu par un procédé comprenant les étapes consistant à : (i) obtenir une fraction de plasma sanguin contenant du Facteur H ; (ii) soumettre la fraction obtenue à l'étape (i) à une unique chromatographie d'affinité de type héparine; 25 (iii) soumettre la fraction enrichie en Facteur H obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations ; (iv) soumettre la fraction enrichie en Facteur H obtenue à l'étape (iii) à une chromatographie échangeuse d'anions ; et comprenant en outre au moins une étape d'inactivation virale, de préférence par 30 l'action d'un solvant et/ou d'un détergent, et/ou au moins une étape d'élimination virale, de préférence par nanofiltration.

De préférence, la purification comprend les étapes consistant à : (i) obtenir une fraction de plasma contenant du Facteur H, par exemple le surnageant d'un 35 cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions ;5 (ii) soumettre ledit surnageant à une chromatographie d'affinité de type héparine, par exemple sur gel de sépharose sur lequel est greffée de l'héparine; (iii) (a) soumettre la fraction obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations, par exemple sur SP-Sépharose ; (iii) (b) suivie le cas échéant par un traitement par solvant et détergent ; (iv) soumettre la fraction en en facteur H obtenue à l'étape (iii) (a) ou (b) à une chromatographie échangeuse d'anions, par exemple sur Q-Sépharose.

Plus précisément, ce procédé de purification peut comprendre les étapes suivantes : (i) obtenir une fraction de plasma contenant du Facteur H, par exemple le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions ; (ii) soumettre ledit surnageant à une chromatographie d'affinité de type héparine, par exemple sur gel de sépharose sur lequel est greffée de l'héparine; éluer le facteur H par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatrographie d'affinité de type héparine, diluer la fraction éluée, puis (iii) (a) la soumettre à une chromatographie échangeuse de cations, par exemple sur SPSépharose ; éluer le facteur H par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatrographie échangeuse de cations, diluer la fraction éluée, puis (iii) (b) le cas échéant la soumettre à un traitement par solvant et détergent ; (iv) puis la soumettre à une chromatographie échangeuse d'anions, par exemple sur QSépharose ; (v) laver et éluer le Facteur H ; (vi) formuler le Facteur H dans une solution tampon.

Ces étapes sont décrites avec de plus amples détails ci-dessous.

Etape (i) obtention d'une fraction de plasma sanguin contenant du Facteur H : De préférence on utilise comme matériau de départ le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions , type DEAE-Séphadex. On peut encore utiliser le surnageant issu d'une précipitation éthanolique.

Etape (ii) chromatographie d'affinité de type héparine : La chromatographie d'affinité de type héparine met en oeuvre une matrice ou un support, qui est le plus souvent un gel d'agarose, sur lequel est greffé de l'héparine ou des dérivés ou mimétiques de l'héparine. Parmi les ligands de type héparine on peut citer notamment les ligands suivants : chondroitin sulfate, heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, ou des oligomères synthétiques, par exemple le cellubiose sulfate ester (Matrex TM Cellufine Sulfate), ou des analogues thérapeutiques de l'héparine, par exemple des oligosaccharides sulfatés. De préférence le pH est ajusté à une valeur de 6, par exemple en équilibrant la colonne avec une solution tampon de phosphate de sodium à 20 mM, avec une osmolalité de 60±5 mOsm/kg, et un pH 6,0±0,1. Cette étape permet de fixer le Facteur H et l'antithrombine III (AT III).

Etape (iii) chromatographie échangeuse de cations : Une chromatographie échangeuse de cations met en oeuvre une matrice, le plus souvent de type agarose ou polymérique, sur laquelle sont greffés des ligands tels que carboxymethyl (CM), sulfopropyl (SP) ou methyl sulfonate (S). Des supports échangeurs de cations sont disponibles dans le commerce: on peut citer par exemple des supports CM-Sepharose, SP-Sepharose (GE Healthcare), Toyopearl CM-650, Toyopearl SP-650 (Tosoh Biosciences), Fractogel EMD SO3", Fractogel EMD COO" (Merck KGaA), Macro- Prep CM Support, Macro-Prep High S Support (BioRad), CM HyperD, S HyperD, CM Trisacryl, SP Trisacryl, SP Sperodex (ail Pall). De préférence, on utilise la SP-Sépharose FF. Cette étape permet d'éliminer essentiellement le composant C3 du complément, les immunoglobulines M (IgM), et l'apolipoprotéine B (Apo B).

