JPH10501522A - 因子ｖｉｉｉまたは因子ｉｘの皮下、筋肉内または皮内投与用の製薬調合剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は凝固因子ＶＩＩＩまたは因子ＩＸからなる皮下、筋肉内または皮内投与用製薬調合剤および血友病ＡまたはＢを治療する薬剤の製造のためのその使用に関する。調合剤は少なくとも２００ＩＵ／ｍｌの活性を有する凝固囚子ＶＩＩＩまたは因子ＩＸおよび因子ＶＩＩＩまたは因子ＩＸの生物学的利用能を増加する添加剤からなる。因子ＶＩＩＩによる試験は皮下、筋肉内または皮内投与後意外に長い時間周期にわたつて血流中に活性因子ＶＩＩＩの治療レベルを付与する。因子ＶＩＩＩは適宜に非常に純化された組み換え因子ＶＩＩＩであり、かつ好ましくは、皮下投与用の薬剤の製造に使用され得るその欠失誘導剤である。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 因子ＶＩＩＩまたは因子ＩＸの皮下、筋肉内または皮内投与用の製薬調合剤 発明の分野 本発明は凝固因子ＶＩＩＩまたは因子ＩＸからなる皮下、筋肉内または皮内投 与用の製薬調合剤および血友病ＡまたはＢを治療する薬剤の製造のためのその使 用に関する。調合剤は少なくとも２００ＩＵ／ｍｌの活性を有する凝固因子ＶＩ ＩＩまたは因子ＩＸおよび因子ＶＩＩＩまたは因子ＩＸの生物学的利用能を増加 する添加剤からなる。因子ＶＩＩＩによる試験は皮下、筋肉内または皮内投与後 意外に長い時間周期にわたって血流中に活性因子ＶＩＩＩの治療レベルを付与す る。因子ＶＩＩＩは適宜に非常に純化された組み換え因子ＶＩＩＩであり、かつ 好ましくは、皮下投与用の薬剤の製造に使用され得るその欠失誘導剤である。 発明の背景 血友病は数世紀にわたつて知られている遺伝によつて受け継がれ疾病であるが 種々の形態、すなわち、血友病Ａ、血友病Ｂおよび血友病Ｃの間を区別すること ができるようになつたのはここ４０年間のみである。血友病Ａは最も頻繁な形態 である。それは生きて生まれた男性１０，０００人当たり１または２人の発病率 により男性のみに影響を及ぼす。疾病は、血漿中に通常存在するたんぱく質であ る生物学的に活性の凝固因子ＶＩＩＩ（抗血友病因子）の非常に減少されたレベ ルまたは不存在によつて発生される。血友病Ａの臨床的明示は強い出血傾向であ りそして因子ＶＩＩＩ濃縮物による治療が導入される前に、それらの患者の平均 年齢は２０才以下であつた。血漿から得られる因子ＶＩＩＩ濃縮物が約３０年間 利用可能であつた。これは血友病患者の治療状況をかなり改善しかつ彼らに通常 の生活で生きる可能性を与えた。 通常認められることは、血友病ＡおよびＢのつらさは３つのカテゴリーに、す なわち、過酷、普通および軽いに分割され得るということである。過酷な血友病 Ａにおいて、血液中の因子ＶＩＩＩ活性の血漿レベルは通常の血漿レベルの１％ 以下である。普通の血友病Ａにおいて、血液中の因子ＶＩＩＩ活性の血漿レベル は通常の血漿レベルの１から４％の範囲にある。軽い血友病Ａにおいて、血液中 の因子ＶＩＩＩ活性の血漿レベルは通常の血漿レベルの５から２５％の範囲であ る。血液中の因子ＶＩＩＩ活性の通常の血漿レベルは血液の１ＩＵ／ｍｌとして 定義されている。過酷、普通および軽い血友病Ｂは上記の因子ＶＩＩＩで付与さ れたそれらと同一の血漿レベルにより定義されている。血液中の因子ＶＩＩＩ活 性の通常の血漿レベルは血液の１ＩＵ／ｍｌとして定義されている。ここでは、 インガ・マリー・ニルツソン氏著、１９９４年スウェーデン国、ストックホルム のフアーマシア・プラズマ・プロダクツの「血友病」、第２頁乃至第３頁を参照 する。 １７０〜３００ｋＤａの分子質量を有する凝固因子ＶＩＩＩのごとき、非常に 大きくかつ不安定な分子を有する薬剤は、それらの薬剤が、もしも皮下、筋肉内 または皮内に付与されるならば、不十分な吸収および激しい劣化による通常非常 に低い生物学的利用能を有するので通常静脈に付与されている。かくして、クエ ン酸ナトリウム中に溶解されかつ筋肉に注射された因子ＶＩＩＩ濃縮物は通常の 血漿レベルの１．４％のみの最大循環レベルをもたらした（プール氏等、ニユー イングランドシャーナル、「医薬」、１９９６年、第２７５巻、第１０号、第５ ４７頁乃至第５４８頁）。研究はさらに、かかるクエン酸塩が製剤に添加された かどうかに関係なく循環中に回収される活性に顕著な差異がないことを示した。 最近の研究において、高純度の因子ＶＩＩＩは血友病の犬および人ボランテイア に筋肉投与された（ジヨンソン氏等、英国ジャーナル「血液学」、１９７１年、 第２１巻、第２１頁乃至第４１頁）。投与量はプール等によつて使用されたより 非常に多かったけれども、犬または人ボランテイアは血漿因子ＶＩＩＩレベルの 顕著な上昇を示さなかつた。