PL180282B1

PL180282B1 - Kompozycja farmaceutyczna do podawania podskórnego, domiesniowego lub sródskórnego, do leczenia hemofilii PL PL

Info

Publication number: PL180282B1
Application number: PL95316618A
Authority: PL
Inventors: Jack Spira; Lars Widlund; Thomas Oesterberg; Brita Sjoestroem; Marianne Mikaelsson
Original assignee: Pharmacia & Upjohn Ab
Priority date: 1994-03-31
Filing date: 1995-03-31
Publication date: 2001-01-31
Also published as: ES2182899T3; IL113010A0; NO964081D0; EP0772452B1; IL113010A; US5925739A; JPH10501522A; AU690666B2; HU9602693D0; MX9604455A; FI963871A0; EP0772452A1; FI963871A; FI118171B; HUT74918A; NZ283499A; WO1995026750A1; NO321139B1; PT772452E; ATE222770T1

Abstract

1. Kompozycja farmaceutyczna do podawania podskórnego, domiesniowego lub sród- skórnego, do leczenia hemofilii, zawierajaca czynnik krzepniecia VIII i dodatki zwiekszajace dostepnosc biologiczna, znamienna tym, ze zawiera (i) co najmniej 500 IU/ml czynnika krzepniecia VIII, lub jego aktywnej pochodnej o masie czasteczkowej co najmniej 170 000, (ii) co najmniej 0,01 mg/ml estru polioksyetylenosorbitanu z kwasem tluszczowym, (iii) co najmniej 0,1 M chlorku sodowego, (iv) co najmniej 0,5 M soli wapniowej, (v) co najmniej 1 mM L-histydyny, (vi) organiczna substancje dodatkowa, zwiekszajaca dostepnosc biologiczna czynnika VIII po podaniu podskórnym, domiesniowym lub sródskómym. P L 180282 B 1 RZECZPOSPOLITA POLSKA ( 1 2 ) OPIS PATENTOWY ( 1 9 ) PL (1 1 ) 180282 ( 1 3 ) B1 PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna do podawania podskórnego, domięśniowego lub śródskórnego, która charakteryzuje się tym, że zawiera (i) co najnunej 500 HJ/ml czynnika krzepnięcia VIII, lub jego aktywnej pochodnej o masie cząsteczkowej co najmniej 170 kDa, (ii) co najmniej 0,01 mg/ml estru polioksyetylenosorbitanu z kwasem tłuszczowym, (iii) co ne^mniej 0,l M chlorku sodowego, (iv) co najnniee1 0,5 M soil (v) co 113111111101 1 mM L-histydyny, (vi) organiczną substancję dodatkową, zwiększającą dostępność biologiczną czynnika VIII po podaniu podskórnego, domięśniowym lub śródskómym.

Aktywność czynnika VIII o omawianej kompozycji wynosi co najmniej 500 IU/ml, a korzystnie ponad 1000 IU/ml. Szczególnie korzystnie aktywność czynnika VIII jest na poziomie 1500 IU/ml, a najkorzystniej aktywność ta wynosi od 5000 do 100000 IU/ml.

Stosowana przy podawaniu objętość może wynosić ponad 0,01 ml, stosownie od 0,1 do 2 ml, korzystnie od 0,25 do 1,5 ml i korzystniej 0,5 do 1ml. Objętość ta może wynosić także od 0,1 do 1 ml.

180 282

Czynnik VIII może pochodzić z osocza, albo może być wytworzony metoda rekombinantowego DNA.

Terapeutyczne koncentraty czynnika VIII były i są, jak dotychczas, wytwarzane sposobem polegającym na frakcjonowaniu osocza krwi. Jednakże, obecnie istniejąjuż nowe sposoby nadające się do wytwarzania czynnika VIII w hodowli komórkowej z wykorzystaniem metody rekombinantowego DNA, jak o tym donieśli W. Wood i in., Nature, 312, str. 330-337 (1984) oraz EP-A-160 457.

Koncentraty czynnika VIII wywodzące się z osocza krwi ludzkiej zawierają szereg fragmentowych, w pełni aktywnych postaci czynnika VIII [Anderson i in., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, tom 83, str. 2979-2983 (maj, 1986)]. Najmniej sza aktywna postać ludzkiego czynnika VIII ma masę cząsteczkową wynoszącą 170 kDa i może składać się z dwóch łańcuchów, 90 kDa i 80 kDa, utrzymywanych razem ze sobąmostkiem jonu metalu. Odnośnikiem jest w tym przypadku EP-A-197 901. W firmie Pharmacia AB, Szwecja, opracowano produkt będący rekombinantowym czynnikiem VIII, który odpowiada postaci czynnika VIII o 170 kDa z osocza występującej w terapeutycznych koncentratach czynnika VIII. Skróconą cząsteczkę rekombinantowego czynnika VIII nazwano r-VIII SQ. Wytwarza się ją w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO) w hodowli komórkowej w podłożu nie zawierającym surowicy'.

Budowę i biochemię produktów stanowiących rekombinantowy czynnika VIII opisał w sposób ogólny Kaufman [Trends in Biotechnology, tom 9 (1991); Hemato-logy, 63, str. 155-165 (1991)]. Budowę i biochemię r-VIII SQ opisano w WO-A-91/09122.

Rekombinantowy czynnik VIII może występować albo w postaci o pełnej długości, albo, korzystnie, w postaci jej pochodnej delecyjnej. Korzystniej, pochodną delecyjna jest rekombinantowy czynnik VIII SQ (r-VIII SQ). Przez pochodnądelecyjna rozumie się tu czynnik krzepnięcia VIII, w przypadku którego brak jest całości lub części domeny B. Oprócz tego, cząsteczka czynnika VIII, a w szczególności cząsteczka r-VIII SQ, może być modyfikowana chemicznie, na przykład na drodze pegilacji (ang. pegylation), kowalencyjnie związanych węglowodanów lub polipeptydów, w celu polepszenia trwałości cząsteczki in vivo.

Stosowany w rozwiązaniu według wynalazku czynnik VIII odznacza się wysoki stopniem czystości, co oznacza, że jego aktywność właściwa wynosi ponad 5000 IU/mg białka, a nawet ponad 12000 IU/mg i korzystnie jest on utrwalony bez dodania albuminy.