Etape (iv) chromatographie échangeuse d'anions : Le Facteur H peut dans certaines conditions se lier à des résines échangeuses d'anions, et en être désorbé par des systèmes tampons à force ionique élevée. Une chromatographie échangeuse d'anions met en oeuvre une matrice, le plus souvent de type agarose ou polymérique, sur laquelle sont greffés des ligands tels que diethylaminoethyle (DEAE), aminoethyle quaternaire (QAE) ou ammonium quaternaire (Q). Des supports échangeurs d'anions sont disponibles dans le commerce: on peut citer par exemple des supports DEAE-Sepharose, Q- Sepharose (GE Healthcare), Toyopearl DEAE-650, Toyopearl Super Q-650 (Tosoh Biosciences), Fractogel EMD DEAE, Fractogel EMD TMAE (Merck KGaA), Macro- Prep DEAE Support, Macro-Prep High Q Support (BioRad), DEAE HyperD, Q HyperD, DEAE Trisacryl, DEAE Sperodex (ail Pall). De préférence, on utilise la Q- Sepharose FF.

Cette étape permet d'éliminer essentiellement le Facteur B et le Facteur I.

Avantageusement, le pH de la fraction de plasma sanguin contenant du Facteur H et obtenue à l'étape (i) est ajusté pour être compris dans la gamme allant de pH 5,5 à pH 6,5 et de préférence pour être égal à pH 6,0. Avantageusement, le pH de la fraction éluée de l'étape (ii) puis diluée avant l'étape (iii) est ajusté pour être compris dans la gamme allant de pH 6,0 à pH 7,5, de préférence de 6,0 à 7,0 de préférence pour être égal à pH 6,5 environ. Avantageusement encore, le pH de la fraction éluée de l'étape (iii) puis diluée avant l'étape (iv) est ajusté pour être compris dans la gamme allant de 6,0 à 7,0 et de préférence pour être égal à 6,5.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la purification comprend les étapes consistant à : (i) obtenir une fraction de plasma enrichie en Facteur H, par exemple le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions et/ou une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'ions; (ii) soumettre ledit surnageant et/ou fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'ions, à une chromatographie d'affinité de type héparine, par exemple sur gel de sépharose sur lequel est greffée de l'héparine; (iii) (a) soumettre la fraction obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations, par exemple sur SP-Sépharose ; (iii) (b) suivie le cas échéant par un traitement par solvant et détergent ; (iv) soumettre la fraction en en facteur H obtenue à l'étape (iii) (a) ou (b) à une chromatographie échangeuse d'anions, par exemple sur Q-Sépharose.

Autres étapes possibles : Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention ne contient aucune autre chromatographie que celles prévues aux étapes (ii) à (iv) définies plus haut.

Toutefois, le procédé de purification peut éventuellement comprendre des étapes supplémentaires, par exemple d'autres chromatographies d'échanges d'anions ou de cations, mais aussi le cas échéant une ou plusieurs chromatographies par interaction hydrophobe, chromatographie de type Hydroxyapatite, une délipidation, etc. Il peut aussi être avantageux d'éliminer ou inhiber les impuretés protéolytiques, à savoir les enzymes ou protéines qui seraient capables de cliver la molécule de Facteur H en des formes tronquées inactives.

Inactivation des virus La préparation de Facteur H utile dans l'invention a généralement subi au moins une étape d'élimination ou d'inactivation d'au moins un agent infectieux. Parmi les agents infectieux, on peut citer les virus et les ATNC (agents transmissibles non conventionnels) comme le prion. Une inactivation virale comprend souvent un traitement avec des produits chimiques, par exemple par solvant, détergent et/ou par la chaleur, par exemple par pasteurisation. Une élimination virale, par exemple au moyen d'une nanofiltration, est aussi possible. De préférence le procédé comprend au moins un traitement par solvant et détergent, et une nanofiltration.

La pasteurisation se réfère à des méthodes exposant les compositions liquides de Facteur H à une température de 60°C pendant au moins 10h. Le traitement par solvant et/ou détergent (appelé généralement traitement solvant/détergent) comprend notamment le traitement par tri-n-butylphosphate et/ou un détergent qui est choisi parmi le Triton X-100, Tween (de préférence Tween 80) et cholate sodium.