事実、血友病の人ボランテイアの血漿因子ＶＩＩＩ 濃度は通常の血漿レベルの１％以下のまま、すなわち過酷な血友病Ａは生物学的 利用能を増加する添加剤の不存在における投与後も同様に存在した。 種々の添加剤が、インシユリンおよび因子ＶＩＩＩのペプチド画分のごとき小 さい分子を含んでいる多数の薬剤の吸収を高めるために提案された。したがって 、ＷＯ−Ａ−９２／０１４４０は約５，８００Ｄａの分子量を有するインシユリ ンの経粘液投与を高めるためのジメチル−β−シクロデキストリンの使用に関す る。非進入ルートによる小さい分子の搬送に関する情報は皮下、筋肉内または皮 内投 与による静脈循環への大きな分子の搬送に変換されることができない。これは、 国際特許出願公開第ＷＯ−Ａ−９２／−０１４４０号公報に記載の発明の目途が （ポリ）ペプチドまたはたんぱく質の不必要な注入を行うことができるので、と くに本当である。そのうえ、筋肉内投与前に生理食塩水が１，０００から２０， ０００Ｄａの分子量を有する因子ＶＩＩＩのペプチド画分を溶解するのに使用さ れる（コンテ等、Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈ．／ドラツグＲｅｓ．，ｖｏ ｌ．３９（Ｉ），ｎｏ．４，ｐ．４６３−４６６，１９８９）。ここで、また、 実験は因子ＶＩＩＩのペプチド画分の活性が測定されないので未知の生物学的利 用能を生じる小さい分子に関する。 ヨーロツパ特許ＥＰ−Ａ−０５２２４９１は、好ましくは約２０ｋＤａ以下の 分子量を有する、薬理学的に活性のポリペプチドの投与を高めるための実質上薬 理学的活性を示さない水溶性たんぱく質と組み合わせてヒアルロン酸の水溶性種 類の使用に関する。血塊因子が多数のポリペプチドの間で記述される。そのうえ 、例えば注入によるいずれ血塊因子の投与時ヒアルロン酸の考え得る作用を示す 例がない。 日本の特許出願公告昭６３−０６３６２４号公報に記載のものは例えば皮下投 与時の明記されていない薬物の遅緩開放を提供するためのコラーゲンの使用に関 する。 日本の特許出願公告昭５６−１２７３０８号公報に記載のものは血液凝固因子 ＶＩＩＩ、大豆油および燐脂質を含有するエマルジヨンに関する。このエマルジ ヨンの目的は通常の非経口投与により遭遇される問題を除去することにある。エ マルジヨンはそれゆえ経口で投与されねそれは例の幾つかにおいて示される。 因子ＶＩＩＩはまた血友病Ａを治療するため以外の治療目的で使用され得る。 かくして、国際特許出願ＷＯ−Ａ−９３／２４１３７は抗炎症剤として皮内また は局所投与に向けられるＦＶＩＩＩを含有する調合剤に関する。該調合剤は非血 友病人体への投与に向けられかつ血友病Ａを患っている人間の静脈循環へではな い。治療効果はしたがつて局所的でかつ系統的でなく、治療は血友病Ａを緩和す るのに必要とされる。添加剤なしの因子ＩＸの皮下投与がベレツテニ等、Ａｍ． Ｊ．ヘマトロジー、ｖｏｌ．４７，ｎｏ．１，ｐ．６１−６２，１９９４から知 られている。因子ＩＸは、約５６ｋＤａの分子量を有する、因子ＶＩＩＩより小 さい分子である。ヒト因子ＩＸは、血友病Ｂ患者の皮下組織に注入されるとき、 循環に不十分にかつ非常にゆつくり搬送された。これは因子ＶＩＩＩにより得ら れた結果と一致している。 市場で現在入手し得るすべての因子ＶＩＩＩおよび因子ＩＸ製剤は静脈投与用 調合剤として作られかつ大多数の因子ＶＩＩＩ製剤はヒト血清アルブミンにより 安定化される。 大きなかつ不安定なたんぱく質がかくして通常薬剤が血流内に直接利用し得る ように静脈に付与される。しかしながら薬剤が皮下、筋肉内または皮内に付与さ れ得るならばこれらの投与形状が患者を取り扱うのに非常に容易であるので好都 合である。とくに薬剤が終生規則的に取られねばならないならずかつ治療が早期 に開始することになるならば、すでに患者の間では生まれた年から開始する。 発明の概要 非常に敏感なたんぱく質である因子ＶＩＩＩが皮下に付与されることができか つあらゆる以前の経験に対比して我々が血液中の活性因子ＶＩＩＩたんぱく質の 顕著な吸収および意外に高いレベルを得ることを認めた。 したがつて因子ＶＩＩＩを皮下、筋肉内または皮内への投与を可能にしかつ因 子ＶＩＩＩを必要とするすべての患者に大きな利点を付与する調合剤を開発した 。 組み換え因子ＶＩＩＩＳＱは典型的な血友病の治療に指示される。ｒ−ＶＩＩ ＩＳＱの半減期は静脈に注射されると人間でおよそ１２時間である。予防治療の ために１５〜４０ＩＵ／ｋg体重が因子ＶＩＩＩについて週３回付与される。 静脈注射は通常５〜２０ｍｌである。皮下に付与される注射は０．０５〜１ｍ ｌの間でありかつ因子ＶＩＩＩの濃度はそのためにかかる調合剤において非常に 高くなければならない。これは例えば加水分解されたゼラチン、ヒアルロン酸お よび／または大豆油エマルジヨンのごとき添加剤を有する調合剤において我々の 非常に純化された組み換え因子ＶＩＩＩにより得ることができる。