Dodatkami wzmagającymi dostępność biologiczną czynnika VIII są stosownie, związki organiczne jako takie, ich sole, emulsje lub układy zawiesinowe zawierające związki organiczne jako takie lub ich sole, na przykład układy dyspersyjne zawierające polarne lipidy. Dowolne są przy tym ich kombinacje i kolejność dodawania. Związkami organicznymi jako takimi, użytecznymi w wynalazku, są na przykład, aminokwasy, peptydy, białka i polisacharydy. Do peptydów należą dipeptydy, tripeptydy, oligopeptydy i polipeptydy, takie jak kolagen i żelatyna. Korzystnie, kolagen i żelatyna są w postaci zhydrolizowanej. Do polisacharydów należą na przykład, chitozany, cylodekstryny, skrobia, kwasy hialuronowe, dekstrany i celuloza, ich dowolne pochodne, kombinacje i/lub kolejność ich dodawania. Korzystnie, skrobia w postaci zhydrolizowanej. Do emulsji należą emulsje typu olej w wodzie, z olejem jako fazą rozproszoną oraz emulsje typu woda w oleju, z olejem jako fazą ciągłą. Olejem może być w tym przypadku olej pochodzenia roślinnego lub zwierzęcego, albo wytworzony na drodze syntezy. Stosownie, olejem roślinnym tworzącym emulsję jest olej sojowy lub olej słoniecznikowy, albo jakakolwiek ich kombinacja. Korzystną emulsją jest produkt o nazwie Intralipid® sprzedawany przez firmę Pharmacia AB, Sztokholm, Szwecja, który zawierajeszcze lecytynę żółtkajaj a kurzego. Korzystnie, lipidem polamymjestjeden, lub więcej niżjeden, fosfolipid lub glikolipid, albo ich dowolna kombinacja. Korzystnie, kwasem hialuronowym jest produkt o nazwie Healon®, sprzedawany przez firmę Pharmacia AB, Uppsala, Szwecja. Korzystnie, jako dekstran stosuje się produkt o nazwie Promiten®, sprzedawany przez firmę Pharmacia AB, Uppsala, Szwecja.

Substancje dodatkowe, zwiększające dostępność biologicznączynnika VIII można wprowadzać przed przeprowadzeniem suszenia lub po przywróceniu pierwotnej postaci, albo można je wprowadzić do stabilnego roztworu lub układu dyspersyjnego zawierającego czynnik VIII.

180 282

Ί

W skład preparatu można także włączyć kombinację co najmniej dwu wyżej wspomnianych substancji dodatkowych. Poza tym, dwie, lub większą ilość powyżej wspomnianych substancji dodatkowych wprowadzić można kolejno.

Do kompozycji wprowadzić można, w ilości nieterapeutycznej, również jeden, lub większą ilość środków przeciwkrzepliwych. Tego rodzaju środkiem przeciwkrzepliwym mogą być na przykład, glukozoaminoglukany, takie jak heparyny, fragmenty heparyny, pochodne heparyny lub siarczan heparanu. Korzystną grupę glukozaminoglukanów stanowią heparyny o małej masie cząsteczkowej, (LMWH), a więc o średniej masie cząsteczkowej wynoszącej do około 1000 Da, korzystniej od 2000 do 8000 Da.

Przed podaniem, do kompozycji wprowadzić można jeden, lub więcej niż jeden wodny roztwór lub układ dyspersyjny, w dowolnej kombinacji lub w dowolnej kolejności, przy czym kompozycja występuje w postaci trwałego roztworu wodnego, układu dyspersyjnego lub preparatu suchego.

Kompozycja zawiera także chlorek sodowy w ilości większej niż 0,1 M.

Asocjacja ciężkiego i lekkiego łańcucha czynnika VIII zależy od obecności jonów wapnia (lub jonów innego metalu dwuwartościowego). W niniejszym przypadku, wapń dodawano jako chlorek wapniowy (CaCh), ale można tu zastosować także inne sole, takie jak glikonian wapniowy, glubionian wapniowy lub gluceptan wapniowy, w ilości większej niż 0,5 mM.

Do buforowania układu korzystnie stosuje się aminokwas, który także zabezpiecza białko w fazie bezpostaciowej w przypadku poddania preparatu liofilizacji. Odpowiednim środkiem buforującym może być L-histydyna, lizyna i/lub arginina. W pierwszym rzędzie wybrano L-histydynę, ponieważ wykazuje ona dobrą pojemność buforową w zakresie pH około 7.

W preparacie może także być obecny niejonowy środek powierzchniowo czynny. Korzystnie, dobiera się go spośród kopolimerów blokowych takich jak, na przykład, poloksamer lub ester polioksyetylenosorbitanu z kwasem tłuszczowym, taki jak monolaurynian polioksyetyleno-(20)-sorbitanu lub monooleinian polioksyetyleno-(20)-sorbitanu. Korzystnie, niejonowy środek powierzchniowo czynny, jeżeli został użyty, powinien występować w ilości przekraczającej krytyczne stężenie micelarne (CMC). [Patrz: Wan i Lee, Journal ofPharm. Sci., 63, str. 136(1974).

Ester polioksyetylenosorbitanu z kwasem tłuszczowym stosuje się w ilości wynoszącej co najmniej 0,01 mg/ml.

Do omawianej kompozycji można wprowadzić także monosacharydy, disacharydy lub alkohole cukrowe, korzystnie sacharozę. Dodać można również przeciwutleniacze, takie jak glutation, acetylocysteina, tokoferol, metionina, butylohydroksy-toluen i/lub butykohydroksyanizol.

Mogą być także obecne, w niskim stężeniu, środki kompleksujące, takie jak EDTA i kwas cytrynowy, w celu stabilizowania cząsteczek czynnika VIII, zwłaszcza wtedy, gdyby cząsteczki te przejawiały silniejsze powinowactwo do destabilizujących jonów metali niż do jonów wapnia, lub innych metali dwuwartościowych, asocjujących łańcuchy czynnika VIII. Oprócz tego dodać można środki konserwujące, takie jak alkohol benzylowy, fenol, kwas sorbowy, parabeny i chlorokrezol.

Kompozycja zawiera L-histydynę i sacharozę. W kompozycji przewidzianej do liofilizacji, stosunek ilościowy chlorku sodowego do L-histydyny i sacharozy stosownie jest większy od 1:1 (wag/wag) i korzystnie wynosi ponad 2:1 (wag/wag).

Kompozycja według wynalazkumoże występować w postaci suchej, korzystnie jako liofilizat. Przed podaniem, produktowi suchemu można przywrócić postać pierwotną przy użyciu wodnego roztworu lub układu dyspersyjnego, na przykład zawiesiny, preparatu liposomowego lub emulsji.

Jedną z postaci jest także stabilny roztwór wodny, gotowy do użycia. Może on także stanowić układ dyspersyjny, na przykład taki, jak zawiesina, preparat liposomowy lub emulsja.

Kompozycję można przechowywać w otoczeniu o obniżonym stężeniu tlenu, jak to ujawniono w zgłoszeniu patentowym WO-A-94/26286.

180 282

Kompozycja według wynalazku jest przeznaczona do podawania podskórnego, domięśniowego lub śródskómego, w celu leczenia hemofilii. Korzystne jest zastosowanie delecyjnej pochodnej rekombinantowego czynnika VIII z przeznaczeniem do podawania podskórnego. Lek może mieć postać trwałego roztworu wodnego lub układu dyspersyjnego, albo postać suchą. Leczenie hemofilii, polega na podskórnym, domięśniowym lub śródskómym podawaniu zastrzeganej kompozycji.

Dane przedstawione w przykładach wykazują że czynnik VIII, a w szczególności r-VIII SQ, można wstrzykiwać podskórnie i odzyskiwać w postaci aktywnej wewnętrznej in vivo. Jest to stwierdzenie nadzwyczaj zaskakujące, ponieważ jak dotychczas nie znano jeszcze żadnego takiego preparatu.