Formulation De manière à obtenir des préparations de Facteur H à usage thérapeutique, qui soient chimiquement et physiquement stables, le concentré de Facteur H obtenu est formulé avec des excipients et agents stabilisants appropriés. Il peut s'agir de diluants, d'agents, cryoprotecteurs, lyoprotecteurs, etc.

Selon l'invention, on utilise au moins de l'arginine ou l'un de ses sels, et du citrate de sodium.

De préférence, l'arginine dans la formulation est sous forme de chlorhydrate ou de phosphate d'arginine. Le citrate de sodium, ou citrate trisodique, est de préférence sous forme dihydratée. De préférence, la formulation liquide de Facteur H avant lyophilisation comprend en outre au moins un autre acide aminé hydrophile et/ou en outre au moins un acide aminé hydrophobe. Les acides aminés sont choisis en fonction de son hydrophobicité selon la classification de Kyte et Doolittle (1982) « A simple method for displaying the hydropathic character of a protein ». J. Mol. Biol. 157: 105-132, cf. Tableau suivant : Acide aminé Code à Score une lettre id'hydropathie .......................................................................... ...................................... Isoleucine I 4.5 Valine V 4.2 Phenylalanine F 2.8 Cysteine C 2.5 .......................................................................... ...................................... Methionine M 1.9 Alanine A 1.8 Glycine G -0.4 .......................................................................... ....................................... Threonine T -0.7 Tryptophan W -0.9 Serine S -0.8 Tyrosine Y -1.3 Praline P -1.6 Histidine H -3.2 Glutamic acid E -3.5 Aspartic acid D -3.5 Asparagine N -3.5 Lysine K -3.9 Arginine R -4.5 Les acides aminés hydrophiles (ou polaires) incluent l'Arginine, la Lysine, l'Histidine, l'Asparagine, la Glutamine, et les acides glutamiques et aspartiques. Des acides aminés comme la glycine et/ou la lysine, ou encore la sérine, peuvent être avantageusement ajoutés. Les acides aminés hydrophobes (à chaîne latérale apolaire) incluent notamment les acides aminés suivants : Alanine, Valine, Leucine, Isoleucine, Phénylalanine. De préférence, l'acide aminé hydrophobe dans le cadre de cette invention est l'isoleucine, la leucine ou un mélange des deux.

Selon un mode de réalisation préféré, la formulation liquide de Facteur H avant lyophilisation comprend de l'arginine, de préférence sous forme de son chlorhydrate, du citrate de sodium, de préférence dihydraté, de l'isoleucine, de la glycine, et de la lysine ou l'un de ses sels.

Parmi les lyoprotecteurs classiques, on peut citer les sucres (saccharose, tréhalose, glucose, lactose etc.), les polyols (mannitol, sorbitol) et les acides aminés (glycine, arginine, histidine, alanine) qui peuvent être utilisés à une concentration entre 0 et 10%. Des tensio-actifs de type polysorbate (Tween 20 ou Tween 80 par exemple), polyoxamer (par exemple poloxamer 188), polyéthylèneglycol peuvent être ajoutés également.

Cependant de manière préférée, la composition liquide injectable ne comprendra pas de sucre.

La formulation proposée permet en effet de maintenir la stabilité du produit sans avoir recours à des sucres ni des polyols, qui sont classiquement utilisés pour lyophiliser les protéines mais qui sont délétères dans la principale indication thérapeutique envisagée, à savoir le Syndrome Hémolytique et Urémique atypique (SHUa). Dans cette pathologie liée à un dysfonctionnement des reins, la présence de sucres dans la composition n'est pas recommandée car ceux-ci sont reconnus comme pouvant induire des problèmes d'insuffisance rénale aigue.

On peut encore ajouter des antioxydants (par exemple methionine, monothioglycérol, glutathion, acide citrique, acide ascorbique, sodium metabisulfite, et sodium sulfite).

Des substances tampon peuvent être encore utilisées, par exemple sous forme de carbonate, phosphate, citrate, acetate, borate, trimethamine [(2-amino-2-hydroxymethyl-1,-3- propanediol),TRIS], glycine et lysine (PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, Vol. 51(4), 1997: Excipients and their use in injectable products (SANDEEP NEMA, R.J. WASHKUHN, R.J. BRENDEL, pp166-171).

Le Facteur H, dans cette formulation, est stabilisé sous forme liquide, sous forme congelée, lors de la lyophilisation et lors du stockage après lyophilisation, comme décrit ci-dessous.

Lyophilisation La formulation liquide de Facteur H subit ensuite une lyophilisation, pour l'obtention d'une forme solide.