したがつて、 本発明によれば静脈内投与後に得られる生物学的利用能に比べて、皮下、筋肉内 または皮内投与後、少なくとも約１５％、適切には約３０％の生物学的利用能を 得ることができるかも知れない。本発明の調合剤の成分のとくに慎重な選択によ り、静脈内投与後に得られた生物学的利用能に比べて、皮下、筋肉内または皮内 投与後５０％かつ同様に７０％の生物学的利用能を得ることができる。 本発明の思想はしたがつて因子ＶＩＩＩが皮下、筋肉内または皮内の製薬調合 剤として付与されるとき血流中に吸収されるることができかつこのために因子Ｖ ＩＩＩの生物学的利用能の所定の増加を付与する特別な調合剤を製造することが できる知見の組み合わせである。 本発明はしたがつて少なくとも２００ＩＵ／１ｍｌの活性を有する凝固因子Ｖ ＩＩＩまたは因子ＩＸおよび因子ＶＩＩＩまたは因子ＩＸの生物学的利用能を増 加する添加剤からなる皮下、筋肉内または皮内投与用製薬調合剤に関し、その調 合剤は投与後少なくとも６時間血液中の通常の血漿の少なくとも１．５％の因子 ＶＩＩＩまたは因子ＩＸ活性の治療レベルを付与する。 本発明における治療レベルは血液中の因子ＶＩＩＩまたは因子ＩＸの通常の血 漿レベルの少なくとも１．５％に関する。血液中の因子ＶＩＩＩまたは因子ＩＸ は適切には通常血漿レベルの２．５％、かつ好ましくは少なくとも４％である。 本発明の調合剤によれば、ＶＩＩＩ：ＣまたはＩＸ：Ｃの治療的に許容し得る レベルを少なくとも６時間、適切には１２時間以上、好ましくは２４時間以上、 かつより好ましくは４８時間以上にわたつて維持することが可能である。最適な 調合剤によればＶＩＩＩ：ＣまたはＩＸ：Ｃの治療的に許容し得るレベルを少な くとも９６時間、かつ同様に１６８時間以上にわたつて維持することが多分可能 である。この方法において、投与の頻度は、意図される治療効果を付与しながら 、最小に保持され得る。本発明による調合剤はまたオン−デマンド治療に適する かも知れない。 本発明は血友病ＡまたはＢ、存在するならば、血液系統全体に普及する疾病の 治療に関する。かくして、上首尾の治療の先行必要条件は系統的効果が得られる ような方法における投与である。かかる系統的効果は、局所の、例えば抗炎症作 用が所望される、他の技術に対立するものとして、本発明により得られる。 因子ＶＩＩＩまたはＩＸを含有する調合剤は好ましくは皮下に付与される。 調合剤中の因子ＶＩＩＩ活性は少なくとも２００ＩＵ／ｍｌ、適切には５００ 以上かつ好ましくは１，０００ＩＵ／ｍｌ以上である。とくに好適であるのは因 子ＶＩＩＩ活性が調合剤中で１，５００ＩＵ／ｍｌ以上であることでありかつ最 もとくに好適であるのは活性が５，０００から１００，０００ＩＵ／ｍｌである ということである。 付与される量は０．０１ｍｌ以上、適切には０．１〜２ｍｌ，好ましくは０． ２５〜１．５ｍｌ，かつより好ましくは０．５〜１ｍｌにすることができ、量は また０．１〜１ｍｌにすることができる。 上記で付与された活性および量は因子ＩＸに等しく適用し得る。 因子ＶＩＩＩおよび因子ＩＸは組み換えＤＮＡ技術によつて引き出されたまた は製造された血漿であつても良い。 本発明が凝固因子ＶＩＩＩおよび因子ＩＸの両方に適用し得る一方、以下で因 子ＶＩＩＩに関連してより詳細に説明される。治療因子ＶＩＩＩ濃縮物今まで血 漿の分画により製造された。しかしながら、現在、例えば、ダブリユー・ウツド 等、ネーチヤー３１２，ｐ．３３０−７，１９８４およびヨーロツパ特許ＥＰ− Ａ−１６０４５７において報告されたように組み換えＤＮＡ技術を使用する細胞 培養において因子ＶＩＩＩの製造に利用し得る方法がある。 ヒト血漿から引き出された因子ＶＩＩＩ濃縮物は幾つかの断片にされた十分に 活性の因子ＶＩＩＩ形状を含んでいる（アンデルツソン等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８３，ｐ．２９７９−８３，１９８６年 ５月）。ヒト因子ＶＩＩＩの最小活性形状は１７０ｋＤａの分子量を有しかつ金 属イオン架橋によりともに保持される９０ｋＤａおよび８０ｋＤａ２つの鎖から なる。ここでヨーロツパ特許ＥＰ−Ａ−１９７９０１が参照される。スエーデン のフアーマシア・エービーは治療因子ＶＩＩＩ濃縮物において１７０ｋＤａ血漿 因子ＶＩＩＩ形状に対応する組み換え因子ＶＩＩＩ製品を開発した。切断された 組み換え因子ＶＩＩＩ分子はｒ−ＶＩＩＩＳＱと呼ばれかつ血清なしの媒体中の 細胞培養方法においてチヤイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）により製造され る。 組み換え因子ＶＩＩＩ製品の構造および生化学は一般にバイオテクノロジーに おける傾向、１９９１年第９巻およびヘマトロジー、６３，ｐ．１５５−６５、 １９９１年においてカウフマンにより記載された。