Ochrona patentowa nie jest ograniczona wyłącznie do kompozycji przedstawionej w poniższych przykładach.

Materiały i metody

Wytworzenia rekombinantowego czynnika VIII SQ (r-VIII SQ) dokonano zasadniczo sposobem przedstawionym w opisie WO-A-91/09122, przykłady 1-3. Komórki linii komórkowej CHO DHFR-deficytowej (DG44N.Y) poddano elektroporacji z udziałem wektora ekspresyjnego obejmującego gen r-VIII SQ i wektora ekspresyjnego obejmującego gen reduktazy dihydrofolianowej. Po selekcji przeprowadzonej na podłożach selekcyjnych, kolonie przeżywające amplifikowano przez hodowle przy stopniowo wzrastających ilościach metotreksatu. Supematanty wyodrębniane z powstałych tak kolonii sprawdzano indywidualnie pod względem aktywności czynnika VIII. Wybrano klon produkcyjny, po czym przystosowano go do hodowli zawiesinowej w podłożu o określonym składzie nie zawierającym surowicy, a w końcu przeprowadzono proces fermentacyjny w dużej skali. W określonych odstępach czasowych pobrano supernatanty i poddano je dalszemu oczyszczaniu sposobem poniżej opisanym.

Sklarowane, kondycjonowane podłoże doprowadzono do odpowiedniego pH i wprowadzono do kolumny S-Sepharose FF. Po przemyciu, czynnik VIII wyeluowano buforem solnym zawierającym 5 mM CaCl₂.

Immunoadsorpcję przeprowadzono na żywicy do chromatografii imunopowinowactwa, przy czym ligandem było przeciwciało monoklonalne (8A4) skierowane ku ciężkiemu łańcuchowi czynnika VIII. Przed załadowaniem kolumny S-eluat potraktowano 0,3% TNBP i 1% Octoxynol 9.

Kolumnę zrównoważono, przemyto i wyeluowano czynnik VIII przy użyciu buforu zawierającego 0,05 M CaCl₂ i 50% glikolu etylenowego.

Eluat mAb wprowadzono do kolumny Q-Sepharose FF i zrównoważono buforem eluującym w etapie immunopowinowactwa. Po przemyciu, czynnik VIII wyeluowano 0,05 M L-histydyną, 0,6 M chlorkiem sodowym, 4 mM chlorkiem wapniowym, pH 6,8.

Eluat Q naniesiono na kolumnę do filtracji żelowej (Superdex 200 p.g.). Zrównoważenie i elucję przeprowadzono przy użyciu buforu zawierającego L-histydynę, chlorek sodowy i chlorek wapniowy.

Zebrano pik białkowy i roztwór sformułowano, a następnie zliofilizowano.

Materiał zawierający r-VIII SQ, uzyskano w etapie ostatecznego oczyszczania. Aktywność czynnika VIII i stężenie składników nieaktywnych doprowadzono do odpowiedniego poziomu za pomocą rozcieńczenia stosowanym buforem zawierającym glikol polietylenowy (PEG). Następnie roztwór wyjałowiono przez przesączenie (0,22 pm), rozdozowano i zliofilizowano.

Przykład 1. Rekombinantowy czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w części doświadczalnej.

Skład zliofilizowanej kompozycji zawierającej r-VIIII SQ, której przywracano poprzednią postać przy użyciu 4 ml wody jałowej, w przeliczeniu na jedną fiolkę, był następujący:

L-Histydyna, mg 31,0

Chlorek sodowy, mg 70,1

Chlorek wapniowy (-2 RC)), mg 2,35

180 282

Glikol polietylenowy (PEG 4000), mg 4,4

Monooleinian polioksyetyleno-(20)-sorbitanu (Tween 80®), mg 1 VIII:C załadowany, Iu/fiolkę 44100

VIII ,C w odtworzonym roztworze, IU/ml 1060

Myszom albinosom, samcom o masie ciała około 30 g, pochodzącym ze szczepu NMRI,SPF, wstrzyknięto podskórnie do szyi odtworzony roztwór r-VIII SQ.

Wstrzyknięta objętość, przy poziomie dawkowania wynoszącym 1000 IU/kg wynosiła 9,4 ml/kg, a przy wyższym poziomie dawkowania, wynoszącym 50000 IU/kg, była 5 razy większa i wynosiła 47 ml/kg. W przypadku zastosowania placebo, używano wodnego roztworu chlorku sodowego w ilości wynoszącej 9,4 ml/kg. Na 3 do 5 minut przed pobraniem krwi myszy znieczulono za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia Mebumal® (pentabarbital) vet. 60 mg/ml. Wstrzyknięta objętość wynosiła 9,4 ml/kg, to znaczy około 0,3 ml/myszy. W stanie znieczulenia pobrano 0,45 ml krwi z żyły głównej do strzykawek z tworzywa sztucznego zawieraj ących po 0,05 mł 0,13M roztworu cytrynainu sodowego. N astępnie, z zebranej tak krwi otrzymano osocze za pomocą wirowania przy 8800 x g w ciągu 7 minut i przetrzymywano je w probówkach Cryflex z tworzywa sztucznego, w temperaturze -70°C, aż do czasu przeprowadzenia oznaczenia aktywności czynnika VIII.

Wyniki Tabela 1

Vffl.C w osoczu od myszy otrzymujących podskórnie r-VIII SQ w dawce wynoszącej 10000 IU/kg masy ciała
Czas po podaniu (godziny)	VU:C (IU/ml), X± SD	n (liczba obserwacji)
0	0,82 ± 0,43	12
0, 33	1,23 ± 0,41	3
1,0	1,38 ± 0,56	4
1,5	1,83 ± 0, 60	12
2,0	1, 43± 0,91	8
4,0	1,34 ± 0,72	6
6, 0	1,27 ± 0,42	4
8,0	1,55 ± 0,80	4
16,0	0,62 ± 0,28	4
20,0	0,58 ± 0,12	3
24, 0	0,76 ± 0, 53	4

180 282

Tabela 2

VH C w osoczu od myszy otrzymujących dożylnie r-VIII SQ w dawce wynoszącej 10000 IU/kg masy ciała. Liczba obserwacji wynosiła w całym teście 6.
Czas po podaniu (minuty)	VIII:C (IU/ml), X
0	1, 6
5	66,7
15	43,7
30	32,1
45	27, 4
60	22, 5
120	15, 7
240	2,3

Tabela 3

Reakcja na dawkę u myszy otrzymujących podskórnie r-VIII-SQ. Dawka: podana dawka r-VIII SQ (IU/kg). Odpowiedź^- VIII:C w osoczu (IU/ml) po upływie 1,5 godziny od podania podskórnego
Dawka (IU/kg)	Odpowiedź (IU/ml)	Odpowiedź (IU/ml, poziom odniesienia ustalony)	n liczba obserwacji
Próba ślepa (poziom odniesienia)	0,82 ± 0,43		12
Wodny roztwór chlorku sodowego	1,21 ± 0,34	0, 39	4
10000	1,83 ± 0,60	1, 01	12
50000	2,47 ± 0,60	1, 65	6

Wyniki

1. Zmiana poziomu VIII:C w osoczu z upływem czasu po podskórnym podaniu dawki r-VIII SQ wynoszącej 10000 IU/kg przedstawia typowy układ dla leku wchłanianego z podskórnego depot (patrztabela 1). Maksimum stężenia VIII:C w osoczu obserwuje się po upływie około 1,5 godziny od podania (patrz tabela 1). Ekstremalnie wysokie d^rwki zastosowane w tym teście wybrano w celu uzyskania efektu statystycznie znaczącego.