Les méthodes de lyophilisation sont bien connues de l'homme du métier, voir par exemple Wang et al, Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals, International Journal of Pharmaceutics, Vol 203, p 1-60, 2000. De préférence le degré d'humidité est inférieur ou égal à 3% en poids, de préférence inférieur ou égal à 2,5%, de préférence inférieur ou égal à 2%, de préférence inférieur ou égal à 1,5%.

Reconstitution La composition solide est ensuite dissoute dans de l'eau pour préparations injectables (ou « water for injection ou WFI ») pour obtenir une composition à usage thérapeutique.

Les inventeurs sont parvenus à concentrer le Facteur H, en diminuant le volume nécessaire à la reconstitution. Ce volume de reconstitution est n fois inférieur au volume V initial de la formulation liquide soumise à lyophilisation, n étant un nombre supérieur à 1, de préférence 2 ou 3. Les concentrations en excipients (dont les concentrations C2 et C3, respectivement en arginine et citrate de sodium) et le volume de reconstitution sont choisies de manière à ce que la composition liquide injectable obtenue finalement soit iso-osmolaire avec le plasma humain. De préférence la formulation liquide de Facteur H présente donc une osmolarité comprise entre 250 et 350 mOsmol/kg. Dans un exemple particulier, la formulation liquide de Facteur H avant lyophilisation comprend, outre du Facteur H, Arginine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 12g/L Isoleucine 3g/L Glycine 0,6g/L Lysine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 0,6g/L Citrate de sodium, de préférence sous forme dihydratée 0,75g/L et n=2. Les inventeurs ont montré que, dans la formulation proposée, le facteur H était stable, même en diluant au demi chacun des excipients. La solution ainsi obtenue présente une faible osmolalité avant lyophilisation ce qui permet de concentrer le principe actif (Facteur H) en réhydratant le lyophilisat avec un volume deux fois moins important de diluant (c'est-à-dire de l'eau pour préparations injectables) pour obtenir un produit injectable isoosmolaire avec le plasma humain.

Les exemples illustrent l'invention sans en limiter la portée. 25 Exemples :

Exemple 1 : Purification du Facteur H

1.1. Protocole 30 Ajustement du matériau de départ On a utilisé comme matériau de départ une solution A, obtenue de la manière suivante : Du plasma décongelé a subi une cryoprécipitation. Après centrifugation, une partie du cryosurnageant a été soumise à une chromatographie sur DEAE Sephadex, qui fixe les facteurs Vitamine K-dépendants. Une fraction non retenue sur DEAE-Sephadex est 35 mélangée avec le cryosurnageant restant pour constituer la Solution A. Celle-ci a été ajustée à un pH de 6.0 ± 0,1 avec une solution de HCI à 0,5N. Deux lots L1 et L2 ont été préparés.

Chromatographie sur colonne héparine ûSépharose FF Les lots sont soumis à une chromatographie sur colonne BP 113 chargée avec 1500 mL de gel héparine-Sépharose Fast Flow (FF) (15cm x 10 cm) équilibrée dans un tampon de phosphate de sodium à 20 mM, une osmolalité de 60±5 mOsm/kg, pH 6,0±0,1. La même solution tampon a été utilisée pour laver le gel jusqu'au retour à la densité optique (DO) basale mesurée à 280nm. La charge protéique appliquée était de 560 et 720 mg de protéines/mL de gel pour les lots L1 et L2 respectivement. Une solution tampon de phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 60mM, osmolalité de 165±10 mOsm/kg, pH 7,4±0,1 a ensuite été injectée dans la colonne pour éluer les protéines qui étaient adsorbées faiblement sur le gel. Le gel a été ré-équilibré par l'injection de 2 à 3 volumes de solution tampon d'équilibrage ajustée à pH 6,5. Le Facteur H a ensuite été élué par l'injection d'une solution tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 250mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 550±10 mOsm/kg, pH 6,5±0,1. Un lavage final de la colonne a été réalisé en injectant une solution de chlorure de sodium 2M pour éluer les protéines qui étaient fortement adsorbées sur le gel, en particulier l'antithrombine III. Le débit linéaire était de 50cm/h pour toutes les étapes de chromatographie. La fraction de Facteur H éluée a été congelée à -80°C jusqu'à l'étape suivante.