ｒ−ＶＩＩＩＳＱの構造およ び生化学は国際特許ＷＯ−Ａ−９１／０９１２２に記載された。 因子ＶＩＩＩが組み換えであるとき、それはその完全な長さ形状または好まし くはその欠失誘導体であつても良い。より好ましくは欠失誘導体が組み換え因子 ＶＩＩＩＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩＳＱ）である。欠失誘導体によつてここではＢ−領 域の全部または１部分が紛失している、凝固因子ＶＩＩＩが意味される。加えて 、因子ＶＩＩＩ分子、かつとくにｒ−ＶＩＩＩＳＱ分子は、生体内分子の安定性 を改善するために、例えば、ペギレイシヨン、共有結合された炭水化物またはポ リペプチドにより、化学的に変性され得る。 我々が使用した因子ＶＩＩＩは非常に純化され、すなわち５，０００ＩＵ／ｍ ｇ以上、同様に１２，０００ＩＵ／ｍｇ以上の特別な活性を有しそして好ましく はアルブミンの添加なしに安定化される。 因子ＶＩＩＩの生物学的利用能を増加する添加剤は適切にはそれ自体有機化合 物、その塩、それ自体有機化合物またはその塩を含むエマルジヨンまたは分散、 例えば極性を有する脂質、またはその添加のあらゆる組み合わせまたは連続であ る。本発明において有用な有機化合物それ自体は例えばアミノ酸、ペプチド、た んぱく質、および多糖類である。ペプチドはジペプチド、トリペプチド、オリゴ ペプチドおよびコラーゲンおよびゼラチンのごときポリペプチドを含む。コラー ゲンおよびゼラチンは好ましくは加水分解される。多糖類は例えばキトサン、シ クロデキストリン、スターチ、ヒアルロン酸、デキストラン、セルロース、およ びその添加の誘導体、組み合わせおよび／または連続を包含する。スターチは好 ましくは加水分解される。エマルジヨンは分散された相として油を有する水中油 エマルジヨンおよび連続相として油を有する油中水エマルジヨンを含む。油は野 菜または動物起源からなるかまたは合成的に製造され得る。適切には、エマルジ ヨンの野菜油は大豆油または紅花油、またはそのあらゆる組み合わせである。好 適なエマルジヨンは、さらに卵レシチンを含有する、スエーデン、ストツクホル ムのフアーマシア・エービーにより販売されるイントラリピド（商標）である。 適切には、極性を有する脂質は１またはそれ以上の燐脂質または糖脂質またはそ のあらゆる組み合わせである。好ましくは、ヒアルロン酸はスエーデン、ウプサ ラのフアーマシア・エービーにより販売されるヒアロン（商標）である。好まし くは、デキストランはスエーデン、ウプサラのフアーマシア・エービーにより販 売されるプロミテン（商標）である。 因子ＶＩＩＩの生物学的利用能を増加する添加剤は乾燥前または再結合時に調 合剤に添加され得るか、または因子ＶＩＩＩを含有する安定溶液または分散に添 加され得る。記載された添加剤の少なくとも２つの組み合わせが同様に添加され 得る。そのうえ、２またはそれ以上の記載された添加剤が次々と添加され得る。 １またはそれ以上の抗凝固剤が、非治療量において、調合剤に同様に添加され 得る。抗凝固剤は例えば、ヘパリン、ヘパリン断片、ヘパリン誘導体のごときグ ルコサミノグルカンであつても良い。グルコサミノグルカンの好適なグループは 約１０，０００Ｄａまでの、より好ましくは２，０００から８，０００Ｄａまで の平均分子量を有する低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）である。 投与前に、１またはそれ以上の水溶液または分散が、混合または連続において 、安定した水溶液、分散または乾燥形状にある、本発明による調合剤に添加され 得る。 調合剤はまた、好ましくは０．１Ｍ以上の量において、塩化ナトリウムまたは カリウムからなる。 因子ＶＩＩＩの重いおよび軽い鎖の結合はカルシウム（または他の二価の金属 イオン）の存在に依存する。ここで、カルシウムは塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂ ）として添加されるがグルコン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウムまたはカ ルシウムグルセプテートのごとき他の塩が、好ましくは０．５ｍＭ以上の量二、 同様に使用され得る。 アミノ酸は好ましくは系統を緩衝するのに使用されかつそれはまた調合剤が凍 結乾燥されるならば不定形の相においてたんぱく質を保護する。適切な緩衝剤は Ｌ−ヒスチジン、リジンおよび／またはアルギニンであるかも知れない。Ｌ−ヒ スチジンは主として約ｐＨ７のＬ−ヒスチジンの良好な緩衝剤能力のため選ばれ る。 