2. Wchłanianie r-VIII SQ z podskórnego depot potwierdza się w dalszym ciągu przez wzrost stężenia maksymalnego obserwowany przy dawce pięciokrotnie wyższej. Nie zauważono wyraźniejszego wpływu na uzyskiwany poziom VIII:C w osoczu zmian objętości wstrzykiwanych podskórnie dawek zakresie od 9,4 do 47 mg/kg przy utrzymywanej na stałym poziomie dawce r-VIII SQ. Oprócz tego, stężenie VIII:C w osoczu zasadniczo nie zależało od osmolowości podawanego roztworu.

180 282

3. Dostępnośę biologiczna i-VIII SV po sodioiu myszom dzogąpodsąómą (s.c.) vs.no siła około 10% dostępności biologicznej w przypadku podawania drogą dożylną (i.v.), przy czym ta ostatnia wynosiła, z definicji, 100%. W obecnych testach, poziom dawki s.c. był taki sam jak poziom dawki i.v. Dostępność biologiczną obliczono z powierzchni pod krzywą aktywność (VIII:C)-czas (AUC). Tak więc, dostępność biologi^t^iz^iąpo podaniu podskórnym obliczyć można zgodnie z następującym równaniem (szczegółowe dane patrz tabela 1 i 2):

Dostępność biologiczna = AUC_Sc /AUC, _v x dawka, _v dawka_{s a}.

Przykład2. Rekombinantowy czynnik VIII wytworzono zgodnie ze sposobem postępowania obisanam w części doświadczalnej, następującymi zmianami:

(i) materiał zawierający r-VIII SQ uzyskany w etapie ostatecznego oczyszczania rozcieńczono buforem nie zawierającym PEG; (ii) roztworu r-VIII SQ nie poddawano liofilizacji, przechowywano go w temperaturze -70°C.

Skład roztworu r-VIII SQ, w przeliczeniu na jedną fiolkę, był następujący:

L-Histydyna, mg 77

Sacharoza, mg 158

Chlorek sodowy, mg 45

Chlorek wapniowy ( -2 H₂0), mg 1,25

Mznozletntan boltzksyetyleno-(200-sorbitIn (Tween 80®), mg 0,50 VIII:C załadowany, IU/fiokę 6607

VIII:C, IU/ml* 1130 * Rozcieńczony roztwór r-VIII SQ (1 część roztworu r-VIII SQ + 1 część wody, obj/obj).

Roztwór r-VIII SQ rozcieńczano wzdąjIłowądo wstrzykiwań (1 część roztworu r-VIII SQ + 1 część wody, obj : obj) przed podaniem, gdy dawka VIII:C wynosiła mniej nić 3000 IU/kg masy ciała.

Małpom makakom (Macacafascicułaris), samicom o masie ciała około 3-3,5 kg, wstrzyknięto podskórnie roztwór r-VIII SQ w okolice pleców. W zależności od dawki, objętość zastrzyku zmieniano w zakresie, w przybliżeniu, od 0,2 do 2,0 ml/kg masy ciała. Stosowano wstrzyknięcia podskórne dawek pojedynczych wynoszących 250,2500 i 5000 IU/kg. Za każdym razem pobierania próbek pobierano po 1,8 ml krwi do probówek zawierających po 0,2 ml cytrynianu jako środka krzepliwego. Po odwirowaniu, osocze oddzielano i przechowywano w porcjach w temperaturach <-60°C.

Wyniki Tabela 4

VIII.C w osoczu małp ztrzamują-a-h podskórnie r-VIII SQ w dawce wynoszącej 250 IU/lg. Stężenie VIII'C w podawanym roztworze wynosiło około 1130 IU/ml.
Małpa nr Próbka pobrana po upływie od wstrzyknięcia godzin:	1 Vm:C (IU/ml)	2 VUI.C (IU/ml)	3 VHI:C (IU/ml)
0	2, 15	1,49	1,76
1	2, 32	1, 75	1,92
4	2,43	1,52	1,89
8	2,48	1,67	1,92
10	2,41	1,76	2, 03
12	2,29	1, 70	2, 01
14	2,20	1, 69	2, 00
24	1,76	1,32	1,98
30	2,31	1,46	1,90
48	2, 18	1, 64	1,96

180 282

Tabela 5

VBI:C w osoczu małp otrzymujących podskórnie r-VHI SQ w dawce wynoszącej 2500 IU/kg. Stężenia VIII'C w podawanym roztworze podawanym wynosiło około 1130 IU/ml
Małpa nr	4a	5a	6a
Próbka pobrana po upływie od wstrzyknięcia godzin:	Vni:C (IU/ml)	VIII:C (IU/ml)	VIII C (IU/ml).
0	1, 85	1,43	2, 18
1	1, 96	1,82	2,72
4	2,70	2,22	3, 14
8	3, 19	2, 60	3, 37
10	3, 19	2, 81	3,46
12	3, 06	1,56	3, 02
14	2, 56	2, 42	2, 85
24	2, 34	2,12	2,75
30	2,20	2,01	2,55
48	2, 02	1,83	2,38
Małpa nr	4b	5b	6b
Próbka pobrana po	VIII:C	VłH-C	VII[:C
upływie od wstrzyknięcia	(IU/ml)	(IU/ml)	(IU/ml)
godzin:
0	1,98	1,35	2, 30
2	2, 43	1,88	3, 05
6	3, 51	2,45	3, 59
9	3, 91	2,47	4,16
11	3, 47	2,24	3, 68
13	3, 11	2, 06	3,34
22	2, 38	1,55	2, 79
40	2,01	1,49	2,38

180 282

Tabela 6

VIII C w osoczu małp otrzymujących podskórnie r-VHI SQ w dawce wynoszącej 5000 IU/kg. Stężenie VIII:C w podawanym roztworze wynosiło około 2470 IU/ml
Małpa nr	7	8	9
Próbka pobrana po	vm-.c	vn-c	vn-.c
upływie od wstrzyknięcia godzm:	(IU/ml)	(IU/ml)	(IU/ml)
0	2, 04	1,78	1,54
2	2, 99	2, 37	2, 99
6	4,56	3, 33	5,32
9	4,75	3, 89	5, 70
11	4,72	3, 32	5,46
13	4,23	3, 06	4, 63
22	3, 03	2, 33	3,46
40	2,76	1,77	2,60