Chromatographie sur colonne SP ûSépharose FF La fraction contenant le Facteur H éluée à partir de la colonne héparine-Sépharose FF a été décongelée dans un bain marie régulé à 30°C et ensuite ajustée aux conditions d'équilibrage de la colonne SP-Sépharose FF par dilution dans de l'eau purifiée pour atteindre une osmolalité de 95±5 mOsm/kg, et si nécessaire ajout d'une solution d'HCI à 0,5N pour obtenir un pH de 6,5±0,1.

La fraction ajustée a été soumise à une chromatographie sur deux colonnes K50 montées en parallèle, chacune contenant 137mL de gel SP-Sépharose FF (7cm x 5cm) et équilibrée avec une solution tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 95±5 mOsm/kg, pH 6,5±0,1. La même solution tampon a été utilisée pour laver le gel jusqu'au retour à la densité optique (DO) basale mesurée à 280nm. Une solution contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 60mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 200±10mOsm/kg, pH 6,5±0,1, a ensuite été injectée dans chaque colonne pour éluer les protéines qui étaient adsorbées faiblement au gel. Le Facteur H a ensuite été élué par injection d'une solution une tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 165mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 400±5 mOsm/kg, pH 6,5±0,1. Un lavage final de la colonne a été réalisé en injectant une solution de chlorure de sodium 2M pour éluer les protéines qui étaient fortement adsorbées sur le gel. Le débit linéaire était de 100cm/h pour toutes les étapes de chromatographie. La fraction de Facteur H éluée a été congelée à -80°C jusqu'à l'étape suivante.

Traitement par Solvant- Détergent La fraction de Facteur H éluée de la colonne de SP-Sépharose FF a été décongelée dans un bain marie régulé à 30°C. Elle a été ensuite soumise à un traitement par Solvant-Détergent en présence de 1% polysorbate 80 (Tween 80) (p/v) et 0,3% de tri-n-butyl phosphate (TnBP) (v/v) à 25±1 °C.

Chromatographie sur colonne Q-Sépharose FF La fraction de Facteur H traitée par Solvant-Détergent a été ajustée aux conditions d'équilibrage pour la colonne Q-Sépharose FF par dilution avec de l'eau purifiée pour atteindre une osmolalité de 140±10 mOsm/kg, et ajout d'une solution de NaOH à 1 N pour obtenir un pH de 7,5±0,1 pour le lot L1 et en utilisant une solution HCI à 0,5M si nécessaire pour obtenir un pH de 6,5±0,1 pour le lot L2. La fraction ajustée a été soumise à une chromatographie sur une colonne K50 contenant 190mL de gel Q-Sépharose FF (9,5cm x 5cm) et équilibrée avec une solution tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 25mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 140±10 mOsm/kg, pH 7,5±0,1 pour le lot L1, et pH de 6,5±0.1 pour le lot L2. La même solution tampon a été utilisée pour laver le gel jusqu'au retour à la densité optique (DO) basale mesurée à 280nm. Le gel a été lavé pour éliminer les protéines non adsorbées sur le gel et le TnBP et Tween 80. Une solution tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 55mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 200±10 mOsm/kg, pH 7,5±0,1 pour le lot L1, et pH 6,5±0,1 pour le lot L2 a ensuite été injectée dans la colonne pour éluer les protéines qui étaient adsorbées faiblement au gel. Le Facteur H a ensuite été élué par injection d'une solution tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 165mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 390±10mOsm/kg, pH 7,5±0,1 pour le lot L1, et pH 6,5±0,1 pour le lot L2. Un lavage final de la colonne a été réalisé en injectant une solution de chlorure de sodium 2M pour éluer les protéines qui étaient fortement adsorbées sur le gel. Le débit linéaire était de 150cm/h pour toutes les étapes de chromatographie. La fraction de Facteur H éluée a été congelée à -80°C jusqu'à l'étape suivante.

Filtration à 20-15nm La fraction éluée de la colonne de Q-Sépharose FF a été ajustée à un pH de 6,5±0,1 pour le lot L2, et pH 7,5±0,1 pour le lot 1, et a ensuite été clarifiée par filtration sur un filtre avec une taille de pores de 0,1 pm et conservée une nuit à 4°C. La fraction clarifiée a été filtrée sur une séquence de filtres PLANOVA 20N et 15N au préalable équilibrée avec une solution tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 165mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 390±10mOsm/kg, pH 7,5 pour le lot L1, et pH 6,5 pour le lot L2. La pression de filtration à l'entrée, appliquée au filtre de 15nm était de 300±50mbar et était maintenue constante. La filtration a été réalisée à la température du laboratoire.