非イオン界面活性剤がまた調合剤中に存在することができかつその場合に好ま しくはポロキサマーまたはポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタンモノロレ ートまたはポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタンモノオレアートのごとき ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルのごとき、ブロツク共重合体から 選ばれる。非イオン界面活性剤は、もしも使用されるならば、好ましくは臨界ミ セル濃度（ＣＭＣ）以上の量において存在すべきである。ワン・アンド・リー、 ジヤーナル・オブ・Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６３，ｐ．１３６，１９７４年を参 照。 ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルは好ましくは少なくとも０．０ １ｍｇ／ｍｌの量において使用される。 この調合剤に単糖類、二糖類またはシユガーアルコール、好ましくはスクロー スが添加される。またグルタチオン、アセチルシステイン、トコフエロール、メ チオニン、ブチルヒドロキシトルエンおよび／またはブチルヒドロキシアニゾー ルのごとき酸化防止剤が添加され得る。 ＥＤＴＡおよびクエン酸のごとき複合剤がまた、それらがカルシウムまたは因 子ＶＩＩＩの鎖を結合する他の二価の金属イオンに関してより金属イオンを不安 定化するより強い親和力を呈するならば、因子ＶＩＩＩ分子を安定化するために 小さい濃度で存在することができる。そのうえ、ベンジルアルコール、フエノー ル、ソルビン酸、パラベンおよびクロロクレゾールのごとき保存料がまた添加さ れ得る。 調合剤は好ましくはＬ−ヒスチジンおよびスクロースからなる。凍結乾燥のた めの組成物中の塩化ナトリウム対Ｌ−ヒスチジンおよびスクロースの比率は適切 には１：１（ｗ：ｗ）以上、好ましくは２：１（ｗ：ｗ）以上である。 調合剤は、 ｉ）少なくとも２００ＩＵ／ｍｌの因子ＶＩＩＩ，好ましくは少なくとも１， ５００ＩＵ／ｍｌの組み換え因子ＶＩＩＩの欠失誘導体 ｉｉ）少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸 エステル ｉｉｉ）好ましくは０．１Ｍ以上の量において、塩化ナトリウム ｉｖ）好ましくは０．５ｍＭの量において、塩化カルシウムまたはグルコン酸 カルシウムのごとき、カルシウム塩 ｖ）１ｍＭ以上の量においてＬ−ヒスチジンのごときアミノ酸 ｖｉ）因子ＶＩＩＩの生物学的利用能を増加する添加剤 かるなることができる。 調合剤は乾燥された形状で、好ましくは凍結乾燥され得る。投与の前に、乾燥 された製品が水溶液または分散、例えば懸濁液、リポゾーム調合剤またはエマル ジヨンにより再構成され得る。 請求された調合剤はまた投与に備えた安定した水溶液にすることができる。そ れはまた分散、例えば懸濁液、リポゾーム調合剤またはエマルジヨンにすること も可能である。 本発明はまた血友病を治療するための皮下、筋肉内または皮内投与用薬剤の製 造のための請求された調合剤の使用、好ましくは皮下投与用の薬剤の製造のため の組み換え因子ＶＩＩＩの欠失誘導体の使用に関する。薬剤は安定した水溶液ま たは分散であるか、または乾燥され得る。それはまた請求された調合剤の皮下、 筋肉内または皮内投与による血友病の治療方法に関する。 例において示されるデータは因子ＶＩＩＩ，かつとくにｒ−ＶＩＩＩＳＱが皮 下で注射されかつ活性形状において生体内に静脈中で回収されることを指示する 。これは、かかる調合剤が以前に公知でないので、非常に驚くべき知見である。 保護はこれらの例による組成物に限定されない。 実験 材料および方法 組み換え因子ＶＩＩＩＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩＳＱ）の製造が本質的に国際特許Ｗ Ｏ−Ａ−９１／０９１２２、例１〜３に記載されたごとく行われた。ＤＨＦＲ不 完全なＣＨＯセリン（ＤＧ４４Ｎ．Ｙ．）がｒ−ＶＩＩＩＳＱを含有する発現ベ クトルおよびジヒドロフオレート−還元酵素遺伝子を含有する発現ベクトルによ り電気穿孔された。選択的な媒体についての選択に続いて生き残っている群体が メトトレキサートの段階的に増加する量の成長により増幅された。結果として生 じる群体からの上清が因子ＶＩＩＩ活性のために個々にふるいにかけられた。製 造クローンが選ばれかつこれが続いて定義さた媒体中の血清なしの懸濁液成長に 適合させられそして最後に大規模発酵方法が開発された。上清は一定の時間周期 後集められかつさらに後述されるように純化される。 浄化されて調節された媒体がｐＨ調整されかつＳ−セフアローズＦＦコラムに 使用された。洗浄後、因子ＶＩＩＩが５ｍＭＣａＣｌ₂を含有する塩緩衝剤によ り溶出された。 免疫吸収がリガンドが因子ＶＩＩＩの重い鎖に向けられた単クローン抗体（８ Ａ４）である免疫親和力樹脂で実施された。コラムに負荷する前にＳ−溶出液が ０．