Tabela 7

Reakcja na dawkę u myszy otrzymujących podskórnie r-VIII SQ Dawka ' podana dawka r-Vin SQ (IU/kg masy ciała). Odpowiedź: VIII'C w osoczu (IU/ml) po upływie około 9 godzin odpódania
Dawka (IU/kg)	Odpowiedź (IU/ml)	Odpowiedź (IU/ml, poziom odniesienia ustalony)	n liczba obserwacji
Próba ślepa (poziom	1,8 ± 0,3	—	9 '
odniesienia)
250		0,37 ± 0,05	3
2500		1,70 ± 0, 06	3
2500		2,05 ± 0, 57	3
5000		3,4 ± 1,20	3

180 282

Tabela 8

Dostępność biologiczna r-VIII SQ po podskórnym podaniu małpom Stęzeme VIII C w podawanym roztworze było zmienne w zakresie od około 1130 IU/ml do około 2470 IU/ml. Dostępność biologiczną obliczano według równania 1 na podstawie danych zamieszczonych w tabelach 4-6 oraz odpowiednich danych uzyskanych po podaniu drogą dożylną.
Dawka (IU/kg masy ciała)	Dostępność biologiczna (%)
250	11
250	9
2500	7
2500	11
2500	6
2500	6
2500	5
2500	5
5000	7
5000	3
5000	9

Wyniki

1. Zgodnie z otrzymanymi wynikami (tabela 4-6), stężenie w osoczu w funkcji czasu odpowiada typowemu rozkładowi stężeń leku wchłanianemu po podaniu drogą podskórną. Najwyższe stężenie VIII:C obserwuje się po upływie około 9 godzin od podania leku.

2. Otrzymane wyniki dla zależności dawka-odpowiedź (tabela 7) stanowią dalsze potwierdzenie faktu, że po podaniu leku drogąpodskómąnastępuje wchłonięcie VIII:C do prądu krwi.

3. Dostępność biologiczna r-VIII SQ po podskórnym podaniu małpom wynosiła około 5-10% (tabela 8). Dostępność biologiczna była w zasadzie niezależna od wielkości dawki r-VIII SQ.

Przykład 3. Stosowano rekombinantowy czynnik VIII (r-VIII SQ) w postaci obu wspomnianych wyżej kompozycji (przykłady 1 i 2).

Myszom albinosom (szczep NMRI, SPF), samcom o masie ciała około 30 g, wstrzyknięto podskórnie w szyję preparat r-VIII SQ.

Stosowana dawka wynosiła 10000 IU/kg, a wstrzykiwana objętość około 10 ml/kg. Na 3 do 5 minut przed pobraniem próbek krwi myszy znieczulono za pomocą dootrzewnowego podania Mebumal® (pentabarbital) vet., w dawce wynoszącej 60 mg/ml. Objętość dawki wynosiła około 0,3 ml/mysz. W stanie znieczulenia pobierano 0,45 ml krwi z żyły głównej do strzykawek z tworzywa sztucznego zawieraj ących po0,05ml0,13M roztworu cytrynianu sodowego. Następnie, z zebranej tak krwi otrzymano osocze za pomocą wirowania przy 8800 x g w ciągu 7 minut i przetrzymywano je w probówkach Cryoflex z tworzywa sztucznego, w temperaturze -70°C, aż do czasu przeprowadzenia oznaczenia aktywności czynnika VIII.

Myszom podawano drogą podskórną roztwór r-VIII SQ w połączeniu z różnymi substancjami dodatkowymi zwiększającymi dostępność biologiczną czynnika VIII (tabela 9).

180 282

Tabela 9

Substancje dodatkowe wprowadzane do roztworu r-VHI SQ przed podskórnym jego podaniem myszom
Substancja dodatkowe	Nazwa handlowa/ źródło zaopatrzenia	Stęzeme substancji dodatkowej w podawanym roztworze r-Vm SQ
Mieszanina aminokwasów	Vamin®/Pharmacia AB	4,5 g N/litr
Dekstran	Promiten ©/Pharmacia AB	150 mg/ml
Kwas hialuronowy	Healon®/Pharmacia AB	5 mg/ml
Kolagen hydrolizowany	Prionex®/'Pentapharm Ltd	150 mg/ml
Żelatyna hydrolizowana	Haemaccel®/Hoechst	17,3-35 g/litr
Albumina surowicy ludzkiej	Albumin/Pharmacia AB	100-200 g/litr
Poli(0-2-hydroksyetylo)skrobia	HAES/steril®/Meda	50-100 g/litr
Emulsja zawierająca olej sojowy	Intrallpid®/Pharma.cia AB	150-200 mg/litr

Wyniki Tabela 10

VIII C w osoczu myszy otrzymujących podskórnie roztwór r-VHI SQ zawierający żelatynę zhydrolizowaną. Stężenie VIII C w podawanym roztworze wynosiło około 1100 IU/ml. Dawka r-VHI SQ wynosiła 10000 IU/kg masy ciała.
Czas od podania (godziny)	VHI.C (IU/ml)	n liczba obserwacji
0	0,82 ± 0,43	12
1,5	1, 83 ± 0,37	4
6	2,02 ± 0,43	6
16	1,94 ± 0,44	9
24	2,00 ± 0,52	5
30	1,52 ± 0,41	6
48	1,32 ± 0,41	6

Tabela 11

VIII:C w osoczu myszy otrzymujących podskórnie roztwór r-VIII SQ zawierający emulsję z olejemsojowym. Stężenie VIII'C w podawanym roztworze wynosiło około 1100 IU/ml. Dawka r-VIII SQ wynosiła 10000 IU/kg masy ciała.
Czas od podania (godziny)	Vm:C (IU/ml)	n liczba obserwacji
0 1,5	0,82 ± 0,43 1,41 ± 0,44	12
4
	1,46 ± 0,34
3, 5	5
1,48 ± 0,87
6	4
	1,29 + 0,25
16 16	1,29 ± 0,25	6 3
1,35+0,31
30	1,92 ±0,51	6
48	1,97 + 0,29	5

180 282

Tabela 12

VIII:C w osoczu myszy otrzymujących podskórnie roztwór	r-VIII SQ zawierający poli(0-2-
hydroksyetylo)skrobię Stężenie VIII C w podawanym roztworze wynosiło około 1100 IU/ml
Dawka r-VIII SQ wynosiła 10000 IU/kg masy ciała.
Czas od podania (godziny)	VIII:C (IU/ml)	n liczba obserwacji
0	0,82 ± 0,43	12
1/5	1,00 ± 0,44	5
3,5	1,62 ± 0,19	4
6	1, 65 ± 0,69	6
16	1, 62 ± 0,38	6
16	1,19 ± 0,40	4
24	0,73 ± 0,52	4
30	1,33 ± 0,39	5
48	1,10 ± 0,38	3