Concentration/Formulation La fraction de Facteur H filtrée a été formulée et a subi une diafiltration sur un module d'ultrafiltration équipé d'une membrane avec un seuil de coupure de poids moléculaire de 100kD. Les lots ont été formulé avec une solution tampon composée de 12g/L arginine HCI, 3g/L isoleucine, 0,6g/L glycine, 0,6g/L lysine HCI, 0,75 g/IL trisodium citrate, osmolalité 150±10mOsm/kg, pH 7,5±0,1. La concentration protéique finale en Facteur H était de 5g/L.

Filtration 0,22,um Le produit concentré et formulé a été filtré sur un filtre de 0,22pm Millipak 20 sous hotte à flux laminaire et conditionné. 1.2. Tests de pureté Des échantillons des fractions de Facteur H en cours de purification ont été prélevés à la fin de chacune des étapes indiquées à l'exemple 1.1.

30 Le dosage du Facteur H est réalisé classiquement par méthode immunoenzymatique (ELISA) avec des réactifs commerciaux (Diagnostica Stago). Brièvement, le Facteur H à doser est capté par un anticorps anti-Facteur H humain immobilisé sur une phase solide. Le Facteur H fixé est ensuite reconnu par un immuno-conjugué à la peroxydase. Le taux de peroxydase liée est mesuré par son activité sur le substrat ortho-phénylènediamine en 35 présence d'eau oxygénée. L'intensité de la coloration, après arrêt de la réaction par un acide fort, est fonction de la quantité de facteur H présente initialement dans l'échantillon.25 Le Facteur H ainsi dosé est appelé « Facteur H antigène » ou « Ag ».

Les résultats de purification sont indiqués dans les tableaux ci-dessous. 5 Tableau 1A : Pureté du Facteur H pour le Lot L1 Etape Facteur H Facteur H Concentration Pureté en (pg/mL) (mg) protéique totale Facteur H (mg/mL) (Ag/proteines totales) Matériau de 360 3870 51,9 0,007 départ Après l'élution de 1800 1080 1,2 1,5 la colonne Q- Sépharose FF Après la 8100 972 5,2 1,56 concentration et la formulation Après la filtration 8500 810 5,7 1,49 à 0,22pm (produit fini) Tableau 1B : Pureté du Facteur H pour le Lot L2 Etape Facteur H Facteur H Concentration Pureté en (pg/mL) (mg) protéique totale Facteur H (mg/mL) (Ag/protéines totales) Matériau de 360 5436 53,7 0,006 départ Après l'élution de 1500 1125 1,1 1,36 la colonne Q- Sépharose FF Après la 9000 1080 6 1,5 concentration et la formulation Après la filtration 7300 905 5,5 1,33 à 0,22pm (produit fini) Les valeurs de pureté supérieures à 1,0 sont données à titre indicatif seulement.

Exemple 2 : Préparation de concentrés de Facteur H, et tests de stabilité 5 2.1. Matériels et méthodes : Deux autres lots de plasma sanguin, dits « lots de faisabilité » L3 et L4, ont été soumis au procédé de purification décrit à l'exemple 1.

Les concentrés de Facteur H obtenus ont été formulés de la manière suivante. Tableau 2 : Composition du concentré filtré (avant lyophilisation) obtenu à partir du lot L3 Composant Concentration Facteur H Environ 7g/L Arginine, HCI 24g/L Isoleucine 6g/L Glycine 1,2g/L Lysine, HCI 1,2g/L Citrate Na, 2H20 1,5g/L Une partie a été lyophilisée en flacons en verre bouchés avec des bouchons en 15 élastomère et conservée à 40°C. Une autre partie a été stockée, sous forme liquide, à 5°C, afin d'estimer la stabilité de la formulation sous cette forme, pendant 6 mois. Pour les analyses, la reconstitution de la partie lyophilisée a été réalisée avec un volume d'eau pour préparations injectables égal au volume initial réparti dans chaque flacon de formulation lyophilisée (n=1). 20 Tableau 3 : Composition du concentré filtré (avant lyophilisation) obtenu à partir du lot L4 Composant Concentration Facteur H Environ 5g/L Arginine, HCI 12g/L Isoleucine 3g/L Glycine 0,6g/L Lysine, HCI 0,6gL Citrate Na, 2H20 0,75g/L La composition a été lyophilisée en flacons en verre bouchés avec des bouchons en 25 élastomère, une partie a été conservée à 40°C, l'autre partie a été conservée à 5°C. Pour les analyses, la reconstitution de la composition lyophilisée a été réalisée avec un volume 10 d'eau pour préparations injectables égal à la moitié du volume initial réparti dans chaque flacon de formulation lyophilisée (n=2). Les analyses suivantes ont été pratiquées: Mesure du pH : Son suivi permet l'observation d'une alcalinisation ou d'une acidification du produit au cours du temps.