３％ＴＮＢＰおよび１％オクトキシノール９により処理された。 コラムは平衡させられ、洗浄されそして因子ＶＩＩＩが０．０５ＭＣａＣｌ₂ および５０％エチレングリコールを含有する緩衝液により溶出された。 ｍＡｂ−溶出液がＱ−セフアローズＦＦコラムに負荷され、免疫親和力工程に おいて溶出緩衝液により平衡させられた。洗浄後、因子ＶＩＩＩは０．０５ＭＬ −ヒスチジン、０．６Ｍ塩化ナトリウム、４ｍＭ塩化カルシウムおよびｐＨ６． ８により溶出された。 Ｑ−溶出液がゲル濾過コラム（スーパーデツクス２００ｐ．ｇ．）に使用され た。平衡および溶出はＬ−ヒスチジン、塩化ナトリウムおよび塩化カルシウムを 含有する緩衝液により実施された。たんぱく質ピークが集められかつ溶液が凍結 乾燥前に調合された。 ｒ−ＶＩＩＩＳＱのこの材料は最終純化段階から受容された。不活性成分の因 子ＶＩＩＩ活性および濃度がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有する適切 な緩衝液で希釈することにより調整された。溶液は次いで濾過（０．２２μｍ） され、分散されかつ凍結乾燥された。 例１ 組み換え因子ＶＩＩＩが実験により記載された方法によつて製造された。 ｒ−ＶＩＩＩＳＱを含有する凍結乾燥組成物は、注射のためにに４ｍｌの殺菌 水中で再び構成される、ガラス瓶当たり以下であつた。 ガラス瓶当たりの組成物 Ｌ−ヒスチジン、ｍｇ ３１．０ 塩化ナトリウム、ｍｇ ７０．１ 塩化カルシウム／（２Ｈ₂Ｏ）、ｍｇ ２．３５ ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００）、ｍｇ ４．０ ポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタン モノオレアート（ツイーン８０（商標））、ｍｇ １ 充填されたＶＩＩＩ：Ｃ ＩＵ／ガラス瓶 ４，４００ 再び構成された溶液中のＶＩＩＩ：Ｃ ＩＵ／ガラス瓶 １，６００ 体重約３０ｇおよび血統ＮＭＲＩ，ＳＰＦの雄のアルビノマウスが再び構成さ れたｒ−ＶＩＩＩＳＱにより首に皮下で注射された。 １０，００ＩＵ／ｋｇの投与レベルで注射された量は９．４ｍｌ／ｋｇそして ５倍大きい、５０，０００ＩＵ／ｋｇのより高い投与量において４７ｍｌ／ｋｇ であつた。プラシーボにおいて処理塩水、９．４ｍｌ／ｋｇが使用された。血液 サンプリングの前３〜５分間マウスはメブマル（商標）（ペントバルビタル）ｖ ｅｔ．６０ｍｇ／ｍｌで腹膜中に麻酔された。注射された量は９．４ｍｌ／ｋｇ 、すなわち約０．３ｍｌ／マウスであつた。麻酔下で０．４５ｍｌの血液が大静 脈から０．０５ｍｌ０．１３Ｍクエン酸ナトリウムを含有するプラスチツク注射 器に集められた。血漿はその場合に遠心分離（７分間８，８００ｇ）により集め られた血液から製造されかつ因子ＶＩＩＩ活性の時間まで−７０°Ｃでプラスチ ツククリオフレツクス管中に凍結されたまま保持される。 結果 結果 １．ｒ−ＶＩＩＩＳＱ１０，０００ＩＵ／ｋｇの皮下投与後の時間による血漿 中のＶＩＩＩ：Ｃの変化は皮下貯溜部から吸収されている薬物に関してテン気定 期腸パターンを示す（表１参照）。血漿中の最大ＶＩＩＩ：Ｃレベルは投与後約 １．５時間で見られる（表１参照）。上記試験において使用された極端に高い投 与量が十分に顕著である効果を得るのに選ばれた。 ２．皮下の貯溜部からのｒ−ＶＩＩＩの吸収はさらに投与量が５倍増加される とき見られる最大濃度の増加によつて確認された。顕著な効果は皮下注射量が９ ．４から４７ｍｌ／ｋｇに変化される一方ｒ−ＶＩＩＩＳＱの投与量が一定のま まであるときＶＩＩＩ：Ｃの得られた血漿レベルに関して観察されなかつた。そ のうえ、血漿中に得られたＶＩＩＩ：Ｃは実質上投与溶液の浸透性に依存しなか つた。 ３．マウスの皮下（ｓ．ｃ．）投与後のｒ−ＶＩＩＩＳＱの生物学的利用能は 静脈（ｉ．ｖ．）投与後の生物学的利用能の約１０％であり、後者は定義により １００％である。本試験において、投与レベルｓ．ｃ．は投与レベルｉ．ｖ．と 同一であつた。生物学的利用能は活性下の区域（ＶＩＩＩ：Ｃ）一時間曲線（Ａ ＵＣ）から計算された。かくして、皮下投与後の生物学的利用能は以下の式（デ ータに関しては表１および２参照）にしたがつて計算され得る。 生物学的利用能ｓ．ｃ．＝ＡＵＣｓ．ｃ．／ＡＵＣｉ．ｖ．・ 投与ｉ．ｖ．／投与ｓ．ｃ． （１） 例２ 組み換え因子ＶＩＩＩが実験により記載された方法によつて以下の除外、すな わち（ｉ）最終純化工程がら受容されたｒ−ＶＩＩＩＳＱの材料がＰＥＧを含有 しない緩衝液により希釈され、（ｉｉ）ｒ−ＶＩＩＩＳＱ溶液が凍結乾燥されず 、それは−７０°Ｃで貯蔵されて、製造された。 ｒ−ＶＩＩＩＳＱ溶液は以下の組成を有した。 ガラス瓶当たりの組成物： Ｌ−ヒスチジン、ｍｇ ７．