Tabela 13

VIII. C w osoczu myszy otrzymujących podskórnie roztwór r-Vffl SQ zawierający kwas hialuronowy. Obliczone stężenie YIII'C w podawanym roztworze wynosiło około 1100 IU/ml
	Dawka r-VIII SQ wynosiła 10000 IU/kg	masy ciała.
Czas od podania (godziny)	VIII :C (IU/ml)	n liczba obserwacji
0	0,82 ± 0,43	12
1,5	1,67 ± 0,42	5
3,5	1,33 ± 0,35	4
6	1,72 ± 0, 61	4
16	1,36 ± 0,43	5

Tabela 14

VHI:C w osoczu myszy otrzymujących podskórnie roztwór	r-VU SQ zawierający dekstran
Stężenie VIII:C w podawanym roztworze wynosiło około 1100 IU/ml.
Dawka r-VIII SQ wynosiła 10000 IU/kg masy ciała.
Czas od podania (godziny)	VIIIC (IU/ml)	n liczba obserwacji
0	0,82 ± 0,43	12
1,5	1,43 ± 0,43	6
3, 5	1,74 ± 0,10	5
6	1,02 ± 0,51	5
16	1,54 ± 0,36	6

180 282

Tabela 15

VIII: C w osoczu myszy otrzymujących podskórnie roztwór r-VHI SQ zawierający zhydrolizowany
kolagen. Stężenie VIII:C w podawanym roztworze wynosiło około 1100 IU/ml.
Dawka r-VIII SQ wynosiła 10000 IU/kg masy ciała.
Czas od podania (godziny)	VIII:C (IU/ml)	n liczba obserwacji
0	0,82 ± 0,43	12
1/5	1,00 ± 0,54	6
7	1,36 ± 0,71	4
16	1,39 ± 0,93	6
24	1,31 ± 0,51	5
30	0,93 ± 0,59	4
48	1,16 ± 0,51	6

Tabela 16

VUI:C w osoczu myszy otrzymujących podskórne roztwór r-VIII SQ zawierający mieszaninę
aminokwasów Stężenie VIII:C w podawanym roztworze wynosiło około 1100 IU/ml.
Dawka r-VIII SQ wynosiła 10000 IU/kg masy ciała.
Czas od podania (godziny)	VII:C (IU/ml)	n liczba obserwacji
0	0,82 ± 0,43	12
1,5	1,47 ± 0,79	4
7	1,66 ± 0,21	4
16	1,26 ± 0,61	6

Tabela 17

Dostępność biologiczna r-VIII SQ u myszy po podaniu podskórnym Podawany drogą podskórną roztwór r-VIII SQ zawierał zmieniające się substancje dodatkowe w stężeniu podanym w ta-beli 8. Stężenie VIII:C w podawanym roztworze wynosiło około 1100 IU/ml, a dawka wynosiła 10000 IU/kg. Dostępność biolo-giczną obliczano z powierzchni pod krzywą aktywność' (VHI:C)-czas w ciągu 48 godzin. Dostępność biologiczną po podaniu drogą podskórną r-VIII SQ podano w procentach dostępności biologicznej uzyskanej po dożylnym podaniu takiej samej dawki (10000 IU/kg).
Substancja dodatkowa wzmagająca dostępność biologiczną czynnika VIII	Dostępność biologiczna	Sposób podawania
Nie ma	100	dożylnie
Nie ma	10	podskórnie
Dekstran	35	podskórnie
Kwas hialuronowy	45	podskórnie
Kolagen hydrolizowany	20	podskórnie
Żelatyna hydrolizowana	50	podskórnie
Poli (0-2-hydroksyety-lo)skrobia	25	podskórnie
Emulsja zawierająca olej sojowy	60	podskórnie

180 282

Wyniki

1. Otrzymane maniki wnkazują, aejest rzeeząmożliwąspowo dowanio zwiększenia dostępności biologicznej r-VIII SQ. Wykazano także, że wysokie stężenie aktywnego r-VIII SQ uzyskuj e się w ciągu o wiele dłuższego czasu, nawet aż do 48 godzin, gdy zgodnie z wynalazkiem do podawanego drogą podskórną preparatu zostanie włączona dodatkowa substancja wzmagająca dostępność biologiczną. Zestawiono to ze stężeniem w osoczu uzyskanym w przypadku podawania drogą podskórną roztworu r-VIII SQ nie zawierającego tego rodzaju substancji dodatkowej. Dostępność biologiczną r-VIII SQ wynoszącą co najmniej 50% osiągnięto po podskórnym wstrzyknięciu roztworu zawierającego r-VIII SQ i zhydrolieowaną żelatynę lub emulsję zawierającą olej sojowy.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja farmaceutyczna do podawania podskórnego, domięśniowego lub śródskómego, do leczenia hemofilii, zawierająca czynnik krzepnięcia VIII i dodatki zwiększające dostępność biologiczną, znamienna tym, że zawiera (i) co najmniej 500 IU/ml czynnika krzepnięcia VIII, lub jego aktywnej pochodnej o masie cząsteczkowej co najmniej 170 000, (ii) co najmniej 0,01 mg/ml estru polioksyetylenosorbitanu z kwasem tłuszczowym, (iii) co najmniej 0,1 M chlorku sodowego, (iv) co najmniej 0,5 M soli wapniowej.

(v) co najmniej 1 mM L-histydyny, (vi) organiczną substancję dodatkową, zwiększającą dostępność biologiczną czynnika VIII po podaniu podskórnym, domięśniowym lub śródskómym.
2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera organiczną substancję dodatkową zwiększającą dostępność biologiczną czynnika VIII po podaniu podskórnym do co najmniej 20% dostępności biologicznej po podaniu dożylnym.
3. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że jako substancję dodatkową zawiera substancję wybranąz grupy obejmującej aminokwasy, peptydy, białka i ich kombinacje.
4. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że jako białko zawiera żelatynę.
5. Kompozycja według zastrz. 3, znamienna tym, że jako białko zawiera kolagen.
6. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że jako substancję dodatkową zawiera polisacharyd.
7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że zawiera polisacharyd wybrany z grupy obejmującej chitozany, cyklodekstryny, skrobię, dekstrany, celulozę i ich pochodne i/lub kombinacje.
8. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że jako polisacharyd zawiera kwas hialuronowy.
9. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że jako substancję dodatkową zawiera substancję wybranąz grupy obejmującej emulsje typu olej w wodzie z olejem jako fazą rozproszoną, emulsje typu woda w oleju z olejemjako fazą ciągłą, i dyspersje polarnych iipidów.
10. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że jako olej zawiera olej sojowy.
11. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2 albo 4 albo 5 albo 7 albo 8 albo 10, znamienna tym, że jako czynnik krzepnięcia VIII zawiera rekombinowany czynnik VIII.
12. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2 albo 4 albo 5 albo 7 albo 8 albo 10, znamienna tym, że pochodna czynnika VIII zawiera rekombinantową pochodną czynnika VIII o masie cząsteczkowej wynoszącej co najmniej 170 000.
13. Kompozycja według zastrz. 12, znamienna tym, że jako rekombinantową pochodną czynnika krzepnięcia VIII zawiera delecyjna. pochodną rekombinantowej pochodnej czynnika krzepnięcia VIII określonąjako r-VIII SQ.

Wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej przeznaczonej do podawania podskórnego, domięśniowego i śródskómego, zawierającej czynnik krzepnięcia VIII mającej zastosowanie w leczeniu hemofilii A lub B.

180 282

Kompozycja zawiera czynnik VIII o aktywności wynoszącej co najmniej 500 IU/ml oraz substancje dodatkowe wzmagające dostępność biologiczną czynnika VIII. Testy przeprowadzone z udziałem czynnika VIII wykazują poziom terapeutyczny aktywnego czynnika VIII w prądzie krwi w ciągu zaskakująco długiego czasu po podaniu podskórnym, domięśniowym lub śródskórnym. Dogodnie, czynnikiem VIII jest rekombinantowy czynnik VIII o wysokim stopniu czystości, korzystnie w postaci swej pochodnej delecyjnej, który można wykorzystać do wytwarzania leku nadającego się do podawania drogą podskórną.

Hemofilia jest chorobą dziedziczną, znanąod stuleci. Ale jedynie od ostatnich czterdziestu lat stało się możliwe rozróżnienie jej rozmaitych postaci: hemofilii A, hemofilii B i hemofilii C. Najczęściej spotykanąpostaciąhemofiliijest hemofilia A. Dotyka ona wyłącznie osobnikówpłci męskiej i występuje z częstościąwynosząca 1 lub 2 osobników na 10000 żywo urodzonych osobników płci męskiej. Chorobę powoduje bardzo obniżony poziom, lub w ogóle brak, aktywnego biologicznie czynnika krzepnięcia krwi VIII (czynnik przeciwkrwawiączkowy), będącego białkiem normalnie obecnym w osoczu. Klinicznym objawem hemofilii A jest przejawianie tendencji do silnego krwawienia i zanim wprowadzono leczenie z użyciem koncentratów czynnika VIII, średnia wieku tych chorych wynosiła mniej niż 20 lat. Od około trzydziestu lat dostępne są koncentraty czynnika VIII otrzymywane z osocza. Polepszyło to w znacznym stopniu sytuację, jeśli chodzi o leczenie chorych na hemofilię i stworzyło im możliwość przeżycia okresu o normalnej długości.

Powszechnie wiadomo, że ciężkość hemofilii A i B można podzielić na trzy kategorie: choroba o przebiegu ciężkim, o przebiegu umiarkowanym i o przebiegu łagodnym. W przypadku hemofilii A o przebiegu ciężkim, poziom aktywności w osoczu czynnika VIII obecnego w krwi wynosi poniżej 1% normalnego jej poziomu w osoczu. W przypadku hemofilii A o przebiegu umiarkowanym, poziom aktywności w osoczu czynnika VIII obecnego w krwi mieści się w zakresie 'od 5 do 25% normalnego jej poziomu w osoczu. Normalny poziom aktywności w osoczu czynnika VIII obecnego w krwi określa się jako 1 IU/ml krwi. Hemofilię B o przebiegu ciężkim, umiarkowanym i łagodnym definiuje się przez takie same poziomy aktywności w osoczu czynnika VIII, jakie podano wyżej.

Lek w postaci bardzo dużej i labilnej cząsteczki, takiej jaka występuje w przypadku czynnika krzepnięcia VIII o masie cząsteczkowej 170-300 kDa, podaje się normalnie drogą dożylną, ponieważ tego rodzaju leki zazwyczaj odznaczzająsię bardzo maiądostępnościąbiologiczną. wynikającą z niedostatecznej wchłanialności oraz daleko posuniętego rozkładu przy podawaniu podskórnym, domięśniowym i śródskórnym. Toteż, koncentrat czynnika VIII rozpuszczony w cytrynianie sodowym i podany we wstrzyknięciu domięśniowym dawał maksymalny poziom w krążeniu, wynoszący jedynie 1,4 % normalnego poziomu w osoczu [Pool i in., New England. J. Medicine, tom 275, nr 10, str, 547-548 (1966)]. Dalsze badania potwierdziły, że nie było większej różnicy, jeśli chodzi o aktywność odzyskaną w krążeniu, niezależnie od tego, czy cytrynian taki dodano do preparatu czy nie. W późniejszych badaniach, czynnik VIII o wysokiej czystości podawano domięśniowo hemofilnym psom i ochotnikom ludzkim [Johnson i in., Br. J. Hemotology, tom 21, str. 21 -41 (1071)]. Aczkolwiek dawki były w tym przypadku o wiele wyższe, niż dawki stosowane przez Poola i wsp., ani psy, ani ochotnicy ludzcy nie wykazali znaczącego podwyższenia poziomu stężenia czynnika VIII w osoczu. W rzeczywistości, stężenie w osoczu czynnika VIII w przypadku hemofilnych ochotników ludzkich utrzymywało się na poziomie wynoszącym mniej niż 1% normalnego poziomu w osoczu, a więc odpowiadającym hemofilii A o przebiegu ciężkim, występującym nieodmiennie po podaniu przy nieobecności dodatków wzmagających dostępność biologiczną.

Dla wielkiej liczby farmaceutyków, włącznie z substancjami o małych cząsteczkach, takimi jak insulina i peptydowe frakcje czynnika VIII, proponowano, w celu wzmożenia ich wchłaniania, użycie rozmaitych substancji dodatkowych. I tak, na przykład, w WO-A-92/01440 doniesiono o zastosowaniu dimetylo-P-cyklodekstryny do powodowania polepszenia sposobu podawania insuliny o masie cząsteczkowej około 5800 Da drogąprzezśluzówkową. Informacji dotyczących wprowadzania małych cząsteczek drogami nieinwazyjnymi nie można wykorzystać

180 282 do rozwiązania problemu wprowadzania cząsteczek dużych do krążenia żylnego za pomocą podawania podskórnego, domięśniowego lub śródskómego. Potwierdzeniem faktu, że stan taki istotnie jest zgodny z rzeczywistością, jest to, że celem WO-A-92/01440 jest doprowadzenie do zbędności stosowania podawania polipeptydów lub białek za pomocąwstrzykiwania. Następnie, przed podaniem domięśniowym używa się wodnego roztworu chlorku sodowego do rozpuszczenia peptydowych frakcji czynnika VIII o masie cząsteczkowej wynoszącej od 1000 do 20000 Da {Conte i in., Arzneim.-Forsch./Drug Res., tom 39(1), nr 4, str. 463-466 (1989)]. I tu, również, eksperymenty dotyczą małych cząsteczek o nieznanej dostępności biologicznej, ponieważ aktywność peptydowych frakcji czynnika VIII nie została jeszcze ustalona.