Distribution de la taille moléculaire par chromatographie par exclusion de taille à haute pression HP SEC (DTM) : Cette analyse permet de mettre en évidence l'apparition de fragments, dimères ou polymères : reflet d'une dégradation de la protéine. La séparation est effectuée sur colonne type Superdex Tricorn 200 10/300 GL û GE Healthcare (Réf : 0344111). La révélation est faite par lecture à une densité optique (DO) à 280 nm.

Mesure de la densité optique (DO) à 280 nm (Spectrophotomètre SHIMADZU UV 2401): Grâce aux cycles aromatiques de certains acides aminés (tryptophane, tyrosine, phénylalanine), les protéines absorbent dans l'ultraviolet. La densité optique (DO) à 280 nm, en utilisant de l'eau comme blanc, est mesurée afin de mettre en évidence une évolution de la DO. La DO est fonction de la concentration en protéines.

Analyse thermique par DSC (Differential Scanning Calorimetry ou Calorimétrie différentielle à balayage DSC, sur appareil DSC7 - TAC 7/DX, Perkin Elmer) : La température de transition vitreuse a été déterminée par un thermoanalyseur différentiel à balayage DSC 7 (Perkin Elmer) calibré à l'aide d'indium (de température de fusion (Tm) 156,6°C) et de n-octadécane (Tm 38,2°C). Les échantillons ont subi des températures de - 50 à 138°C à la vitesse de 20°C/min. L'hélium a été utilisé pour mener les expériences à une température inférieure à la température ambiante. La température de transition vitreuse (Tg) a été prise au point médian du changement endothermique dans la chaleur spécifique apparente. Deux mesures ont été réalisées et la moyenne donne la Tg.

Mesure de taille (Nano-ZS, Malvern) : 500 microlitres de chaque échantillon issus de la lyophilisation ont été placés dans une microcuvette (Plastibrand®, Wertheim, Allemagne), qui a été transférée dans un appareil Zetasizer Nano (Malvern Instruments, Worcestershire, UK). Cet appareil fonctionne avec un laser à 633nm He-Ne à 4mM, et une technique non invasive de rétrodiffusion « Non-Invasive Backscatter» ou NIBS.

La distribution de taille des populations monomériques de la protéine par intensité et volume a été calculée à partir du logiciel Dispersion Technology Software de Malvern (version 4.00). Les indices de réfraction du matériau et du dispersant ont été définis à 1,33 et 1,45 respectivement. La température durant les mesures a été contrôlée et fixée à 20°C. L'un des paramètres de qualité pour les formulations testées est le diamètre de la population de protéines sous forme de monomères.

Dosage de l'activité anti-convertase du facteur H. Le taux calculé correspond à la quantité de facteur H qui permet de dissocier 50% de la C3 convertase préformée, on l'appelle aussi EC 50 (concentration effective pour avoir 50% de l'activité). Un échantillon de pool de plasma est passé à chaque analyse pour servir de référence. Plus le pourcentage est élevé, plus il faut de facteur H pour dissocier la même quantité de C3 convertase donc moins le facteur H est actif. Toute augmentation du taux traduit une dénaturation de la protéine. 2.2. Résultats :

Les résultats sont présentés dans les tableaux 4 et 5 suivants.

Tableau 4 : Stabilité de la formulation issue du lot L3 Méthode Avant Après 6 mois 40°C 2 mois 5°C lyophilisation lyophilisation Forme forme liquide (composition lyophilisée non lyophilisée liquide reconstituée) DO 280 nm 0,24 0,23 0,25 0,28 taille du 16 nm 16 nm 16 nm 16 nm monomère par DLS Pourcentage 81% 85% 86% 85% monomère par DTM Activité conforme Conforme conforme Conforme (comparable à la référence plasma) Tg NA 74°C 76°C NA pH 7,4 7,5 7,5 7,5 La formulation est stable 2 mois à 5°C sous forme liquide et 6 mois à 40°C sous forme lyophilisée.