５ スクロース、ｍｇ １５８ 塩化ナトリウム、ｍｇ ４５ 塩化カルシウム・（２Ｈ₂Ｏ）、ｍｇ １．２５ ポリオキシエチレン−（２０）−ソルビタン モノオレアート（ツイーン８０（商標））、ｍｇ ０．５０ 充填されたＶＩＩＩ：Ｃ ＩＵ／ガラス瓶 ６，０７０ ＶＩＩＩ：Ｃ ＩＵ／ｍｌ★ １，１３０ ★希釈されたｒ−ＶＩＩＩＳＱ（ｒ−ＶＩＩＩＳＱの１部＋水の１部、v：v） ｒ−ＶＩＩＩＳＱ溶液がＶＩＩＩ：Ｃの投与量が３，０００ＩＵ／ｋｇ体重 以下だつたとき投与前に注射のために殺菌水により希釈された（１部のｒ−ＶＩ ＩＩＳＱ溶液＋１部の水、v：v）。 約３〜３．５ｋｇの体重の雌のカニクイザル（マカカ・フアシキユラリス）が 背側の領域においてｒ−ＶＩＩＩＳＱ溶液で皮下注射された。投与量に依存して 、注射の量はおよそ０．２ないし２０．ｍｌ／ｋｇ体重の間で変化された。２５ ０，２，５００および５，０００ＩＵ／ｋｇの単一投与量による皮下注射が投与 された。各サンプリングの場合に１．８ｍｌの血液が抗凝固剤（０．２ｍｌ）と してクエン酸を収容する管内に集められた。遠心分離後血漿が分離されかつ部分 標本において凍結された（＜−６０°Ｃ）。 結果 結果 １．結果（表４〜６）にしたがつて時間の関数としての血漿濃度は皮下投与後 に吸収されている薬物の代表的なパターンに追随する。ＶＩＩＩ：Ｃの最大濃度 は投与後約９時間で見られた。 ２．得られた投与量−反応関係（表７）は、皮下注射の結果として起こる血液 流へのＶＩＩＩ：Ｃの吸収があることのさらに他の確認を付与する。 ３．サルの皮下投与後のｒ−ＶＩＩＩＳＱの生物学的利用能は約５〜１０％で あつた（表８）。生物学的利用能は本質的にｒ−ＶＩＩＩＳＱの投与量から独立 している。 例３ 上述された両方の組成（例１および２）の組み換え因子ＶＩＩＩ（ｒ−ＶＩＩ ＩＳＱ）が使用された。 体重約３０ｇおよび血統ＮＭＲＩ，ＳＰＦの雄のアルビノマウスがｒ−ＶＩＩ ＩＳＱ調合剤により首に皮下で注射された。 投与量は１０，００ＩＵ／ｋｇでかつ注射量は約１０ｍｌ／ｋｇであつた。血 液サンプリングの前３〜５分間マウスはメブマル（商標）（ペントバルビタル） ｖｅｔ．６０ｍｇ／ｍｌで腹膜中に麻酔された。投与量は約０．３ｍｌ／マウス であつた。麻酔下で０．４５ｍｌの血液が大静脈から０．０５ｍｌのクエン酸ナ トリウム（０．１３Ｍ）を含有するプラスチツク注射器に集められた。血漿は遠 心分離（７分間８，８００ｇ）により集められた血液から製造されかつその後因 子ＶＩＩＩ活性の測定まで−７０°Ｃでプラスチツククリオフレツクス管中に貯 蔵された。 因子ＶＩＩＩの生物学的利用能を増加する種々の添加剤（表９）と組み合わせ てｒ−ＶＩＩＩＳＱ溶液がマウスに皮下注射された。 結果： 結果 １．結果はｒ−ＶＩＩＩＳＱの生物学的利用能を増加することができることを 示す。また、活性ｒ−ＶＩＩＩＳＱの高い血漿濃度が本発明による生物学的利用 能を増加する添加剤が皮下投与調合剤に含まれるとき、４８ｈ以上までの、非常 に長い時間周期の間中得られることが示される。これはかかる添加剤なしのｒ− ＶＩＩＩＳＱ溶液が皮下で投与されるとき得られる血漿濃度に比較される。少な くとも５０％の活性ｒ−ＶＩＩＩＳＱの生物学的利用能がｒ−ＶＩＩＩＳＱおよ び加水分解されたゼラチンまたは大豆油エマルジヨンを含有する溶液のの皮下注 射時に達成される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 47/42 7433−4Ｃ Ａ６１Ｋ 47/44 Ｚ 47/44 9051−4Ｃ 37/12 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＲ ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ， ＳＩ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者 オステルベルグ トーマス スウェーデン国，エス−116 22 ストッ クホルム，フオルクンガガータン 88 ビ ー (72)発明者 ソストロム ブリタ スウェーデン国，エス−131 50 サルト ソ デュブナス，スコバタルバーゲン ４ (72)発明者 ミカエルソン マリアンヌ スウェーデン国，エス−161 35 ブロン マ，スメデバーゲン ９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）少なくとも５００ＩＵ／ｍｌの活性を有する凝固因子ＶＩＩＩおよび因子 ＶＩＩＩの生物学的利用能を増加する有機添加剤からなる皮下、筋肉内または皮 内投与用製薬調合剤であって、該調合剤が投与後少なくとも６時間血液中の通常 の血漿レベルの少なくとも１．５％の因子ＶＩＩＩ活性の治療レベルを付与する ことを特徴とする製薬調合剤。 ２）投与後血液中の通常の血漿レベルの少なくとも２．