EP-A-0522491 dotyczy zastosowania rozpuszczalnych w wodzie związków typy kwasu hialuronowego łącznie o rozpuszczalnym w wodzie białkiem nie wykazującym znaczniejszej aktywności farmakologicznej, w celu polepszenia stosowania farmakologicznie aktywnego polipeptydu, korzystnie o masie cząsteczkowej poniżej około 20 kDa. Wśród wielkiej liczby polipeptydów wymienione zostały także czynniki krzepnięcia krwi. Poza tym, nie podano tam przykładów wskazujących na możliwe oddziaływanie kwasów hialuronowych po podaniu któregokolwiek z czynników krzepnięciu krwi, na przykład przez wstrzyknięcie.

JP-A-63-063624 dotyczy zastosowania kolagenu do powodowania spowolnionego uwalniania nie wyszczególnionego leku po podaniu, na przykład, drogą podskórną.

JP-A-56-127308 dotyczy emulsji zawierających czynnik krzepnięcia krwi VIII, olej sojowy i fosfolipidy. Celem tego rodzaju emulsji jest wyeliminowanie problemów związanych z typowym sposobem stosowania, a mianowicie podawaniem drogąpozajelitową. A zatem, emulsje takie podawane są doustnie, co przedstawiono w szeregu przykładów.

Czynnik VIII można także stosować w innych przeznaczeniach terapeutycznych niz w celu leczenia hemofilii A. I tak, opis WO-A-93/24137 dotyczy preparatów zawierających F VIII przeznaczonych do śródskómego lub miejscowego podawania w charakterze środka przeciwzapalnego. Preparaty przeznaczone są do podawania miejscowego ludziom nie cierpiącym na hemofilię, a nie sąprzeznaczone do wprowadzania do krążenia ludziom dotkniętym hemofilią A. Uzyskany efekt terapeutyczny jest więc miejscowy, a nie układowy, a właśnie ten ostatni jest konieczny do złagodzenia przebiegu hemofilii A.

Wszystkie dostępne obecnie na rynku preparaty czynnika VIII wykonane sąj ako preparaty przeznaczone do podawania drogą dożylną, przy czym większość preparatów czynnika VIII stanowią preparaty stabilizowane ludzką albuminą surowiczą.

Tak więc, duże i nietrwałe białka podaje się normalnie drogą dożylną tak, że lek dostępny jest bezpośrednio w prądzie krwi. Jednakże, korzystniejsze byłoby, gdyby lekmógł być podawany podskórnie, domięśniowo lub śródskómie, gdyż takie sposoby stosowania są dla chorego o wiele łatwiejsze pod względem manipulowania, a zwłaszcza wtedy, gdy lek musi być przyjmowany w sposób regularny przez całe życie, a leczenie musi rozpoczynać się wcześnie, już podczas pierwszego roku życia chorego.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że czynnik VIII, będący bardzo wrażliwym białkiem, można podawać drogą podskórną i, w przeciwieństwie do wszystkich wcześniejszych doświadczeń, uzyskano znakomitąwchłanialność i zaskakująco wysokie stężenie aktywnego czynnika VIII we krwi.

Stosowanie rekombinantowego czynnika VIII SQ wskazane jest w leczeniu klasycznej hemofilii. Okres półtrwania r-VIII SQ, w przypadku dożylnego podawania ludziom, wynosi około 12 godzin. W przypadku stosowania profilaktycznego, czynnik VIII podaje się trzy razy tygodniowo w dawce wynoszącej 15-40 IU/kg masy ciała.

Objętość wstrzyknięcia dożylnego wynosi zazwyczaj od 5 do 20 ml. We wstrzyknięciu podskórnym podaje się od 0,05 do 1 ml, wobec czego stężenie czynnika VIII musi być w takim preparacie bardzo wysokie. Otrzymanie takiego preparatu staje się możliwe, na przykład, w przypadku użycia w preparacie rekombinantowego czynnika VIII o wysokim stopniu czystości łącznie z substancją dodatkową, takąjak emulsja z hydrolizatem żelatyny, kwasem hialuronowym i/lub olejem sojowym. Dzięki wynalazkowi możliwe jest w warunkach podawania

180 282 podskórnego, domięśniowego lub śródskómego uzyskiwanie dostępności biologicznej wynoszącej co najmniej 20%, a stosownie co najmniej 30% dostępności biologicznej osiąganej przy podawaniu dożylnym. W przypadku szczególnie starannego doboru składników, dzięki wynalazkowi możliwe staje się w warunkach stosowania podskórnego, domięśniowego lub śródskómego uzyskanie dostępności biologicznej wynoszącej co najmniej 50%, a nawet 70% tej dostępności biologicznej, którą osiąga się przy podawaniu drogą dożylną.

Pomysł wynalazczy polega na połączeniu stwierdzenia, że czynnik VIII, gdy zostanie podany w postaci farmeceutyku do podawania podskórnego, domięśniowego lub śródskómego, może być wchłaniany do prądu krwi, ze stwierdzeniem, że możliwe jest wytworzenie, w tym przeznaczeniu, specjalnego preparatu zapewniającego zwiększenie dostępności biologicznej czynnika VIII.

Wynalazek dotyczy zatem kompozycji farmaceutycznej przeznaczonej do podawania podskórnego, domięśniowego lub śródskómego, zawierającej czynnik krzepnięcia VIII o aktywności co najmniej 500 IU/ml oraz dodatki zwiększające dostępność biologiczną czynnika VIII, przy czym preparat ten zapewnia uzyskanie terapeutycznego poziomu aktywności czynnika VIII wynoszącego co najmniej 1,5% normalnego poziomu w osoczu krwi w ciągu co najmniej 6 godzin po podaniu.

Jako poziom terapeutyczny w wynalazku przyjmuje się co najmniej 1,5% normalnego poziomu aktywności w osoczu czynnika VIII występującego w krwi. Aktywność czynnika VIII w krwi wynosi, stosownie 2,5% normalnego poziomu aktywności w osoczu, a korzystnie co najmniej 4%.

Dzięki rozwiązaniu według wynalazku stało się możliwe utrzymanie terapeutycznie zadowalaj ącego poziomu VIII:C w ciągu co najmniej 6 godzin, stosowanie ponad 12 godzin, korzystnie ponad 24 godziny, a korzystniej ponad 48 godzin. W przypadku preparatów o jakości zoptymalizowanej możliwe jest utrzymanie terapeutycznie zadowalającego poziomu VIII:C w ciągu co najmniej 96 godzin, a nawet ponad 168 godzin. W ten sposób można sprowadzić do minimum częstość podawania, z jednoczesnym utrzymywaniem na odpowiednim poziomie zamierzonego działania terapeutycznego. Preparaty według wynalazku mogą także nadawać się do leczenia w trybie na żądanie.

Dzięki wynalazkowi możliwe jest leczenie hemofilii A lub B, a więc chorób, które (jeżeli występują) opanowującały układ krwionośny. Toteż, warunkiem wstępnym powodzenia terapii jest także stosowanie leku, które pozwala uzyskać działanie układowe. Dzięki wynalazkowi osiąga się tego rodzaju działanie układowe, w przeciwieństwie do innych sposobów leczenia, w przypadku których pożądane są miejscowe, na przykład przeciwzapalne, efekty działania.

Preparat zawierający czynnik VIII korzystnie podaje się drogą podskórną.