Tableau 5 : Stabilité de la formulation issue du lot L4 Méthode Avant Après 6 mois 40°C 12 mois 5°C lyophilisation lyophilisation Forme Forme (composition lyophilisée lyophilisée liquide reconstituée) DO 280 nm 0,41 0,40 0,40 0,40 taille du 20 nm 18 nm 18 nm 17 nm monomère par DLS Pourcentage 92% 93% 92% 92% monomère par DTM Activité conforme Conforme conforme conforme (comparable à la référence plasma) Tg NA 71°C 71°C 71°C pH 6,5 6,5 6,4 6,4 Sous forme lyophilisée la formulation est stable 6 mois à 40°C et 12 mois à 5°C.10

Claims (14)

1. Revendications1. Procédé d'obtention d'une composition liquide injectable de Facteur H, comprenant a. la fourniture d'une composition solide obtenue par lyophilisation d'un volume V d'une formulation liquide comprenant du Facteur H de concentration Cl, de l'arginine ou l'un de ses sels, de concentration C2, du citrate de sodium, de concentration C3, b. l'ajout d'un volume V/n d'eau, avec n>1, par ce en quoi on obtient une composition liquide injectable contenant du Facteur H à une concentration C=Clxn.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel n est égal à 2.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le Facteur H provient de plasma humain.
4. 4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel le Facteur H a été obtenu par un 20 procédé comprenant les étapes consistant à : (i) obtenir une fraction de plasma sanguin contenant du Facteur H ; (ii) soumettre la fraction obtenue à l'étape (i) à une unique chromatographie d'affinité de type héparine; (iii) soumettre la fraction enrichie en Facteur H obtenue à l'étape (ii) à une 25 chromatographie échangeuse de cations ; (iv) soumettre la fraction enrichie en Facteur H obtenue à l'étape (iii) à une chromatographie échangeuse d'anions ; et comprenant en outre au moins une étape d'inactivation virale, de préférence par l'action d'un solvant et/ou d'un détergent, et/ou au moins une étape d'élimination 30 virale, de préférence par nanofiltration.
5. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel l'arginine dans la formulation est sous forme de chlorhydrate ou de phosphate d'arginine. 35
6. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel la formulation liquide de Facteur H avant lyophilisation comprend en outre au moins un autre acide aminé hydrophile.15
7. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel la formulation liquide de Facteur H avant lyophilisation comprend en outre au moins un acide aminé hydrophobe.
8. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel la formulation liquide de Facteur H avant lyophilisation comprend de l'arginine, de préférence sous forme de son chlorhydrate, du citrate de sodium, de préférence sous forme dihydratée, de l'isoleucine, de la glycine, et de la lysine ou l'un de ses sels. 10
9. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel la concentration C en Facteur H dans la composition liquide injectable est comprise entre 0,5 et 50g/L, de préférence entre 1 et 30g/L, de préférence encore entre 5 et 20g/L, ou encore entre 10 et 20g/L.
10. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel la formulation liquide de Facteur H présente une osmolarité comprise entre 250 et 350 mOsmol/kg.
11. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, dans lequel la formulation liquide 20 de Facteur H avant lyophilisation comprend, outre du Facteur H, Arginine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 12g/L Isoleucine 3g/L Glycine 0,6g/L Lysine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 0,6g/L Citrate de sodium *2H2O 0,75g/L et n=2.
12. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, dans lequel la composition liquide injectable ne comprend pas de sucre.
13. 13. Composition liquide injectable de Facteur H, comprenant, outre du Facteur H à une concentration comprise entre 0,5 et 50g/L, de préférence entre 1 et 30g/L, de préférence encore entre 5 et 20g/L, ou encore entre 10 et 20g/L, Arginine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 24g/L Isoleucine 6g/L Glycine 1,2g/L Lysine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 1,2g/L Citrate de sodium, de préférence sous forme dihydratée 1,5g/L 15 25 30 35
14. 14. Composition solide de Facteur H obtenue par lyophilisation d'une formulation comprenant, outre du Facteur H à une concentration comprise entre 0,5 et 50g/L, de préférence entre 1 et 30g/L, de préférence encore entre 5 et 20g/L, ou encore entre 10 et 20g/L, Arginine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 12g/L Isoleucine 3g/L Glycine 0,6g/L Lysine ou ses sels (de préférence le chlorhydrate) 0,6g/L Citrate de sodium, de préférence sous forme dihydratée 0,75g/L