５％の因子ＶＩＩＩ活 性の治療レベルを付与することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の製薬調合 剤。 ３）因子ＶＩＩＩ性の治療レベルが投与後１２時間維持されることを特徴とす る請求の範囲第１項または第２項に記載の製薬調合剤。 ４）前記添加剤がアミノ酸、ペプチド、たんぱく質、またはその組み合わせか らなるグループから選択されることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第３項 のいずれか１項に記載の製薬調合剤。 ５）前記たんぱく質がゼラチンおよびコラーゲンからなるグループから選択さ れることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の製薬調合剤。 ６）前記添加剤が多糖類からなるグループから選択されることを特徴とする請 求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載の製薬調合剤。 ７）前記多糖類がキトサン、シクロデキストリン、スターチ、デキストラン、 セルロース、およびその誘導体および／または組み合わせからなるグループから 選択されることを特徴とする請求の範囲第６項に記載の製薬調合剤。 ８）前記多糖類がヒアルロン酸からなるグループから選択されることを特徴と する請求の範囲第６項に記載の製薬調合剤。 ９）前記添加剤が分散された相として油を有する水中油エマルジヨンおよび連 続相として油を有する油中水エマルジヨンおよび極性を有する脂質の分散からな るグループから選択されることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第３項のい ずれか１項に記載の製薬調合剤。 １０）油が大豆油であることを特徴とする請求の範囲第９項に記載の製薬調合 剤。 １１）因子ＶＩＩＩの分子量が少なくとも１７０ｋＤａであることを特徴とす る請求の範囲前項いずれか１項に記載の製薬調合剤。 １２）因子ＶＩＩＩ活性が１，０００ＩＵ／ｍｌ以上、好ましくは１，５００ ＩＵｍｌであることを特徴とする請求の範囲前項いずれか１項に記載の製薬調合 剤。 １３）０．０１ｍｌ以上、好ましくは０．１ないし２ｍｌ以上の量を有するこ とを特徴とする請求の範囲前項いずれか１項に記載の製薬調合剤。 １４）因子ＶＩＩＩが組み換え凝固因子ＶＩＩＩであることを特徴とする請求 の範囲前項いずれか１項に記載の製薬調合剤。 １５）因子ＶＩＩＩが組み換え凝固因子ＶＩＩＩの欠失誘導体であることを特 徴とする請求の範囲第１４項に記載の製薬調合剤。 １６）ｉ）少なくとも５００ＩＵ／ｍｌの因子ＶＩＩＩ、好ましくは少なくと も１，５００ＩＵ／ｍｌの組み換え因子ＶＩＩＩの欠失誘導体と、 ｉｉ）少なくとも０．０１ｍｇ／ｍｌのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸 エステルと、 ｉｉｉ）好ましくは０．１Ｍ以上の量において、塩化ナトリウムと、 ｉｖ）好ましくは０．５ｍＭの量において、塩化カルシウムまたはグルコン酸 カルシウムのごとき、カルシウム塩と、 ｖ）１ｍＭ以上の量においてＬ−ヒスチジンのごときアミノ酸と、 ｖｉ）因子ＶＩＩＩの生物学的利用能を増加する添加剤と、 かるなることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の製薬調合剤。 １７）欠失誘導体因子ＶＩＩＩが欠失誘導体組み換え因子ＶＩＩＩＳＱ（ｒ− ＶＩＩＩＳＱ）であることを特徴とする請求の範囲第１４項ないし第１６項のい ずれか１項に記載の製薬調合剤。 １８）投与に備えられた安定した水溶液または分散であることを特徴とする請 求の範囲第１項ないし第１７項のいずれか１項に記載の製薬調合剤。 １９）投与前に、任意の混合または連続において１またはそれ以上の水溶液ま たは分散と混合されることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の製薬調合剤 。 ２０）乾燥されかつ投与の前に、任意の混合または連続において１つまたはそ れ以上の水溶液または分散により再構成されることを特徴とする請求の範囲第1 項ないし第１７項のいずれか１項に記載の製薬調合剤。 ２１）血友病を治療するための皮下、筋肉内または皮内投与用薬剤の製造のた めの請求の範囲前項いずれか１項に記載の調合剤を使用する方法。 ２２）皮下投与用の薬剤の製造のための組み換え因子ＶＩＩＩの欠失誘導体を 使用する方法。 ２３）前記薬剤が安定した水溶液または分散であるか、または乾燥されること を特徴とする請求の範囲第２１項または第２２項に記載の調合剤または欠失誘導 体を使用する方法。 ２４）請求の範囲第１項ないし第２０項のいずれか１項に記載の調合剤の皮下 、筋肉内または皮内投与による血友病の治療方法。